一种淀粉蔗糖酶突变体及其制备方法与应用与流程

本发明涉及一种淀粉蔗糖酶突变体及其制备方法与应用，属于基因工程和酶工程领域。
背景技术：
：松二糖是由一分子葡萄糖和一分子果糖以α-1,3糖苷键连接形成的，其作为蔗糖的一种同分异构体，甜度仅为蔗糖的一半。它具有容易结晶、高度可溶、水解速率慢、易于与其他物质调和、不被致龋微生物发酵等特点，适于患有肥胖症、高血脂、高血压、糖尿病等人群食用。因此，在食品领域中松二糖具有成为新一代低热量的功能性甜味剂的潜力。此外，松二糖在医药领域也应用广泛，可作为酸性α-葡萄糖苷酶的抑制剂，用于庞贝氏病的医疗诊断；还具有消炎作用，可以抑制脂多糖与葡萄糖介导的炎症反应等，是一种具有高附加值的产品。目前酶法制备松二糖的报道仅有两种。一种方法是以α-环糊精和果糖的混合物为底物，利用环糊精葡萄糖基转移酶合成松二糖，所得松二糖的最高产率可达为45％。但该法所利用的底物的成本较高且另需糖化处理。另一种方法是以蔗糖为底物，利用淀粉蔗糖酶直接将蔗糖异构化为松二糖，该法底物的成本较低、工艺更简洁。淀粉蔗糖酶属于α-淀粉酶家族(gh13)，以蔗糖为天然底物，主要催化聚合和异构这两大转苷反应，而这两大转苷反应的发生依赖于初始蔗糖浓度。当蔗糖浓度较高时淀粉蔗糖酶会以催化异构反应为主，主要产物为松二糖；当蔗糖浓度较低时淀粉蔗糖酶则会以催化聚合反应为主，生成大量具有不溶性的α-1,4糖苷链及具有可溶性的麦芽低聚糖。因此，在松二糖的制备过程中，虽然聚合反应在一定程度上会被高浓度的蔗糖所抑制，但反应至蔗糖浓度减少时，聚合反应的发生还是会影响最终产物的产率。因此，获得一种聚合活性减弱的淀粉蔗糖酶突变体对于提高松二糖的转化率具有重要的工业应用潜力。技术实现要素：本发明所要解决的一个技术问题是提供一种催化异构化反应能力提升的淀粉蔗糖酶的突变体。本发明通过将出发氨基酸序列为seqidno.1的淀粉蔗糖酶第399位氨基酸由甘氨酸突变为丝氨酸，得到的淀粉蔗糖酶突变体，与亲本相比具有更高的松二糖转化效率。在本发明的一种实施方式中，所述淀粉蔗糖酶的来源为中度嗜热菌(deinococcusgeothermalis)。在本发明的一种实施方式中，所述淀粉蔗糖酶突变体的氨基酸序列如seqidno.2所示。本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种制备淀粉蔗糖酶突变体的方法，包括如下步骤：(1)在淀粉蔗糖酶氨基酸序列的基础上确定突变位点；设计定点突变的突变引物，以携带淀粉蔗糖酶基因的载体为模板进行定点突变；构建含突变体的质粒载体；(2)将突变体质粒转化进宿主细胞；(3)挑选阳性克隆进行发酵培养，制备酶液。在本发明的一种实施方式中，所述淀粉蔗糖酶的出发氨基酸序列如seqidno.1所述。在本发明的一种实施方式中，所述淀粉蔗糖酶的来源为中度嗜热菌(deinococcusgeothermalis)。在本发明的一种实施方式中，所述淀粉蔗糖酶突变体的氨基酸序列如seqidno.2所示。在本发明的一种实施方式中，所述质粒载体为puc系列，pet系列，或pgex中的任意一种。在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为细菌或真菌细胞。在本发明的一种实施方式中，所述的细菌为革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种制备松二糖的方法，所述方法是以蔗糖为底物，以蔗糖淀粉酶突变体为催化剂进行转化；所述蔗糖酶突变体是通过将出发氨基酸序列为seqidno.1的淀粉蔗糖酶第399位氨基酸由甘氨酸突变为丝氨酸得到的。在本发明的一种实施方式中，所述转化是在30～40℃的条件下进行45～50h。所述淀粉蔗糖酶突变体在制备含松二糖的产品方面的应用。有益效果：本发明构建了一种淀粉蔗糖酶突变体及其制备方法与应用，淀粉蔗糖酶突变体g399s是通过将来源于deinococcusgeothermalis的淀粉蔗糖酶第399位甘氨酸突变为丝氨酸得到的。将淀粉蔗糖酶突变体g399s应用于松二糖的生产，在35℃，ph7.0的条件下松二糖的转化率可达32.2％，是野生酶转化率的2倍。