一种DNA组装的方法及其应用与流程

本发明总地涉及生物技术领域，具体涉及一种dna组装的方法及其应用。

背景技术：

dna组装是合成生物学和生物工程的基础使能技术。当前，dna组装方法主要分为两类：基于限制性内切酶(restrictionendonucleases,re)的组装策略和基于同源片段介导的组装策略。其中，基于re的dna组装方法是应用最广泛的组装方法。

在基于re的dna组装方法的发展过程中，biobrick^tm方法(shetty,r.p.,endy,d.,andknight,t.f.,jr.(2008)engineeringbiobrickvectorsfrombiobrickparts,jbioleng2,5.)是第一个被开发并得到实际应用的方法。此方法利用四个iip型限制性内切酶(如ecori、xbai、spei、psti)进行可循环的dna片段组装，其中两个iip型限制性内切酶(如xbai、spei)为同尾酶。

biobrick^tm方法通过在dna片段的5’端添加ecori/xbai位点以及spei/psti位点，能够实现重组载体依然保持单一性的ecori/xbai位点以及spei/psti位点，以达到酶和载体的可重复利用性，从而连续循环(递归)的在已组装的dna中整合新的片段。这种递归循环的dna组装方法，可以实现多轮的“设计-构建-检验”循环，以解决在没有充分掌握遗传、生理和代谢机制条件下的生物工程试错验证研究。特别是在代谢工程研究中，多轮的“设计-构建-检验”循环可以逐步解决关键酶筛选、代谢瓶颈去除、代谢流量优化和代谢途径重构等问题，逐步提高特定代谢物的产量、转化率和生产强度，构建高性能的工程菌，以满足工业生产的需求。

biobrick^tm方法简单易用和递归组装的特点使其得到了广泛的应用，并在此基础上衍生出了多种类似的dna组装方法，如bglbrick(anderson,j.c.,dueber,j.e.,leguia,m.,wu,g.c.,goler,j.a.,arkin,a.p.,andkeasling,j.d.(2010)bglbricks:aflexiblestandardforbiologicalpartassembly,jbioleng4,1)、ibrick(liu,j.k.,chen,w.h.,ren,s.x.,zhao,g.p.,andwang,j.(2014)ibrick:anewstandardforiterativeassemblyofbiologicalpartswithhomingendonucleases,plosone9.)、c-brick(li,s.y.,zhao,g.p.,andwang,j.(2016)c-brick:anewstandardforassemblyofbiologicalpartsusingcpf1,acssynthbiol5,1383-1388)以及yalibrick(wong,l.,engel,j.,jin,e.,holdridge,b.,andxu,p.(2017)yalibricks,aversatilegenetictoolkitforstreamlinedandrapidpathwayengineeringinyarrowialipolytica,metabengcommun5,68-77.)等。但这些方法都会在dna片段的一对同尾酶融合处引入多余的碱基序列(“疤痕序列”)，如biobrick^tm方法会产生8bp的疤痕序列，bglbrick、c-brick、cctl和yalibrick方法会产生6bp的疤痕序列。拼接dna片段之间的疤痕序列会影响dna序列的完整性、mrna的二级结构及蛋白的正确表达，增加了dna序列设计的难度，限制了其在需要无痕组装和精确组装中的应用。特别是将上下游序列影响功能的遗传原件，如增强子、启动子、rbs、间隔序列、编码序列和终止子序列等，精确地组装成开放阅读框、基因回路、代谢途径或代谢模块，亟需解决biobrick^tm及其衍生组装方法中存在的疤痕序列问题，开发无痕的递归循环dna组装技术。

技术实现要素：

针对上述递归循环的dna组装方法存在的“疤痕”序列问题，本发明建立了无痕的ps-brick组装方法。该方法同时应用iip型和iis型限制性内切酶，并结合pcr产物的特性，能够实现无痕、迭代、串联重复序列组装，具有经济性及易用性等特点。利用此方法进行苏氨酸菌种的代谢工程改造，包括thra点突变筛选及与thrb、thrc的模块化整合、代谢瓶颈的解除及核心外排基因的鉴定以及用于苏氨酸分解途径相关基因共敲除的crispr-sgrna重复排列载体的组装，通过多轮的“设计-构建-检验”循环，构建了高效积累苏氨酸的工程菌，证明了该方法的工业应用性。

本发明提供了一种质粒，包含单个毗邻的iip和iis型限制性内切酶识别位点。

优选地，根据上述的质粒，所述iip型限制性核酸内切酶为切割产生两个及以上碱基粘性末端的iip型限制性内切酶。

优选地，根据上述的质粒，所述iis型限制性内切酶为切割产生单碱基粘性末端的iis型限制性内切酶；或为切割产生平末端的iis型限制性内切酶。

更优选地，根据上述的质粒，所述iis型限制性内切酶为bmri、bcivi、hphi或mlyi。

本发明还提供了一种dna组装的方法，包括：(1)待插入基因(即模板)的单端连接含有毗邻iip和iis型限制性核酸内切酶识别位点的dna片段以获得目的基因；(2)采用相应的iip型限制性核酸内切酶剪切所述目的基因以获得供体dna；(3)采用相应的iip和iis型限制性核酸内切酶剪切上述质粒以获得受体dna，所述质粒包含与所述目的基因相同的iip和iis型限制性核酸内切酶识别位点；(4)连接所述供体dna和所述受体dna。

