富硒的花生四烯酸油脂制品、富硒高山被孢霉和制备方法与流程

本发明涉及富硒发酵技术领域，具体而言，涉及一种富硒的花生四烯酸油脂制品、富硒高山被孢霉和制备方法。

背景技术：

硒对人体的好处：硒(se)被世界卫生组织和中华医学会定为21世纪继碘、锌后必补的第三大微量营养保健元素，它对人体具有抗氧化、防癌变、排毒、提高免疫力等作用。

目前摄取人工添加的各类补硒产品主要分为无机硒和有机硒两类，无机硒主要为亚硒酸钠，国外多用于饲料使用，有很大的毒素，以及处于技术淘汰的边缘。有机硒与亚硒酸钠等无机硒相比，具有食用安全、无毒副作用、吸收利用率高、营养价值高等优点。有机硒的种类很多，如硒酵母、硒蛋、富硒藻类、富硒蘑菇和硒麦芽等等。

花生四烯酸是一种ω-6多不饱和脂肪酸，英文缩写为,又名aa，在体内发挥多重作用。首先，它是体内多种循环二十烷酸衍生物的前体，如前列腺素、前列腺环素、血栓烷素和白细胞三烯等；第二，花生四烯酸可促进神经及大脑发育，又因婴幼儿体内部分酶功能未完善，自身合成花生四烯酸能力较低，需补充外源花生四烯酸以促进神经及智力发育；第三，花生四烯酸作为结构成分与磷脂相结合；另外，花生四烯酸还具有提高视觉敏锐度、增强血管弹性、降低血液黏稠度等多种生理功能。花生四烯酸除动物组织提取外，工业上主要由两类生物获取，一是被孢霉类发酵生产，如高山被孢霉(mortierellaalpina)、深黄被孢霉(mortierellaisabellina)、长被孢霉(mortierellaelongata)等；二是通过海洋微藻培养所得，如紫球藻(porphyridium)、缺刻缘绿藻(porphyridiumincisa)，但此方法目前应用并不广泛，仅处于实验及试生产阶段

高山被孢霉是目前常见的产花生四烯酸油脂的菌种，但是高山被孢霉株只产微生物油脂，产品单一，营养单一，资源利用不充分；普通高山被孢霉的硒转化能力较弱，对硒的耐受性差，需要通过筛选驯化得到富硒高山被孢霉，但筛选驯化需要花大量的时间人力。高山被孢霉发酵前期生长缓慢，中后期产物与生物量无法同时积累，而我们发现适时适量的添加硒能够适当改善高山被孢霉中后期的产量问题，并且能够使高山被孢霉富集生物硒。

鉴于此，本发明通过改善发酵中富硒的工艺条件得到富硒的花生四烯酸即ara油脂。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种富硒的花生四烯酸油脂制品，该制品中富含硒元素和花生四烯酸油脂，具有较高的营养价值。

本发明的另一目的在于提供上述花生四烯酸油脂制品的制备方法。

本发明的目的在于提供一种富硒高山被孢霉的制备方法，该制备方法可以制得富含硒元素和花生四烯酸油脂的高山被孢霉。

本发明的目的在于提供一种富硒高山被孢霉，其由上述的制备方法制得。

本发明是这样实现的：

一方面，本发明提供了富硒的花生四烯酸油脂制品，其含花生四烯酸油脂和硒元素；

优选的，所述制品中每克干菌体至少含有0.017mg的硒元素；

优选的，所述制品中每克干菌体中至多可达到0.112mg的硒元素

优选的，所述制品中每克干菌体中至少含有0.17g的花生四烯酸油脂。

优选的，所述制品中每克干菌体中至多可以达到0.27g的花生四烯酸油脂。

本发明提供的富硒的花生四烯酸油脂制品其含有花生四烯酸油脂和硒元素，具有较高的营养价值。

本发明提供的富硒的花生四烯酸油脂制品，不仅富含花生四烯酸油脂，还富含有机硒元素。该制品消除了化学硒(如亚硒酸钠)对人体的毒副反应和肠胃刺激，使硒能够更高效、更安全地被人体吸收利用。

另一方面，本发明提供了上述花生四烯酸油脂制品的制备方法，其包括：

发酵步骤：往接种有高山被孢霉的发酵培养基中添加硒盐；

其中，所述硒盐可以是2-羟基-4甲基硒代丁酸或其盐、亚硒酸盐、硒酸、硒酸盐、硒代半胱氨酸、硒代甲硫氨酸、硒代胱硫醚、硒代高半胱氨酸或se-腺苷硒代甲硫氨酸，优选地，硒盐可以是亚硒酸钠。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，在发酵的第0-140h添加所述硒盐。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述硒盐的添加量为1-50mg/l，优选的，硒盐添加量为2-20mg/l。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述硒盐的添加方式是一次性加入、分批加入、流加，或者，在从所述发酵培养基中富集高山被孢霉体，向富集的所述高山被孢霉菌体中加入所述硒盐；

