利用CRISPR/Cas9介导的腺嘌呤碱基编辑系统改良水稻稻瘟病广谱抗性的方法与流程

本发明农业生产技术领域，具体涉及一农业生产的水稻种质资源生产领域，特别是一种利用crispr/cas9介导的腺嘌呤碱基编辑系统改良水稻稻瘟病广谱抗性的方法。

背景技术：

水稻，是全世界最重要的粮食作物之一，在世界约一半人口是水稻作为口粮，稻瘟病是水稻主要病害之一，在业界被称为“水稻癌症”，可造成水稻大幅度减产，情况严重时，减产量可达30%～50%，甚至颗粒无收，据不完全统计全世界因稻瘟病而至水稻减产损失在1.6亿吨以上。因此提高水稻对稻瘟菌的抗性一直以来都是水稻抗病育种工作的重要问题。

水稻对稻瘟病菌的抗性主要分为crispr/cas9介导的抗性和非crispr/cas9介导的抗性两种。crispr/cas9介导的抗性，即利用水稻稻瘟病抗病（r）基因介导的对含有对应无毒基因的稻瘟菌生理小种所产生的抗性，这种抗性具有抗病效果强的特点，然而该抗性的局限在于范围狭窄且难以持久。由于稻瘟菌的毒性发生变异和优势小种的产生，通常抗病品种在推广3-5年后就丧失其抗性，也因此该抗性在农业生产上受到较大限制。非crispr/cas9介导的抗性又称广谱抗性，能使水稻对几乎所有稻瘟病菌均具有良好的抗病效果，与crispr/cas9介导的抗性相比具有不易被克服，田间效果持久的特点，具有更大应用价值。虽然人类在长期的农业生产中选择出少量具有广谱抗性的水稻材料，然而这类抗性背后的作用机制一直不清楚。最近，四川农业大学陈学伟教授课题组在cell杂志发表研究论文，报道了利用广谱高抗水稻地谷与基因组已经测序的66份非广谱抗病水稻进行gwas（全基因组关联）分析，并应用高抗水稻地谷与高感材料丽江新团黑谷为亲本构建的重组自交系，抗病性经多年田间自然诱发和苗期接种鉴定，进行共相关分析，鉴定到一个与广谱抗病表型高度关联单核苷酸替换snp位点（a→g）（距离起始密码子-618），该位点位于一个编码c2h2类转录因子基因bsr-d1（loc_os03g32230）的启动子区。围绕这一snp位点巧妙地开展了一系列实验，揭示了该转录因子正调控下游过氧化物酶基因表达，以及上游受mybs1转录因子负调控该c2h2转录因子表达的一条完整的调控途径。地谷与其它感病水稻品种相比，bsr-d1启动子区域中的mybs1结合位点存在差异，进而导致mybs1对地谷bsr-d1的启动子具有更强的结合能力。该研究成果揭示一个崭新的水稻免疫转录调控网络：稻瘟菌通过某种未知机制诱导水稻中bsr-d1转录因子的表达，从而导致水稻体内过氧化物酶水平的升高，这将有助于清除由于宿主pti通路激活所产生的h2o2累积，进而为稻瘟菌的侵染减小压力；而bsr-d1的启动子区域发生突变使得bsr-d1的负调控转录因子mybs1对其拥有更强的结合能力，从而降低了bsr-d1和其所调控的过氧化物酶的表达，促进了水稻在受到稻瘟菌侵染时h2o2的累积，提高水稻对稻瘟菌的广谱抗性。若应用到实际生产中，可培育具有广谱抗病能力的品种，将大幅度提高水稻对稻瘟病的抵抗力，并将有效避免病源菌进化导致的抗病能力失效的问题，有效减少农药使用，非常符合生态绿色环保的需求。且这一变异位点在提高抗病性的同时，对水稻产量性状和稻米品质没有明显影响，因而具有十分重要的应用价值。