优选地，根据上述的方法，所述目的基因中，iip型限制性核酸内切酶识别位点在iis型限制性核酸内切酶识别位点的外侧。

优选地，根据上述的方法，当所述iis型限制性核酸内切酶为切割产生单碱基粘性末端的iis型限制性内切酶时，步骤(1)还包括在所述待插入基因的另一端连接一个a碱基。

优选地，根据上述的方法，在步骤(3)中，先使用相应的iip型限制性核酸内切酶剪切所述质粒以获得线性化质粒，再使用相应的iis型限制性核酸内切酶剪切所述线性化质粒。

本发明还提供了一种重组菌，根据上述的方法构建。

优选地，根据上述的重组菌，所述重组菌为生产苏氨酸的重组菌，与所述出发菌相比具有提高的天冬氨酸激酶thra、高丝氨酸激酶thrb、苏氨酸合成酶thrc、天冬氨酸半醛脱氢酶asd、苏氨酸外排转运蛋白rhtc的表达，与所述出发菌相比具有降低的苏氨酸脱氢酶tdh、苏氨酸脱水酶ilva的表达。

更优选地，通过使用携带相应基因的质粒转化至所述出发菌来实现所述表达的提高，通过敲除所述出发菌的相应基因来实现所述表达的降低。

还优选地，采用上述的方法构建所述携带相应基因的质粒，采用上述的方法构建用于敲除所述相应基因的载体。

本申请公开了一种基于iip型和iis型限制性内切酶的dna组装方法——ps-brick。该方法综合应用pcr产物、iip和iis型限制性内切酶的特性实现了递归循环、无痕和重复序列的组装。应用ps-brick组装方法开展代谢工程育种，具有工业应用性：利用该方法无痕组装的优势，实现了密码子饱和突变以及双顺反子的精确拼接；应用该方法的串联重复片段组装的优势，组装具有相同启动子和终止子的串联crissprsgrna重复序列；通过ps-brick的循环迭代组装特性，逐步的解除了苏氨酸生物合成的反馈抑制、消除了代谢瓶颈、强化了苏氨酸外排、失活了苏氨酸分解代谢，对苏氨酸代谢途径进行了系统的优化改造，获得了高效生产苏氨酸的工程菌。此外，ps-brick组装方法还具有简单、省时和高效的优点，具有较高的实用性。

与现有的dna组装技术相比，ps-brick组装方法的新颖设计之处主要体现在以下几个方面：

(1)现有的基于限制性内切酶的dna组装方法(如biobrick和goldengate组装方法)分别只使用一种类型的限制性内切酶，即iip或iis型限制性内切酶，而本方法同时使用了iip和iis两种类型的限制性内切酶，可同时实现上述两种方法递归和无痕的两大优点；

(2)目的基因仅单端悬挂毗邻的限制性内切酶识别位点，从而可以同时利用目的基因另一端平末端或加a粘性末端的特性；

(3)应用产生平末端的iis型限制性内切酶和平末端的目的基因，或产生单碱基粘性末端的iis型限制性内切酶和加a粘性末端的目的基因，实现dna片段的无痕拼接；

(4)单对毗邻的iip和iis型限制性内切酶位点形成了可循环使用的进口位点，从而实现递归循环组装。

iip型限制性内切酶的识别和切割位点为同一个回文序列。目前基于iip型限制性内切酶的dna组装方法，仅可以同时使用四种特定的限制性内切酶，如biobrick方法仅可以同时使用spei、psti、xbai和spei；bglbrick仅可以同时使用ecori、bglii、bamhi和xhoi；yalibrick仅可以同时使用spei、xbai、nhei和avrii。而ps-brick组装技术可以使用上百种的任何一个产生两个及以上碱基粘性末端的iip型限制性内切酶，极大的减少了位点限制，提高了ps-brick组装方法的序列设计性。

iis型限制性内切酶的切割位点在识别位点之外，不同的iis型限制性内切酶可以分别产生1-4个碱基的粘性末端，也可以产生平末端。ps-brick仅使用产生平末端或单碱基粘性末端的iis型限制性内切酶。目前三种单碱基粘性末端iis型限制性内切酶(bmri,bcivi和hphi)和一种平末端iis型限制性内切酶mlyi可以通过商业化渠道购买。

此外，用于pcr扩增供体dna的引物无需特殊修饰(如5’端口磷酸化)，从而降低了本技术的应用成本。

附图说明

图1为ps-brick组装方法的设计原理与操作流程图；

图2为实施例2ps-brick组装的反应条件优化，其中d纵坐标单位为cfus/μg质粒dna，e纵坐标单位为％；

图3为实施例3ps-brick组装在苏氨酸代谢工程育种中的应用，其中c、d和e中苏氨酸产量均为相对苏氨酸产量；

图4为实施例3ps-brick组装在苏氨酸代谢工程育种中的应用，其中c中wt为野生型，δtdh为验证是否敲除tdh基因，△ilva为验证是否敲除ilva基因；d中dcw为对照菌株的细胞干重，dcw-ilv-tdh为敲除ilv和tdh基因的工程菌的细胞干重，thr为对照菌株的苏氨酸产量，thr-ilv-tdh为敲除菌株的苏氨酸产量，ile为对照菌株的异亮氨酸积累量。

