一种分泌抗AGR2的单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用的制作方法

本发明属于单克隆抗体领域，涉及一种稳定表达可特异性针对agr2(前梯度蛋白2)的单克隆抗体的细胞株以及该细胞株和产生的单克隆抗体的应用。
背景技术：
：agr2是非洲爪蟾（xenopus）前梯度蛋白-2（xag-2）在人类中的同源蛋白。在人体中agr2蛋白主要与腺体的分泌功能有关，因此在富含粘液或者具有分泌功能的一些组织器官中高表达，如结直肠、胃、乳腺和前列腺等。agr2蛋白属于pdi家族（蛋白质二硫键异构酶）中的一员，主要定位于内质网上，同时也能够被分泌到细胞外。在血清、尿液等体液标本中均能检测到分泌型agr2蛋白的存在。人们最早发现agr2与肿瘤相关是在乳腺癌中，随着研究的不断深入，人们发现agr2作为一个促癌分子与多种肿瘤的发生发展都有密切联系，agr2在肿瘤中的作用越来越受到人们的重视。在前期研究中发明人发现外源性agr2能够促进结直肠癌细胞的迁移，其表达量与肿瘤预后密切相关。此外有研究发现agr2可以与细胞外基质相互作用促进肿瘤发生发展。因此agr2可能成为一个潜在的肿瘤治疗靶点。因此有必要开发用于检测、靶向agr2的单克隆抗体，为癌症的诊断、治疗提供新的思路和工具，具有重要的意义及应用价值。本专利采用带有his标签的agr2全长蛋白免疫icr小鼠，因为免疫蛋白所携带的标签分子量较小，相对于mbp、gst等大分子标签来说免疫原性较低，产生的抗体特异性较好。此外采用的icr小鼠相关融合稳定性高，排异性小，后期产生的抗体稳定性较好。技术实现要素：本发明的目的之一在于提供一种分泌抗agr2蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。所述杂交瘤细胞株的分类命名为：小鼠杂交瘤细胞株，该细胞株于2018年08月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：中国北京。保藏中心登记入册编号为cgmccno.16288。本发明目的之二在于提供了一种能特异性地识别、靶向agr2蛋白的单克隆抗体10g11。该抗体由上述杂交瘤细胞株分泌。本发明目的之三在于提供了上述的针对agr2杂交瘤细胞或单克隆抗体的应用。上述杂交瘤细胞株在制备agr2蛋白检测或诊断相关药物及试剂中的应用；上述杂交瘤细胞株在制备治疗癌症的药物及制剂中的应用；上述单克隆抗体在制备agr2蛋白检测或诊断相关药物及试剂中的应用；上述单克隆抗体在制备治疗癌症的药物及制剂中的应用。本发明提供了一种制备agr2单克隆抗体的方法，主要包括以下步骤：1）重组表达载体的构建根据agr2开放阅读框序列，设计引物扩增agr2编码区，通过ecori和xhoi酶切位点插入到pet28a载体中，构建pet28a-agr2-his重组表达载体。）agr2重组蛋白的表达和纯化将步骤1）中构建好的重组表达载体转化至bl21感受态细菌中，iptg诱导蛋白表达，超声裂解细菌，离心获得蛋白上清。通过镍柱亲和层析柱纯化，获得纯化的agr2蛋白。）单克隆抗体的筛选与制备将步骤2)中纯化的agr2蛋白免疫icr雌鼠，经过初次免疫和加强免疫后，取小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞sp2/0融合，有限稀释法获得单克隆。通过elisa方法筛选出阳性杂交瘤细胞株，得到能够分泌针对agr2蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为10g11，亚型鉴定为igg1型。将杂交瘤细胞株接种至小鼠腹腔，收集小鼠腹水，通过proteina/g纯化抗体。本发明的优点在于：发明人通过上述方法制备得到的抗体能够有效检测结肠癌细胞如ht29及结肠癌组织中的agr2，特异性好。此外还可阻断agr2促进结肠癌的转移，具体为体外实验抑制结肠癌细胞的迁移。所述的结肠癌细胞包括sw48及ht29，体外转移实验采用本领域常见的实验方法确定，如附图2中的肿瘤迁移小室实验（transwell实验）。附图说明图1显示pet28a-agr2-c-his质粒克隆位点的设计图，其中阴影部分为agr2的编码区；图2显示agr2蛋白在菌液上清及沉淀中的表达结果；图3显示agr2蛋白表达及纯化结果；图4显示westernblot实验筛选小鼠血清中agr2抗体特异性识别agr2蛋白的结果；图5显示transwell实验筛选小鼠血清中agr2抗体阻断结肠癌细胞迁移的结果；图6显示westernblot实验筛选单克隆细胞株细胞上清中agr2抗体特异性识别结肠癌细胞中内源性agr2蛋白的结果；图7显示transwell实验筛克隆细胞株细胞上清中agr2抗体阻断结肠癌细胞迁移的结果；图8显示纯化的agr2抗体纯度检测结果；图9显示transwell实验验证agr2单克隆抗体可以阻断外源性agr2蛋白促进sw48细胞的迁移；图10显示transwell实验检测agr2单克隆抗体可以阻断分泌型agr2促进ht29细胞的迁移；图11显示westernblot实验检测agr2单克隆抗体特异性识别结肠癌细胞中内源性agr2蛋白的结果；图12显示免疫荧光实验检测agr2单克隆抗体特异性识别结肠癌细胞中内源性agr2蛋白的结果。