crispr/cas9技术自诞生以来在生命科学领域掀起了一场全新的技术革命，该技术已经广泛应用于包括农作物在内的各种生物体的基因组编辑。科学工作者利用该技术，创造了大量的植物内源基因功能缺失的突变体，为植物的功能基因组学研究和应用研究做出了巨大的贡献。然而，核苷酸点突变是作物许多重要农艺性状发生变异的遗传基础。大多数时候科学家希望通过引入单碱基突变造成氨基酸的变化达到基因功能的增强或减弱，而不是单纯地敲除基因功能。由于定向同源修复(hdr)的编辑效率低，crispr/cas9介导的单碱基突变编辑系统的研究就十分必要。2016年，哈佛大学davidliu研究组开发了apobec1脱氨酶与dspcas9的n末端融合的胞嘧啶编辑器cbe。神户大学akihikokondo研究组开发了胞苷脱氨酶（aid）直向同源物与dspcas9的c末端融合的胞嘧啶编辑器cbe，该两个课题组首次在动物中实现了c-g到t-a的单碱基突变。随后，2017年，朱健康课题组首次在植物中运用apobec1-dcas9实现了crispr/cas9介导的c-g到t-a的单碱基突变。2017年，哈佛大学davidliu研究组通过几轮定向进化和蛋白质工程将大肠杆菌一种trna腺苷脱氨酶tada进化成能作用在dna上的腺苷脱氨。然后，将改造后的tada与nspcas9切口酶融合成abe，实现了将动物细胞内dna中的a-t碱基转换为g-c碱基对。2018年,朱健康课题组又通过融合spcas9(d10a)和ectada*7.10的方法实现了ipa1等基因的编辑，编辑效率最高达45.2%，成功开发了水稻中的腺嘌呤碱基编辑器，从而拓宽了植物中的基因组工程工具。该文首次证明了的腺嘌呤碱基编辑器可以在植物中有效地和crispr/cas9介导的地将目标a-t转换成g-c。该研究没有在目标位点或潜在的脱靶位点上发现任何插入缺失或其他碱基转换或颠换的突变。这些特征表明了腺嘌呤碱基编辑系统优于hdr介导的序列替换。2018年，朱健康课题组再次利用spcas9和sacas9的变体开发了新的腺嘌呤和胞嘧啶碱基编辑器，通过使用切口酶vqr-cas9（d10a）、vrer-cas9（d10a）和sakkh-cas9(d10a)代替abe/cbe-p1碱基编辑器中spcas9（d10a）切口酶，分别产生新的碱基编辑器abe/cbe-p3、abe-p4和abe/cbe-p5[25]。已有报道vqr-cas9识别的pam序列为nga,而vrer-cas9的pam为ngcg序列，则sakkh-cas9的pam是nnnrrt，这在很大程度上拓宽了碱基编辑器的应用范围，扩展了水稻基因组中的可靶向的crispr/cas9介导的单碱基突变，故该研究报道对推进水稻的精确分子育种具有重要的现实意义。

因此如何来利用日本晴水稻为受体材料，利用crispr/cas9介导的腺嘌呤碱基编辑系统，通过农杆菌介导转化进行稻瘟病感病水稻材料bsr-d1基因的启动子区域距离起始密码子-618位点的单碱基定点替换（a→g），获得双等位突变植株后自交筛选转基因阴性后代，即可获得不携带转基因成份的稻瘟病广谱抗性改良新材料。该方法为快速精准地创制稻瘟病广谱抗性水稻种质资源开辟一条崭新的途径，将大大推动水稻稻瘟病抗病育种进程。保障水稻米的高产、稳产有着重要意义。

技术实现要素：

本发明针对现有技术存在的不足，提供一种利用crispr/cas9介导的腺嘌呤碱基编辑系统改良水稻稻瘟病广谱抗性的方法。以日本晴水稻品种为受体材料，利用crispr/cas9介导的crispr/cas9腺嘌呤碱基编辑系统通过农杆菌介导转化进行bsr-d1基因的启动子区域距离起始密码子-618位点的单碱基定点替换（a→g），获得转基因再生植株后鉴定筛选获得该位点的双等位突变植株，自交结实后筛选出转基因阴性后代，即为改良后不携带转基因成份的稻瘟病抗性改良新材料，该方法将大大推动水稻稻瘟病抗病育种水平。

本发明公开一种利用crispr/cas9介导的腺嘌呤碱基编辑系统改良水稻稻瘟病广谱抗性的方法，以日本晴水稻品种为受体材料，其是利用crispr/cas9介导的腺嘌呤碱基编辑系统通过农杆菌介导转化进行水稻bsr-d1基因的启动子区域距离起始密码子-618位点的单碱基定点替换（a→g），获得转基因再生植株后鉴定筛选获得该位点的双等位突变植株，自交结实后筛选出转基因阴性后代，即为改良的具有稻瘟病广谱抗性水稻种质材料。