图5为ps-brick组装在重复序列拼接中的具体时间流程，其中rep酶为iip型限制性内切酶，res酶为iis型限制性内切酶；以及

图6为ps-brick组装在重复序列拼接中的设计原理。

具体实施方式

以下结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式进行更加详细的说明，以便能够更好地理解本发明的方案以及其各个方面的优点。然而，以下描述的具体实施方式和实施例仅是说明的目的，而不是对本发明的限制。

本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。

本发明提及的方法中各步骤的执行顺序，除特别说明外，并不限于本文的文字所体现出来的顺序，也就是说，各个步骤的执行顺序是可以改变的，而且两个步骤之间根据需要可以插入其他步骤。

本发明提及的“出发菌”是指用于本发明基因改造策略的初始菌株。该菌株可以是天然存在的菌株，也可以是通过诱变或遗传工程改造等方式选育的菌株。为构建用于生产苏氨酸的工程菌，所述出发菌优选为可积累苏氨酸的菌株。

本发明提及的“提高……的表达”旨在表示提高由相应基因编码的蛋白的表达量，可通过相应基因的过表达实现，例如通过构建包含该基因的重组质粒，再将重组质粒导入出发菌中实现；也可通过将该基因插入出发菌中的染色体实现。这些方法都是本领域常用的，因此不再赘述。用于构建重组质粒的载体没有限制，可以是任何适宜的质粒，例如pxmj19。

本发明提及的“降低……的表达”旨在表示降低由相应基因编码的蛋白的表达量，可通过失活相应基因，“失活”指的是相应被改造的对象发生变化，从而达到一定的效果，包括但是不限于，定点突变、插入失活和/或敲除。

本发明提及的“连接……识别位点”可通过pcr引物引入。

所述目的基因可为使用taq、lataq或extaq等dna聚合酶扩增得到的3’末端附有突出单“a”碱基的pcr产物，或使用q5、kapa、kod或pfu等高保真聚合酶扩增得到的平末端pcr产物。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中如未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段和市售的常用仪器、试剂，可参见《分子克隆实验指南(第3版)》(科学出版社)、《微生物学实验(第4版)》(高等教育出版社)以及相应仪器和试剂的厂商说明书等参考。

限制性内切酶bcivi购自thermofisherscientific公司，其它限制性内切酶购自newenglandbiolabs(neb)公司。kapa热启动高保真聚合酶购自kapabiosystems公司，ex-taqdna聚合酶购自takara-bio公司。

实施例中所使用的菌种、质粒和引物序列(5’→3’)如下：

如图1和图6所示，ps-brick方法主要是基于dna聚合酶在dna片段扩增过程中是否具有在3’端加a碱基的特性及iis型限制性内切酶的切割粘性末端特点进行设计。其中dna片段在pcr扩增过程中利用引物在5’端加入iip/iis型双酶切位点，3’端不做修饰，以所用的iis型内切酶来确定dna聚合酶的类型。对于初始载体，通过一定的dna修饰方法，使之只含有与片段相同且单一的iip/iis型双酶切位点。在dna片段组装过程中，dna片段进行iip型内切酶的单酶切，载体进行iip型和iis型内切酶的双酶切，连接dna片段后的载体依然保持着单一的iip型/iis型双酶切位点，如此便可进行第二轮、第三轮……的循环组装。

为了验证此方法的可行性，选取了iip型限制性内切酶sphi和两种iis型限制性内切酶bmri(切割后产生1nt碱基的粘性末端)和mlyi(切割后产生平末端)，以研究不同iis型限制性内切酶的应用效果。如图1a所示，对于sphi/bmri组合，使用taqdnapolymerase扩增dna片段使之3’端带有突出的a碱基，同时利用正向引物在5’端加上sphi/bmri双酶切位点。如图1b所示，对于sphi/mlyi组合，利用kapadnapolymerase扩增dna片段使之3’端为平末端，同样利用引物在5’端加上sphi/mlyi双酶切位点。二者对应的出发载体pob和pom通过一定的改造方法使之带有单一的sphi/bmri或者sphi/mlyi双酶切位点。

实施例1

(一)构建ps-brick原始载体pob质粒和pom质粒

质粒puc19(seqidno.1)作为验证ps-brick组装方法的基本载体，载体中的一个bmri位点和三个mlyi位点通过overlapextensionpcr(重叠延伸聚合酶链式反应，overlappcr)的方法(ho,s.n.,hunt,h.d.,horton,r.m.,pullen,j.k.,andpease,l.r.(1989)site-directedmutagenesisbyoverlapextensionusingthepolymerasechain-reaction,gene77,51-59.)去除。具体为首先分别使用引物对uc709-f/uc1179-r和uc1179-f/uc1695-r扩增得到两个dna片段，进一步使用引物uc709-f/uc1746-r通过overlappcr的方法拼接这两个dna片段，拼接产物作为大引物，以质粒puc19为模板，突变其中的一个bmri位点和三个mlyi位点。位于质粒puc19上多克隆位点序列中的另外两个bmri位点和mlyi位点，通过sphi和ndei双酶切去除，获得无bmri和mlyi位点的puc19载体骨架。

