对虾肝胰腺病原毒素蛋白PirA的单克隆抗体B及应用的制作方法

本发明属于分子免疫学和病原生物学交叉技术领域，是一种对虾肝胰腺病原毒素蛋白pira的单克隆抗体及应用，具体是抗对虾急性肝胰腺坏死病(acutehepatopancreaticnecrosisdisease，ahpnd)病原毒素蛋白pira(photorhabdusinsectrelateda，发光杆菌昆虫毒素关联基因a)的单抗及其制备与应用。

背景技术：

急性肝胰腺坏死病(ahpns)是近年来引起东南亚乃至全球养殖仔虾、幼虾大量死亡的一种疾病。仅在我国，每年造成的直接经济损失超过10亿美元，严重危害对虾产业的发展，已对全球的对虾养殖及相关产业造成了前所未有的打击和影响。对于ahpnd的病原，初始研究认为是携带有特定致病性质粒的副溶血弧菌(vibrioparahaemolyticus)特异菌株，进一步研究发现，该病可能与致病性质粒所携带的pira和pirb毒素蛋白基因密切相关，台湾成功大学罗竹芳教授团队通过一系列感染实验证实pirab毒素基因就是诱导ahpnd症状的毒素基因，其中pira约13kda，pirb约50kda，且pirab基因操纵子位于不稳定的序列上，有可能在其他微生物间自由进出。后续研究表明pira和pirb毒素蛋白的三维结构与苏云金芽抱杆菌分泌的一种昆虫毒素蛋白非常相似，暗示苏云金芽抱杆菌也可能引起对虾肝胰腺的坏死。黄海水产研究所黄倢博士团队发现坎氏弧菌(v.campbellii)也可导致对虾的ahpnd，有证据显示，早先发现的副溶血弧菌在自然条件下可将对虾急性肝胰腺坏死症致病基因pirab传递给坎氏弧菌，使其成为新的致病菌。

目前针对对虾ahpnd，仍无有效的防制措施，如何早期诊断该病就迫在眉睫。现有的分子生物学检测技术需要复杂的仪器设备，成本较高，不适合基层和现场检测，免疫学检测技术可以形成简便快速的现场检测产品，应用免疫学检测技术的关键在于制备高质量的抗体，近年来利用单克隆抗体技术，提高了免疫学检测技术的权威性和特异性，使检测结果更加可靠。但至今尚无对虾ahpnd毒素蛋白单克隆抗体研制的报道。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术的不足，而提供对虾肝胰腺病原毒素蛋白pira单抗及其制备与应用。本发明拟以毒素蛋白pira基因所表达的多肽为抗原，应用免疫学方法，制备出抗毒素蛋白pira的单克隆抗体，为建立ahpnd的早期诊断技术及病原受体蛋白的研究提供新的思路。

本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：

一种对虾肝胰腺病原毒素蛋白pira的单克隆抗体b，该单克隆抗体b是由保藏号为：cctccno:c2017153的杂交瘤细胞分泌的，能够与毒素蛋白pira表位发生特异性结合；

所述保藏编号为cctccno:c2017153的杂交瘤细胞名称为杂交瘤细胞株3m6，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏日期2017年12月28日。

而且，所述cctcc－c2017153的杂交瘤细胞是根据推测分析pira蛋白质氨基酸结构特性，人工设计合成pira多肽-vlp蛋白载体复合物，然后将得到的pira多肽-vlp蛋白载体复合物免疫小鼠，将免疫小鼠脾细胞与sp2骨髓瘤细胞融合产生的杂交瘤细胞。

而且，所述pira多肽-vlp蛋白载体表面偶联多个拷贝的多肽序列为sq8：hetdyshdwtvepn。

一种对虾肝胰腺病原毒素蛋白pira的单克隆抗体b作为对虾ahpnd病原检测的应用。

所述应用于对虾ahpnd病原检测，具体是采用斑点印记法检测对虾中是否含有携带pirab质粒的病原。

本发明的优点和积极效果是：

1、本发明研制的由保藏号为cctcc－c2017153的杂交瘤细胞分泌的抗ahpnd毒素蛋白pira的单抗b能够与pira蛋白氨基酸序列为hetdyshdwtvepn的肽段所形成的表位结合，所以使得单抗b可以应用到ahpnd病原的早期快速检测中，为建立ahpnd病原的单克隆抗体诊断方法，研究ahpnd的发病机理与感染动态、增殖特点、流行病学规律等，继而实现切断感染途径、预防控制虾类ahpnd奠定了坚实的基础。

