本申请属于酶工程性领域。具体而言，本申请涉及固定化酶组合物及其制备方法和用途。
背景技术：
脂肪酶是一种工业中常用的生物催化剂，广泛存在于动植物和微生物体内。脂肪酶按其底物特异性可分为五类：无特异性脂肪酶、脂肪酸特异性脂肪酶、位置特异性脂肪酶、立体特异性脂肪酶和底物特异性脂肪酶。具有位置特异性的脂肪酶优先水解甘油三酯的sn-1和sn-3位，因此也被称为sn-1,3专一性脂肪酶。游离的脂肪酶虽然用途广泛，催化技术比较成熟，但其容易受到ph、温度等条件的影响而不稳定，分离困难，大多数情况下只能使用一次，不是工业应用中理想的催化剂。
通常将sn-1,3专一性脂肪酶进行固定化再进行酯交换反应，常用的载体有离子交换树脂、大孔吸附树脂等大颗粒载体。然而采用这类载体的固定化脂肪酶成本高、设备投入大。目前市售的sn-1,3专一性固定化脂肪酶品种少、价格昂贵、大多采用此类载体，并且不适合用于高于60℃的反应。
专利cn1806044b描述了一种sn-1,3专一性脂肪酶粉末的制备方法，该方法通过喷雾干燥得到固定化酶，酶液在喷雾干燥前需要经过超滤处理并调节ph值，制备过程复杂。经喷雾干燥后还需用油脂浸渍或浸润才能得到最终的固定化酶产品，增加了生产成本。专利cn101675159a描述了一种无载体sn-1,3专一性脂肪酶粉末的制备方法，该法所制备的脂肪酶产品颗粒较细、密度小、流动性差，在实际应用中很难与底物分离。而且该方法喷雾干燥入口温度控制非常低，大大降低了生产效率。专利cn103468668b描述了一种采用白炭黑为载体制备粉末脂肪酶的方法，采用该方法所制备的粉末脂肪酶丧失了sn-1,3专一性。
目前还没有关于sn-1,3专一性高并且耐热性好的固定化sn-1,3专一性脂肪酶的报道。
技术实现要素：
第一方面，本申请提供了固定化酶组合物，其包含脂肪酶、载体和植物蛋白。在优选的实施方案中，所述植物蛋白的分子量为约100kda-约400kda，优选为约120kda-约360kda。
第二方面，本申请提供了第一方面所述的固定化酶组合物的制备方法，其包括：将脂肪酶、载体和植物蛋白混合，得到包含脂肪酶、载体和植物蛋白的混合物；以及将上述混合物进行干燥。
在一些实施方案中，上述制备方法包括在入口温度约140℃-约200℃、出口温度约75℃-约120℃的条件下将包含脂肪酶、载体和植物蛋白的混合物进行喷雾干燥。
在上述任一方面的一些实施方案中，所述脂肪酶为sn-1,3专一性脂肪酶。
在上述任一方面的一些实施方案中，所述脂肪酶为来自动物、植物或微生物的脂肪酶。在具体的实施方案中，所述脂肪酶来自选自以下的微生物：疏棉状嗜热丝孢菌(thermomyceslanuginosus)、米黑毛霉(mucormiehei)、萤光假单胞菌(pseudomonasfluorescens)、黑曲霉(aspergillusniger)、米黑根毛霉(rhizomucormiehei)、解脂假丝酵母(candidalipolytica)、根霉(rhizopussp.)或以上微生物的基因改造菌种。
在上述任一方面的一些实施方案中，所述载体为非极性载体，例如疏水载体。在具体的实施方案中，上述载体选自二氧化硅、滑石粉、高岭土、硅藻土、石墨、炭黑、氧化铝粉、玻璃粉、石棉粉、云母粉、石英粉、碳纤维、粉末状软木、金刚砂或其任意组合。
在上述任一方面的一些实施方案中，所述植物蛋白选自大豆分离蛋白、花生分离蛋白、豌豆蛋白、葵籽蛋白、杏仁蛋白中分子量100kda-400kda的蛋白以及分子量为约100kda-约400kda的其他植物蛋白中的一种或多种。
在上述任一方面的一些实施方案中，所述脂肪酶在所述固定化酶组合物中的百分含量以重量计为约0.1％-约20％，优选约1％-约10％。
在上述任一方面的一些实施方案中，所述载体在所述固定化酶组合物中的百分含量以重量计为约10％-约70％，优选约30％-约60％。