具体实施方式按照说明书说描述的具体实施方案，本领域技术人员能够按照其描述再现其实施例并能制备其所述产物。说明书中的所有术语均采用本领域公知的专业术语（包括原料等的英文缩写），无法采用专业术语的，说明书会对所用术语进行解释及说明，使得本领域技术人员清楚其含义。除非特殊说明，说明书中所采用的技术手段均是本领域的常规技术，在已发表文献中均可查阅。实施例1agr2重组表达质粒的构建从ncbi网站获得agr2开放阅读框（orf）核苷酸序列。以人的基因组cdna为模板，分别以agr2-f、agr2-r为引物扩增agr2全长，回收目的片段，与酶切后的pet28a载体进行融合重组。载体的克隆位点设计图如图1所示，通过酶切位点ecori和xhoi，将agr2基因编码区插入到pet28a载体中，构建et28a-agr2-his重组表达载体。步骤1）目的基因引物设计设计合成以下引物，用于扩增agr2开放阅读框全长：agr2-f：atgggtcgcggatccgaattcatggagaaaattccagtgtc；agr2-r：gtggtggtggtggtgctcgagtcaattcagtcttcagcaact。步骤2）目的基因扩增以人基因组cdna为模板，分别以agr2-f、agr2-r为引物扩增agr2全长，扩增体系如下：扩增条件如下：95℃预变性3min；95℃变性15s、56℃退火15s、72℃延伸30s，共30个循环；最后72℃再延伸5min；步骤3）酶切载体用ecori和xhoi双酶切pet28a载体，37℃酶切1小时。酶切体系如下：步骤4）载体与目的基因连接将酶切后载体进行胶回收后与扩增的目的基因进行融合重组，37℃反应30分钟。重组体系如下：步骤5）质粒鉴定将上述步骤中连接产物转化至dh5α感受态细菌：从-80℃冰箱取50ul感受态细菌，冰上融化后，加入上述连接产物，冰置20min后，42℃水浴热激90s，继续冰置10min后加入1ml无抗性lb培养基，在37度摇床孵育45min后5000rpm离心3min收集适量菌液，涂布于含有卡那霉素抗生素的lb平板中，将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养；挑取单克隆菌落在含有卡那霉素的新鲜培养基中进行培养，提取质粒测序鉴定正确后将质粒保存在-20℃。实施例2agr2重组蛋白的表达与纯化步骤1）小量表达蛋白与鉴定取100ng构建好的pet28a-agr2-his质粒,转化至50ul的bl21感受态大肠杆菌中；冰置20min后42℃热激90s；继续冰置10min后加入无抗性的lb培养基；37度摇床孵育45min后5000rpm离心3min收集适量菌液，涂布于含有卡那霉素抗生素的lb平板中，将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养；挑取单克隆菌落在2ml含有卡那霉素的新鲜培养基中进行培养并保存适量菌液留做菌种，37℃，200rpm培养至od值达到0.5时加入终浓度为500um的iptg在30℃继续诱导表达6h；8000rpm离心2min收集菌体；用150ulpbs重悬菌体，冰上超声裂解细菌后于4℃，8000rpm离心15min，收集上清蛋白；将沉淀用ripa裂解液溶解提取蛋白；取50ul上清蛋白和沉淀蛋白加loadingbuffer后95℃煮5min，通过sds-page胶电泳鉴定，考马斯亮蓝染色。结果如图2所示，agr2蛋白大量表达于上清和沉淀中，后续选择超声后的上清用于大量纯化agr2蛋白。步骤2）大量表达蛋白取-80℃保存的转化有pet28a-agr2-his质粒的bl21菌种，接种到含卡那霉素抗性的lb培养中，37℃摇床培养活化16小时；将活化的菌液转接到含卡那霉素的400mllb培养基中，37℃培养至od值约0.5左右，加入500umiptg在30℃诱导表达6小时；8000rpm离心2min收集菌体，称量菌沉淀质量后加入适量pbs（含蛋白酶抑制剂），冰上超声裂解细菌；4℃，8000rpm离心15min，收集上清溶液。步骤3）蛋白纯化本发明中采用镍柱亲和层析柱法纯化蛋白。组装好层析柱，待镍柱静置分层后，用10倍柱体积bindingbuffer(10mm咪唑、20mmtris-hcl、500mmnacl)清洗并平衡镍柱，注意不要有气泡；将收集好的上清蛋白用0.45um的滤器过滤后，与bindingbuffer等体积混匀并上样到镍柱中，收集流穿液，重复上柱两次，以确保蛋白充分结合到镍柱；用10倍柱体积bindingbuffer再次平衡镍柱，洗去未结合杂蛋白；用elutionbuffer(250mm咪唑、20mmtris-hcl、500mmnacl)洗脱目的蛋白，分别收集后进行sds-page胶电泳鉴定。结果如图3所示，结果提示大部分蛋白均洗脱成功，于是将洗脱的蛋白液放置透析袋(规格3500)进行透析。透析液咪唑浓度从200mm开始逐渐将至30mm，每次稀释0.8倍，透析48小时后收集蛋白，测定浓度为400ng/ul，将蛋白分装放置-80℃保存。