一种D-氨基酸氧化酶突变体及其应用的制作方法

本发明涉及生物
技术领域：
，尤其涉及一种d-氨基酸氧化酶突变体及其应用。
背景技术：
：草铵膦，又名草丁膦，英文名为phosphinothricin(简称ppt)，化学名为2-氨基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸，是世界第二大转基因作物耐受除草剂，由赫斯特公司(几经合并后现归属拜耳公司)开发生产。草铵膦属膦酸类除草剂，是谷氨酰胺合成酶抑制剂，非选择性(灭生性)触杀型除草剂。众所周知，灭生性除草剂市场巨大。目前，世界三大除草剂分别为百草枯，草甘膦，草铵膦。在市场使用方面，草甘膦独占鳌头，但是由于其长期使用，使得大量杂草产生抗性，而草甘膦也趋于失效；百草枯由于其剧毒性，已被列入《鹿特丹公约》，全球越来越多国家禁用或限用，中国农业部已发布公告说明，百草枯在2014年7月1日停止生产，2016年7月1日禁止使用。目前，草铵膦产量虽小，却具有优异的除草性能和较小的药害副作用，因此，在未来一段时间内拥有巨大的市场潜力。草铵膦由两种光学异构体，分别为l-草铵膦和d-草铵膦；但只有l-型具有除草活性，且在土壤中易分解，对人类和动物的毒性较小，除草谱广，对环境的破坏力小。目前，市场上销售的草铵膦一般都是外消旋混合物。若草铵膦产品能以l-构型的纯光学异构体形式使用，可显著降低草铵膦的使用量，这对于提高原子经济性、降低使用成本、减轻环境压力具有重要意义。手性纯l-草铵膦的主要制备方法主要由三种：手性拆分法，化学合成法和生物催化法。手性拆分法是通过对外消旋d,l-草铵膦或其衍生物进行手性拆分，实现d型和l型异构体的分离，从而得到光学纯的l-草铵膦。此工艺主要存在以下缺点：需要使用昂贵手性拆分试剂、理论收率只能达到50％、单次拆分率低、工艺比较复杂。化学合成法是从手性原料出发合成光学纯l-草铵膦。化学不对称合成法工艺步骤多、收率低，手性原料昂贵导致生产成本高，不利于大规模制备l-草铵膦。生物催化法生产草铵膦则具有立体选择性严格、反应条件温和、收率高等优点，是生产l-草铵膦的优势方法。主要包括以下三类：(1)以l-草铵膦的衍生物为底物，通过酶法直接水解获得，主要优点是转化率高，产物ee值较高，但需要昂贵且不易获得的手性原料为前体。(2)以外消旋草铵膦的前体为底物，通过酶的选择性拆分获得。主要优点为原料相对易得，催化剂活力高，但是理论收率只能达到50％，造成原料浪费。(3)以d,l-草铵膦为原料，经d-氨基酸氧化酶催化d-草铵膦得到l-草铵膦前体2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸，再经氨基酸脱氢酶或转氨酶催化得到l-草铵膦。早在研究草铵膦在土壤微生物的代谢途径中就已经发现l-草铵膦在酶的作用下会被分解成2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸。因此，以2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸为底物，经酶法可逆催化生成l-草铵膦不失为一个好方法。d-氨基酸氧化酶是一类特异选择性的将d-氨基酸及其衍生物催化生成α-酮酸的酶，反应由其本身自带的辅酶fad催化完成，因其表现出的优良催化效率和选择性，d-氨基酸氧化酶被广泛用于生物拆分l-氨基酸和α酮酸的生产。例如，d-氨基酸氧化酶转化头孢菌素c为戊二酰-7-氨基头孢烯酸。技术实现要素：本发明针对现有l-草铵膦工艺合成存在的缺陷，提供了一种d-氨基酸氧化酶突变体及其应用；该突变体具有高酶活、高转化率的特点，可高效制备4-(羟基甲基磷酰基)-2-羰基-丁酸，催化获得的产物收率高，产物可作为底物直接一锅法继续生产l-草铵膦。具体技术方案如下：一种d-氨基酸氧化酶突变体，为下列之一：(1)将seqidno.1所示氨基酸第213位的蛋氨酸突变为丝氨酸，第54位的天门冬酰胺突变为缬氨酸，第58位的苯丙氨酸突变为谷氨酰胺；(2)将seqidno.1所示氨基酸第213位的蛋氨酸突变为丝氨酸，第54位的天门冬酰胺突变为缬氨酸，第58位的苯丙氨酸突变为谷氨酰胺，第52位的甘氨酸突变为亮氨酸；(3)将seqidno.1所示氨基酸第213位的蛋氨酸突变为丝氨酸，第54位的天门冬酰胺突变为缬氨酸，第58位的苯丙氨酸突变为谷氨酰胺，第52位的甘氨酸突变为亮氨酸，第335位的丝氨酸突变为苏氨酸或甘氨酸。