在上述任一方面的一些实施方案中，所述植物蛋白在所述固定化酶组合物中的百分含量以重量计为约2％-约50％，优选约8％-约30％。
在上述任一方面的一些实施方案中，所述固定化酶组合物还含有水，例如，所述水在所述固定化酶组合物中的百分含量以重量计为约1％-约25％，优选约3％-约10％。
在上述任一方面的一些实施方案中，所述固定化酶组合物具有sn-1,3专一性。
第三方面，本申请提供了第一方面所述的固定化酶组合物或者第二方面所述的方法制备的固定化酶组合物在酯交换反应中的应用。在一些实施方案中，所述酯交换反应为高温酯交换反应，优选为反应温度高于约70℃的反应。
第四方面，本申请提供了第一方面所述的固定化酶组合物或者第二方面所述的方法制备的固定化酶组合物在制备可可脂改良剂中的应用。
第五方面，本申请提供了高温酯交换反应方法，其包括使用第一方面所述的固定化酶组合物或者第二方面所述的方法制备的固定化酶组合物。在一些实施方案中，所述高温酯交换反应为高于约70℃的反应。
第六方面，本申请提供了提高脂肪酶sn-1,3专一性和/或耐高温性的方法，其包括将脂肪酶与载体和植物蛋白混合，其中所述载体优选为二氧化硅，和/或所述植物蛋白优选为分子量约100kda-约400kda的蛋白。在一些实施方案中，所述耐高温性为耐高于约70℃的温度。
具体实施方式
提供以下定义和方法用以更好地界定本申请以及在本申请实践中指导本领域普通技术人员。除非另作说明，本申请的术语按照相关领域普通技术人员的常规用法理解。
如本文所用术语“脂肪酶”，是指一类具有多种催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、酸解、转酯化及酯类的逆向合成反应。脂肪酶广泛存在于动植物和微生物中。
如本文所用术语“sn-1,3专一性”，是指对甘油三酯或其衍生物(甘油、甘油一酯、甘油二酯)1位和3位基团优先催化。
如本文所用术语“载体”，是指用于负载活性组分以参与某种化学或物理过程的物质。
如本文所用术语“植物蛋白”，是指从植物组织中提取的蛋白质。
如本文所用术语“酯交换反应”，是指酯与醇/酸/酯(相同或不同的酯)在催化剂的催化下生成一个新酯和一个新醇/酸/酯的反应。本文所述的酯交换反应可以为酯酯交换、酸解或醇解。
本文所限定的具体数值前的术语“约”，意味着该具体数值±10％范围内的数值均在本申请要求保护的范围内。
本申请提供了固定化酶组合物，其包含脂肪酶、载体和植物蛋白。在一些实施方案中，本文所用的脂肪酶为sn-1,3专一性脂肪酶。
在一些实施方案中，可使用来自动物、植物的脂肪酶，如猪胰脂肪酶，也可以使用来自微生物的脂肪酶，如来自疏绵状嗜热丝孢菌(thermomyceslanuginosus)、米黑毛霉(mucormiehei)、萤光假单胞菌(pseudomonasfluorescens)、黑曲霉(aspergillusniger)、米黑根毛霉(rhizomucormiehei)、解脂假丝酵母(candidalipolytica)、根霉(rhizopussp.)等中的任何一种或其基因改造菌种。
在一些实施方案中，所述脂肪酶在所述固定化酶组合物中的百分含量以重量计为0.1％-20％，优选1％-10％。
在一些实施方案中，本文所用的脂肪酶载体为非极性载体，例如疏水载体，优选为二氧化硅。