实施例3agr2单克隆抗体的筛选与制备将纯化的agr2蛋白以60ug/只的剂量对4只spf级icr雌鼠进行初次免疫，两周后以30ug/只剂量进行加强免疫，经过四次加强免疫后，眼眶取血，用elisa方法检测小鼠血清效价（表1）和westernblot检测血清特异性（图4），并用transwell方法测定小鼠血清阻断agr2的促迁移效果（图5）。选择血清效价最高并有阻断agr2促迁移作用的小鼠进行细胞融合实验；取小鼠脾细胞悬液与状态良好的sp2/0细胞，用peg法进行融合。融合后细胞在含有hat的半固体培养基中进行筛选培养。表1小鼠血清效价稀释倍数200400800160032006400128002560051200102400空白阴性agr2-11.1040.9710.8150.6040.4310.2730.1540.0920.0780.0620.0190.087agr2-21.0691.0780.990.8350.6710.5050.3380.1660.1360.0930.0210.083agr2-31.2921.2941.2341.1771.1010.9270.6880.4580.3460.2610.020.076agr2-40.2380.340.3340.2280.1490.1020.0720.0480.0590.0440.0440.078注：效价为大于最大od/2的最小od读数所对应的稀释度。步骤1）动物免疫(1)用纯化的agr2蛋白，按60ug蛋白/只小鼠的量，皮下初次免疫4只spficr雌性小鼠，编号为：1#、2#、3#、4#；(2)两周后进行皮下加强免疫，免疫量为30ug蛋白/只，共加强免疫4次。步骤2）elisa方法测定血清免疫效价(1)眼眶取血；(2)用纯化的agr2蛋白，2ug/ml，4°c包被过夜；(3)2%牛奶，37°c封闭2h；(4)用洗液洗涤3次，加入小鼠血清，小鼠血清从200倍开始2倍梯度稀释，空白对照（blank）为pbs，阴性对照（negative）为阴性血清200倍稀释；(5)用洗液洗涤3次。加入pbs稀释20000倍的二抗，100ul/孔，37℃孵箱，1h；(6)取出后用洗液洗涤3次；(7)显色，显色液100ul/孔，显色时间为5min左右。每孔加入50ul终止液终止；(8)双波长(450，630)测吸光值，记录保存数据。步骤3）westernblot筛选小鼠血清(1)将细胞用预冷的pbs洗两遍，加入ripa裂解液(含蛋白酶抑制剂)，吹吸混匀；(2)冰上超声裂解15s后冰置15min；12000rpm；(3)4℃离心15min后将上清转入新管并做好标记；(4)按照bca蛋白定量试剂盒进行蛋白定量，每个样品中加入蛋白上样缓冲液后于98℃金属浴5min；(5)经12%的page胶电泳后，180ma恒流电转100min；(6)用tbst配置的5%牛奶室温封闭1h；(7)一抗4℃孵育过夜。(8)tbst洗膜3次，每次5min后，室温孵育二抗1h，tbst洗膜后曝光。步骤4）血清阻断效果测定(1)结肠癌细胞sw48消化计数并制成合适的细胞悬液后，将transwell小室放入24孔无菌培养板中；(2)小室下层加入500ul新鲜完全培养基，实验组下层培养基中加入100ng/ml的agr2蛋白和适量小鼠血清；(3)小室上层加入细胞悬液200ul，加入细胞数量5万；(4)在培养箱中培养12小时后，取出小室并用4%多聚甲醛室温固定15分钟，然后结晶紫染色20分钟。用棉签轻轻擦拭小室上层没有穿过的细胞，用显微镜观察并拍照记录。结果如表1所示，agr2蛋白经过初次免疫和三次加强免疫小鼠后，3#小鼠的血清elisa效价最高；图4显示westernblot检测结果，3#小鼠的血清能检测出ht29细胞中agr2的表达，而sw48细胞中表达较少，这与文献报道一致；图5显示transwell实验结果，3#小鼠血清能够阻断外源性agr2对sw48细胞的促迁移作用。因此我们接下来选择3#小鼠进行细胞融合实验，在细胞融合之前，再进行腹腔冲击免疫一次。步骤5）细胞融合实验选择血清效价最高并有阻断agr2促迁移作用的小鼠，用免疫原50ugagr2蛋白，腹腔冲击该小鼠，然后准备细胞融合实验。(1)将状态良好的sp2/0细胞轻柔的从培养瓶壁上吹打下来，吸入到50ml离心管中；(2)小鼠摘眼球取血，然后拉颈处死，放入75％的酒精中浸泡5min；(3)在平皿中倒入少量无血清的imdm，将细胞筛及注射器内芯放入平皿中。用剪刀和镊子取下小鼠的脾脏，放到细胞筛上。用注射器的内芯轻轻地将脾充分碾碎，将碾好的细胞吸入到装sp2/0的离心管中，离心1500rad/min，5min；(4)用剪刀和镊子取下小鼠的胸腺，碾碎。将碾好的胸腺细胞到15ml离心管中，再加入2ml的hat，2ml的ht放在孵箱中备用；(5)将离心好的细胞，倒掉上清，用无血清的imdm将细胞小心轻柔地吹匀，离心（1500rad/min，5min）；(6)将离心好的细胞上清尽量倒掉。拍打离心管底充分悬浮细胞，将离心管放入37℃温水中，在1分钟内缓慢加入1ml的peg，加完后，在温水中静置1min。然后2min内缓慢加入2ml的无血清的imdm，接着2min内缓慢加入8ml无血清的imdm。