2、由于本发明重要的制备技术路线是：以人工设计合成的pira多肽-vlp蛋白载体复合物为抗原，免疫小鼠获得脾细胞，将脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，采用免疫学检测方法分别以合成多肽和ahpnd病原为抗原筛选融合后的杂交瘤细胞，获得能够分泌特异性抗ahpnd病原毒素天然蛋白pira单克隆抗体b的杂交瘤细胞株。这样的制备技术路线设计新颖，严密而合理。

3、本发明以人工设计合成的pira多肽-vlp蛋白载体复合物为抗原，免疫小鼠制备抗体。由于ahpnd病原毒素蛋白pira是质粒表达的分泌蛋白，现有方法无法从细菌培养液中准确提纯，而原核表达的蛋白又与天然蛋白在高级结构上会有所差异，因此本发明采用人工合成多肽偶联载体蛋白的方法取得抗原，具体方法是：取得pira全基因序列，采用蛋白分析软件拟合pira基因所表达蛋白的晶体结构，识别靶标蛋白结构的可能的高级结构区域及表面环状区域，综合选择具有较好的亲水性、暴露于天然蛋白的表面环状区域，按照多肽抗原的设计原则，设计合成12条多肽，并偶联到vlp蛋白载体上，每个蛋白载体表面偶联多个拷贝的多肽序列，形成pira多肽-vlp蛋白载体复合物。通过人工合成多肽的方法，最大程度的模拟天然蛋白的结构，且每个蛋白载体表面偶联多个拷贝的多肽序列，保证了合成多肽的纯度与免疫原性，为获得高效价、高特异性单抗奠定了基础。采用酶联免疫吸附技术与免疫印记技术筛选出的单抗b，能够更加具体的说明本发明单抗b与非变性的和变性后的pira发生特异性结合，识别pira蛋白的线性表位，为ahpnd毒素蛋白的免疫学检测技术提供手段和方法。

附图说明

图1为抗体制备流程图；

图2为pira蛋白质氨基酸结构特性分析图，其中，细线-表示蛋白结构表面的环状区域；粗箭头-表示蛋白结构中的beta折叠区域；对应的pira蛋白氨基酸序列为：(斜体部分为beta折叠区域对应的氨基酸序列)

图3为多肽偶联结果鉴定图，顺序依次从左往右为：lane1marker；lane2-13，vlp载体偶联多肽1-12，lane14为阴性对照(nc)，lane15为阳性对照(pc)；

图4为显示本发明的单抗b与ahpnd病原的免疫印迹结果图，在15kda处有明显的显示条带。

具体实施方式

以下结合附图对本发明实施做进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

一种对虾肝胰腺病原毒素蛋白pira的单抗b，其菌株保藏号为cctcc－c2017153。

上述对虾肝胰腺病原毒素蛋白pira的单抗b的制备方法包括步骤如下：

(1)多肽合成与蛋白偶联

根据靶标蛋白pira蛋白的基因序列sq13：atgagtaacaatataaaacatgaaactgactattctcacgattggactgtcgaaccaaacggaggcgtcacagaagtagacagcaaacatacacctatcatcccggaagtcggtcgtagtgtagacattgagaatacgggacgtggggagcttaccattcaataccaatggggtgcgccatttatggctggcggctggaaagtggctaaatcacatgtggtacaacgtgatgaaacttaccatttacaacgccctgataatgcattctatcatcagcgtattgttgtaattaacaatggcgctagtcgtggtttctgtacaatctattaccac，推测分析pira蛋白质氨基酸结构特性，如图2所示，识别靶点蛋白结构的高级结构区域、表面的环状区域，针对靶点蛋白结构表面的环状区域(loop)，具有较好的亲水性、暴露于天然蛋白的表面，按照多肽抗原的设计原则设计12条多肽抗原如下：

