L-谷氨酸氧化酶固体酶制剂及其制备方法与流程

本发明涉及酶制剂应用
技术领域：
，更具体地，本发明公开了l-谷氨酸氧化酶固体酶制剂及其制备方法。
背景技术：
：酶制剂是一种具有生物催化性能的蛋白质，在催化加工过程中的化学反应得到的生物活性物质即生物制剂，加工成不同纯度和剂型的生物酶制剂，其主要用于催化生产过程中的各种化学反应，具有催化效率高、高度专一性、作用条件温和、降低能耗、减少化学污染等特点，并应用领域遍布各个行业。由于生物制品的高效性，具有很高的应用价值，但是其易受温度、ph等环境因素的影响，所以人们采用低温的方式进行保存生物制品；真空冷冻干燥法所涉及的低温储藏与冻干技术是在生物学领域的重要的技术，而且近些年被广泛应用于食品，同时也是商品化的一种有力手段，冷冻干燥较耗能低，经济成本上非常有优势；但是冷冻干燥技术存在生产周期长、能耗高、生产成本高等缺点，从而限制了其广泛应用，所以除了控制冻干时的影响因素外，添加一些冻干保护剂的方式降低活性的损耗，同时开可以提高生物制品的贮存稳定性。l-谷氨酸氧化酶(ec1.4.3.1)是以fad为辅酶的一种黄素酶，能在不添加外源性辅助因子的条件下氧化l-谷氨酸脱氨，生成氨、α-酮戊二酸和过氧化氢。根据氧气的消耗量或过氧化氢的生成量，可以用于检测l-谷氨酸及其相关偶联反应；在临床生化检验中，l-谷氨酸氧化酶可用于检测谷丙转氨酶、谷草转氨酶和γ-谷氨酰基转移酶活性以及血氨、肌酐等含量；在生物传感器中，将l-谷氨酸氧化酶固定在不同载体上，并结合流体注射分析系统、微渗析等技术，使得l-谷氨酸含量的测定方便、快速、高准确度。因而高活力、酶学性质稳定的l-谷氨酸氧化酶是其大规模应用不可缺少的关键因素。l-谷氨酸氧化酶作为生物催化剂，虽然具有专一性强、反应条件温和等优点，但由于其成本高、稳定性差，保存困难，大大妨碍了它的应用；因此将谷氨酸氧化酶制成稳定态的酶制剂，可以提高其在食品加工、α-酮戊二酸的生产、生物传感器等行业的应用前景。技术实现要素：本发明第一个方面提供一种酶制剂的制备方法，包括预处理、预冻、速冻以及真空干燥的步骤；其中，所述酶制剂的制备原料包括保护剂与l-谷氨酸氧化酶酶液。作为本发明的一种优选技术方案，其中，保护剂选自甘油、甘露醇、二硫苏糖醇、山梨醇、鼠李糖脂中的任一种或多种的组合。作为本发明的一种优选技术方案，其中，保护剂与l-谷氨酸氧化酶酶液的质量比为(1～20)：(80～99)。作为本发明的一种优选技术方案，其中，预处理为保护剂与l-谷氨酸氧化酶酶液混合。作为本发明的一种优选技术方案，其中，预冻过程的预冻温度为-5～-25℃，预冻时间为0.5～2h。作为本发明的一种优选技术方案，其中，速冻过程的速冻温度为-30～-65℃，速冻时间为0.25～1h。作为本发明的一种优选技术方案，其中，真空干燥过程的真空度为1～10pa，真空干燥的温度为-10～-60℃。本发明第二个方面提供一种利用所述制备方法得到的酶制剂。作为本发明的一种优选技术方案，其中，酶制剂为粉体材料。本发明第三个方面提供了所述酶制剂的应用，所述酶制剂应用于催化l-谷氨酸氧化酶生成α-酮戊二酸、氨和过氧化氢；所述酶制剂也应用于测定谷氨酸或制成测定谷氨酸的生物传感器。