本发明涉及细胞技术领域，特别涉及一种新的cik细胞培养方法。
背景技术：
cik细胞(cytokineinducedkiller，细胞因子诱导的杀伤细胞)是一种新型的免疫活性细胞，它是自体外周血单个核细胞，经多种细胞因子共同诱导培养产生的一类cd3+和cd56+两种膜蛋白分子共同表达的杀伤细胞。cik细胞具有抗肿瘤活性和非mhc杀瘤特性，是一种具有增殖速度快，杀瘤活性高，杀瘤谱广等特点的效应细胞。
dc细胞虽然可以促进cik细胞的增殖及杀伤活性，但是dc细胞必须经过体外的扩增培养，且扩增的效果还不是很理想，扩增能力较差。且dc细胞的扩增体系需用到多种细胞因子，甚至有的现有方法还加入了某些单抗，造成了dc和cik细胞共培养方法的复杂程度和成本。
常见的cik细胞体外培养方法是在添加相应的细胞因子的无血清培养基中培养外周血单个核细胞(pbmc)，在细胞因子的刺激下诱导pbmc成为cik细胞。但采用这种方法培养cik细胞时，cik细胞的增殖效果较差。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种新的cik细胞培养方法，所要解决的技术问题是：培养cik细胞时，cik细胞的增殖效果较差。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种新的cik细胞培养方法，包括以下步骤：
将b细胞用含有flt3细胞因子和il-2细胞因子的免疫细胞培养基重悬，然后加入肿瘤抗原刺激b细胞；
将cik细胞和经过肿瘤抗原刺激后的b细胞共培养，并补加含il-2的免疫细胞培养基共培养，定期补充含il-2细胞因子、干扰素-γ、cd3激发型单抗、白细胞介素-2、ifn-λ细胞因子、il-1α细胞因子、okt-3细胞因子和香菇多糖的免疫细胞培养基。
进一步，所述flt3细胞因子在免疫细胞培养基中的浓度为10-20ng/ml，il-2细胞因子在免疫细胞培养基中的浓度为10-50u/ml。
进一步，所述干扰素-γ在免疫细胞培养基中的含量为300～850u/ml；所述cd3激发型单抗在免疫细胞培养基中的含量为20～35ng/ml；所述白细胞介素-2在免疫细胞培养基中的含量为300～400u/ml。
进一步，所述ifn-λ细胞因子在免疫细胞培养基中的含量为500-1500u/ml，所述il-1α细胞因子在免疫细胞培养基中的含量为50-150u/ml、所述okt-3细胞因子在免疫细胞培养基中的含量为10-50ng/ml。
进一步，所述cik细胞由单个核细胞诱导培养获得，具体为将单个核细胞用x-vivo15培养基重悬，获得得到细胞悬液；将细胞悬液按照1×106-2×106/ml的密度接种在细胞培养瓶中，并加入500-1500u/mlifn-λ，在37℃、5％二氧化碳的培养箱诱导培养cik细胞。
进一步，所述cik细胞和b细胞的体积比为9:1。
本发明的有益效果是：通过b细胞和cik细胞之间的相互作用促进cik细胞增殖和杀伤活性的提高，同时又避免了dc体外扩增培养和添加多种细胞因子和抗体的复杂操作，整体工艺得到简化；
本发明技术方案还抑制了cd4+cd25+调节性t细胞的产生，降低了其数量进而降低了其免疫抑制作用，使cik细胞治疗发挥最大的免疫作用；
在cik细胞培养液中加入香菇多糖，使用这种培养液进行cik细胞培养时，能够促进pbmc产生淋巴细胞活化因子和释放辅助性t细胞因子，从而促进cik细胞的增殖，进而使培养得到的cik细胞表现出大的扩增倍数、强的杀伤活性和高的细胞表面抗原含量。