优选的，在第24-48h，以流加方式添加所述硒盐，或者，在第24-48h内任一时间以一次性加入方式添加所述硒盐，或者，在24-48h内分两批加入，或者，优选的在第36-48小时内任一时间进行富集添加。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，从所述发酵培养基中富集高山被孢霉体，向富集的所述高山被孢霉体中加入所述硒盐。优选的在第36-48h之内实现此操作。

其中富集的方式，优选本发明方案中的富集设备，本发明的富集设备特别适合霉菌的富集发酵，将富集和后续的发酵连续起来，效率提高的同时微生物的适应性更好，并且能够避免发酵罐外富集操作的染菌风险。

另外，在一些实施例中，离心，过滤皆可以得到高浓度的高山被孢霉体。

富集后可以保留原体积五分之一的培养基，也可以加入新鲜的为原体积五分之一的培养基，在培养基中加入所述硒盐，后续的培养中根据耗糖速度进行补料。

由于硒对细胞具有一定的毒性，高浓度的无机硒会抑制菌体生长代谢，发明人发现高山被孢霉非常敏感，浓度较高得硒即会影响其生长，所以在加入无机硒前将菌体进行富集，在保证高富硒能力的同时，能够减少单位细胞吸收的硒量，进而降低无机硒对菌体的毒性。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，在发酵的第0-140h往所述发酵培养基中添加发酵助剂，优选的，富硒助剂为十二烷基磺酸钠(sds)或环己氨基磺酸钠(甜蜜素)；

优选的，助剂的添加量0.01-1g/l，进一步优选的助剂的添加量为0.1-0.5g/l。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，在第36-48h中，从所述发酵培养基中富集菌体后，添加助剂。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，助剂的添加方式是一次性加入、分批加入、流加或者在富集时候加入。

发明人意外的发现添加富硒助剂能够提升硒的富集量，其原因可能是在富硒的过程中主要起到提供了有机硫来源的作用，从而能够提高甲硫氨酸的表达量，进一步提高硒与甲硫氨酸的结合，进而提高富硒效果。

助剂主要为十二烷基磺酸钠或环己氨基磺酸钠。环己氨基磺酸钠作为食品生产中常用的添加剂，具有较高的安全性。十二烷基磺酸钠能够提高甲硫氨酸的表达，并且，发明人发现富集之后，高山被孢霉菌丝容易缠绕非常影响生长，而搅拌等操作又极易使菌丝断裂，造成高山被孢霉停滞生长，添加sds，能够使霉菌缠绕的菌丝解开，并且sds可以利用其作为氧载体，加强高山被孢霉的供氧，从而提升高山被孢霉的生长状况，进而提高高山被孢霉的富硒效果。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，助剂的添加方式是在24-48h之内一次性加入、分批加入或流加。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述高山被孢霉的保藏编号为：cctccno.m2015421。

该菌于2015年7月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：cctccno.m2015421，地址：中国武汉武汉大学，分类学命名：mortierellaalpine。

本发明提供的富硒高山被孢霉的制备方法，通过优化、改变发酵中的工艺条件，使高山被孢霉株的硒转化能力有较大的提高，得到富含硒元素的高浓度花生四烯酸微生物油脂。高山被孢霉生长时吸收利用了硒，使硒与高山被孢霉体内的蛋白质和多糖有机结合转化为生物硒，从而消除了化学硒(如亚硒酸钠)对人体的毒副反应和肠胃刺激，使硒能够更高效、更安全地被人体吸收利用。

另一方面，本发明提供了一种富硒高山被孢霉的制备方法，其包括：往接种有高山被孢霉的发酵培养基中添加硒。

进一步的，在本发明的一些实施方案中，在发酵的第0-140h添加所述硒盐。

进一步的，在本发明的一些实施方案中，所述硒盐的添加量为1-50mg/l；优选的，硒盐添加量为2-20mg/l。

进一步的，在本发明的一些实施方案中，所述硒盐的添加方式是一次性加入、分批加入、流加，或者，在从所述发酵培养基中富集高山被孢霉体，向富集的所述高山被孢霉菌体中加入所述硒盐；