有益效果：本发明所设计的固体酶制剂，由保护剂和谷氨酸氧化酶液组成，经过预处理，预冻(低温处理)，速冻，真空干燥，将酶液制成粉体材料，可大大减小酶制剂的体积，且添加保护剂可提高酶稳定性，方便保存和运输；该制备方法的能耗低，工艺简单，产品成本低，制备过程中的酶蛋白的变性和物料损失少；颗粒产品的容重、强度和流动性好、吸湿性低粉尘极少。附图说明图1：保护剂含量对酶制剂的性能影响；图2：冷冻方式对酶制剂的性能影响；图3：酶制剂在保存过程中酶活率测定；图4：固体酶制剂的热稳定性研究；图5：固体酶制剂的ph稳定性研究。具体实施方式本发明第一个方面提供一种酶制剂的制备方法，包括预处理、预冻、速冻以及真空干燥的步骤；其中，所述酶制剂的制备原料包括保护剂与l-谷氨酸氧化酶酶液。在一种实施方式中，所述保护剂选自甘油、甘露醇、二硫苏糖醇、山梨醇、鼠李糖脂中的任一种或多种的组合；优选地，所述保护剂为山梨醇。申请人通过实验发现，在冷冻干燥过程中，不添加保护剂的酶制剂酶活性不能得到很好的保持，而于酶液中添加保护剂可以有效减少酶活性的降低，这可能是由于保护剂与蛋白质表面形成物理作用力，使其在缺水条件下仍能保持稳定的结构，不丧失活性；此外，还有可能抑制冷冻干燥过程中ph的剧烈变化，减少蛋白质失活变性；也可能与蛋白质形成高粘度的玻璃态物质，降低其扩散系数，减慢其亚稳态的构象互变和构象松弛，抑制蛋白质的伸展和聚集，使其空间结构得以维持。此外，申请人在实验过程中也意外发现，甘露醇对酶制剂酶活性保持最佳，且其得到的产品外观为白色海绵状疏松结构，很易与器壁剁离，轻轻揉搓可成为粉末，具有较好的品质。在一种实施方式中，所述保护剂与l-谷氨酸氧化酶酶液的质量比为(1～20)：(80～99)；优选地，所述保护剂与l-谷氨酸氧化酶酶液的质量比为(2～5)：(95～98)；更优选地，所述保护剂与l-谷氨酸氧化酶酶液的质量比为2.5:97.5。在一种实施方式中，所述l-谷氨酸氧化酶酶液为l-谷氨酸氧化酶的磷酸盐缓冲液；优选地，所述l-谷氨酸氧化酶的磷酸盐缓冲液的浓度为0.1～2mol/l；更优选地，所述l-谷氨酸氧化酶的磷酸盐缓冲液的浓度为1mol/l。在一种实施方式中，所述l-谷氨酸氧化酶购自sigma公司，cas号：39346-34-4。申请人通过实验也能够发现，当保护剂与l-谷氨酸氧化酶酶液的质量比为(1～20)：(80～99)是，所得酶制剂的酶活性较佳，这可能由于当保护剂含量太多时，体系粘度较大，一方面延长冷冻、干燥时间，另一方面所得粉体材料容易与管壁结合，不易玻璃，提高加工成本，也破坏了粉体原有的结构。在一种实施方式中，所述预处理为保护剂与l-谷氨酸氧化酶酶液混合。在一种实施方式中，所述预冻过程的预冻温度为-5～-25℃，预冻时间为0.5～2h；优选地，所述预冻过程的预冻温度为-10～-20℃，预冻时间为0.8～1.5h；更优选地，所述预冻过程的预冻温度为-15℃，预冻时间为1h。在一种实施方式中，所述速冻过程的速冻温度为-30～-65℃，速冻时间为0.25～1h；优选地，所述速冻过程的速冻温度为-50℃，速冻时间为0.5h。保护剂与酶液的混合物预处理后一般要先进行预冻，这是由于酶液水分较多时，若直接进行抽真空处理，会使溶解在水中的气体因外界压力减小而逸出，形成气泡，导致酶粉末出现空洞，影响制剂质量。