具体实施方式
以下结合对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1：
一种新的cik细胞培养方法，包括以下步骤：
将b细胞用含有flt3细胞因子和il-2细胞因子的免疫细胞培养基重悬，然后加入肿瘤抗原刺激b细胞；
将cik细胞和经过肿瘤抗原刺激后的b细胞共培养，并补加含il-2的免疫细胞培养基共培养，定期补充含il-2细胞因子、干扰素-γ、cd3激发型单抗、白细胞介素-2、ifn-λ细胞因子、il-1α细胞因子、okt-3细胞因子和香菇多糖的免疫细胞培养基。
上述实施例中，所述flt3细胞因子在免疫细胞培养基中的浓度为10ng/ml，il-2细胞因子在免疫细胞培养基中的浓度为50u/ml。
上述实施例中，所述干扰素-γ在免疫细胞培养基中的含量为850u/ml；所述cd3激发型单抗在免疫细胞培养基中的含量为20ng/ml；所述白细胞介素-2在免疫细胞培养基中的含量为300u/ml。
上述实施例中，所述ifn-λ细胞因子在免疫细胞培养基中的含量为1500u/ml，所述il-1α细胞因子在免疫细胞培养基中的含量为50u/ml、所述okt-3细胞因子在免疫细胞培养基中的含量为10ng/ml。
上述实施例中，所述cik细胞由单个核细胞诱导培养获得，具体为将单个核细胞用x-vivo15培养基重悬，获得得到细胞悬液；将细胞悬液按照1×106-2×106/ml的密度接种在细胞培养瓶中，并加入1500u/mlifn-λ，在37℃、5％二氧化碳的培养箱诱导培养cik细胞。
上述实施例中，所述cik细胞和b细胞的体积比为9:1。
通过b细胞和cik细胞之间的相互作用促进cik细胞增殖和杀伤活性的提高，同时又避免了dc体外扩增培养和添加多种细胞因子和抗体的复杂操作，整体工艺得到简化。
实施例2：
一种新的cik细胞培养方法，包括以下步骤：
将b细胞用含有flt3细胞因子和il-2细胞因子的免疫细胞培养基重悬，然后加入肿瘤抗原刺激b细胞；
将cik细胞和经过肿瘤抗原刺激后的b细胞共培养，并补加含il-2的免疫细胞培养基共培养，定期补充含il-2细胞因子、干扰素-γ、cd3激发型单抗、白细胞介素-2、ifn-λ细胞因子、il-1α细胞因子、okt-3细胞因子和香菇多糖的免疫细胞培养基。
上述实施例中，所述flt3细胞因子在免疫细胞培养基中的浓度为20ng/ml，il-2细胞因子在免疫细胞培养基中的浓度为10u/ml。
上述实施例中，所述干扰素-γ在免疫细胞培养基中的含量为300u/ml；所述cd3激发型单抗在免疫细胞培养基中的含量为35ng/ml；所述白细胞介素-2在免疫细胞培养基中的含量为400u/ml。
上述实施例中，所述ifn-λ细胞因子在免疫细胞培养基中的含量为500u/ml，所述il-1α细胞因子在免疫细胞培养基中的含量为150u/ml、所述okt-3细胞因子在免疫细胞培养基中的含量为50ng/ml。
上述实施例中，所述cik细胞由单个核细胞诱导培养获得，具体为将单个核细胞用x-vivo15培养基重悬，获得得到细胞悬液；将细胞悬液按照1×106-2×106/ml的密度接种在细胞培养瓶中，并加入1500u/mlifn-λ，在37℃、5％二氧化碳的培养箱诱导培养cik细胞。
上述实施例中，所述cik细胞和b细胞的体积比为9:1。
通过b细胞和cik细胞之间的相互作用促进cik细胞增殖和杀伤活性的提高，同时又避免了dc体外扩增培养和添加多种细胞因子和抗体的复杂操作，整体工艺得到简化。