在一些实施方案中，本申请所用的植物蛋白为分子量分布在约100kda-约400kda之间的植物蛋白。在具体的实施方案中，植物蛋白分子量为分布在约100kda-约400kda之间，优选为分布在约120kda-约360kda之间，例如分布在约180kda-约360kda之间、分布在约180kda-约350kda之间、分布在约120-约350kda之间等。在一些实施方案中，本文所用的植物蛋白为大豆分离蛋白、花生分离蛋白、豌豆蛋白、葵籽蛋白、杏仁蛋白中分子量分布在100kda-400kda之间的蛋白或者分子量为分布在约100kda-约400kda之间的其他植物蛋白。在具体实施方案中，所用植物蛋白可以为一种蛋白或两种以上蛋白混合物。在具体的实施方案中，植物蛋白分子量为分布在约100kda-约400kda，优选为约120kda-约360kda，例如分布在约180kda-约360kda之间的大豆分离蛋白、分布在约180kda-约350kda之间的花生球蛋白、分布在约120-约350kda之间的大豆分离蛋白等。
在一些实施方案中，本文公开的固定化酶组合物包含脂肪酶、载体、植物蛋白和水分。在具体的实施方案中，所述固定化酶组合物包含脂肪酶、二氧化硅、分子量为约100kda-约400kda的植物蛋白和水分。在一些实施方案中，所述固定化酶组合物除含有二氧化硅、分子量100kda～400kda的植物蛋白、脂肪酶蛋白和水分外还可以含有其它成分。
本申请还提供了本文公开的固定化酶组合物的制备方法，其包括将脂肪酶、载体和植物蛋白进行混合，以及将上述混合物进行干燥。
在一些实施方案中，上述干燥的方法可以为喷雾干燥、自然干燥、真空干燥、冷冻干燥、旋转蒸发干燥等。
在一些实施方案中，上述干燥的方法优选为喷雾干燥。在具体的实施方案中，制备固定化酶组合物的方法包括以下步骤：
(1)将二氧化硅、分子量约100kda-约400kda的植物蛋白、脂肪酶溶液混合或将任意两种先混合再加入另一种；
(2)在入口温度约140-200℃，出口温度约75-120℃条件下进行喷雾干燥。
在一些实施方案中，以二氧化硅为脂肪酶载体，在较高温度下进行喷雾干燥，喷雾干燥前加入分子量约100kda-约400kda的植物蛋白。
在一些实施方案中，上述制备方法中所用的脂肪酶溶液可以为市售的酶液或由其配制而成的溶液，也可为自行发酵的酶液或由其配制而成的溶液，或者为酶粉配制而成的溶液。
在一些实施方案中，上述制备方法中喷雾干燥的入口温度为约140-200℃，优选约150-180℃。
在一些实施方案中，上述制备方法中喷雾干燥的出口温度为约75-120℃，优选约80-100℃。
在一些实施方案中，上述二氧化硅按固定化酶组合物重量计以约10％-约70％的量存在，优选约30％-约60％。
在一些实施方案中，上述分子量为100kda～400kda的植物蛋白按固定化酶组合物重量计以约2％-约50％的量存在，优选约8％-约30％。
在一些实施方案中，上述脂肪酶按固定化酶组合物重量计以约0.1％-约20％的量存在，优选约1％-约10％。
在一些实施方案中，上述水分按固定化酶组合物重量计以约1％-约25％的量存在，优选约3％-约10％。
在具体实施方案中，本文公开的固定化酶组合物或者利用本文公开的方法制备的固定化酶组合物具有较强的sn-1,3专一性。在一些实施方案中，测定脂肪酶sn-1,3专一性的方法为：以三棕榈酸硬脂精：硬脂酸＝1:2(w/w)为底物，添加3mg酶蛋白/g底物的酶量，在75℃下进行6小时酯交换反应，计算棕榈酸的二位插入率，即sn-2棕榈酸插入率。在具体的实施方案中，本文公开的固定化脂肪酶或者利用本文公开的方法制备的固定化脂肪酶的sn-2棕榈酸插入率大于33％，优选高于50％，例如大于60％。
在具体的实施方案中，本文公开的固定化脂肪酶组合物或者利用本文公开的方法制备的固定化脂肪酶组合物中，载体(例如二氧化硅)和植物蛋白发挥协同作用，能够使耐热性差的脂肪酶适合高温酯交换反应，尤其适合反应温度高于约70℃的反应。
在一些实施方案中，本申请以较高的温度对包含脂肪酶、载体(例如二氧化硅)和植物蛋白的混合物进行干燥来制备粉末型sn-1,3专一性脂肪酶，大大提高了生产效率。