以pseva237r载体(martinez-garcia,e.,aparicio,t.,goni-moreno,a.,fraile,s.,anddelorenzo,v.(2015)seva2.0:anupdateofthestandardeuropeanvectorarchitectureforde-/re-constructionofbacterialfunctionalities,nucleicacidsres43,d1183-d1189)为模板，使用相同的正向引物mc-f，以及不同的反向引物mcb-r(携带毗邻的sphi/bmri位点)和mcm-r(携带毗邻的sphi/mlyi位点)，分别pcr扩增得到两种不同的mcherry截短片段。截短位点位于mcherry基因(seqidno.2)中唯一存在的mlyi反向识别位点“gactc”(图2a)，因此，拟整合的pcr片段(即mcherry截短片段)中仅存在mcb-r和mcm-r所携带的sphi，bmri和mlyi位点。

使用kapa热启动高保真聚合酶对上述两种拟整合的pcr片段进行pcr反应，反应循环如下95℃保持3min进行一个循环,98℃保持20s,65℃保持20s，72℃保持30s进行27个循环，最后72℃保持1min。纯化回收pcr产物，并使用nanodrop2000c(thermofisher公司)测定dna浓度。

使用sphi和ndei双酶切纯化的pcr产物，并分别连接到上述无bmri和mlyi位点的puc19载体骨架上。通过测序验证，分别获得sphi/mlyi毗邻位点的pob质粒和sphi/bmri毗邻位点的pom质粒，作为ps-brick原始载体(如图1)。

(二)dna片段组装

使用ex-taq聚合酶和携带sphi/bmri位点的引物fb-r以及引物fb-f扩增得到的pcr产物fb作为ta克隆的插入片段(图1a)，使用kapa热启动高保真聚合酶和携带sphi/mlyi位点的引物fm-r以及引物fm-f扩增得到的pcr产物fm作为平末端连接的插入片段(图1b)。以pseva237r载体(martinez-garcia,e.,aparicio,t.,goni-moreno,a.,fraile,s.,anddelorenzo,v.(2015)seva2.0:anupdateofthestandardeuropeanvectorarchitectureforde-/re-constructionofbacterialfunctionalities,nucleicacidsres43,d1183-d1189)为模板，使用kapa热启动高保真聚合酶进行pcr反应的条件同上。

使用ex-taq聚合酶的pcr反应条件如下：94℃保持5min预变性,94℃保持30s、54℃保持30s并且72℃保持30s循环27次，72℃延伸5min。使用ex-taq聚合酶或kapa热启动高保真聚合酶pcr结束后，凝胶电泳pcr产物，切取大小正确的条带，柱纯化，再使用sphi单酶切。

ps-brick原始载体pob和pom分别使用bmri和mlyi单酶切15min，线性化的载体通过凝胶电泳分离，柱纯化后再使用sphi第二次酶切15min后，60℃热失活20min，柱纯化。两次酶切后，iis型bmri或mlyi的识别位点和一半的iip型sphi位点从原始载体骨架上剥离，bmri在载体的一端产1-nt的粘性末端(或mlyi产生一个平末端)，而sphi在载体的另一端产生4-nt的粘性末端(图1)。纯化后的pob与纯化后的fb连接，纯化后的pom与纯化后的fm连接。使用sphi单酶切的单端悬挂相同毗邻酶切位点(sphi/bmri或sphi/mlyi)的pcr产物(即纯化后的fb和fm)具有与载体互补的4-nt粘性末端。载体pob的1-nt粘性末端与ex-taq聚合酶扩增fb产生的加a末端连接(图1a)。载体pom的平末端与kapa热启动高保真聚合酶扩增fm的平末端连接(图1b)。ta连接或平末端的连接处不引入任何疤痕序列，从而可以实现无痕组装(图2a)。新组装的载体同样只包含一个sphi/bmri或sphi/mlyi毗邻内切酶序列对，作为下一轮组装的入口位点，实现循环递归组装(图1)。因此，ps-brick技术可以同时实现dna片段的递归和无痕组装。

上述所有的限制性内切酶的酶切反应体系为50μl，包含20个单位的酶和1μg的dna，37℃反应。10μl连接反应体系包含1μl的t4dnaligase,20ng线性化载体和5倍摩尔量的插入dna片段，25℃孵育15分钟，然后置于冰上并转化至100μl自制的大肠杆菌dh5α感受态细胞(转化puc19质粒的效率为(1.17±0.19)×10⁶cfu/μgdna)。引物uc1～6用于转化子菌落pcr鉴定。

实施例2ps-brick组装的反应条件优化

分别使用iis型限制性内切酶bmri和mlyi单酶切pob和pom载体，酶切反应体系如实施例1所述，根据time-saver产品反应条件，反应时间从15分钟到180分钟，然后电泳检测切割效率。如图2bc所示，几乎所有的载体在15分钟内完全被切断，产生线性化大小的单一条带。