(4)将seqidno.1所示氨基酸第213位的蛋氨酸突变为丝氨酸，第54位的天门冬酰胺突变为缬氨酸，第58位的苯丙氨酸突变为谷氨酰胺，第335位的丝氨酸突变为甘氨酸。本发明通过构建d-氨基酸氧化酶突变体文库，获得了具有较高酶活和产物转化率的d-氨基酸氧化酶突变体，进而提供了d-氨基酸氧化酶重组菌在制备l-草铵膦前体2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸中的应用。本发明中，所述野生菌d-氨基酸氧化酶的ncbi登录号为alm22233.1；其氨基酸序列如seqidno.1所示，核苷酸序列如seqidno.2所示。作为优选，所述d-氨基酸氧化酶突变体为将seqidno.1所示氨基酸第213位的蛋氨酸突变为丝氨酸，第54位的天门冬酰胺突变为缬氨酸，第58位的苯丙氨酸突变为谷氨酰胺，第52位的甘氨酸突变为亮氨酸，第335位的丝氨酸突变为甘氨酸。本发明提供了一种所述d-氨基酸氧化酶突变体的编码基因。本发明还提供了所述编码基因的重组载体和基因工程菌。优选重组表达载体pet-24a(+)；宿主细胞优选大肠杆菌e.colibl21(de3)，通过蛋白诱导表达、细胞破碎，获得粗酶液。本发明还提供了所述的d-氨基酸氧化酶突变体在催化d,l-草铵膦或d-草铵膦合成4-(羟基甲基磷酰基)-2-羰基-丁酸中的应用。本发明还提供了一种制备4-(羟基甲基磷酰基)-2-羰基-丁酸的方法，包括：以d,l-草铵膦或d-草铵膦为底物，fad为辅酶，向缓冲溶液中加入过氧化氢酶后，在催化剂的作用下，进行反应，反应液分离纯化后，得到4-(羟基甲基磷酰基)-2-羰基-丁酸；所述催化剂为d-氨基酸氧化酶突变体或包含d-氨基酸氧化酶突变体基因的基因工程菌及其粗酶液。具体的，上述方法的添加方法为：配置一定浓度的d,l-草铵膦溶液，再以酶活力为单位，加入d-氨基酸氧化酶突变体或包含d-氨基酸氧化酶突变体基因的基因工程菌及其粗酶液，过氧化氢酶，恒温震荡，直至d-草铵膦完全氧化，经检测d-氨基酸氧化酶突变体催化特性。进一步地，反应体系中，d-氨基酸氧化酶的添加量为0.1～100u/l，过氧化氢酶的添加量为0.1～100u/l，底物的初始浓度为10～500mm。进一步地，反应的温度为30～50℃，时间为6～72小时；更优选的，反应温度为25～35℃，时间为6～24小时。进一步地，反应体系的ph值为6～9，缓冲溶液为磷酸盐缓冲液，反应过程中需要通入空气或氧气。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：(1)本发明通过利用随机突变及定点饱和突变技术对seqidno.2所示的d-氨基酸氧化酶基因进行突变，发现第52位、第54位、第58位、第213位和第335位是影响酶活的关键位点，获得酶活和产物转化率远高于野生型d-氨基酸氧化酶基因的突变体，提高了4-(羟基甲基磷酰基)-2-羰基-丁酸生产工艺中的收率；4-(羟基甲基磷酰基)-2-羰基-丁酸又可以被继续催化还原为l-草铵膦，进而实现d,l-草铵膦的原位去消旋化。(2)本发明提供的4-(羟基甲基磷酰基)-2-羰基-丁酸制备方法仅需添加2g/l的过氧化氢酶，显著降低了过氧化氢酶的添加量(一般为50g/l)，说明该氨基酸氧化酶突变体的过氧化氢耐受性高，有利于后续工业化应用。(3)本发明提供的4-(羟基甲基磷酰基)-2-羰基-丁酸制备方法能够直接以d,l-草铵膦为底物进行拆分，无需昂贵的拆分试剂，也无需合成草铵膦衍生物，更无需对d-草铵膦进行分离、再消旋、再拆分等步骤；在突变体e7的作用下，最高的转化率为48.4％(最大理论转化率为50％)为目前报道的最高水平，具有较好的应用价值。(4)本发明提供的4-(羟基甲基磷酰基)-2-羰基-丁酸制备方法克服了化学法合成l-草铵膦前体2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸的缺陷，是一种绿色，环保，低碳的工艺路线，适合大规模工业化生产应用。附图说明图1为d-氨基酸氧化酶催化d-草铵膦产生2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸以及氨气和过氧化氢的反应式。图2为产物2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸在不同介质，不同浓度下，与显色剂2，4-二硝基苯肼在380nm处的吸光值。图3为实施例7的反应进程图。图4为实施例7中d-氨基酸氧化酶菌体细胞液、粗酶液和纯酶的sds-page电泳图，其中，泳道1：10-180kda标准蛋白分子量；泳道2：200mm咪唑洗脱的纯酶；泳道3：粗酶液；泳道4：相同浓度的湿菌体。