一种用于防治牙龈炎的卵黄抗体夹心含片及其制备方法与流程

本发明属于免疫学技术领域。具体地，涉及一种用于防治牙龈炎的卵黄抗体夹心含片及其制备方法。

背景技术：

牙龈炎是一种临床常见病，是危害人类牙齿和全身健康的主要口腔疾病，由于牙龈炎患者的牙龈上皮薄，龈牙结合部堆积的牙菌斑及其中的有害物质长期作用于牙龈，引起炎症，加上牙石、不良修复体、食物嵌塞、牙错位拥挤及口呼吸等的存在，加重了菌斑堆积及牙龈的炎症。

目前，对于牙龈炎的防治主要采用洁治术清除牙石，控制菌斑，并改正一切造成菌斑滞留和刺激牙龈的因素或者用1%的过氧化氢溶液和0.12%～0.2%氯己定（洗必泰）以及碘制剂进行局部用药，严重者需要全身使用抗生素，但这些方法往往会对人体造成伤害。

卵黄抗体又称卵黄免疫球蛋白，是禽类蛋黄中存在的唯一的免疫球蛋白，目前应用较多的是鸡卵黄抗体，是用抗原免疫产蛋母鸡后，鸡血清中可产生相应的抗体，母鸡又能以产蛋的方式将血清中的抗体有效地转移至卵黄中，不同的抗原免疫就会产生针对该抗原的特异性卵黄抗体；卵黄抗体无需采血符合现代动物保护规则，产生的抗体量大，专一性强，性质稳定，无毒副作用，且不仅具有能与抗原结合的能力还对抗原菌的生长具有显著的抑制作用；有研究表明：特异性卵黄抗体对口腔中变形链球菌引起的龋齿有比较显著的预防效果；口服卵黄抗体可为人或动物提供有效的被动免疫保护，防治由于细菌或病毒引起的一些消化道感染等；然而，目前尚未见有关特异性卵黄抗体用于防治牙龈炎的报道。

cn106467572a公开了一种特异性复合卵黄抗体及其制备方法和应用，提供了一种抗牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌和solobacteriummoorei三种口腔厌氧菌的特异性复合卵黄抗体，代替抗生素等，更加有针对性的防治牙周病及口臭，为牙周病及口臭的预防和治疗提供一种安全有效的新方法；cn106214510a公开了一种防治口臭的卵黄抗体漱口水及其制备方法，研制了抗牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌和solobacteriummoorei三种口腔厌氧菌的特异性复合卵黄抗体，代替抗生素等，更加有针对性的防治口臭，从而为口臭的预防和治疗提供一种安全有效的新方法；该发明既含有特异性复合卵黄抗体又有重要提取物，能够有效抑制口腔中细菌的滋生，防治口臭，且不会影响口腔正常菌群，安全无害；然而以上两项发明并仅涉及抗牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌和solobacteriummoorei用于预防和治疗牙周病及口臭并未涉及牙龈炎的防治。

因此，开发一种能够特异性防治牙龈炎的卵黄抗体产品具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的是是克服现有技术的缺陷和不足，提供一种特异性复合卵黄抗体，所述特异性复合卵黄抗体专一性强，对牙龈炎的防治效果好，而且不会影响口腔内的正常菌群，绿色安全。

本发明的第二个目的是提供一种用于防治牙龈炎的卵黄抗体含片及其制备方法。

本发明的第三个目的是提供一种用于防治牙龈炎的卵黄抗体夹心含片及其制备方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种特异性复合卵黄抗体，以中间链球菌、粘放线菌和二氧化碳噬纤维菌为复合抗原并将其免疫母鸡后得到。

本发明通过将与牙龈炎发生密切相关的三种细菌：中间链球菌、粘放线菌和二氧化碳噬纤维经超声、混匀得到复合抗原，再将复合抗原免疫母鸡得到复合卵黄抗体，所述特异性复合卵黄抗体专一性强，对牙龈炎的防治效果好，而且不会影响口腔内的正常菌群，携带方便，安全环保。