因此，本发明的淀粉蔗糖酶突变体能够应用于松二糖的制备中，使松二糖的转化率得到进一步的提高。附图说明图1：淀粉蔗糖酶突变体g399s转化体系中松二糖的hplc检测图。具体实施方式lb固体培养基：胰蛋白胨10g·l-1，酵母粉5g·l-1，氯化钠10g·l-1，琼脂粉20g·l-1。lb液体培养基：胰蛋白胨10g·l-1，酵母粉5g·l-1，氯化钠10g·l-1。tb培养基：胰蛋白胨12g·l-1，酵母粉24g·l-1，甘油5g·l-1，kh2po42.31g·l-1，k2hpo4·3h2o16.43g·l-1。pbs缓冲液：氯化钠8.18g·l-1，氯化钾0.2g·l-1，磷酸氢二钠1.42g·l-1，磷酸二氢钾0.25g·l-1，用2mol/l盐酸将ph调节至7.4。松二糖转化率的计算公式：(松二糖的质量/初始蔗糖的质量)×100％淀粉蔗糖酶的酶活测定方法：采用3,5-二硝基水杨酸法(dns)与还原糖显色的方法测定酶活。用50mmph7.0tris-hcl缓冲液配制0.3m蔗糖溶液，在具塞试管中加入1.9ml底物，于35℃水浴预热10min后加入0.1ml酶液，震荡混匀，反应30min后加入3mldns终止反应，随后煮沸7min并迅速用冰水冷却，最后向上述反应体系中加入10ml蒸馏水，并于540nm下测定吸光值。淀粉蔗糖酶的酶活定义：每分钟催化产生相当于1μmol果糖所需的酶量为一个活力单位。实施例1：重组菌构建根据ncbi上淀粉蔗糖酶dgas的氨基酸序列(pdbid：3uer)，采用化学合成法合成淀粉蔗糖酶的dgas基因。用于构建大肠杆菌的质粒是pet24a(+)，带有t7启动子。将pet24a(+)质粒和dgas基因分别用ndei和hindiii双酶切，酶切产物割胶回收后，再用t4连接酶连接，连接产物转化e.colijm109感受态细胞，得到重组细胞。将重组细胞经37℃培养培养8h，挑转化子在lb液体培养基(含30mg/l卡纳霉素)中震荡培养，提取质粒，酶切验证后得到表达质粒dgas/pet24a(+)。将质粒dgas/pet24a(+)转化e.colibl21(de3)宿主菌，涂布lb平板(含30mg/l卡纳霉素)，37℃培养8h，得到的重组菌命名为e.colijbl21(de3)/dgas/pet24a(+)。挑单菌落到lb液体培养基(含30mg/l卡纳霉素)中，37℃培养过夜，保存于甘油管中。实施例2：单突变体的制备根据实施例1中化学合成法合成的淀粉蔗糖酶的dgas基因序列，设计并合成引入g399s突变的引物，对淀粉蔗糖酶dgas基因进行定点突变，测定dna编码序列，鉴别出第399位的gly密码子变成ser密码子。将携带突变体基因的载体导入枯草芽孢杆菌、大肠杆菌或短小芽孢杆菌中进行表达，得到单突变淀粉蔗糖酶。g399s的定点突变：利用快速pcr技术，以携带野生型淀粉蔗糖酶的基因的表达载体dgas/pet24a(+)为模板。引入g399s突变的定点突变引物为：核苷酸序列为seqidno.3的正向引物：5’-gtcatgatgatattagctgggcaattagcg-3’(下划线为突变碱基)核苷酸序列为seqidno.4的反向引物：5’-cgctaattgcccagctaatatcatcatgac-3’(下划线为突变碱基)pcr反应体系均为：5×psbuffer10μl，dntpsmix(2.5mm)4μl，正向引物(10μm)1μl，反向引物(10μm)1μl，模板dna1μl，primerstarhs(5u/μl)0.5μl，加入双蒸水至50μl。pcr扩增条件为：94℃预变性4min；随后20个循环(98℃10s，55℃30s，72℃8min)；72℃继续延伸10min。pcr产物经dpnⅰ消化，转化大肠杆菌jm109感受态，感受态细胞在lb固体培养基(含30μg/ml卡纳霉素)培养过夜后，挑克隆于lb液体培养基(含30μg/ml卡纳霉素)中培养后提取质粒，所有突变质粒均测序正确，得到的重组菌命名为e.colijm109/dgas/pet24a(+)(g399s)。