具体实施方式以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。本实验中的实验方法如无特别说明均为常规方法。上游基因工程所用试剂：本发明实施例中使用的基因组提取试剂盒、质粒提取试剂盒、dna纯化回收试剂盒购自康宁生命科学(吴江)有限公司；e.colidh5α、e.colibl21(de3)、质粒pet-24a(+)等购自上海旭冠生物科技发展有限公司；dnamarker、低分子量标准蛋白、蛋白胶等购自北京genstar有限公司；引物合成，序列测序工作由杭州擎科梓熙生物技术有限公司完成。以上试剂使用方法参考商品说明书。下游催化工艺所用试剂2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸(简称ppo)为实验室合成，也可市售获得；d,l-草铵膦购自sigma-aldrich公司；其他常用试剂购自国药集团化学试剂有限公司。下列实施例通过高效液相色谱(hplc)检测反应的进行产物的检测，并对产物进行分析。hplc分析方法为：色谱柱/c18；柱温/30℃；流速/1ml/min；检测波长/232nm；流动相：50mm(nh2)hpo4，加入1％的10％的四丁基溴化铵水溶液，用磷酸调ph至3.8，加入12％的乙腈。通过手性hplc分析方法检查草铵膦的两个构型含量。具体的，手性hplc分析方法为：色谱柱/pntulipsqs-c18；流动相/50mm乙酸铵溶液：甲醇＝9:1；检测波长/338nm；流速/1ml/min；柱温/30℃。衍生化试剂：分别称取0.1g邻苯二甲醛与0.12gn-乙酰-l-半胱氨酸，用10ml乙醇助溶，在加入40ml0.1m硼酸缓冲液(ph)9.8。振荡使其充分溶解，4℃冰箱保存备用(不超过3天)。衍生化反应与测定：取200μl样品加入400μl衍生化试剂，混匀至30℃保温5min，加入400μl超纯水混合，进样10μl进行分析。d-草铵膦(简称d-ppt)的结构式如式(1)所示；l-草铵膦(简称l-ppt)的结构式如式(2)所示；2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸(简称ppo)的结构式如式(3)所示。实施例1d-氨基酸氧化酶突变体文库的构建及筛选将d-氨基酸氧化酶基因(氨基酸序列seqidno.1所示，核苷酸序列为seqidno.2所示)构建表达载体pet-24a(+)，转化大肠杆菌，获得出发菌株e.colibl21(de3)/pet-24a。d-氨基酸氧化酶突变体文库的制备通过5轮突变来实现，引物设计如表1所示。具体方法如下：第一轮，以野生菌纤细红酵母菌(rhodotorulagracilis)的基因组为模板，以eppcr-f和eppcr-r为上下游引物，经易错pcr，转化，涂平板，通过优势菌株筛选、测序发现了有益突变位点213、54、58、52、335。第二轮，以野生菌纤细红酵母菌(rhodotorulagracilis)的基因组为模板，以m213-f和m213-r为上下游引物，经定点饱和突变、转化、涂平板，通过优势菌株筛选、获得d-氨基酸氧化酶突变体prtdaao-m213s。第三轮，以氨基酸序列seqidno.1对应的突变体prtdaao-m213s为模板，以n5458-f和n5458-r为引物，经定点饱和突变pcr，转化，涂平板，通过优势菌株筛选，获得d-氨基酸氧化酶突变体prtdaao-m213s-n54v-f58q。第四轮，以突变体prtdaao-m213s-n54v-f58q为模板，以g52-f和g52-r为引物，经定点饱和突变pcr，转化，涂平板，通过优势菌株筛选，获得d-氨基酸氧化酶突变体prtdaao-m213s-n54v-f58q-g52l。第五轮，以突变体prtdaao-m213s-n54v-f58q-g52l为模板，以s335-f和s335-r为引物，经定点饱和突变pcr，转化，涂平板，通过优势菌株筛选，获得d-氨基酸氧化酶突变体prtdaao-m213s-n54v-f58q-g52l-s335g。表1d-氨基酸氧化酶突变引物设计注：n5458是指第54位和第58位共用相同的引物。其中，pcr反应体系如下：2×phantamax缓冲液：25μl；dntps：1μl；上游引物：1μl；下游引物：1μl；模板：0.5μl；phantasuper-fidelitydna聚合酶：0.5μl；ddh2o：21μl。