在一些实施方案中，为了避免干燥时温度过高造成的脂肪酶失活，采用二氧化硅作为脂肪酶的载体，在干燥前加入分子量100kda-400kda的植物蛋白，利用二氧化硅、分子量为100kda-400kda的植物蛋白、水分和脂肪酶蛋白的有效结合，赋予固定化脂肪酶较高的活力、sn-1,3专一性和/或良好的耐热性，使其适合高温酯交换反应，尤其适合高于70℃的反应。在具体的实施方案中，上述干燥为喷雾干燥。
因此，在一些实施方案中，将本文公开的固定化酶组合物或者利用本文公开的方法制备的固定化酶组合物用于酯交换反应，特别是高温酯交换反应，优选为反应温度高于约70℃的反应。
在另一些实施方案中，本文公开的固定化酶组合物或者利用本文公开的方法制备的固定化酶组合物可以用于制备可可脂改良剂，例如sos。
本申请还提供了一种高温酯交换反应方法，其包括使用本文公开的固定化酶组合物或者利用本文公开的方法制备的固定化酶组合物。在优选的实施方案中，所述高温酯交换反应为高于约70℃的反应。
另外，本申请还提供了一种提高脂肪酶sn-1,3专一性和/或耐高温性(例如耐高于约70℃的温度)的方法，其包括将脂肪酶与载体和植物蛋白混合。在优选的实施方案中，所述载体为二氧化硅，以及所述植物蛋白为分子量约100kda-约400kda的蛋白。
本申请的发明人发现，本文公开的固定化脂肪酶或其制备方法具有以下一种或多种优势：利用例如二氧化硅作为脂肪酶的载体，所制备的产品流动性好，易于分散到底物中；采用较高的入口温度进行干燥(例如喷雾干燥)，大大提高了生产效率；所制备的固定化脂肪酶具有较高的sn-1,3专一性，是无载体或二氧化硅单独作为载体所无法达到的；和/或所制备的固定化脂肪酶耐热性好，适合高温酯交换反应，尤其适合反应温度高于70℃的反应。
在本说明书和权利要求书中，词语“包括”、“包含”和“含有”意指“包括但不限于”，且并非意图排除其他部分、添加物、组分、或步骤。
应该理解，在本申请的特定方面、实施方案或实施例中描述的特征、特性、组分或步骤，可适用于本文所描述的任何其他的方面、实施方案或实施例，除非与之矛盾。
下述实施例仅是说明性的，并不意图限制本申请实施方案的范围或者所附的权利要求的范围。
实施例
在下述实施例中，水分含量的测定方法参照中华人民共和国国家标准gb5009.3-2010；喷雾干燥法参照文献“潘雪,谭天伟.假丝酵母99-125脂肪酶喷雾干燥工艺及催化性质的研究.生物加工过程,2010(8):30-35”进行；蛋白分离及分子量的测定参照文献“任健,郑喜群,刘晓兰等.葵花蛋的分离及特性研究.中国粮油学报,2008(23):100-103”及“杨晓泉,陈中,赵谋民.花生蛋白的分离及部分性质研究.中国粮油学报,2001(16):26-28”进行。
实施例1固定化酶组合物的制备
1.1将40g脂肪酶粉末(疏绵状嗜热丝孢菌(thermomyceslanuginosus)脂肪酶，夏盛(上海)生物科技有限公司)溶于100mlph7.0的磷酸盐缓冲液中，充分搅拌溶解，离心除去不可溶固体得脂肪酶液。将8g卵清蛋白(约44.5kda，gentihold公司)分散于200ml水中，充分混匀。向上述蛋白液中加入脂肪酶液和20g二氧化硅(grace公司)，在25℃下以120rpm气浴摇床充分混匀，在入口温度150℃、出口温度85℃下进行喷雾干燥，制得固定化脂肪酶组合物a。
1.2将40g脂肪酶粉末(疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶，夏盛(上海)生物科技有限公司)溶于100mlph7.0的磷酸盐缓冲液中，充分搅拌溶解，离心除去不可溶固体得脂肪酶液。将8g牛血清白蛋白(约66kda，上海宝曼生物科技有限公司)分散于200ml水中，充分混匀。向上述蛋白液中加入脂肪酶液和20g二氧化硅(grace公司)，在25℃下以120rpm气浴摇床充分混匀，在入口温度150℃、出口温度85℃下进行喷雾干燥，制得固定化脂肪酶组合物b。