表1设计的多肽序列

多肽合成与偶联由艾比玛特医药科技(上海)有限公司完成，采用edc法(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidehydrochloride)将多肽(n端增加有cystine)和vlp载体进行偶联，每个蛋白载体的表面偶联多个拷贝的多肽序列；

结果：如图3所示，nc对照条带，因无多肽参与反应，载体蛋白vlp在原蛋白大小处，即17kda处蛋白条带清晰，该区域上方无连续呈阶梯状条带，证明无多肽被偶联上，nc对照偶联成功；pc对照多肽偶联，在载体蛋白vlp原蛋白大小处，即17kda处条带消失，该区域上方有连续几个条带(呈阶梯状)，则证明pc对照偶联成功；nc、pc对照成功，证明本次实验成功；2-13在17kda处区域上方有连续几个条带(呈阶梯状)，证明偶联成功。

(2)偶联多肽特异性抗体的制备

①多肽免疫

成功偶联多肽的蛋白载体复合物免疫4只4周龄balb/c小鼠，每6条多肽免疫2只,共免疫4次，具体免疫程序如下：

i,基础免疫，将样品液与弗氏完全佐剂等比混匀，采用腹腔注射方法；

ii,2周后加强免疫，将样品液与弗氏不完全佐剂等比混匀，采用腹腔注射方法；

iii,1周后再加强免疫1次，采用尾静脉直接注射方法，注射剂量为0.1ml，无佐剂；

iv,再1周后加强免疫第2次，本次免疫后的第3天，取血清检测，采用elisa检测抗血清效价，采用western-blot检测抗血清与ahpnd病原——含pirab质粒的副溶血弧菌的反应性，抗血清检测效价和与目的蛋白反应性良好、结果符合融合要求，取小鼠脾脏用于细胞融合。

②细胞融合

在无菌条件下将免疫小鼠脾细胞与sp2骨髓瘤细胞用50％peg融合，融合细胞(10⁵cells/ml)用hat-git选择性培养液重悬，滴入加有营养细胞的96孔细胞培养板中，每孔0.2ml，置于37℃，co2浓度为5％的培养箱中培养，倒置相差显微镜观察杂交瘤细胞生长情况，两周后，检测杂交瘤细胞上清液，筛选阳性细胞；

③克隆

采用有限稀释法克隆阳性杂交瘤细胞，将杂交瘤细胞用细胞培养液重悬，10倍梯度稀释至10²cells/ml，取1ml细胞液加入9ml培养液，混合均匀，滴入加有营养细胞的96孔细胞培养板中，每孔0.1ml。选取只有一个杂交瘤细胞的培养孔，待细胞长满孔底2/3以上时，取上清液，即含有本发明的pira单抗，用酶联免疫吸附法检测，每株杂交瘤细胞克隆3次；

④冻存

取生长旺盛，形态良好的待冻存细胞，制成细胞悬液，200g离心5min，去上清，加冻存液(含10％dmso的细胞培养液)，使最终细胞密度为5×10⁶个/ml，将1ml细胞悬液装于2ml冻存管中，拧紧螺盖，然后将冻存管在4℃放置30min，-20℃放置2h，之后放于-80℃超低温冰箱内过夜(8-12h)后，再浸入液氮内长期保存；

(3)酶联免疫吸附法筛选鉴定

①抗原包被：偶联多肽抗原包被，1μg/ml，分别溶解于碳酸盐缓冲液(1×cbs包被液)，100μl/孔，阳性对照孔包被vlp偶联多肽，37℃孵育2h；

②封闭：3％牛血清白蛋白封闭液37℃封闭1h，以含0.5％吐温-20的磷酸盐缓冲液(pbst)洗涤3次，每次5min；

③加一抗孵育：取待检测抗体(杂交瘤上清/4免后小鼠血清稀释不同浓度)100μl/孔，阳性对照加鼠抗vlp抗体，阴性对照加pbst，37℃孵育1h，同上洗涤；

④加二抗孵育：加hrp标记的羊抗鼠igg二抗，100μl/孔，37℃孵育45min，同上洗涤；

⑤显色：每孔加100μltmb底物液37℃孵育显色5min；

⑥终止：每孔加50μl2mh2so4终止显色，450nm处读数，30min内完成。

⑦数据判断：pc值≥2.0且nc值≤0.2，实验结果有效；效价判断标准：od值≥2倍nc值的抗体最高稀释度，且od值≥0.25；单抗筛选标准：od值≥0.5以上。