pcr反应条件如下：1)预变性：95℃3min；2)变性：95℃15s；退火：56℃-68℃30s；延伸：72℃6min；共循环30次3)后延伸：72℃10min；4)4℃保存。将pcr结果分别进行dna琼脂糖凝胶电泳阳性验证，结果显示扩增产物为单一条带，大小分别为6400bp左右。将pcr产物进行dpni酶消化模板。将pcr产物转化到大肠杆菌bl21中，首先吸取8ul的pcr产物，加入到bl21的感受态细胞中，冰浴30min，热击90s，冰浴3min，加600ul的lb培养基，培养1h，涂布于含50μg/ml卡那霉素抗性的lb平板上，37℃倒置培养过夜，挑取单菌落到96孔板中，进行培养，进行高通量筛选。实施例2高通量筛选方法的构建以d,l-草铵膦为底物，通过2，4-二硝基苯肼显色法筛选对d-草铵膦有催化活力的酶。定量称取d,l-草铵膦到50mmph＝8的磷酸盐缓冲液中，至于反应容器中，使得d,l-草铵膦的终浓度为50mm，粗酶液浓度为50g/l，过氧化氢酶浓度为2g/l。通过水浴控制反应温度为30℃，定时取样。通过2，4-二硝基苯肼显色法检测2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸的含量：取60μl的反应液，加入2mm的2，4-二硝基苯肼40μl，37℃恒温槽保温20分钟，加入100μl1m氢氧化钠，混匀30s，生成红棕色的化合物2，4-二硝基苯棕，并且，随着2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸浓度的升高，红棕色化合物颜色加深。对反应液进行全波长扫描，显示在380nm处有最大光吸收值，并在0.05-1mm范围内成线性。为了准确的测量出2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸和显色剂2，4-二硝基苯肼(dnph)在碱性条件下生成红棕色化合物的含量，分别测定了2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸在水，d,l-草铵膦溶液，铵根离子溶液和菌液为介质按上文所述方法与显色剂dnph反应后，在碱性条件下生成红棕色化合物的最大吸收波长。结果显示：2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸在四种不同介质下在380nm处均有最大光吸收值，并成线性关系，结果参见附图2。由此，确定该方法可以作为高通量筛选d-草铵膦氧化酶的有效方法。对实施例1中的突变体进行高通量筛选，得到优势菌株如下表表2d-氨基酸氧化酶突变体优势菌株对高通量筛选结果进行液相检测，液相检测条件：色谱柱c18(4.6×250mm)柱；流动相：将50mm磷酸二氢胺溶于800ml超纯水中，加入10ml四丁基氢氧化铵(10％)用水稀释并定容至1000ml,用磷酸调ph到3.8，与乙腈以88:12混合。流速：1ml/min，检测波长为232nm，进样量10μl，柱温30℃。选取e4,e5,e7,e8,e9进行液相检测，检测结果为e7>e8>e5>e9>e4，与高通量筛选结果一致。实施例3菌体的培养及突变体的纯化一、菌体的培养将含有d-氨基酸氧化酶基因的工程菌经平皿划线活化后，挑单菌落接种至含有50μg/ml卡那霉素的5mllb液体培养基中，37℃震荡培养12h。按2％的接种量转接至50ml同样含有50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中，37℃震荡培养至od600达到0.8左右时，加入终浓度为0.5mm的iptg，28℃下震荡培养16h。培养结束后，将培养液8000rpm离心10min，弃上清，收集菌体，放到-80℃超低温冰箱中保存，待用。二、粗酶液的制备将培养结束后收集的菌体用ph8的磷酸盐缓冲液(pbs(50mm))洗涤两次，之后，将菌体加入ph8的pbs(50mm)重悬细胞，在冰水混合物上破碎30次，超声破碎条件：功率为400w，破碎2s，间歇5s。将此细胞破碎液于4℃离心10min，去除沉淀，得到的上清，即为重组d-氨基酸氧化酶的粗酶液。