实施例3：
一种新的cik细胞培养方法，包括以下步骤：
将b细胞用含有flt3细胞因子和il-2细胞因子的免疫细胞培养基重悬，然后加入肿瘤抗原刺激b细胞；
将cik细胞和经过肿瘤抗原刺激后的b细胞共培养，并补加含il-2的免疫细胞培养基共培养，定期补充含il-2细胞因子、干扰素-γ、cd3激发型单抗、白细胞介素-2、ifn-λ细胞因子、il-1α细胞因子、okt-3细胞因子和香菇多糖的免疫细胞培养基。
上述实施例中，所述flt3细胞因子在免疫细胞培养基中的浓度为15ng/ml，il-2细胞因子在免疫细胞培养基中的浓度为30u/ml。
上述实施例中，所述干扰素-γ在免疫细胞培养基中的含量为300～850u/ml；所述cd3激发型单抗在免疫细胞培养基中的含量为20～35ng/ml；所述白细胞介素-2在免疫细胞培养基中的含量为300～400u/ml。
上述实施例中，所述ifn-λ细胞因子在免疫细胞培养基中的含量为1000u/ml，所述il-1α细胞因子在免疫细胞培养基中的含量为100u/ml、所述okt-3细胞因子在免疫细胞培养基中的含量为30ng/ml。
上述实施例中，所述cik细胞由单个核细胞诱导培养获得，具体为将单个核细胞用x-vivo15培养基重悬，获得得到细胞悬液；将细胞悬液按照1×106-2×106/ml的密度接种在细胞培养瓶中，并加入1000u/mlifn-λ，在37℃、5％二氧化碳的培养箱诱导培养cik细胞。
上述实施例中，所述cik细胞和b细胞的体积比为9:1。
通过b细胞和cik细胞之间的相互作用促进cik细胞增殖和杀伤活性的提高，同时又避免了dc体外扩增培养和添加多种细胞因子和抗体的复杂操作，整体工艺得到简化。
实施例4：
一种新的cik细胞培养方法，包括以下步骤：
将b细胞用含有flt3细胞因子和il-2细胞因子的免疫细胞培养基重悬，然后加入肿瘤抗原刺激b细胞；
将cik细胞和经过肿瘤抗原刺激后的b细胞共培养，并补加含il-2的免疫细胞培养基共培养，定期补充含il-2细胞因子、干扰素-γ、cd3激发型单抗、白细胞介素-2、ifn-λ细胞因子、il-1α细胞因子、okt-3细胞因子和香菇多糖的免疫细胞培养基。
上述实施例中，所述flt3细胞因子在免疫细胞培养基中的浓度为15ng/ml，il-2细胞因子在免疫细胞培养基中的浓度为35u/ml。
上述实施例中，所述干扰素-γ在免疫细胞培养基中的含量为650u/ml；所述cd3激发型单抗在免疫细胞培养基中的含量为28ng/ml；所述白细胞介素-2在免疫细胞培养基中的含量为350u/ml。
上述实施例中，所述ifn-λ细胞因子在免疫细胞培养基中的含量为800u/ml，所述il-1α细胞因子在免疫细胞培养基中的含量为120u/ml、所述okt-3细胞因子在免疫细胞培养基中的含量为25ng/ml。
上述实施例中，所述cik细胞由单个核细胞诱导培养获得，具体为将单个核细胞用x-vivo15培养基重悬，获得得到细胞悬液；将细胞悬液按照1×106-2×106/ml的密度接种在细胞培养瓶中，并加入800u/mlifn-λ，在37℃、5％二氧化碳的培养箱诱导培养cik细胞。
上述实施例中，所述cik细胞和b细胞的体积比为9:1。
通过b细胞和cik细胞之间的相互作用促进cik细胞增殖和杀伤活性的提高，同时又避免了dc体外扩增培养和添加多种细胞因子和抗体的复杂操作，整体工艺得到简化。