结果：免疫小鼠血清检测结果显示，除vlp偶联多肽25142-1-10未刺激实验动物免疫产生抗体，所制作的鼠抗血清对检测其它抗原的效价在1:1k以上，western-blot结果显示鼠抗血清与ahpnd病原——含pirab质粒的副溶血弧菌在15kda附近处有清晰的条带识别；对杂交瘤上清的筛选结果根据od值排序结果，最终确定选取279株细胞继续培养后进行表位亲和力鉴定。

(4)抗体表位鉴定

①抗原包被：vlp偶联多肽抗原包被，cbs调节浓度分别为0.1mg/l、0.01mg/l、0.001mg/l，100μl/孔，阳性对照孔包被vlp偶联多肽，37℃孵育2h；

②封闭：3％牛血清白蛋白封闭液37℃封闭1h，以含0.5％吐温-20的磷酸盐缓冲液(pbst)洗涤3次，每次5min；

③加一抗孵育：分别加入初筛阳性的279株细胞的杂交瘤上清，100μl/孔，阳性对照加鼠抗vlp抗体，阴性对照加pbst，37℃孵育1h，同上洗涤；

④加二抗孵育：加hrp标记的羊抗鼠igg二抗，100μl/孔，37℃孵育45min，同上洗涤；

⑤显色：每孔加100μltmb底物液37℃孵育显色5min；

⑥终止：每孔加50μl2mh2so4终止显色，450nm处读数，30min内完成。

⑦数据判断：pc值≥2.0且nc值≤0.2，实验结果有效；阳性判定标准：od值≥0.5以上；表位亲和力判定标准：与包被抗原浓度为0.001mg/l、0.01mg/l、0.1mg/l均能特异性结合检测结果为阳性的杂交瘤上清所含抗体为高亲和力抗体，对应菌株为优先级一，与包被抗原浓度为0.01mg/l、0.1mg/l能特异性结合检测结果为阳性的杂交瘤上清对应菌株为优先级二，仅与0.1mg/l的包被抗原特异性结合检测结果为阳性的杂交瘤上清对应菌株为优先级三。

结果：表位亲和力鉴定结果显示，共筛选出20株优先级一的可产生高亲和力抗体的菌株(其中1株为保藏号为cctcc－c2017153菌株)；筛选出36株优先级二的菌株，其中2株所产生的单抗为双表位抗体，能与两种vlp偶联多肽反应；筛选出69株优先级三的菌株，其中7株所产生的单抗为双表位抗体，能与两种vlp偶联多肽反应。

(5)免疫印迹实验筛选单抗

①电泳分离：将ahpnd病原—含pirab质粒的副溶血弧菌用十二烷基磺酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳分离；

②转移：采用湿法转移将凝胶内的蛋白转移到nc膜上，具体操作如下：

i剪取一块与电泳凝胶相同大小的硝酸纤维素膜(孔径0.22μm)以电转移缓冲液(电转移缓冲液：25mmol/ltris-base，192mmol/l甘氨酸，20％甲醇，ph8.3)润湿，放在电泳后的凝胶上，两边分别贴上润湿的滤纸，在滤纸的外侧再分别贴上充分浸湿的泡沫垫，最外层再用两块有机玻璃支持板加以支撑；

ii将此夹层结构置入盛有电转移缓冲液的电泳槽内，将硝酸纤维素膜面向阳极；电泳稳流200ma，通电5h；

iii转移完毕，取出硝酸纤维素膜，将marker泳道剪下丽春红染色，以显示蛋白条带；

③免疫印迹

i将带有含pirab质粒的副溶血弧菌样品的硝酸纤维素膜用0.01m磷酸盐缓冲液洗10min，然后置0.01m磷酸盐缓冲液配成的2％-3％的牛血清白蛋白溶液中37℃封闭45min。