本发明所述一种利用crispr/cas9介导的腺嘌呤碱基编辑系统改良水稻稻瘟病广谱抗性的方法，其包括如下方法步骤：

（1）确定crispr/cas9介导的腺嘌呤碱基编辑系统作用靶位点，

根据水稻品种日本晴的水稻bsr-d1基因位点的启动子序列，确定水稻bsr-d1基因的启动子区域目标突变位点(a)的下游邻近序列，在目标替换碱基下游设置2个不同的pam1和pam2，分别进行目标替换碱基的单碱基替换（a→g），其中pam1的序列为ataagt，上游对应的包含目标替换碱基由20个碱基组成靶标序列为ttaaattttaactgataaat；pam2的序列为agcg，上游对应的包含了目标替换碱基(a)由20个碱基组成靶标序列为aactgataaatataagtata；

其中所述pam1由crispr/cas9介导的腺嘌呤碱基编辑系统abe-p5系统识别，所述pam2是由crispr/cas9介导的腺嘌呤碱基编辑系统abe-p4系统识别；

（2）构建crispr/cas9介导的腺嘌呤碱基编辑载体，

按照（1）步的靶标片段的核酸排列顺序，构建用于水稻bsr-d1基因的启动子区域目标突变位点(a)打靶的crispr/cas9介导的腺嘌呤碱基编辑载体，所述crispr/cas9介导的腺嘌呤碱基编辑载体包括具有所述靶标片段的向导rna表达框以及cas9核酸酶与trna腺苷脱氨酶tada基因融合的表达框；

（3）遗传转化，

利用农杆菌介导转化法将已构建好的crispr/cas9介导的腺嘌呤碱基编辑载体转入受体水稻品种日本晴，获得不少于200株独立转化植株；

（4）筛选并检测单碱基替换突变体植株，

crispr/cas9介导的腺嘌呤碱基编辑载体转基因植株潮霉素阳性鉴定后，通过在单碱基替换靶位点侧翼引物扩增转基因植株，而后送样pcr产物和t载体克隆质粒进行测序，最后筛选并检测出完成单碱基替换突变体植株；

（5）筛选具有广谱稻瘟病抗性改良水稻，

选择步骤（4）已实现单碱基替换突变体植株即纯合突变t0再生株系，种植结实收获t1代种子，根据cas9基因引物和潮霉素基因序列引物筛选出t1代转基因阴性植株，为不携带任何转基因成分的具有广谱稻瘟病抗性改良水稻。

优选的是，步骤（2）所述构建crispr/cas9介导的腺嘌呤碱基编辑载体，包括如下方法，

a）、在目标替换碱基下游找到合适的pam位置，选择pam上游的20个碱基作为靶标序列；

b）、根据20个碱基组成的靶标序列合成两条携带接头寡聚引物oligo1和oligo2；

c）、将b）步合成好的接头寡聚引物oligo1和oligo2分别溶解成80-120μm母液，各取0.5-1.5μl加入到80-110μl0.5×te混合稀释到1μm；于温度为80-100℃，20-40sec，移至室温冷却完成退火，为靶点接头引物tam；

d）、将c）步制备好的靶点接头引物tam与经bsai酶切后回收的crispr/cas9介导的腺嘌呤碱基编辑载体进行连接，连接程序为20-28℃，时间2-4h，12-20℃过夜连接。使用m13-f和靶点接头引物oligo2于1-3%琼脂糖凝胶上进行pcr鉴定阳性克隆。

优选的，是步骤（4）所述单碱基替换靶位点侧翼引物扩增转基因植株的上游引物tb-bsr-f序列为5‘-tagcatccaccgttccacac-3’；下游引物tb-bsr-r序列为5‘-gcgacgtgagtacttggctg-3’。

进一步的，是步骤（1）所述水稻bsr-d1基因的启动子区域位于启动子上距离起始密码子-618的位置。

进一步的，是步骤（1）所述abe-p4的pam2的序列为ngcg；abe-p5的pam1的序列为nnnrrt，其中n为a、g、c、t中的任意一个，r代表a或g。

优选的，是步骤（2）所述向导rna表达框包括crisprrna(crrna)和sgrna，crisprrna的序列为所述靶标区段的5’-(n)x-pam-3’结构中的(n)x或与之互补的序列。