优选的，在第24-48h，以流加方式添加所述硒盐，或者，在第24-48h内任一时间以一次性加入方式添加所述硒盐，或者，在24-48h内分两批加入，或者，优选的在第36-48小时内任一时间进行富集添加。

进一步的，在本发明的一些实施方案中，在发酵的第0-140h往所述发酵培养基中添加富硒助剂，优选的，富硒助剂为十二烷基磺酸钠或环己氨基磺酸钠；

优选的，助剂的添加量0.01-1g/l，进一步优选的助剂的添加量为0.1-0.5g/l；

优选的，助剂的添加方式是一次性加入、分批加入、流加或者在富集时候加入。

进一步的，在本发明的一些实施方案中，优选的，所述高山被孢霉的保藏编号为：cctccno.m2015421。

本发明的提供的富硒高山被孢霉的制备方法，可以提高高山被孢霉菌体体内的有机硒元素含量。另一方面，本发明提供了一种富硒高山被孢霉，其由如上所述的方法制得。

值得注意的是该高山被孢霉可以视为放罐后发酵液中的菌体，也可以为过滤菌体后进行干燥的含油干菌体。

本发明提供的富硒高山被孢霉，优选的，所述制品中每克干菌体至少含有0.017mg的硒元素，最高可达到0.112mg的硒元素。

优选的，所述制品中每克生物质至少含有0.17g的花生四烯酸油脂，最高可达到0.27g的花生四烯酸。

本发明提供的富硒高山被孢霉，其不仅含有花生四烯酸油脂，其还富含硒元素，其与高山被孢霉的蛋白质和多糖有机结合转化为生物硒，消除了化学硒(如亚硒酸钠)对人体的毒副反应和肠胃刺激，使硒能够更高效、更安全地被人体吸收利用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例中所用的发酵罐的结构示意图。

图2为图1中a-a的剖面图。

附图标记：

1-补料口；2-检修口；3-出气口；4-罐体；5-过滤阀门组件；6-气动执行机构；7-进气口；8-气体分布盘；9-裙座；10-出料口；11-密封圈；12-过滤孔；13-阀板；14-阀座。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供的富硒高山被孢霉的制备方法如下：

菌种：高山被孢霉y16(mortierellaalpiney16)保藏编号为cctccno.m2015421。

1孢子悬浮液的准备：

将高山被孢霉株接种到马铃薯葡萄糖琼脂(pda)培养基平板上，在28℃下培养6天至孢子生成并成熟，取下培养基上的菌丝和孢子，用无菌水配制成孢子悬液。

2种子培养：

孢子悬浮液接种到摇瓶中进行培养，接种量为10(体积比)，培养温度28℃，培养时间48h，摇床振摇转速为220转/分钟。

所述摇瓶中的种子培养基为包括：葡萄糖20g/l；酵母粉15g/l；ph5.5-8.5。

3发酵：

种摇瓶发酵：种子培养液菌浓达到30％(体积浓度)时，按照10％(体积比)接种量接入到发酵瓶中振荡培养，所述振摇培养的温度为28℃，培养时间为11天，摇床速率为220转/分钟。

所述发酵培养基包括：葡萄糖60g/l；酵母粉为20g/l；ph7.5；

发酵罐发酵：摇瓶培养的种子培养液逐级扩大培养，获得种子扩大培养液，当种子扩大培养液的菌浓达到20％(体积浓度)时，接种到发酵罐中进行发酵培养(此时计为发酵第0h)，接种量10％(体积比)，发酵罐温度28℃，搅拌速度220转/分钟，通气量2vvm(l/l.min)即每升发酵液中每分钟所需要的空气通入量为1-2l，罐压0.15mpa，培养190h，并在发酵过程中通过流加碳源来控制发酵液中葡萄糖浓度在10g/l，初始所述发酵罐中的发酵培养基为：葡萄糖30g/l；酵母粉15g/l；ph6.5。

4补加硒盐

在发酵第36h，发酵液进入富集发酵罐完成富集操作，往富集的菌体中加入初始发酵培养基体积五分之一的新鲜发酵培养基，再一次性添加10mg/l的亚硒酸钠，继续发酵，后续发酵根据耗糖速率进行补料。