另一方面，通过实验可以发现，通过速冻过程所得酶制剂的酶活性较好，这可能是由于速冻过程中，形成细微冰晶呈树枝不规则形状或球型，细胞小，冰晶小，外观好，间隙小，且升华时的阻力大；升华速度较慢，制得产品疏松易溶，且成品引湿性也较大，复水性好，对于酶类或活菌的保存有利；而慢冻过程，所得晶格较大，冰晶呈六角对称型，所得成品对酶类或活菌的保存不利。在一种实施方式中，所述真空干燥过程的真空度为1～10pa，真空干燥的温度为-10～-60℃；优选地，所述真空干燥过程的真空度为1.3～8pa，真空干燥的温度为-10～-50℃；更优选地，所述真空干燥过程的真空度为5pa，真空干燥的温度为-45℃。在一种实施方式中，所述真空干燥时间为5～12h；优选地，所述真空干燥时间为9h。在制备过程中需要保持所述真空干燥过程的真空度为1～10pa，真空干燥的温度为-10～-60℃，否则会造成物品污染或者产品制备失败的可能。优选地，在一种实施方式中，一种酶制剂的制备方法如下：(1)预处理：将保护剂与l-谷氨酸氧化酶酶液按照重量比为2.5:97.5混合均匀；(2)预冻：在温度为-15℃的条件下预冻1；(3)速冻：在温度为-50条件下预冻0.5h；(4)真空干燥：在真空度为5pa，温度为-45℃干燥9h。本发明第二个方面提供一种利用所述制备方法得到的酶制剂。在一种实施方式中，所述酶制剂为粉体材料。将酶液制成固体酶制剂产品，可大大减小酶液的体积，且添加保护剂可提高酶稳定性，方便保存和运输。本发明第三个方面提供了所述酶制剂的应用，所述酶制剂应用于催化l-谷氨酸氧化酶生成α-酮戊二酸、氨和过氧化氢；所述酶制剂也应用于测定谷氨酸或制成测定谷氨酸的生物传感器。实施例1本发明实施例1提供一种固体酶制剂，其制备方法为：(1)预处理：将保护剂与l-谷氨酸氧化酶酶液按照重量比为2.5:97.5混合均匀；(2)预冻：在温度为-15℃的条件下预冻1；(3)速冻：在温度为-50条件下预冻0.5h；(4)真空干燥：在真空度为5pa，温度为-45℃干燥9h；所述保护剂为山梨醇；所述l-谷氨酸氧化酶酶液为1mol/ll-谷氨酸氧化酶的磷酸盐缓冲液。实施例2本发明实施例2提供一种固体酶制剂，其制备方法为：(1)预处理：将保护剂与l-谷氨酸氧化酶酶液按照重量比为2.5:97.5混合均匀；(2)预冻：在温度为-15℃的条件下预冻1；(3)速冻：在温度为-50条件下预冻0.5h；(4)真空干燥：在真空度为5pa，温度为-45℃干燥9h；所述保护剂为甘油；所述l-谷氨酸氧化酶酶液为1mol/ll-谷氨酸氧化酶的磷酸盐缓冲液。实施例3本发明实施例3提供一种固体酶制剂，其制备方法为：(1)预处理：将保护剂与l-谷氨酸氧化酶酶液按照重量比为2.5:97.5混合均匀；(2)预冻：在温度为-15℃的条件下预冻1；(3)速冻：在温度为-50条件下预冻0.5h；(4)真空干燥：在真空度为5pa，温度为-45℃干燥9h；所述保护剂为甘露醇；所述l-谷氨酸氧化酶酶液为1mol/ll-谷氨酸氧化酶的磷酸盐缓冲液。实施例4本发明实施例4提供一种固体酶制剂，其制备方法为：(1)预处理：将保护剂与l-谷氨酸氧化酶酶液按照重量比为2.5:97.5混合均匀；(2)预冻：在温度为-15℃的条件下预冻1；(3)速冻：在温度为-50条件下预冻0.5h；(4)真空干燥：在真空度为5pa，温度为-45℃干燥9h；所述保护剂为二硫苏糖醇；所述l-谷氨酸氧化酶酶液为1mol/ll-谷氨酸氧化酶的磷酸盐缓冲液。