优选地，将中间链球菌、黏放线菌及二氧化碳噬纤维菌经超声破碎后，按1:1:1混合成复合抗原，经处理后的复合抗原分别与弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂（分别按1:1比例）混合，充分乳化，制成弗式完全佐剂疫苗和弗式不完全佐剂疫苗。从第一轮免疫开始，每14～15天收集免疫鸡蛋，用75%～85%酒精消毒，利用蛋清蛋黄分离器，除去蛋清，收集蛋黄，加入3%～4%的peg6000的pbs溶液，离心获得水溶性成分，再经过8～16层纱布过滤，在10000～12000r/min，3℃～5℃下离心10min，取上清，加入10%～13%peg6000的pbs溶液并搅拌，于10000～12000r/min，3～5℃下低温离心10min，取沉淀，加入饱和硫酸钠，在10000～12000r/min，低温离心，加入pbs溶液，3℃～5℃下静置2h，取沉淀，使用pbs溶液溶解，经过超滤膜超滤作用，再经过冷冻干燥，获得特异性复合卵黄抗体。

更优选地，所述中间链球菌、粘放线菌和二氧化碳噬纤维菌的浓度均为2×10⁹cfu/ml。

优选地，所述复合抗原由中间链球菌、粘放线菌和二氧化碳噬纤维菌按体积比1:1:1制备得到。为了更好更方便的利用上述特异性复合卵黄抗体，可以将其制备成相关的口服产品，用于特异性防治牙龈炎；例如漱口水、口香糖、夹心含片等。

因此，本发明请求保护上述特异性复合卵黄抗体在制备防治牙龈炎的卵黄抗体含片中的应用。

优选地，所述卵黄抗体含片包括卵黄抗体夹心含片。

上述卵黄抗体加上辅料和中药提取物能够制成方便携带的卵黄抗体含片用于防治牙龈炎。

因此，本发明还请求保护一种用于防治牙龈炎的卵黄抗体含片，所述含片包含以下各组分原料：中药提取物，特异性复合卵黄抗体，辅料；

所述中药提取物由以下组分原料中药制成：胖大海，黄岑，三七花，天花粉，桂花。

优选地，所述用于防治牙龈炎的卵黄抗体含片，所述含片包含以下重量份数的各组分制备而成：中药提取物3～5份，特异性复合卵黄抗体0.1～0.5份，润滑剂1～3份，木糖醇5～10份，清凉醇1～3份；

所述中药提取物由以下重量份数的组分制成：胖大海5～10份，黄岑5～10份，三七花1～5份，天花粉1～5份，桂花1～3份。

更优选地，所述润滑剂为硬脂酸镁、滑石粉、甘油中的一种或多种。

优选地，所述中药提取物由以下重量份数的中药制成：胖大海6～10份，黄岑6～10份，三七花1～5份，天花粉1～5份，桂花3份。

优选地，所述中药提取物的制备方法为通过先将胖大海、黄岑、三七花、天花粉、桂花按重量份数比研成粉末，然后用60%～80%的乙醇回流提取3～5次，每次回流1～2h，获得提取液，再将所得提取液经滤膜过滤，将滤液真空干燥处理得到。

更优选地，所述乙醇的加入量为中药粉末质量的4～6倍。

更优选地，所述真空干燥是指真空冷冻干燥。

同时，本发明还请求保护上述卵黄抗体含片的制备方法，具体为：将中药提取物、特异性复合卵黄抗体、木糖醇、清凉醇和润滑剂按上述重量份数混匀，于4℃～8℃，500rpm条件下，乳化至粘稠状，压缩成片状，即得到防治牙龈炎的卵黄抗体含片。