切胶回收bmri切割的pob和mlyi切割pom的条带，进一步使用sphi酶切15至180分钟、65℃失活、回收后分别与sphsphi酶切的pcr产物fb和fm连接，转化至大肠杆菌dh5α感受态细胞。转化子单位数(colony-formingunits(cfus))代表dna组装效率。分别挑取20个克隆测序，正确组装的克隆比例作为组装方法的准确率。

在sphi的不同酶切时间条件下，分别将sphi单酶切后的dna片段与对应的双酶切后的载体进行连接。通过转化子的菌落计数和pcr鉴定确定ps-brick连接的转化率和正确率。结果显示，无论是sphi/bmri组合，还是sphi/mlyi组合，在不同的酶切时间下，其转化率均能达到10⁴～10⁵cfu/μgdna(图2d)，正确率均能达到90％以上(图2e)。

上述结果说明，对于本实施例所使用的iis和iip型限制性内切酶，15分钟的酶切时间已经足够。考虑到两次的30分钟的dna回收，20分钟的限制性内切酶失活，30分钟的dna连接，30分钟的化转，40分钟复苏，ps-brick的主体实验流程可在半天内完成(图5)，加上pcr扩增、克隆培养与鉴定的时间，每一轮的ps-brick可在两天内完成。

实施例3利用ps-brick方法进行苏氨酸代谢通路的工程改造

应用ps-brick组装技术开展了多轮迭代的“设计-构建-检验”循环，构建了产苏氨酸的工程菌。由于生物体基因表达和信号网络的调控和互作非常复杂，以及对于预测一个导入细胞的dna组装体如何发挥作用的先验知识非常匮乏，所以需要检验多个版本的构建体才能获得最优的组装方案。多轮的逐步的“设计-构建-检验”试验需要具有迭代特性的dna组装方法。

构建苏氨酸工程菌的代谢工程策略通常包括以下步骤：解除苏氨酸操纵子的反馈抑制，增强苏氨酸终端合成途径，去除代谢瓶颈，阻断苏氨酸分解代谢，改造苏氨酸转运系统和增强辅因子再生(图3a)。每一步的代谢工程改造均通过一轮的“设计-构建-检验”循环获得最优的方案，每一轮的“设计-构建-检验”循环通过ps-brick组装技术实现(图3b)。递归的ps-brick组装技术可以实现多轮的“设计-构建-检验”循环，从而逐步改造工程菌的代谢途径并提高工程菌的苏氨酸积累量。本实施例除了应用ps-brick组装技术的递归特性，还利用该方法无痕组装的优势，实现了密码子饱和突变以及双顺反子的精确拼接。此外，本实施例还应用ps-brick组装技术的串联重复片段组装的优势，组装了具有相同启动子和终止子的串联crissprsgrna重复序列，敲除了两条苏氨酸分解途径。

(一)无痕融合thra实现密码子饱和突变

本实施例使用hindiii和mlyi分别作为ps-brick组装的iip和iis型限制性内切酶。使用引物对ac3211-f/ac727-r和ac727-f/ac1143-r，通过重叠延伸pcr的方法突变了质粒pacyc184(seqidno.3)上的三个mlyi位点，另外一个位于多克隆位点处的mlyi位点通过hindiii和nrui限制性内切酶双酶切去除。

使用三对引物tab-f/tab-r，tbc-f/tbc-r和tc-f/tc-r进行重叠pcr，扩增截断的thrabc操纵子(seqidno.4)。限制性内切酶nrui位点设计在thrc的引物外侧，毗邻的hindiii和mlyi酶切位点设计在thra截断处外侧(图3b)。mlyi位点的pacyc184载体骨架与截断的thrabc操纵子pcr产物连接，获得包含一个hindiii/mlyi入口位点的原始载体pothr，用于下一步的thra基因的密码子饱和突变融合(图3b)。

使用kapa热启动高保真聚合酶扩增下一步的thra插入片段，毗邻的hindiii和mlyi酶切位点设计在正向引物ta-f外侧，20条反向引物ta^aa-r分别携带使thra第433个残基产生饱和突变的密码子序列。使用hindiii酶切20条pcr产物，分别与hindiii和mlyi双酶切的pothr载体连接，获得20个pthra⁴³³bc无痕拼接的饱和突变载体。这些载体上含有相同hindiii/mlyi位点，用于下一轮dna组装。

得到的含有20种不同thra*突变序列的表达载体转入e.colimg1655中，摇瓶发酵比较12h时，过表达不同突变体的工程菌的苏氨酸产量差异较大(图3c)，选出解除反馈抑制效果最好的点突变类型。实验结果显示转入pthra^gly433phebc载体的工程菌的苏氨酸产量最高，为0.39±0.04g/l，是野性型对照的6.5倍。