ii用0.01m磷酸盐缓冲液(含0.05％吐温-20)洗3次，每次5min。

iii将硝酸纤维素膜分别置杂交瘤细胞(步骤(4)中优先级一、二、三的菌株)培养上清中，普通瘤细胞培养上清为阴性对照，37℃缓慢摇动1h或4℃过夜。

iv用0.01m磷酸盐缓冲液(含0.05％吐温-20)洗3次，每次5min。

v将硝酸纤维素膜加入辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠igg抗体(1:30000稀释于0.01m磷酸盐缓冲液中)，37℃缓慢摇动1h。

vi用0.01m磷酸盐缓冲液(含0.05％吐温-20)洗3次，每次5min。

vii把硝酸纤维素膜放入tmb沉淀型底物液中显色，直到颜色(蓝色)清晰为止，用2mh2so4洗涤，以终止反应。

viii用去离子水洗涤，滤纸吸水，干燥。

结果：筛选出14株杂交瘤细胞所分泌的抗体能够特异性识别含pirab质粒的副溶血弧菌所表达的pira蛋白，在15kda附近有明显的显色条带。图4为保藏号cctcc-c2017153的杂交瘤细胞所分泌的pira蛋白单抗b与转印后的含pirab质粒的副溶血弧菌反应结果，在15kda附近有明显的显色条带。在上述步骤(4)中，单抗b亲和力优先级一，识别编号8的多肽。

(6)本发明在对虾ahpnd病原检测中的应用

利用本发明的单抗，采用斑点印记法检测对虾中含pirab质粒的病原的存在。

①待检样品的制备

分别取少量虾鳃组织，按1g组织加入2ml0.01m磷酸盐缓冲液(含10mm苯硫脲)冰浴研磨3～5min,室温静置后取上清3μl，点样于0.22μm的nc膜上，以0.01m磷酸盐缓冲液作为阴性对照，室温干燥后放入96孔板中。

②每孔加入3％bsa于37℃封闭1h，0.01m磷酸盐缓冲液(含0.5％tween-20)洗3次，每次5min。

③每孔加入保藏号cctcc-c2017153的杂交瘤细胞上清液(单抗b)，37℃孵育1h，用0.01m磷酸盐缓冲液(含0.05％吐温-20)洗3次，每次5min。

④每孔加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠igg抗体(1:10000稀释于0.01m磷酸盐缓冲液中)，37℃孵育1h，0.01m磷酸盐缓冲液(含0.05％吐温-20)洗3次，每次5min。

⑤每孔加入tmb沉淀型底物液中显色，直到颜色(蓝色)清晰为止，用2mh2so4洗涤，以终止反应。观察显色结果。

结果：含有ahpnd病原(携带有pirab质粒的细菌)的样品，在nc膜上呈现清晰的紫红色圆点，不含ahpnd病原(不携带pirab质粒的细菌)的样品，在nc膜上不显色，阴性对在nc膜上不显色。

总结结果：本发明的实验制备了对虾急性肝胰腺坏死病病原毒素蛋白pira单克隆抗体。

本发明所用仪器及试剂：

酶标仪(购于biotek公司)；垂直电泳槽(购于bio-rad公司)；水平电泳仪(购于北京六一)；1640培养基(购自gibco公司)；胎牛血清(购自gibco公司)；hat(购自gibco公司)；牛血清白蛋白(购自sigma公司)；硝酸纤维素膜(购自millpore公司)；苯硫脲、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠igg(购自sigma_aldrich)；十二烷基磺酸钠、β-疏基乙醇、考马斯亮蓝-r250、丙烯酰胺、亚甲叉双丙烯酰胺、tris-base、过硫酸铵、溴酚兰、甘氨酸(购于生工生物工程有限公司)；四甲基乙二胺(temed)(购于sigma公司)；tmb底物液(购自济南泰天和生物科技有限公司)，酶标板(购自corning公司)。