此外，本发明还请求保护由上述含片制备得到的用于防治牙龈炎的卵黄抗体夹心含片，该夹心含片还含有糖衣。

另外，上述夹心含片的制备方法也在本申请的保护范围内，所述方法具体为：将上述含片表面包裹糖衣即得夹心含片。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明以中间链球菌、粘放线菌和二氧化碳噬纤维菌三种混合菌作为复合抗原，将该复合抗原免疫母鸡后制备得到特异性复合卵黄抗体，所述特异性复合卵黄抗体专一性强，对牙龈炎的防治效果好，而且不会影响口腔内的正常菌群，携带方便；由上述特异性复合卵黄抗体制备得到的用于防治牙龈炎的卵黄抗体含片及夹心含片，药效明显，见效快，所述含片及夹心含片的制备方法简单，安全环保，适用于大规模生产。

附图说明

图1为特异性卵黄抗体的间接竞争抑制elisa检测结果。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1特异性复合卵黄抗体的制备

1、方法

（1）免疫原制备：取浓度均为2×10⁹cfu/ml的中间链球菌、黏放线菌和二氧化碳噬纤维菌各1ml，经过超声破碎后混合成复合抗原，经处理后的复合抗原分别与弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂按1:1比例混合，充分乳化，制成弗式完全佐剂疫苗和弗式不完全佐剂疫苗。

（2）免疫母鸡：选取20周龄产蛋母鸡，初次免疫使用弗氏完全佐剂疫苗，采用皮下多点注射的免疫方式，对每只母鸡的翅根下部及腿部注射0.5～0.8ml，初次免疫15天后进行第一次加强免疫，用弗氏不完全佐剂疫苗，采用皮下多点注射的免疫方式对每只母鸡注射0.5～0.8ml，以后每隔15天进行加强免疫一次，一共加强免疫5轮。

（3）特异性卵黄抗体的制备：从第一轮免疫开始，每15天收集免疫鸡蛋，用85%酒精消毒，利用蛋清蛋黄分离器，除去蛋清，收集蛋黄，加入3.5%的peg6000的pbs溶液，离心获得水溶性成分，再经过纱布过滤，在10000r/min，4℃下离心10min，取上清，加入12%peg6000的pbs溶液，搅拌后，10000r/min，4℃下离心10min，取沉淀，按1:1的比例加入饱和硫酸钠，在10000r/min，4℃下离心10min，然后加入pbs溶液将硫酸钠溶液稀释至饱和度为33%，4℃下静置2h，取沉淀，使用pbs溶液溶解，经过超滤膜超滤作用，再经过冷冻干燥，获得特异性复合卵黄抗体。

（4）特异性卵黄抗体的检测：

①包被：用包被缓冲液（cbs缓冲液，ph=9.6，0.05mol/l）分别将中间链球菌、黏放线菌和二氧化碳噬纤维菌抗原稀释至2×10⁹cfu/ml，包被于96孔酶标板，包被量为100μl/孔，4℃包被过夜，甩干孔中液体并用pbst（含有0.05%吐温-20的pbs）洗板三次并用吸水纸拍干；

②封闭：用含3%脱脂奶粉的pbs（0.01mol/l）进行封闭（270μl/孔），于水浴锅中37℃下温育1h，按步骤①中所述方法进行洗板；

③加一抗：分别将特异性igy用pbs（0.01mol/l）进行倍比稀释后，用移液枪加入到96孔酶标板（100μl/孔）中，同时加入pbs作为空白对照，于水浴锅中在37℃条件下温育1h，然后甩干酶标板孔中的液体，按步骤①中所述方法进行洗板；

④加酶标二抗：每孔加入1:5000稀释过的辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡igy抗体100μl，于37℃水浴锅中温育1h，然后甩干孔中液体，按步骤①中所述方法进行洗板；