优选的，是步骤（5）所述cas9基因的上游引物cas9-f序列为5‘-gacaacagcgacgtggac-3’，扩增cas9基因的下游引物cas9-r序列为5‘-ctggtggtgctcgtcgtatc-3’；所述潮霉素基因的上游引物hpt-f序列为5‘-gcttctgcgggcgatttgtg-3’,下游引物hpt-r序列为5‘-ctgaactcaccgcgacgtctg-3’。

9本发明所述的一种利用crispr/cas9介导的腺嘌呤碱基编辑系统改良水稻稻瘟病广谱抗性的方法，其步骤a）所述合适的pam位置是ngg、nga、ngcg或者nnnrrt任意一个。

优选的，是步骤b）所述接头序列与经bsai酶切后的腺嘌呤碱基编辑载体粘性末端互补。

本发明公开的一种利用crispr/cas9介导的腺嘌呤碱基编辑系统改良水稻稻瘟病广谱抗性的方法，具有如下有益特点：

（1）育种周期短，整个水稻种质资源材料定向创制过程耗时约7个月左右，而传统杂交-回交方法至少需要3～5年时间；

（2）只改变了受体品种特定基因启动子区域的一个碱基，所获水稻种质资源材料除稻瘟病抗性外其他农艺性状不变，而传统回交方法会导入与bsr-d1基因启动子区域连锁的其他基因，可能影响受体品种的农艺性状；

（3）本项目虽然借助转基因技术来完成本发明方法，但最终获得的成果是不携带任何转基因成分的稻瘟病广谱抗性水稻新材料。且本发明的一种利用crispr/cas9介导的腺嘌呤碱基编辑系统改良水稻稻瘟病广谱抗性的方法，在国内外还未见相关报道；还有是思路创新。

本发明一种利用crispr/cas9介导的腺嘌呤碱基编辑系统改良水稻稻瘟病广谱抗性的方法，以日本晴水稻品种为受体材料，其利用crispr/cas9介导的腺嘌呤碱基编辑系统通过农杆菌介导转化进行bsr-d1基因的启动子区域的单碱基，距离起始密码子-618位点的单碱基定点替换（a→g），获得转基因再生植株后鉴定筛选获得该位点的双等位突变植株，自交结实后筛选出转基因阴性后代，即为改良的具有稻瘟病广谱抗性水稻种质材料。

附图说明：

图1，为本发明的pam1序列与目标替换碱基的靶标序列图；

图2，为本发明的pam2序列与目标替换碱基的靶标序列图；

图3，为本发明的腺嘌呤碱基编辑植物表达载体abe-p4和abe-p5示意图；

图1、2、3中，1、目标替换碱基，2、pam1，3、起始密码子，4、pam2。

具体实施方式：

下面结合附图及具体实施方式对本发明的具方方法作进一步的详细说明，本发明具体实施方法中使用材料如农杆菌菌株等，均可市售或现有技术方法制备获得且发明人所制备拥有。

实施例，

本发明一种利用crispr/cas9介导的腺嘌呤碱基编辑系统改良水稻稻瘟病广谱抗性的方法，以日本晴水稻品种为受体材料，其是利用crispr/cas9介导的腺嘌呤碱基编辑系统通过农杆菌介导转化进行水稻bsr-d1基因的启动子区域的单碱基，距离起始密码子-618，定点替换（a→g），获得转基因再生植株后鉴定筛选获得该位点的双等位突变植株，自交结实后筛选出转基因阴性后代，即为改良的具有稻瘟病广谱抗性水稻种质材料。

本发明所述一种利用crispr/cas9介导的腺嘌呤碱基编辑系统改良水稻稻瘟病广谱抗性的方法，具体包括如下方法步骤：

（1）确定crispr/cas9介导的腺嘌呤碱基编辑系统作用靶位点，

根据水稻品种日本晴的水稻bsr-d1基因位点的启动子序列，确定水稻bsr-d1基因的启动子区域目标突变位点(a→g)的下游邻近序列，在目标替换碱基下游设置2个不同的pam1和pam2，分别进行目标替换碱基的单碱基替换（a→g），其中pam1的序列为ataagt，上游对应的包含目标替换碱基由20个碱基组成靶标序列为ttaaattttaactgataaat；pam2的序列为agcg，上游对应的包含了目标替换碱基由20个碱基组成靶标序列为aactgataaatataagtata；