测序正确的突变体，从甘油管接种至lb培养基，过夜培养，提取质粒，将质粒转化表达宿主大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，突变质粒均测序正确，得到的重组菌命名为e.colijbl21(de3)/dgas/pet24a(+)(g399s)。实施例3：淀粉蔗糖酶突变体的发酵挑取重组菌e.colijbl21(de3)/dgas/pet24a(+)(g399s)于lb液体培养基(含30μg/ml卡纳霉素)生长8～10h，按5％接种量将种子发酵液接到tb培养基(含30μg/ml卡纳霉素)中，37℃摇床培养od600至0.2后，加入0.4mm异丙基β-d-1-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)进行诱导，于25℃下发酵24h后，将发酵液于4℃、8000rpm离心10min弃去上清，收集菌体至30od，并用ph7.4的pbs缓冲液复溶后进行高压匀浆破壁，8000rpm离心10min后收集上清液得到突变体粗酶液。采用同样方法，以实施例1中的重组菌e.colijbl21(de3)/dgas/pet24a(+)发酵得到的破壁酶液为野生酶粗酶液。将所得突变体粗酶液和野生酶粗酶液分别进行酶活测定。结果表明，突变体的酶活为1.5u/ml，野生酶的酶活为2.2u/ml。实施例4：hplc检测松二糖的产量在10ml的反应器中，加入2g蔗糖及2ml实例3中获得的破壁后的突变体粗酶液或野生酶粗酶液于35℃、初始ph7.0的条件下，在150rpm水浴摇床中反应48小时，反应结束后，煮沸10min使酶失活，12000rpm离心10min，收集上清，用50％(v/v)乙腈溶液稀释至4倍，最后用0.22μm的滤头过滤。所得滤液作为样品通过hplc色谱来测定松二糖的含量，产物吸收峰如图1所示。hplc色谱分析检测的条件为：agilent1200hplc色谱仪，agilent示差检测器，色谱柱4.6mm×250mm5μmsyncronisaminocolumn，流动相为80％(v/v)的乙腈溶液，流速0.8ml/min，柱温35℃。结果见表1，单突变体g399s生产松二糖的转化率为32.2％，是野生酶转化率的2倍。表1野生酶以及突变体生产松二糖的转化率酶生产松二糖的转化率％野生酶15.8g399s32.2虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。sequencelisting<110>江南大学<120>一种淀粉蔗糖酶突变体及其制备方法与应用<160>4<170>patentinversion3.3<210>1<211>650<212>prt<213>deinococcusgeothermalis<400>1metleulysaspvalleuthrsergluleualaalaglnvalargasp151015alapheaspaspaspargaspalagluthrpheleuleuargleuglu202530argtyrglygluaspleutrpgluserleuargalavaltyrglyasp354045glnvalargalaleuproglyargleuleugluvalmetleuhisala505560tyrhisalaargproalagluleuargargleuaspglualaargleu65707580leuargproasptrpleuglnargproglumetvalglytyrvalala859095tyrthraspargphealaglythrleulysglyvalglugluargleu100105110asptyrleugluglyleuglyvallystyrleuhisleumetproleu115120125leuargproarggluglygluasnaspglyglytyralavalglnasp130135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