⑤显色和终止反应：以100μl/孔的量加入新鲜配制的tmb显色液，于37℃水浴锅中温育15min，然后按50μl/孔的量加入终止液；

⑥检测吸光值：立即检测酶标板各孔在450nm处的吸光值，以阳性孔od值大于或等于2.1倍阴性孔od值时的最高稀释倍数作为特异性卵黄抗体的效价。

2、结果

实验结果如图1所示，效价检测结果如下表1所示：

表1效价检测结果

通过间接竞争抑制elisa实验证明：上述所制备的卵黄抗体为复合中间链球菌、黏放线菌及二氧化碳噬纤维菌特异性抗体，效价高且稳定，可应用于制备特定卵黄抗体的夹心含片。

实施例2

按以下重量份数称取中药原料：胖大海10份、黄岑10份、三七花5份、天花粉5份、桂花3份，木糖醇10份，特异性卵黄抗体0.1份，润滑剂1份，清凉醇香精1份；

（1）将胖大海、黄岑、三七花、天花粉、桂花等中药研制成粉末，用5倍质量的60%的乙醇回流提取3次，每次回流2小时，得到提取液，回收乙醇，用微孔滤膜过滤，收集滤液，收缩至原来体积三分之一，真空冷冻干燥，得到提取物；

（2）向上述中药提取物中添加润滑剂，然后加入提纯的特异性卵黄抗体，再加入木糖醇及清凉醇香精，低温下低速乳化至黏稠状，压缩成片状；

（3）在片状结构外包裹糖衣，即得到防治牙龈炎的卵黄抗体夹心含片。

实施例3

本实施例与实施例1的制备方法基本相同，不同之处在于，按以下重量份数加入中药原料：胖大海9份、黄岑9份、三七花4重量份、天花粉4份、桂花3份，木糖醇10份，特异性卵黄抗体0.2份，润滑剂1份，清凉醇香精1份。

实施例4

本实施例与实施例1的制备方法基本相同，不同之处在于，按以下重量份数加入中药原料：胖大海8份、黄岑8份、三七花3份、天花粉3份、桂花3份，木糖醇10份，特异性卵黄抗体0.3份，润滑剂1份，清凉醇香精1份。

实施例5

本实施例与实施例1的制备方法基本相同，不同之处在于，按以下重量份数加入中药原料：胖大海7份、黄岑7份、三七花2份、天花粉2份、桂花3份，木糖醇10份，特异性卵黄抗体0.4份，润滑剂1份，清凉醇香精1份。

实施例6

本实施例与实施例1的制备方法基本相同，不同之处在于，按以下重量份数加入中药原料：胖大海6份、黄岑6份、三七花1份、天花粉1份、桂花3份，木糖醇10份，特异性卵黄抗体0.5份，润滑剂1份，清凉醇香精1份。

实施例7临床使用案例

病例1：

李某，男，57岁。左下后牙龈肿痛3天，未作任何治疗。左侧脸颊侧牙龈肿胀、充血，牙龈处深3毫米且溢脓，口服实施例4制备得到的防治牙龈炎的卵黄抗体夹心含片2片牙龈消肿，服用2天痊愈。

病例2：

邵某，女，30岁，农民，2018年8月26日初诊，右后上牙痛7天，面颊肿胀并口张困难3天，平素喜食辛辣，7天前始觉右后上牙痛，周红肿，自服黄连上清丸，止痛片可暂缓解症状，3天来症状逐渐加剧，右面部肿胀、嫩红作痛连及腮颊，张口困难，伴口臭、头痛、恶寒发热，遇冷、热食物刺激疼痛加重，以夜间为甚，影响进食和睡眠；每餐饭后服用实施例5制备得到的夹心含片1片，每日口服3片防治牙龈炎的卵黄抗体夹心含片，3日后逐渐痊愈。

病例3：

患者，男，23岁，临床表现：双侧后上牙龈钝痛1周。检查：牙龈红肿、质软，压痛明显，松动，牙周袋深5mm，并有较多的牙石，轻压少量脓性分泌物溢出；每餐饭后服用实施例6制备得到的夹心含片1片，一日口服3片防治牙龈炎的卵黄抗体夹心含片，2日后逐渐痊愈。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。