离心（1000rad/min，5min）；(7)倒掉上清，加入10ml的血清，小心的将细胞吹匀，倒入前面准备好的胸腺细胞。再加入25ml灭过菌的半固体培养基，充分混匀。然后均匀倒入30个细胞培养皿中。将细胞培养皿放入湿盒中，然后放入孵箱中培养。步骤6）单克隆细胞初筛(1)融合细胞培养10天后，开始种板并挑选单克隆。将常规培养的杂交瘤细胞用胰酶消化并计数稀释后种于10个96孔板中，稀释标准为每孔仅有1个细胞；(2)培养5天后，对挑选的克隆采用elisa方法，进行第一次筛选。elisa实验操作步骤与此实例中步骤2）相似，不同之处在于此步骤中使用的一抗为单克隆细胞培养上清。结果如表2-表11所示，从10个96孔板中共筛选出24株阳性单克隆细胞株并进行编号标记。表2融合细胞板筛选(板1)123456789101112a0.0360.0140.0250.0210.01800.0410.0130.0340.0010.0010.021b0.0260.0010.0010.0010.00100.0010.0010.0010.0010.0010.028c0.0170.0190.0130.0100.0160.0140.0010.0070.0010.0070.001d0.0230.0170.020.0130.0120.3390.0120.0010.0010.01100.015e0.0150.0140.0170.0140.0220.0270.0220.010.0310.0070.0120.011f0.0140.0080.0180.0010.0010.0010.0080.010.0130.010.0010.031*g0.0250.0190.0170.010.0220.0140.0150.0150.0150.030.0140.011*h0.0170.1950.0380.0520.0660.1140.0410.0470.0110.0350.0340.659*注：加*的从上到下依次为阴性对照、空白对照和阳性对照；加粗字体为筛选的阳性克隆表3融合细胞板筛选(板2)123456789101112a0.0630.030.0260.0360.0340.0290.0410.0470.0530.0340.030.046b0.0260.0240.0180.0260.0250.0250.0350.0360.6440.0260.0240.028c0.0280.0190.0320.0110.0010.0150.0240.0230.0180.0160.0290.042d0.0220.0160.0210.0240.0220.0190.0230.0210.0310.0380.0180.03e0.0140.0140.0170.0140.0220.0270.0210.010.0210.0180.0250.033f0.0140.0080.0010.0010.00100.0090.0090.0130.0110.0010.031*g0.0150.020.0170.010.0220.0140.0150.0150.0160.030.0370.023*h0.0360.0240.0380.0630.0380.0290.1110.1040.060.0350.050.792*注：同表2表4融合细胞板筛选(板3)123456789101112a0.0360.0320.0250.0180.0190.0170.0260.0130.0280.0190.0190.024b0.0240.0010.0010.0010.0120.0010.0010.0010.0290.0010.0010.001c0.0170.0180.0140.010.0140.0120.0140.0080.0240.0090.0180.016d0.0240.0160.020.0130.0120.0180.0220.0120.1390.0110.0160.016e0.0250.0140.0140.0130.0110.0150.0220.0110.0220.0160.0230.029f0.0330.0250.0260.0210.0240.0240.0180.0090.0140.0230.0270.042*g0.0260.020.0170.010.0260.0140.0150.0160.0150.0230.020.029*h0.060.0410.0240.0260.0170.0440.0280.0130.0250.0670.0430.815*注：同表2表5融合细胞板筛选(板4)123456789101112a0.0360.0140.0250.0080.0010.0010.010.0130.0010.0010.0010.001b0.0010.0010.0010.0010.0010.0010.0010.0010.0010.0010.0010.001c0.0170.0180.0140.0110.0010.0010.0140.0010.0070.140.0070.016d0.0230.0170.020.0130.0110.0180.0130.0010.0010.0110.0010.001e0.0150.0140.0450.0140.0120.0150