至此，下文所述thra⁴³³bc均指thra^gly433phebc。

(二)苏氨酸生物合成的代谢瓶颈的鉴定

为了鉴定苏氨酸生物合成的代谢瓶颈，选取了aspa(seqidno.5)、aspc(seqidno.5)、ppc(seqidno.7)、asd(seqidno.8)和pntab(seqidno.9)共5个关键酶基因，分别连接到thra^gly433phe载体上，方法同上。使用引物aspa-f/aspa-r扩增aspa基因,使用引物aspc1-f/aspc1-r和aspc2-f/aspc2-r扩增aspc基因；使用引物ppc1-f/ppc1-r，ppc2-f/ppc2-r，ppc3-f/ppc3-r和ppc4-f/r扩增ppc基因；使用引物asd1-f/asd1-r和asd2-f/asd2-r扩增asd基因；使用引物pnta/b1-f/pnta/b1-r，pnta/b2-f/pnta/b2-r，pnta/b3-f/pnta/b3-r，pnta/b4-f/pnta/b4-r和pnta/b5-f/pnta/b5-r扩增pntab基因。pcr产物分别通过第二轮的ps-brick反应与载体pthra^433phebc连接，转化至dh5α感受态细胞，测序验证正确的载体pacyc184-thra⁴³³bc-ppc/aspa/aspc/asd/pntab，分别转入e.colimg655中，摇瓶发酵12h，测定携带不同载体的菌体的苏氨酸产量。结果显示，携带pacyc184-thra⁴³³bc-asd载体的工程菌的氨酸产量最高，比对照菌株(e.colimg1655/pacyc184-thra⁴³³bc)提高了56.7％(图3d)；而过表达其它4个基因的工程菌与对照菌株相比，苏氨酸积累量并没有提高，说明asd基因是继过表达解除反馈抑制的苏氨酸操纵子的苏氨酸合成限制步骤。

(三)苏氨酸外排转运蛋白的筛选

进一步在pacyc184-thra⁴³³bc-asd载体上分别组装四个苏氨酸外排转运蛋白基因rhta(seqidno.12)、rhtb(seqidno.13)、rhtc(seqidno.14)、yecc(seqidno.15)。使用引物rhta-f/rhta-r扩增rhta基因，使用引物rhtb-f/rhtb-r扩增rhtb基因，使用引物rhtc-f/rhtc-r扩增rhtc基因，使用引物yec-f/yec-r扩增yecc基因。pcr产物通过第三轮ps-brick反应与载体pacyc184-thra⁴³³bc-asd连接，分别获得pacyc184-thra⁴³³bc-asd-rhta/rhtb/rhtc/yecc四个载体。进一步地，使用引物t-f/tbcd-r和tbcd-f/bcd-r拼接扩增启动子pt(seqidno.10)和双顺反子设计元件bcd1(seqidno.11)，pcr产物通过第四轮ps-brick反应分别与载体pacyc184-thra⁴³³bc-asd-rhta/rhtb/rhtc/yecc连接，获得pacyc184-thra⁴³³bc-asd-ptbcd1-rhta/rhtb/rhtc/yecc(图3b)。需要强调的是，ps-brick无痕组装的特性，保证了翻译起始原件bcd1与起始密码子的精确拼接，即bcd1元件的终止密码子uaa的最后一个碱基a与下游融合基因的起始密码子atg的第一个碱基a重合(uaaug)。通过第三轮和第四轮的ps-brick组装，获得了在相同转录和翻译起始元件调控下的过表达的四个苏氨酸外排转运蛋白基因，通过摇瓶发酵，以e.colimg655/pacyc184-thra⁴³³bc-asd为对照菌株，筛选出最优的同工酶。如图3e所示，过表达rhtc基因的工程菌的苏氨酸积累量最高。

(四)苏氨酸分解代谢途径的阻断

在上述实施例中，基于限制性内切酶mlyi平末端连接的ps-brick方法逐步地在表达载体上整合了苏氨酸合成关键基因。在本实施例中，基于使用bcivi限制性内切酶的ta克隆的ps-brick方法，组装了用于敲除苏氨酸分解途径基因的crisprsgrna重复序列。

应用已报道的包含pcas9和ptargetf载体的crispr-cas9基因编辑系统(jiang,y.,chen,b.,duan,c.l.,sun,b.b.,yang,j.j.,andyang,s.(2015)multigeneeditingintheescherichiacoligenomeviathecrispr-cas9system,applenvironmicrob81,2506-2514.)敲除tdh(seqidno.17)和ilva基因(seqidno.16)。使用引物tgb-f/r进行pcr、dpni酶切和转化的方法突变ptargetf质粒中的bcivi位点。供体dna包含靶基因ilva和tdh上下游500个碱基对的同源序列，作为基因编辑的模板。使用引物ilv1/2-f/r和tdh1/2-f/r，通过overlappcr的方法拼接三个靶基因的编辑模板。毗邻的hindiii-bcivi限制性内切酶位点设计在引物ilv1-f外侧，bamhi位点设计在引物tdh2-r外侧。使用限制性内切酶bamhi和hindiii双酶切供体dna片段和ptargetf载体，并连接，获得包含hindiii-bcivi限制性内切酶位点的ptargetet载体，用于组装crisprsgrna重复序列片段(图4a)。