三、d-氨基酸氧化酶的纯化将粗酶液与经上样缓冲液(ph8pbs(50mm)，其中包含500mmnacl、20mm咪唑)平衡过的ni亲和层析树脂结合后，再用冲洗缓冲液(50mm，ph8pbs，其中包含50mm咪唑、500mmnacl)冲洗至基本无杂蛋白，随后以洗脱缓冲液(50mm，ph8pbs，其中包含200mm咪唑、500mmnacl)洗脱并收集目的蛋白，电泳鉴定纯度后合并目的蛋白并以透析缓冲液(50mm，ph8pbs)透析24h，取截留液采用考马斯亮蓝法测定蛋白含量为2.7mg/ml，将酶液稀释至终浓度为0.5mg/ml分装，冻存于-80℃，即获得重组d-氨基酸氧化酶纯酶。所得d-氨基酸氧化酶菌体细胞液，粗酶液和纯酶的sds-page电泳图见附图4。实施例4d-氨基酸氧化酶活力的测定酶活定义:1961年国际酶学会议规定，1个酶活力单位是指在特定条件(30℃)下，在1分钟内转化1微摩尔底物的酶量，或是转化底物中的1微摩尔的有关基团的酶量。d-氨基酸氧化酶的酶活测定：取溶于50mm的磷酸盐缓冲液的底物溶液(100mmd,l-草铵膦)400μl，置于金属浴振荡器中，30℃保温10min，加入20μl纯酶，开始计时，30℃反应10min，加入20μl6m的盐酸，取出震荡混匀，反应终止，12000rpm离心3min，取上清，用去离子水稀释2倍，进行hplc检测。根据hplc测得的2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸浓度，计算酶活。表3酶活测定结果编号突变类型酶活(u/l)e4m213s-n54v-f58q2.28±0.3e5m213s-n54v-f58q-g52l4.63±0.14e7m213s-n54v-f58q-g52l-s335g5.96±0.22e8m213s-n54v-f58q-g52l-s335t5.01±0.07e9m213s-n54v-f58q-s335g3.21±0.2对照11.31±0.03对照21.29±0.07实施例5菌体的大规模制备因生产l-草铵膦及2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸的过程中，需要大量的生物催化剂，因此需要菌体大规模制备。所用培养基为lb培养基。将保藏有重组d-氨基酸氧化酶工程菌的甘油管经平皿划线活化后，挑单菌落接种至含有50μg/ml卡那霉素的50mllb液体培养基中，37℃震荡培养12h。按2％的接种量转接至1l同样含有50μg/ml卡那霉素的新鲜lb液体培养基中，37℃震荡培养至od600达到0.8左右时，加入终浓度为0.5mm的iptg，28℃下震荡培养16h。培养结束后，将培养液8000rpm离心10min，弃上清，收集菌体，放到-80℃超低温冰箱中保存，待用。粗酶液的制备见实施例2。实施例6d-氨基酸氧化酶(e7)制备2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸按照实施例5的方法培养能够表达d-氨基酸氧化酶(e7)的基因工程菌，离心收集细胞，并超声破碎制备粗酶液。定量称取d,l-草铵膦到50mmph＝8的磷酸盐缓冲液中，至于反应容器中，使得d,l-草铵膦的终浓度为50mm，粗酶液浓度为50g/l，仅需要加入2g/l过氧化氢酶。通过水浴控制反应温度为30℃，定时取样用非手性液相色谱检测ppo的生成量，同时用柱前衍生化高效液相色谱检测d-ppt的减少量与ee值。反应结束，数据如下：d-ppt剩余0.8mm，转化率48.4％(其中，最大理论转化率为50％)，ppo的生成浓度为20mm，产率为40％(其中，最大理论产率为50％)，反应后底物ee值达99％。实施例7d-氨基酸氧化酶(e9)制备2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸按照实施例5的方法培养能够表达d-氨基酸氧化酶(e9)的基因工程菌，离心收集细胞，并超声破碎制备粗酶液。定量称取d,l-草铵膦到50mmph＝8的磷酸盐缓冲液中，至于反应容器中，使得d,l-草铵膦的终浓度为50mm，湿菌体浓度为50g/l，仅需要加入2g/l过氧化氢酶。通过水浴控制反应温度为30℃，定时取样用非手性液相色谱检测ppo的生成量，同时用柱前衍生化高效液相色谱检测d-ppt的减少量与ee值。反应结束，数据如下：d-ppt剩余5.6mm,转化率38.8％(其中，最大理论转化率为50％)，ppo的生成浓度为12.8mm,产率为25.6％(其中，最大理论产率为50％)，反应后底物ee值达99％。实施例8d-氨基酸氧化酶(e8)制备2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸按照实施例5的方法培养能够表达d-氨基酸氧化酶(e8)的基因工程菌，离心收集细胞，并超声破碎制备粗酶液。定量称取d,l-草铵膦到50mmph＝8的磷酸盐缓冲液中，至于反应容器中，使得d,l-草铵膦的终浓度为50mm，湿菌体浓度为50g/l，仅需要加入2g/l过氧化氢酶。通过水浴控制反应温度为30℃，定时取样用非手性液相色谱检测ppo的生成量，同时用柱前衍生化高效液相色谱检测d-ppt的减少量与ee值。反应结束，数据如下：d-ppt剩余3.4mm,转化率43.2％(其中，最大理论转化率为50％)，ppo的生成浓度为15.6mm，产率为31.2％(其中，最大理论产率为50％)，反应后底物ee值达99％。实施例9d-氨基酸氧化酶(e5)制备2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸按照实施例5的方法培养能够表达d-氨基酸氧化酶(e5)的基因工程菌，离心收集细胞，并超声破碎制备粗酶液。定量称取d,l-草铵膦到50mmph＝8的磷酸盐缓冲液中，至于反应容器中，使得d,l-草铵膦的终浓度为50mm，湿菌体浓度为50g/l，仅需要加入2g/l过氧化氢酶。通过水浴控制反应温度为30℃，定时取样用非手性液相色谱检测ppo的生成量，同时用柱前衍生化高效液相色谱检测d-ppt的减少量与ee值。反应结束，数据如下：d-ppt剩余4.9mm，转化率40.2％(其中，最大理论转化率为50％)，ppo的生成浓度为13.9mm，产率为27.8％(其中，最大理论产率为50％)，反应后底物ee值达99％。实施例10d-氨基酸氧化酶(e4)制备2-羰基-4-[羟基(甲基)膦酰基]丁酸按照实施例5的方法培养能够表达d-氨基酸氧化酶(e4)的基因工程菌，离心收集细胞，并超声破碎制备粗酶液。定量称取d,l-草铵膦到50mmph＝8的磷酸盐缓冲液中，至于反应容器中，使得d,l-草铵膦的终浓度为50mm，湿菌体浓度为50g/l，仅需要加入2g/l过氧化氢酶。通过水浴控制反应温度为30℃，定时取样用非手性液相色谱检测ppo的生成量，同时用柱前衍生化高效液相色谱检测d-ppt的减少量与ee值。反应结束，数据如下：d-ppt剩余9.7mm，转化率30.6％(其中，最大理论转化率为50％)，ppo的生成浓度为13.9mm，产率为27.8％(其中，最大理论产率为50％)，反应后底物ee值达99％。对比例1按照实施例5的方法培养能够表达d-氨基酸氧化酶的基因工程菌，离心收集细胞，并超声破碎制备粗酶液。定量称取d,l-草铵膦到50mmph＝8的磷酸盐缓冲液中，至于反应容器中，使得d,l-草铵膦的终浓度为50mm，湿菌体浓度为50g/l，过氧化氢酶浓度为10g/l。通过水浴控制反应温度为30℃，定时取样用非手性液相色谱检测ppo的生成量，同时用柱前衍生化高效液相色谱检测d-ppt的减少量与ee值。反应结束，数据如下：d-ppt剩余13mm,转化率24％(其中，最大理论转化率为50％)，ppo的生成浓度为10.78mm,产率为21.56％(其中，最大理论产率为50％)，反应后底物ee值达99％。对比例2按照实施例5的方法培养能够表达d-氨基酸氧化酶(e3)的基因工程菌，离心收集细胞，并超声破碎制备粗酶液。定量称取d,l-草铵膦到50mmph＝8的磷酸盐缓冲液中，至于反应容器中，使得d,l-草铵膦的终浓度为50mm，湿菌体浓度为50g/l，过氧化氢酶浓度为10g/l。通过水浴控制反应温度为30℃，定时取样用非手性液相色谱检测ppo的生成量，同时用柱前衍生化高效液相色谱检测d-ppt的减少量与ee值。反应结束，数据如下：d-ppt剩余12.6mm，转化率24.8％(其中，最大理论转化率为50％)，ppo的生成浓度为11.8mm，产率为23.6％(其中，最大理论产率为50％)，反应后底物ee值达99％。序列表<110>浙江工业大学<120>一种d-氨基酸氧化酶突变体及其应用<160>12<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>368<212>prt<213>纤细红酵母菌(rhodotorulagracilis)<400>1methisserglnlysargvalvalvalleuglyserglyvalilegly151015leuserseralaleuileleualaarglysglytyrservalhisile202530valalaargaspleuprogluaspvalserserglnthrphealaser354045protrpalaglyalaasntrpthrprophemetserleuthraspgly505560proargglnalalystrpglugluleuthrphelyslystrpvalglu65707580leuvalprothrglyglnvalmettrpleulysglythrargargphe859095alaglnasngluaspglyleuleuglyhistrptyrlysaspilethr100105110proasntyrargproleuproserserglucysproproasnserile115120125glyvalthrtyraspthrleuservalhisalaprolystyrcysgln130135140tyrleualaargglyleuglnlysleuglyalathrphegluargarg145150155160thrvalthrservalgluglnalaphegluglyvalaspleuvalval165170175asnalathrglyleuglyalalysserilealaglyileaspaspgln180185190alaalagluproileargglyglnthrvalleuvallysseralacys195200205lysargcysthrmetaspserseraspproserserproalatyrile210215220ileproargproglyglygluvalilecysglyglythrtyrglyval225230235240glyasptrpaspleuservalasnprogluthrvalglnargileleu245250255lyshiscysleuargleuaspproserileserseraspglythrile260265270gluglyilegluvalleuarghisasnvalglyleuargproalaarg275280285argglyglyproargvalglualagluargleuvalleuproleuasp290295300argserlysserproleuserleuglylysglythrthrargalaala305310315320lysglulysgluvalthrleuvalhisalatyrglypheserserala325330335glytyrglnglnsertrpglyalaalagluaspvalalaleuleuval340345350gluglualapheglnargtyrhisglyalaalaarggluserlysleu355360365<210>2<211>1104<212>dna<213>纤细红酵母菌(rhodotorulagracilis)<400>2atgcacagccagaagcgtgtggttgtgctgggtagcggcgttatcggtctgagcagcgcg60ctgattctggcgcgtaaaggctacagcgttcacatcgtggcgcgtgacctgccggaggat120gtgagcagccagacctttgcgagcccgtgggcgggtgcgaactggaccccgtttatgagc180ctgaccgatggtccgcgtcaagcgaagtgggaggaactgaccttcaagaaatgggttgag240ctggtgccgaccggtcaggttatgtggctgaagggcacccgtcgttttgcgcaaaacgaa300gacggtctgctgggccactggtacaaagatatcaccccgaactatcgtccgctgccgagc360agcgagtgcccgccgaacagcattggtgttacctatgacaccctgagcgtgcacgcgccg420aagtactgccagtatctggcgcgtggtctgcagaaactgggcgcgaccttcgaacgtcgt480accgttaccagcgtggagcaggcgtttgaaggtgtggatctggttgtgaacgcgaccggt540ctgggtgcgaagagcatcgcgggtattgacgatcaggcggcggaaccgatccgtggccaa600accgttctggtgaagagcgcgtgcaaacgttgcaccatggacagcagcgatccgagcagc660ccggcgtacatcattccgcgtccgggtggcgaggttatttgcggtggcacctatggtgtg720ggcgactgggatctgagcgttaacccggaaaccgtgcaacgtatcctgaaacactgcctg780cgtctggacccgagcattagcagcgatggtaccatcgagggcattgaagttctgcgtcat840aacgttggcctgcgtccggcgcgtcgtggtggcccgcgtgttgaagcggaacgtctggtg900ctgccgctggaccgtagcaagagcccgctgagcctgggtaaaggcaccacccgtgcggcg960aaggagaaagaagttaccctggtgcacgcgtacggtttcagcagcgcgggctatcagcaa1020agctggggtgcggcggaggatgttgcgctgctggttgaggaagcgttccaacgttaccac1080ggcgcggcgcgtgaaagcaaactg1104<210>3<211>29<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><221>misc_feature<222>(17)..(18)<223>nisa,c,g,ort<400>3gtgcaaacgttgcaccnnkgacagcagcg29<210>4<211>29<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><221>misc_feature<222>(19)..(20)<223>nisa,c,g,ort<400>4ctcggatcgctgctgtcmnnggtgcaacg29<210>5<211>29<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><221>misc_feature<222>(4)..(5)<223>nisa,c,g,ort<220><221>misc_feature<222>(16)..(17)<223>nisa,c,g,ort<400>5gcgnnktggaccccgnnkatgagcctgac29<210>6<211>31<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><221>misc_feature<222>(8)..(9)<223>nisa,c,g,ort<220><221>misc_feature<222>(20)..(21)<223>nisa,c,g,ort<400>6gctcatmnncggggtccamnncgcacccgcc31<210>7<211>32<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><221>misc_feature<222>(23)..(24)<223>nisa,c,g,ort<400>7gacctttgcgagcccgtgggcgnnkgcggtgt32<210>8<211>33<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><221>misc_feature<222>(24)..(25)<223>nisa,c,g,ort<400>8tcattggcggggtccaaaccgcmnncgcccacg33<210>9<211>32<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><221>misc_feature<222>(20)..(21)<223>nisa,c,g,ort<400>9gcacgcgtacggtttcagcnnkgcgggctatc32<210>10<211>34<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><221>misc_feature<222>(23)..(24)<223>nisa,c,g,ort<400>10ccagctttgctgatagcccgcmnngctgaaaccg34<210>11<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11atgcacagccagaagcgtgtgg22<210>12<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12cagtttgctttcacgcgccgcg22当前第1页12