.0220.0110.0110.0160.0120.01f0.0330.0260.7350.0210.0140.0240.0180.010.0140.010.0140.042*g0.0250.0190.0170.010.0110.0140.0150.0150.0150.0080.0290.01*h0.0160.0130.0240.0130.0010.0840.0540.0130.1080.0160.0140.66*注：同表2表6融合细胞板筛选(板5)123456789101112a0.0340.030.0150.0170.0010.0130.020.0120.0170.0090.030.033b0.0080.0010.0010.0010.0010.0010.0010.0010.0010.0010.0010.001c0.010.0090.0070.010.0010.0150.0110.010.0180.0010.0120.02d0.0550.0170.0080.0010.0010.010.010.0070.0090.0010.0190.029e0.0150.0140.0160.0140.0010.0120.0210.010.0220.0180.0250.506f0.0140.0430.0010.0010.0010.0010.0080.0090.0120.0110.0010.017*g0.0150.020.0160.010.0010.0140.0150.0150.0160.0110.0150.023*h0.0220.0240.0260.0240.0010.030.0190.0280.0470.0170.0360.653*注：同表2表7融合细胞板筛选(板6)123456789101112a0.0510.030.0250.0170.0390.0250.020.0270.0360.0340.0290.056b0.0190.0010.00100.0010.0160.0150.0160.0210.0180.0170.036c0.0410.0090.0010.0110.0150.0150.0230.020.0180.0190.0120.021d0.2190.0160.0070.0010.0160.5190.0240.020.0190.0160.0190.029e0.3260.0140.0160.0140.020.0320.020.0260.0220.0170.0240.038f0.0510.0660.0250.0190.0270.0330.0360.0320.0540.0350.0370.065*g0.2060.5640.0970.0110.0180.0140.0150.0150.0160.0280.0330.023*h0.0340.2690.0620.0340.0340.030.0380.040.0360.0570.0361.007*注：同表2表8融合细胞板筛选(板7)123456789101112a0.0350.0310.330.0160.0250.0250.0290.0160.0150.0010.0160.024b0.0180.0010.00100.0010.0160.0010.0010.0010.0190.0010.001c0.0140.0090.0010.0120.0010.0140.0240.0010.0180.0010.0120.185d0.0210.0160.0070.0010.0010.020.0130.0110.010.0160.0080.009e0.0270.0140.0160.0130.0090.0220.020.0120.0220.0170.0240.018f0.0190.0160.0150.01900.0120.0140.0010.010.0130.0210.035*g0.0230.0140.0120.0110.0080.0140.0150.0140.0160.010.3040.022*h0.0340.0470.0160.0340.0170.0170.0380.0140.0170.0140.0150.779*注：同表2表9融合细胞板筛选(板8)123456789101112a0.0350.030.0220.0160.0120.0250.0290.0340.0140.0170.0150.024b0.0080.0070000.0160.0010.0010.0010.1160.0010.019c0.0140.0090.0010.01200.0140.010.0010.0180.0010.0110.023d0.0460.0260.01700.0010.2890.0130.0110.0110.0160.0090.02e0.0270.0140.3120.0130.0090.0220.020.0120.0110.0170.0230.018f0.0310.0170.0150.00100.0110.0140.0010.0110.0130.0210.035*g0.0230.0140.0120.0110.0080.0140.0140.0150.0160.010.0270.022*h0.0220.0220.0270.0170.0290.0