首先，使用分别含有tdh和ilva基因n20序列的引物n20-tdh-f/r和n20-ilva-f/r，以ptargetf为模板进行pcr扩增，产物回收后使用dpni酶切，酶切产物化转至dh5α感受态细胞，获得两个分别含有tdh和ilva基因n20序列的ptargetf-tdh和ptargetf-ilv载体。其次，使用extaqdna聚合酶和引物sgrna-f/r，以ptargetf-tdh载体为模板进行pcr扩增，获得tdh基因的sgrna片段(即包括pj23119,tdhn20以及sgrna的片段)(jiang,y.,chen,b.,duan,c.l.,sun,b.b.,yang,j.j.,andyang,s.(2015)multigeneeditingintheescherichiacoligenomeviathecrispr-cas9system,applenvironmicrob81,2506-2514.)。使用hindiii单酶切该片段，与hindiii/bcivi双酶切的ptargetet载体连接，获得ptargetet-tdh载体。该载体包含由引物sgrna-f引入hindiii-bcivi的位点，作为下一轮ps-brick组装的入口位点。再次，使用extaqdna聚合酶和引物sgrna-f/r，以ptargetf-ilv载体为模板进行pcr扩增，获得ilva基因的sgrna片段。使用hindiii单酶切该片段，与hindiii/bcivi双酶切的ptargetet-tdh载体连接，获得ptargetet-tdh-ilv载体(图4a)。使用引物tg-f和sgrna-r进行菌落pcr，并进一步测序鉴定正确的ptargetet-tdh和ptargetet-tdh-ilv载体。

通过两轮ps-brick组装，构建了含有两个相同启动子和终止子sgrna序列的载体ptargetet-tdh-ilv，根据文献(jiang,y.,chen,b.,duan,c.l.,sun,b.b.,yang,j.j.,andyang,s.(2015)multigeneeditingintheescherichiacoligenomeviathecrispr-cas9system,applenvironmicrob81,2506-2514.)的方法进行基因编辑。将ptargetet-tdh-ilva质粒转入mg1655/pcas9感受态中，涂布含有50mg/l卡那霉素和50mg/l壮观霉素的双抗性平板，30℃培养。分别使用引物对ilva-i-f/r和tdh-i-f/r鉴定敲除ilva和tdh基因的转化子。挑选成功敲除了tdh和ilva基因的转化子，先后消除ptargetet-tdh-ilva和pcas质粒，获得大肠杆菌mg1655△tdh△ilva(图4c)。将上述构建的质粒pacyc184-thra⁴³³bc-asd-ptbcd1-rhtc转化至e.colimg1655△tdh△ilva，获得产苏氨酸工程菌。通过7.5l发酵罐进行补料分批发酵，积累43.9±1.4g/l苏氨酸，比没敲除tdh和ilva基因的对照菌株mg1655/pacyc184-thra⁴³³bc-asd-ptbcd1-rhtc提高了20.3％(图4d)，并且发酵过程中没有检测出副产物异亮氨酸。

(五)苏氨酸工程菌的发酵试验

在上述描述中，如无特别说明，其摇瓶发酵实验方法具体如下。

摇瓶发酵试验：

1、取试验菌株，划线接种于含34mg/l氯霉素的固体lb培养基平板，37℃静置培养12小时。

2、完成步骤1后，挑取平板上的菌苔，接种至lb培养基斜面中，37℃静置培养10-12h。

3、完成步骤2后，挑取平板上的菌苔，接种至液体lb培养基中，37℃、220rpm振荡培养12h，得到种子液。

4、完成步骤3后，将种子液按照3％的接种量接种至发酵培养基中，37℃、220rpm震荡培养。

发酵培养基：mops80g/l，葡萄糖20.0g/l、硫酸铵15.0g/l、磷酸二氢钾2.0g/l、七水硫酸镁2.0g/l、酵母粉2.0g/l、微量元素混合液5ml/l，余量为水。

微量元素混合液：feso4·7h2o10g/l、cacl21.35g/l、znso4·7h2o2.25g/l、mnso4·4h2o0.5g/l、cuso4·5h2o1g/l、(nh4)6mo7o24·4h2o0.106g/l、na2b4o7·10h2o0.23g/l、cocl2·6h2o0.48g/l、35％hcl10ml/l，余量为水。

培养过程中，用氨水调节反应体系的ph值使其维持在6.8-7.0。

培养过程中，每隔3-4h取样一次，使用生物传感分析仪sba-40d检测葡萄糖含量，当体系中的葡萄糖含量低于5g/l时，补加葡萄糖并使体系中的葡萄糖浓度达到10g/l。

培养24h后取样，12000g离心2分钟，取上清液，检测l-苏氨酸浓度。

在上述描述中，如无特别说明，其发酵罐发酵实验方法具体如下。

发酵罐发酵试验：

本实施例方法参考专利(申请号201110279419.1)，所用的种子培养基由水和溶质组成；所述溶质在培养基中的浓度如下：葡萄糖40g/l，硫酸铵15g/l，磷酸二氢钾2g/l，硫酸镁2g/l，酵母粉2g/l，l-异亮氨酸0.05g/l，碳酸钙15g/l，微量元素混合液2ml/l。

本实施例所用的发酵初始培养基由水和溶质组成；所述溶质在培养基中的浓度如下：葡萄糖10g/l，硫酸铵10g/l，磷酸二氢钾2g/l，硫酸镁2g/l，酵母粉2g/l，微量元素混合液2ml/l。