实施例5本发明实施例5提供一种固体酶制剂，其制备方法为：(1)预处理：将保护剂与l-谷氨酸氧化酶酶液按照重量比为2.5:97.5混合均匀；(2)预冻：在温度为-15℃的条件下预冻1；(3)速冻：在温度为-50条件下预冻0.5h；(4)真空干燥：在真空度为5pa，温度为-45℃干燥9h；所述保护剂为鼠李糖脂；所述l-谷氨酸氧化酶酶液为1mol/ll-谷氨酸氧化酶的磷酸盐缓冲液。实施例6本发明实施例6提供一种固体酶制剂，其制备方法为：(1)预处理：将l-谷氨酸氧化酶液搅拌均匀；(2)预冻：在温度为-15℃的条件下预冻1；(3)速冻：在温度为-50条件下预冻0.5h；(4)真空干燥：在真空度为5pa，温度为-45℃干燥9h；所述l-谷氨酸氧化酶酶液为1mol/ll-谷氨酸氧化酶的磷酸盐缓冲液。实施例7本发明实施例7提供一种酶制剂，其具体实施方式同实施例1，不同之处在于，所述保护剂与l-谷氨酸氧化酶酶液按照重量比替换为1.25：98.75。实施例8本发明实施例8提供一种酶制剂，其具体实施方式同实施例1，不同之处在于，所述保护剂与l-谷氨酸氧化酶酶液按照重量比替换为5：95。实施例9本发明实施例9提供一种酶制剂，其制备方法为：(1)预处理：将保护剂与l-谷氨酸氧化酶酶液按照重量比为2.5:97.5混合均匀；(2)慢冻：在温度为-20条件下预冻12h；(3)真空干燥：在真空度为5pa，温度为-45℃干燥9h；所述保护剂为山梨醇；所述l-谷氨酸氧化酶酶液为1mol/ll-谷氨酸氧化酶的磷酸盐缓冲液。实施例10本发明实施例10提供一种酶制剂，其具体实施方式同实施例9，不同之处在于，将山梨醇替换为甘油。实施例11本发明实施例11提供一种酶制剂，其具体实施方式同实施例9，不同之处在于，将山梨醇替换为甘露醇。实施例12本发明实施例12提供一种酶制剂，其具体实施方式同实施例9，不同之处在于，将山梨醇替换为二硫苏糖醇。实施例13本发明实施例13提供一种酶制剂，其具体实施方式同实施例9，不同之处在于，将山梨醇替换为鼠李糖脂。性能评估利用苯胺显色法进行检测谷氨酸氧化酶的活力。将辣根过氧化物酶，4-氨基安替吡啉，苯胺，谷氨酸、磷酸缓冲液和适量酶，于37℃下反应10min，测定其在550nm下的吸光值变化，以吸光值的变化来表示l-谷氨酸氧化酶的酶活力大小；其中，一个酶活力单位定义：37℃下1min反应生成1μmol过氧化氢所需的酶量，并以灭活酶液在不同的温度条件下测定的酶活力作为对照，计算其相对酶活力(以最高酶活为100％)。1.不同保护剂对酶制剂的性能影响：利用上述方法测定实施例1～6的l-谷氨酸氧化酶酶液与所得酶制剂的酶活性，从而测定实施例1～6的剩余酶活性概率，并观察所得酶制剂的外观结构，结果见表1。2.保护剂含量对酶制剂的性能影响：利用上述方法测定实施例1、实施例6～8的l-谷氨酸氧化酶酶液与所得酶制剂的酶活性，进一步判断剩余酶活性概率，从而判断保护剂含量对酶活性保持率的影响，结果见图1。3.冷冻方式对酶制剂的性能影响：利用上述测定方法测定实施例1～5、实施例9～13的l-谷氨酸氧化酶酶液与所得酶制剂的酶活性，从而测定实施例1～5、实施例9～13的剩余酶活性概率，结果见图2。4.酶制剂在保存过程中酶活率测定：分别将等量的l-谷氨酸氧化酶酶液、实施例1、6所得酶制剂于4℃冷藏条件保存一个月，并用上述相同的方法测定其剩余酶活性概率，结果见图3。