170.0210.0260.0170.0480.0280.597*注：同表2表10融合细胞板筛选(板9)123456789101112a0.0350.030.0220.4630.0120.3190.0290.0120.0150.0080.0150.024b0.0080.0070.0010.0010.0010.0160.0010.0010.0010.0010.0010.001c0.0140.0090.0180.02300.0140.0110.0010.0180.0010.0110.022d0.0150.0770.0180.0010.0010.0370.0130.0110.0110.0910.0080.02e0.0270.0140.1360.0130.0090.0220.0310.0110.0110.0170.0230.029f0.0310.0960.4830.0170.020.0120.0140.0010.020.0340.030.036*g0.0230.0140.0120.010.0070.0140.0140.0140.0160.010.0270.011*h0.0770.0220.0270.0530.0130.0180.0210.0110.0170.0210.0280.596*注：同表2表11融合细胞板筛选(板10)123456789101112a0.0340.030.0210.0260.0130.0230.0290.0120.0150.0550.0160.532b0.0080.0020.001000.0160.3360.0010.0010.0010.0010.001c0.0140.0090.0180.0070.2750.0140.0110.0010.0180.0170.0110.001d0.0150.0130.0180.0010.0010.4070.0850.0110.0110.0010.0090.019e0.0270.0130.0150.0370.0090.0610.0150.0320.0110.0170.0240.012f0.0140.0090.0090.0170.0070.0110.0140.0070.0070.0090.0140.015*g0.0230.0130.0110.0110.0080.0140.0140.0150.0150.0520.470.012*h0.0230.0220.0140.0190.0130.0180.0210.0260.0160.0210.0280.617*注：同表2步骤7）单克隆细胞二筛将单克隆初筛得到的24株阳性细胞株，分别用agr2蛋白和标签蛋白包板，采用elisa方法，进行第二次筛选，进一步筛选阳性细胞株。结果如表12所示，agr2蛋白测定结果阳性且标签蛋白测定结果为阴性的单克隆细胞株共有5株，分别为2b9、4f3、7g11、9f3和10g11。表12对24个阳性克隆用agr2蛋白和标签蛋白进行elisa筛选编号1d61h22b94f35e126d16d66e16g16g26h27a3agr20.0360.0970.783*0.653*0.7030.0220.0150.0140.0260.750.0220.165标签0.0720.1290.039*0.027*0.8430.0410.0390.0320.0390.4810.0510.15编号7c127g118d68e39a49a69f310a1210b710c510d610g11agr20.0330.225*0.0010.0850.5850.1290.675*0.0010.6840.0910.0010.46*标签0.0680.039*0.020.0240.6390.0310.092*0.0310.90.0290.0380.077*对照阴性空白阳性agr20.0430.0180.453标签0.0550.0280.207注：标签指标签蛋白his；带*的为阳性克隆。步骤8）单克隆细胞亚类鉴定对上述筛选得到的5株阳性细胞株进行亚类鉴定。(1)用100mmpbs（ph7.4）稀释包被抗体至0.5ug/ml，每孔加0.1ml，4℃过夜；(2)pbst洗2次；每孔加入200ul封闭液，370c孵育2h；(3)pbst洗3次；每孔加入100ul杂交瘤上清，370c孵育1h；(4)pbst洗3次；用封闭液1：1000(κ，λ)或1：2000(其它的)稀释的hrp标记的抗体0.1ml每孔，分别加入适当的孔中，37℃孵育1h；(5)pbst洗3次；每孔加50ul底物溶液，10-20min内于双波长（450，630）测吸光值，记录保存数据。亚类鉴定结果如表13所示，得到4株igg类型阳性杂交瘤细胞株，为2b9、4f3、9f3和10g11。表13对5株阳性细胞株进行亚类鉴定igmigg1igg2aigg2bigg3iggaκλ2b90.1130.0260.5560.0790.060.1410.2890.1054f30.0830.0340.5290.0360.0460.0480.2520.1347g110.6760.020.0380.0230.0260.0350.3030.0969f30.0460.010.2610.020.0280.0280.2120.07210g110.060.9050.0260.0180.0350.0290.1820.073阴性对照0.0340.0010.0350.020.0240.0270.030.039步骤9）westernblot和transwell筛选单克隆细胞株此步骤中实验方法与本实例中前述实验方法相似，不同之处在于此步骤中使用的是单克隆细胞培养上清。