本发明中多肽氨基酸序列表

sq1:msnnikhetdyshd

sq2:wtvepnggvtevds

sq3:skhtpiipevgrsv

sq4:vdientgrgelt

sq5:yqwgapfmaggwkv

sq6:detyhlqrpdna

sq7:hqrivvinngasrg

sq8:hetdyshdwtvepn

sq9:ggvtevdskhtpii

sq10:pdnafyhqrivvin

sq11:nngasrgfctiyyh

sq12:tevdskhtpiipev

基因序列表sq13:

atgagtaacaatataaaacatgaaactgactattctcacgattggactgtcgaaccaaacggaggcgtcacagaagtagacagcaaacatacacctatcatcccggaagtcggtcgtagtgtagacattgagaatacgggacgtggggagcttaccattcaataccaatggggtgcgccatttatggctggcggctggaaagtggctaaatcacatgtggtacaacgtgatgaaacttaccatttacaacgccctgataatgcattctatcatcagcgtattgttgtaattaacaatggcgctagtcgtggtttctgtacaatctattaccac

本领域的普通技术人员都会理解，在本发明的保护范围内，对于上述实施例进行修改、添加和替换都是可能的，其都没有超出本发明的保护范围。

序列表

<110>天津市水产技术推广站

艾比玛特医药科技（上海）有限公司

<120>对虾肝胰腺病原毒素蛋白pira的单克隆抗体b及应用

<140>2018105774295

<141>2018-06-07

<160>13

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>14

<212>prt

<213>多肽序列sq8(unknown)

<400>1

hisgluthrasptyrserhisasptrpthrvalgluproasn

1510

<210>2

<211>14

<212>prt

<213>多肽序列sq9(unknown)

<400>2

glyglyvalthrgluvalaspserlyshisthrproileile

1510

<210>3

<211>14

<212>prt

<213>多肽序列sq10(unknown)

<400>3

proaspasnalaphetyrhisglnargilevalvalileasn

1510

<210>4

<211>14

<212>prt

<213>多肽序列sq11(unknown)

<400>4

asnasnglyalaserargglyphecysthriletyrtyrhis

1510

<210>5

<211>14

<212>prt

<213>多肽序列sq12(unknown)

<400>5

thrgluvalaspserlyshisthrproileileprogluval

1510

<210>6

<211>333

<212>dna

<213>基因序列表sq13(unknown)

<400>6

atgagtaacaatataaaacatgaaactgactattctcacgattggactgtcgaaccaaac60

ggaggcgtcacagaagtagacagcaaacatacacctatcatcccggaagtcggtcgtagt120

gtagacattgagaatacgggacgtggggagcttaccattcaataccaatggggtgcgcca180

tttatggctggcggctggaaagtggctaaatcacatgtggtacaacgtgatgaaacttac240

catttacaacgccctgataatgcattctatcatcagcgtattgttgtaattaacaatggc300

gctagtcgtggtttctgtacaatctattaccac333

<210>7

<211>14

<212>prt

<213>多肽序列sq1(unknown)

<400>7

metserasnasnilelyshisgluthrasptyrserhisasp

1510

<210>8

<211>14

<212>prt

<213>多肽序列sq2(unknown)

<400>8

trpthrvalgluproasnglyglyvalthrgluvalaspser

1510

<210>9

<211>14

<212>prt

<213>多肽序列sq3(unknown)

<400>9

serlyshisthrproileileprogluvalglyargserval

1510

<210>10

<211>12

<212>prt

<213>多肽序列sq4(unknown)

<400>10

valaspilegluasnthrglyargglygluleuthr

1510

<210>11

<211>14

<212>prt

<213>多肽序列sq5(unknown)

<400>11

tyrglntrpglyalaprophemetalaglyglytrplysval

1510

<210>12

<211>12

<212>prt

<213>多肽序列sq6(unknown)

<400>12

aspgluthrtyrhisleuglnargproaspasnala

1510

<210>13

<211>14

<212>prt

<213>多肽序列sq7(unknown)

<400>13

hisglnargilevalvalileasnasnglyalaserarggly

1510