5.固体酶制剂的热稳定性研究：分别在27,32,37,42,47,52℃温度下测定l-谷氨酸氧化酶酶液和实施例1的相对酶活性，以及测定l-谷氨酸氧化酶酶液和实施例1在37℃下保存2、4、6、8、10h下的相对酶活性，结果见图4，其中l-谷氨酸氧化酶酶液记为游离酶液，实施例1记为固体酶制剂。6.固体酶制剂的ph稳定性研究：分别在不同ph下测定l-谷氨酸氧化酶酶液和实施例1的相对酶活性；以及测定l-谷氨酸氧化酶酶液和实施例1置于不同ph的缓冲液中6.0h下的相对酶活性，结果见图5，其中，l-谷氨酸氧化酶酶液记为游离酶液，实施例1记为固体酶制剂。此外，通过以上5、6步骤的测试，可以得到l-谷氨酸氧化酶酶液和实施例1所得酶制剂性能之间的区别，见表2。表1表2l-谷氨酸氧化酶酶液实施例1酶活(u/ml)3296.5最适温度(℃)4242温度耐受性(37℃,6h)酶活力保持70％酶活力保持82％最适ph66ph耐受性(12h)酶活会迅速下降或上升ph5.0-7.0，酶活保持在80％通过实验我们可以看出：首选，甘露醇、山梨醇、二硫苏糖醇、甘油均对酶液活性有一定的保护作用，而山梨醇显示出了优于其他保护剂的保护作用，得到的产品外观为白色海绵状疏松结构，很易与器壁剁离，轻轻揉搓可成为粉末，具有较好的品质；且鼠李糖脂没有起到有效的保护作用，而且酶制剂产品的表面出现油状物质，甚至结块凝结，影响了产品的品质；其次，酶制剂体系中保护剂的含量对酶活性及其保持有一定的影响，在本实验中添加2.5％的山梨醇就可以有效的保护酶液可以保证在干燥过程中不失活。我们也可以通过实验发现冷冻方式对酶制剂的品质也有较大的影响，本发明提供的冻结、干燥方法可以有效保持酶制剂的活性及其保持性能；且通过实验发现不经冷冻干燥的酶液保存一个月后滋长了微生物菌群，显著失活，剩余酶活为48％；不加保护剂的固体酶粉剂在保存一个月后部分失活，剩余酶活力为28％；而加入保护剂的固体酶粉剂表现出良好的稳定性，一个月后仍能保持82％的活性，因此谷l-氨酸氧化酶酶粉剂的制备为谷氨酸氧化酶的贮存，运输和应用奠定了基础。在实验过程中可以看出，由4中的a可知固体酶制剂和l-氨酸氧化酶游离酶液的最适温度并没有变化，仍保持在42℃，且酶活变化趋势相似，并无明显的变化，说明冻干工艺并未使酶促反应的最适温度发生改变；由图4中的b可知，在37℃保温10h后游离酶和固体酶制剂相对酶活分别为60％和72％，可以表明本发明提供的酶制剂在37℃条件下的热稳定性强于l-氨酸氧化酶游离酶的稳定性。另一方面，由图5中的a可知，l-氨酸氧化酶游离酶酶液与固体酶制剂的最适ph均在ph6.0并未变化；图5中的b可知游离酶对于ph的变化表现较固体酶制剂的更为敏感，当ph稍有变化时，酶活会迅速下降或上升，固体酶制剂在ph5-7下放置6h后相对酶活力仍保持在80％以上，固体酶制剂的ph稳定性较游离酶有所提高。前述的实例仅是说明性的，用于解释本发明所述方法的一些特征。所附的权利要求旨在要求可以设想的尽可能广的范围，且本文所呈现的实施例仅是根据所有可能的实施例的组合的选择的实施方式的说明。因此，申请人的用意是所附的权利要求不被说明本发明的特征的示例的选择限制。在权利要求中所用的一些数值范围也包括了在其之内的子范围，这些范围中的变化也应在可能的情况下解释为被所附的权利要求覆盖。当前第1页12