实施例5：
一种新的cik细胞培养方法，包括以下步骤：
将b细胞用含有flt3细胞因子和il-2细胞因子的免疫细胞培养基重悬，然后加入肿瘤抗原刺激b细胞；
将cik细胞和经过肿瘤抗原刺激后的b细胞共培养，并补加含il-2的免疫细胞培养基共培养，定期补充含il-2细胞因子、干扰素-γ、cd3激发型单抗、白细胞介素-2、ifn-λ细胞因子、il-1α细胞因子、okt-3细胞因子和香菇多糖的免疫细胞培养基。
上述实施例中，所述flt3细胞因子在免疫细胞培养基中的浓度为12ng/ml，il-2细胞因子在免疫细胞培养基中的浓度为22u/ml。
上述实施例中，所述干扰素-γ在免疫细胞培养基中的含量为550u/ml；所述cd3激发型单抗在免疫细胞培养基中的含量为26ng/ml；所述白细胞介素-2在免疫细胞培养基中的含量为330u/ml。
上述实施例中，所述ifn-λ细胞因子在免疫细胞培养基中的含量为1200u/ml，所述il-1α细胞因子在免疫细胞培养基中的含量为80u/ml、所述okt-3细胞因子在免疫细胞培养基中的含量为40ng/ml。
上述实施例中，所述cik细胞由单个核细胞诱导培养获得，具体为将单个核细胞用x-vivo15培养基重悬，获得得到细胞悬液；将细胞悬液按照1×106-2×106/ml的密度接种在细胞培养瓶中，并加入800u/mlifn-λ，在37℃、5％二氧化碳的培养箱诱导培养cik细胞。
上述实施例中，所述cik细胞和b细胞的体积比为9:1。
通过b细胞和cik细胞之间的相互作用促进cik细胞增殖和杀伤活性的提高，同时又避免了dc体外扩增培养和添加多种细胞因子和抗体的复杂操作，整体工艺得到简化。
实施例6：
一种新的cik细胞培养方法，包括以下步骤：
将b细胞用含有flt3细胞因子和il-2细胞因子的免疫细胞培养基重悬，然后加入肿瘤抗原刺激b细胞；
将cik细胞和经过肿瘤抗原刺激后的b细胞共培养，并补加含il-2的免疫细胞培养基共培养，定期补充含il-2细胞因子、干扰素-γ、cd3激发型单抗、白细胞介素-2、ifn-λ细胞因子、il-1α细胞因子、okt-3细胞因子和香菇多糖的免疫细胞培养基。
上述实施例中，所述flt3细胞因子在免疫细胞培养基中的浓度为15ng/ml，il-2细胞因子在免疫细胞培养基中的浓度为40u/ml。
上述实施例中，所述干扰素-γ在免疫细胞培养基中的含量为750u/ml；所述cd3激发型单抗在免疫细胞培养基中的含量为25ng/ml；所述白细胞介素-2在免疫细胞培养基中的含量为340u/ml。
上述实施例中，所述ifn-λ细胞因子在免疫细胞培养基中的含量为1200u/ml，所述il-1α细胞因子在免疫细胞培养基中的含量为120u/ml、所述okt-3细胞因子在免疫细胞培养基中的含量为30ng/ml。
上述实施例中，所述cik细胞由单个核细胞诱导培养获得，具体为将单个核细胞用x-vivo15培养基重悬，获得得到细胞悬液；将细胞悬液按照1×106-2×106/ml的密度接种在细胞培养瓶中，并加入1100u/mlifn-λ，在37℃、5％二氧化碳的培养箱诱导培养cik细胞。
上述实施例中，所述cik细胞和b细胞的体积比为9:1。
通过b细胞和cik细胞之间的相互作用促进cik细胞增殖和杀伤活性的提高，同时又避免了dc体外扩增培养和添加多种细胞因子和抗体的复杂操作，整体工艺得到简化。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。