1.3将40g脂肪酶粉末(疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶，夏盛(上海)生物科技有限公司)溶于100mlph7.0的磷酸盐缓冲液中，充分搅拌溶解，离心除去不可溶固体得脂肪酶液。将8g鱼精蛋白(约4kda，江西百盈生物技术有限公司)分散于200ml水中，充分混匀。向上述蛋白液中加入脂肪酶液和20g二氧化硅(grace公司)，在25℃下以120rpm气浴摇床充分混匀，在入口温度150℃、出口温度85℃下进行喷雾干燥，制得固定化脂肪酶组合物c。
1.4将40g脂肪酶粉末(疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶，夏盛(上海)生物科技有限公司)溶于100mlph7.0的磷酸盐缓冲液中，充分搅拌溶解，离心除去不可溶固体得脂肪酶液。将8g大豆分离蛋白(约180-360kda，益海嘉里(秦皇岛)蛋白工业有限公司，型号d210)分散于200ml水中，充分混匀。向上述蛋白液中加入脂肪酶液和20g二氧化硅(grace公司)，在25℃下以120rpm气浴摇床充分混匀，在入口温度150℃、出口温度85℃下进行喷雾干燥，制得固定化脂肪酶组合物d。
1.5将8g花生球蛋白(约180-350kda，益海嘉里(秦皇岛)蛋白工业有限公司，批号20180302)分散于200ml水中，充分混匀。向上述蛋白液中加入100mlpalatase20000l(novozymes，米黑根毛霉(rhizomucormiehei))酶液和20g二氧化硅(天津市龙华化工有限公司)，在25℃下以120rpm气浴摇床充分混匀，在入口温度150℃、出口温度85℃下进行喷雾干燥，制得固定化脂肪酶组合物e。
1.6将40g脂肪酶粉末(疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶，夏盛(上海)生物科技有限公司)溶于100mlph7.0的磷酸盐缓冲液中，充分搅拌溶解，离心除去不可溶固体得脂肪酶液。将100ml酵母细胞壁蛋白溶液(约200kda，自制(具体方法为将酵母细胞用玻璃珠破碎，离心，充分洗涤后加入2％sds缓冲液，100℃抽提10min，得到酵母细胞壁非共价键结合蛋白溶液))分散于200ml水中，充分混匀。向上述蛋白液中加入脂肪酶液和20g二氧化硅(grace公司)，在25℃下以120rpm气浴摇床充分混匀，在入口温度150℃、出口温度85℃下进行喷雾干燥，制得固定化脂肪酶组合物f。
1.7将40g脂肪酶粉末(疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶，夏盛(上海)生物科技有限公司)溶于100mlph7.0的磷酸盐缓冲液中，充分搅拌溶解，离心除去不可溶固体得脂肪酶液。将8g大米谷蛋白(＞650kda，江西金农生物科技有限公司)分散于200ml水中，充分混匀。向上述蛋白液中加入脂肪酶液和20g二氧化硅(grace公司)，在25℃下以120rpm气浴摇床充分混匀，在入口温度150℃、出口温度85℃下进行喷雾干燥，制得固定化脂肪酶组合物g。
1.8将8g大豆分离蛋白(约120-350kda，山松生物，型号sd-100)分散于200ml水中，充分混匀。向上述蛋白液中加入100mllipozymetl100l(novozymes，疏绵状嗜热丝孢菌)酶液和20g二氧化硅(天津市龙华化工有限公司)，在25℃下以120rpm气浴摇床充分混匀，在入口温度150℃、出口温度85℃下进行喷雾干燥，制得固定化脂肪酶组合物h。
所制备的固定化脂肪酶组合物中各组分的含量如表1所示。
表1固定化酶组合物中各组分含量
比较例1