其中所述pam1由腺嘌呤碱基编辑系统abe-p5系统识别，所述pam2是由腺嘌呤碱基编辑系统abe-p4系统识别；

（2）构建crispr/cas9介导的腺嘌呤碱基编辑载体，

按照（1）步所述靶标片段的核酸排列顺序，构建用于水稻bsr-d1基因的启动子区域目标突变位点(a→g)打靶的crispr/cas9介导的腺嘌呤碱基编辑载体，所述crispr/cas9介导的腺嘌呤碱基编辑载体包括具有所述靶标片段的向导rna表达框以及cas9核酸酶与trna腺苷脱氨酶tada基因融合的表达框；

（3）遗传转化，

利用农杆菌介导转化法将已构建好的crispr/cas9介导的腺嘌呤碱基编辑载体转入受体水稻品种日本晴，获得不少于200株独立转化植株；

（4）筛选并检测单碱基替换突变体植株，

crispr/cas9介导的腺嘌呤碱基编辑载体转基因植株潮霉素阳性鉴定后，通过在单碱基替换靶位点侧翼引物扩增转基因植株，而后送样pcr产物和t载体克隆质粒进行测序，最后筛选并检测出完成单碱基替换突变体植株；

（5）筛选具有广谱稻瘟病抗性改良水稻，

选择步骤（4）已实现单碱基替换突变体植株即纯合突变t0再生株系，种植结实收获t1代种子，根据cas9基因引物和潮霉素基因序列引物筛选出t1代转基因阴性植株，为不携带任何转基因成分的具有广谱稻瘟病抗性改良水稻。

本发明所述的一种利用crispr/cas9介导的腺嘌呤碱基编辑系统改良水稻稻瘟病广谱抗性的方法，上述的步骤（1）所述构建腺嘌呤碱基编辑载体，包括如下方法，

a）、在目标替换碱基下游找到合适的pam位置，选择pam上游的20个碱基作为靶标序列；

b）、根据20个碱基组成的靶标序列合成两条携带接头寡聚引物oligo1和oligo2；

c）、将b）步合成好的接头寡聚引物oligo1和oligo2分别溶解成80-120μm母液，各取0.5-1.5μl加入到80-110μl0.5×te混合稀释到1μm；于温度为80-100℃，20-40sec，移至室温冷却完成退火，为靶点接头引物tam；

d）、将c）步制备好的靶点接头引物tam与经bsai酶切后回收的crispr/cas9介导的腺嘌呤碱基编辑载体进行连接，连接程序为20-28℃，时间2-4h，12-20℃过夜连接。使用m13-f和靶点接头引物oligo2于1-3%琼脂糖凝胶上进行pcr鉴定阳性克隆。

对于转基因手段获得的再生植株，选择双等位突变水稻t0再生株系，种植结实收获t1代种子，根据cas9和潮霉素基因序列设计特异引物，筛选出t1代转基因阴性植株，从而实现通过基因组编辑技术获得最终不携带任何转基因成分的具有广谱稻瘟病抗性改良水稻。自交结实后筛选出转基因阴性后代，即为改良后不携带转基因且具有稻瘟病广谱抗性的水稻。

如图1、2、3所示，（1）crispr/cas9介导的腺嘌呤碱基编辑系统作用靶位点的确定

如图1和图2所示根据测序水稻品种日本晴水稻bsr-d1下称水稻bsr-d1或bsr-d1，基因位点loc_os03g32230的启动子序列，分析日本晴水稻bsr-d1基因的启动子区域突变位点(a→g)，位于启动子上距离起始密码子-618的位置的下游邻近序列，在目标替换碱基下游设置2个不同的pam即pam1和pam2，如图1和图2所示，分别进行目标碱基的单碱基替换a→g，其中pam1的序列为ataagt，上游对应的包含目标替换碱基由20个碱基组成靶标序列为ttaaattttaactgataaat；pam2的序列为agcg，上游对应的包含了目标替换碱基由20个碱基组成靶标序列为aactgataaatataagtata。腺嘌呤碱基编辑系统abe-p5如图3所示，识别pam1，腺嘌呤碱基编辑系统abe-p4如图3所示，识别pam2，spcas9识别的pam序列为ngg；vqr-cas9识别的pam序列为nga；vrer-cas9即abe-p4的pam序列为ngcg；而sakkh-cas9即abe-p5的pam序列为nnnrrt。其中n为a、g、c、t中的任意一个，r代表a或g。