图6显示westernblot检测结果，2b9、4f3和10g11能够检测出ht29细胞中内源性的agr2蛋白；更进一步的，使用transwell实验筛选这三种单克隆细胞株，图7结果显示10g11能够明显阻断外源性agr2对sw48细胞的促迁移作用。步骤10）单克隆抗体的纯化(1)我们挑选2b9、10g11杂交瘤细胞株接种至spf级小鼠腹腔内，一周后抽取小鼠腹水，用proteina/g进行纯化；(2)sds-page检测纯化后抗体纯度；(3)elisa检测抗体亲和常数。图8显示sds-page检测抗体纯度结果，两种抗体在重链区(55kda)和轻链区(25kda)均有清晰条带，可以看出抗体纯度大于90%；表14显示抗体亲和常数检测结果，可以计算得到2b9的亲和常数为3.95e+09，10g11的亲和常数为5.19e+08。表14elisa检测抗体的亲和常数200400800160032006400128002560051200102400204800空白2b91.4361.4321.3531.2611.191.0450.9120.7370.5620.4060.2820.03510g111.0481.0280.8780.7520.660.5860.4750.3640.2390.1250.0940.024注：亲和常数≈150000xa/抗体浓度；a=1/2od值所对应的稀释倍数。实施例4单克隆抗体的阻断效果采用transwell方法检测单克隆抗体的阻断效果，本实施例中实验方法与实施例3中步骤4）相似，不同之处在于本实施例中在sw48细胞下室加入的是纯化后的单克隆抗体2b9或10g11；另外由于ht29细胞高表达并分泌agr2，因此我们在ht29细胞的transwell实验中上室加入单克隆抗体，ht29上室细胞数为10万，在培养箱中培养72小时后取出小孔，固定、染色并拍照。结果如图9所示，纯化的两种单克隆抗体2b9和10g11均能够阻断外加agr2蛋白引起的sw48细胞迁移，但是10g11的阻断效果更明显，因此我们后续的实验选择的是10g11；从图10更进一步看出，单抗10g11能够明显阻断ht29细胞中分泌型agr2的促迁移作用。实施例5agr2单克隆抗体的特异性1）westernblot检测单克隆抗体的特异性本实例中实验方法与实例3中步骤4）相似，不同之处在于本实例中使用的一抗为纯化后的抗体，且抗体稀释比例为1:1000。结果如图11所示，单克隆抗体10g11可以检测到ht29细胞中高表达的agr2蛋白，并且特异性程度较高，这与实施例3中小鼠血清的检测结果和文献报道的结果一致。）免疫荧光检测单克隆抗体的特异性(1)胰酶消化结肠癌细胞ht29；(2)将圆形盖玻片放入24孔板中，pbs润洗一次；(3)将消化后的ht29细胞转入24孔板；(4)细胞贴壁后，吸弃培养基，pbs浸洗两次；(5)4%多聚甲醛室温固定15min，pbs浸洗三次；(6)0.2%tritonx-100细胞打孔15min，pbs浸洗三次；(7)含10%fbs的pbs室温封闭1h；(8)对照组加igg，实验组加单克隆抗体，1：200稀释，4℃孵育过夜；(9)pbs浸洗3次，加荧光二抗，室温孵育1h；(10)pbs浸洗3次，dapi染色20min，pbs浸洗2次后在激光共聚焦显微镜下观察并拍照记录。结果如图12所示，单克隆抗体10g11可以检测到ht29细胞内的agr2，而对照抗体检测结果阴性，这进一步表明了本发明中单克隆抗体10g11的特异性。序列表<110>华中科技大学同济医学院附属协和医院<120>一种针对agr2的单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用<160>2<210>1<211>528<212>dna<213>人(homosapiens)<221>cds<400>1atggagaaaattccagtgtcagcattcttgctccttgtggccctctcctacactctggcc60agagataccacagtcaaacctggagccaaaaaggacacaaaggactctcgacccaaactg120ccccagaccctctccagaggttggggtgaccaactcatctggactcagacatatgaagaa180gctctatataaatccaagacaagcaacaaacccttgatgattattcatcacttggatgag240tgcccacacagtcaagctttaaagaaagtgtttgctgaaaataaagaaatccagaaattg300gcagagcagtttgtcctcctcaatctggtttatgaaacaactgacaaacacctttctcct360gatggccagtatgtccccaggattatgtttgttgacccatctctgacagttagagccgat420atcactggaagatattcaaatcgtctctatgcttacgaacctgcagatacagctctgttg480cttgacaacatgaagaaagctctcaagttgctgaagactgaattgtaa528<210>2<211>175<212>prt<213>人(homosapiens)<400>2metglulysileprovalseralapheleuleuleuvalalaleuser151015tyrthrleualaargaspthrthrvallysproglyalalyslysasp202530thrlysaspserargprolysleuproglnthrleuserargglytrp354045glyaspglnleuiletrpthrglnthrtyrgluglualaleutyrlys505560serlysthrserasnlysproleumetileilehishisleuaspglu65707580cysprohisserglnalaleulyslysvalphealagluasnlysglu859095ileglnlysleualagluglnphevalleuleuasnleuvaltyrglu100105110thrthrasplyshisleuserproaspglyglntyrvalproargile115120125metphevalaspproserleuthrvalargalaaspilethrglyarg130135140tyrserasnargleutyralatyrgluproalaaspthralaleuleu145150155160leuaspasnmetlyslysalaleulysleuleulysthrgluleu165170175序列表<110>华中科技大学同济医学院附属协和医院<120>一种分泌抗agr2的单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用<160>2<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>528<212>dna<213>homosapiens<400>1atggagaaaattccagtgtcagcattcttgctccttgtggccctctcctacactctggcc60agagataccacagtcaaacctggagccaaaaaggacacaaaggactctcgacccaaactg120ccccagaccctctccagaggttggggtgaccaactcatctggactcagacatatgaagaa180gctctatataaatccaagacaagcaacaaacccttgatgattattcatcacttggatgag240tgcccacacagtcaagctttaaagaaagtgtttgctgaaaataaagaaatccagaaattg300gcagagcagtttgtcctcctcaatctggtttatgaaacaactgacaaacacctttctcct360gatggccagtatgtccccaggattatgtttgttgacccatctctgacagttagagccgat420atcactggaagatattcaaatcgtctctatgcttacgaacctgcagatacagctctgttg480cttgacaacatgaagaaagctctcaagttgctgaagactgaattgtaa528<210>2<211>175<212>prt<213>homosapiens<400>2metglyleuileprovalseralaproleuleuleuvalalaleuser151015thrthrleualaalaalathrthrvalleuproglyalaleuleuala202530thrleualaseralaproleuleuproglythrleuseralaglythr354045glyalaglyleuilethrthrglythrthrglyglyalaleuthrleu505560serleuthrseralaleuproleumetileilehishisleualagly65707580cysprohisserglyalaleuleuleuvalproalaglyalaleugly859095ileglyleuleualaglyglyprovalleuleualaleuvalthrgly100105110thrthralaleuhisleuserproalaglyglythrvalproalaile115120125metprovalalaproserleuthrvalalaalaalailethrglyala130135140thrseralaalaleuthralathrglyproalaalathralaleuleu145150155160leualaalametleuleualaleuleuleuleuleuthrglyleu165170175当前第1页12