将40g脂肪酶粉末(疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶，夏盛(上海)生物科技有限公司)溶于100mlph7.0的磷酸盐缓冲液中，充分搅拌溶解，离心除去不可溶固体得脂肪酶液。向上述脂肪酶液中加入20g二氧化硅(grace公司)，在25℃下以120rpm气浴摇床充分混匀，在入口温度150℃、出口温度85℃下进行喷雾干燥，制得固定化脂肪酶组合物i。
比较例2
将40g脂肪酶粉末(疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶，夏盛(上海)生物科技有限公司)溶于100mlph7.0的磷酸盐缓冲液中，充分搅拌溶解，离心除去不可溶固体得脂肪酶液。将8g大豆蛋白(约180-350kda，益海嘉里(秦皇岛)蛋白工业有限公司)分散于200ml水中，充分混匀。将大豆蛋白液与脂肪酶液在25℃下以120rpm气浴摇床充分混匀，在入口温度150℃、出口温度85℃下进行喷雾干燥，制得固定化脂肪酶组合物j。
实施例2固定化脂肪酶的酯交换活力
以三棕榈酸硬脂精和硬脂酸作为反应底物(质量比1:2)，固定化脂肪酶组合物添加量为3mg酶蛋白/g底物，75℃下反应6小时。反应结束后分离出产物，用分子蒸馏除去产物中的游离脂肪酸后，对剩余产物的脂肪酸组成进行测定。脂肪酸组成的测定方法参照“gb5009.168-2016食品中脂肪酸的测定”中的第三法归一化法。表2显示了各固定化脂肪酶组合物的硬脂酸插入率即硬脂酸占总脂肪酸的百分比。硬脂酸插入率越高说明固定化脂肪酶的酯交换活力越高。
表2固定化脂肪酶酯交换产物硬脂酸插入率(％)
由表2的数据可以看出，包含植物蛋白、二氧化硅的本申请固定化脂肪酶组合物(例如脂肪酶组合物d、e、h)相比不含植物蛋白或二氧化硅的固定化脂肪酶组合物具有较高的酯交换活力。
实施例3固定化脂肪酶的专一性
本实施例通过测定实施例2中固定化脂肪酶催化产物中脂肪酸和2-位脂肪酸组成来确定固定化脂肪酶的专一性。
固定化脂肪酶催化产物中脂肪酸组成的测定方法参照实施例2中产物的处理和测定方法，脂肪酸组成中棕榈酸占总脂肪酸的百分比为m。2-位脂肪酸组成的测定方法参照gbt24894-2010《动植物油脂甘三酯分子2-位脂肪酸组分的测定》，2-位脂肪酸组成中，棕榈酸占总脂肪酸的百分比为n，并计算sn-2棕榈酸插入率。
sn-2棕榈酸插入率(％)＝100*n/3m
sn-2棕榈酸插入率大于33％说明固定化脂肪酶具有sn-1,3专一性，并且sn-2棕榈酸插入率越大表明sn-1,3专一性越强。表3显示了固定化脂肪酶酯交换产物sn-2棕榈酸插入率。
表3固定化脂肪酶酯交换产物sn-2棕榈酸插入率(％)
由表3的数据可以看出，固定化脂肪酶组合物i(其不含植物蛋白)几乎没有sn-1,3专一性，而包含植物蛋白、二氧化硅的固定化脂肪酶组合物(例如脂肪酶组合物d、e、h)相比不含植物蛋白或二氧化硅的固定化脂肪酶组合物具有较强的sn-1,3专一性。
实施例4固定化脂肪酶用于可可脂改良剂的制备
将高油酸葵花籽油与硬脂酸按质量比1:2的比例混合溶解配制成反应底物，然后以300mg酶蛋白/g底物的量添加固定化脂肪酶组合物，75℃水浴，150rpm反应5h，制备可可脂改良剂sos。取样进行gc分析甘油三酯组成。表4显示了催化产物甘油三酯组成中sos的含量。
表4固定化脂肪酶催化产物甘油三酯组成中sos的含量(％)
由表4的数据可以看出，包含植物蛋白、二氧化硅的本申请的固定化脂肪酶组合物，例如脂肪酶组合物d、e，适用于可可脂改良剂的制备。
可以理解，尽管本申请以某种形式被说明，但本申请并不局限于本说明书中所显示和描述的内容。对本领域的技术人员显而易见的是，在不偏离本申请的范围的前提下还可对所述实施方式和/或某一特征或参数做出各种变化，这些变化都在本申请要求保护的范围内。