（2）crispr/cas9介导的腺嘌呤碱基编辑载体构建

按照所述靶标片段的核酸排列顺序，构建用于水稻bsr-d1基因的启动子区域目标突变位点(a→g)打靶的crispr/cas9介导的腺嘌呤碱基编辑重组载体，所述重组载体包括具有所述靶标片段的向导rna表达框以及cas9核酸酶与trna腺苷脱氨酶tada基因融合的表达框，所述向导rna表达框包括crisprrna(crrna)和sgrna，crisprrna的序列为所述靶标区段的5’-(n)x-pam-3’结构中的(n)x或与之互补的序列。

（3）遗传转化

利用农杆菌介导转化法将上步已构建好的crispr/cas9介导的腺嘌呤碱基编辑载体转入受体水稻品种日本晴，获得不少于200株独立转化植株。

（4）单碱基替换突变体植株检测

对crispr/cas9介导的腺嘌呤碱基编辑载体转基因植株潮霉素阳性鉴定后，通过在单碱基替换靶位点侧翼设计特异引物扩增转基因植株，其上游引物tb-bsr-f序列为5‘-tagcatccaccgttccacac-3’；下游引物tb-bsr-r序列为5‘-gcgacgtgagtacttggctg-3’。而后送样pcr产物和t载体克隆质粒进行测序，最终筛选出完成单碱基替换(a→g)的双等位突变植株。

（5）不携带转基因成分的双等位突变水稻筛选

选择已成功实现单碱基替换(a→g)的双等位纯合突变t0再生株系，种植结实收获t1代种子，根据cas9和潮霉素基因序列设计特异引物，扩增cas9基因的上游引物cas9-f序列为5‘-gacaacagcgacgtggac-3’，扩增cas9基因的下游引物cas9-r序列为5‘-ctggtggtgctcgtcgtatc-3’；扩增潮霉素基因的上游引物hpt-f序列为5‘-gcttctgcgggcgatttgtg-3’,下游引物hpt-r序列为5‘-ctgaactcaccgcgacgtctg-3’；筛选出t1代转基因阴性植株，从而实现通过单碱基编辑技术获得最终不携带任何转基因成分的具有广谱稻瘟病抗性改良水稻。

本发明制备方法的再生植株单碱基定点替换成功率情况说明，

本发明的20个碱基组成的靶序列中的腺嘌呤碱基都有可能被定点替换，所以仅仅只在某一特定的腺嘌呤碱基上替换成功的突变效率可能相对较低，为获得成功实现靶位点定点替换的突变体植株，本发明通过加大了遗传转化工作，尽可能多的获得转基因植株来进行突变筛选，从而达到本发明的预期目标。

（2）对于合适的pam序列及对应的腺嘌呤碱基编辑系统的选择

本发明是在对bsr-d1基因启动子区域特定单个碱基进行定点替换（a→g），而pam序列又只能在目标替换碱基下游的20个碱基范围之内进行选择，所以能否选择到合适的pam序列以及携带对应的cas9变体的腺嘌呤碱基编辑系统尤为重要。

（1）crispr/cas9介导的腺嘌呤碱基编辑载体构建

a）在目标替换碱基下游找到合适的pam（ngg、nga、ngcg或者nnnrrt）位置，选择pam上游的20个碱基作为靶标序列。

b）根据20个碱基组成的靶标序列合成两条携带接头的寡聚引物oligo1和oligo2，接头序列与经bsai酶切后的crispr/cas9介导的腺嘌呤碱基编辑载体粘性末端互补。

c）将合成好的接头引物te溶解成100μm母液，各取1μl加入到98μl0.5×te混合稀释到1μm。约90℃30sec，移至室温冷却完成退火。

d）将制备好靶点接头引物(tam)与经bsai酶切后回收的crispr/cas9介导的腺嘌呤碱基编辑载体进行连接，连接程序为22℃3h，16℃过夜连接。使用m13-f和靶点接头引物oligo2于2%琼脂糖凝胶上进行pcr鉴定阳性克隆。

本发明的引物设计，是根据目标定点替换碱基（a）侧翼序列的核苷酸序列特点，应用primerpremier5.0设计软件，设计用于扩增包含目标替换碱基区段的pcr特异引物。

需要说明的是：以上本发明所公开的上述的技术方案，非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。都应属于本发明技术方案保护的范围。