通过预实验确定以l-异亮氨酸为底物大肠埃希氏菌e.colimg1655的细胞得率为107g/g(即每克l-异亮氨酸生成107克干重的大肠埃希氏菌e.colimg1655菌体)。

1、获得种子液

(1)将保存在-80℃冻存管的试验菌株划线接种于lb培养基平板，置于37℃培养箱中培养12h；

(2)挑取步骤(1)的单菌落转接入含有3ml液体lb培养基的试管，置于37℃摇床180rpm培养12h；

(3)取步骤(2)的菌液按3％接种量(体积比)转接入含有30ml种子培养基的500ml摇瓶，置于37℃摇床220rpm培养12h，得到种子液(od600＝8.5)。

2、将步骤1的种子液以3％接种量(体积比)接种于发酵罐中的发酵初始培养基，培养至每升发酵液中含有3g菌体(干重)，共得到2.2l发酵液。

整个步骤2中：通过加热套和冷却水控制发酵温度为37℃；通入空气提供溶氧，必要时按1:1的比例(体积比)通氧气和空气混合气，转速与溶氧信号级联控制溶氧为50％；补加25％(体积比)氨水调控ph维持在6.8。

3、采用补料液甲(l-异亮氨酸的水溶液)进行补料，通过biocommandplus生物过程软件控制发酵罐内置的定速可编程控泵，实现指数补料：输入如下程序：f＝(μ·x0·v0·e^μt)/(s·yile/x)，其中f为指数补料速率，μ为设定的比生长速率，x0为初始菌体浓度(数值为3g·l^-1)，v0为初始发酵液体积(数值为2.2l)，e为自然对数(数值为2.718)，t为发酵时间,s为补料液甲中的l-异亮氨酸浓度(数值为2g/l)，yile/x为细胞得率(数值为107g/g)；设置比生长速率为0.16h^-1。持续进行指数补料和发酵直至菌体生长量不再增加。

整个步骤3中：通过加热套和冷却水控制发酵温度为37℃；通入空气提供溶氧，必要时按1:1的比例(体积比)通氧气和空气混合气，转速与溶氧信号级联控制溶氧为50％；补加25％(体积比)氨水调控ph维持在6.8。

培养过程中，每隔3-4h取样一次，12000g离心2分钟，取上清液，检测l-苏氨酸浓度。

(六)苏氨酸hplc检测方法

l-苏氨酸浓度的检测方法：高效液相法，在参考文献(氨基酸和生物资源，2000，22，59-60)中氨基酸检测方法的基础上进行优化，具体方法如下(2,4-二硝基氟苯(fdbn)柱前衍生高效液相法)：

取10μl上清液于2ml离心管中，加入200μl0.5mnahco3水溶液和100μl1％(体积比)fdbn-乙腈溶液，于60℃水浴中暗处恒温加热60min，然后冷却至室温，然后加入700μl0.04mol/lkh2po4水溶液(ph＝7.2±0.05,用40g/lkoh水溶液调整ph)并摇匀，静置15min，然后过滤并收集滤液。滤液用于上样，进样量为15μl。

色谱柱为c18柱(zorbaxeclipsexdb-c18，4.6*150mm,agilent,usa)；柱温：40℃；紫外检测波长：360nm；流动相a为0.04mol/lkh2po4水溶液(ph＝7.2±0.05,用40g/100mlkoh水溶液调整ph)，流动相b为55％(体积比)乙腈水溶液，流动相总流量为1ml/min。

洗脱过程：洗脱起始时刻(0min)流动相a占流动相总流量的体积份数为86％、流动相b占流动相总流量的体积份数为14％；洗脱过程分为4个阶段，每个阶段中流动相a和流动相d占流动相总流量的体积份数均为线性变化；第1阶段(从起始时刻开始共进行2min)结束时流动相a占流动相总流量的体积份数为88％、流动相b占流动相总流量的体积份数为12％，第2阶段(从第1阶段结束时刻开始共进行2min)结束时流动相a占流动相总流量的体积份数为86％、流动相b占流动相总流量的体积份数为14％，第3阶段(从第2阶段结束时刻开始共进行6min)结束时流动相a占流动相总流量的体积份数为70％、流动相b占流动相总流量的体积份数为30％，第4阶段(从第3阶段结束时刻开始共进行10min)结束时流动相a占流动相总流量的体积份数为30％、流动相b占流动相总流量的体积份数为70％。

以市售l-苏氨酸为标准品(购自sigma,货号8917)制作标准曲线，计算样品的苏氨酸浓度。

最后应说明的是：显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

序列表

<110>南京中科游子生物技术研究院有限公司

<120>一种dna组装的方法及其应用

<130>180795ci

<160>17

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>2686

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

tcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtca60

cagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtg120

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<210>2

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

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aacatcaagttggacatcacctcccacaacgaggactacaccatcgtggaacagtacgaa660

cgcgccgagggccgccactccaccggcggcatggacgagctgtacaagtaa711

<210>3

<211>4245

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

gaattccggatgagcattcatcaggcgggcaagaatgtgaataaaggccggataaaactt60

gtgcttatttttctttacggtctttaaaaaggccgtaatatccagctgaacggtctggtt120

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