5补加富硒助剂

在接种种子液后的第36h，即在添加硒盐的同时，按0.1g/l的量往富集后的菌体中一次性加入sds，继续发酵。

所用的富集发酵罐的结构描述如下：

参考图1和图2，本发明提供一种发酵罐，包括：罐体4和过滤阀门组件5，过滤阀门组件5具体可采用卫生级蝶阀，质量可靠，且保证发酵罐内物料的卫生。罐体4的顶部设有补料口1、出气口3和检修口2，罐体4的底部设有进气口7和出料口10，过滤阀门组件5将罐体4分隔为上下两部分，利用过滤阀门组件5将发酵液过滤并使菌体分离。检修口2用于维修人员进入罐体4内对设备进行维修和保养。进气口7和出气口3作为罐体4内的气体通道，方便为罐体内的菌体提供氧气或其他的反应气体。

其中，过滤阀门组件5包括阀座14和阀板13，阀座14为圆环形结构，阀板13为圆盘形结构，阀座14套装在罐体4的侧壁，相当于将罐体14的侧壁分为上下两段；阀板13套装在阀座4内，并可绕阀座14的径向上下反转，阀板13上设有多个过滤孔12，过滤孔12用于将发酵液中的菌体富集在阀板上，过滤后的发酵液通过出料口10排出发酵罐。当然，为了提高过滤的效率，多个过滤孔12均匀分布在阀板13上，过滤孔的孔径具体根据需要过滤的菌体大小进行设置。

为了实现阀板13的自动控制，在罐体4的侧壁上装设有气动执行机构6，气动执行机构6与阀板13连接，用于带动阀板13上下翻转。具体地，阀座14内沿其径向穿设有转轴，阀板13固定装设在转轴上，具体为转轴穿过阀板的径向中心，转轴穿过阀座14的端部与气动执行机构6连接，气动执行机构6可设置成两种位置模式，一种位置模式时控制阀板13为初始水平位置，另一种位置模式时阀板13翻转180度。

为了保证阀板与阀座之间的密封性，减少罐体4内上、下两部分内物料之间的相互干扰，并且增强过滤效果，在阀板13与阀座14之间设有密封圈11，具体地，阀座14内设有凹槽，密封圈11装设在凹槽内。

为了提高罐体4的稳定性，本实施例还在罐体4的底部装设有裙座9，裙座主要用于为罐体4提供支撑，保证罐体4的稳定性。

罐体4内部靠下的位置还设有气体分布盘8，气体分布盘8通过气管与进气口7连接，气体分布盘8上均匀分布有多个出气孔，用于将从进气口7进入的气体均匀分散。

在具体工作时：发酵液由补料口1进入罐体，落到过滤阀门组件5上，发酵液由阀板13上的过滤孔12流下，在罐体内气体压力的作用下可由出料口10排出，菌体留在阀板13上完成富集，启动气动机构6翻转阀体180°，菌体面朝下，可再由补料口加入培养液，菌体随着培养液冲下，落入罐体内，可进行下一步的高密度培养或者富集培养工作。同时，培养液冲下时还能够对阀板13上的过滤孔12进行冲洗，以保证下一次对发酵液的过滤效果。

6发酵结束后放罐，过滤菌体，干燥后得到干菌体，即为富硒高山被孢霉菌，也可以作为富硒的花生四烯酸油脂制品。

7检测：

7.1花生四烯酸检测：方法参考国标gb26400-2001。

7.2硒元素含量的检测方法：

(1)硒标准溶液

准确称取2.19g干燥的亚硒酸钠(优级纯)，溶于蒸馏水中，添加80ml48％的hbr，用蒸馏水稀释至1l，制备成含硒1g/l的标准硒配备液或直接购买1g/l的硒标准液。

(2)样品消化

精确称取0.1～0.2g干菌体于150ml高脚烧杯中，加少量水湿样，加消化液(双氧水∶高氯酸∶硫酸＝3∶3∶1)，摇匀，待气泡平息后加盖表面皿，置通风橱内的电炉上消化至终点，若消化不完全可稍冷后补加双氧水，继续加热消化至完全。置冷后用少量水冲洗表面皿及瓶壁，加氢氧化钠调ph值为7.0，摇匀，用甲酸调ph值为2.0～3.0，加入4ml40％盐酸羟胺,然后定容至50ml，同法做空白溶液。

(3)样品总硒测定

取消化液10ml于125ml分液漏斗中，另取7个分液漏斗，分别加入与消化液等量的空白溶液及标准硒工作液0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0ml，加水适量，各加入5％edta-2na溶液4ml，0.5％的3，3-二氨基联苯胺溶液2ml，摇匀，置暗处反应30min，用氨水溶液调ph值6.5～7.0，加入甲苯4ml，猛烈振摇萃取3min，静置分层，取甲苯层滤液于1cm比色皿中，在波长425nm处测定吸光度。用标准硒工作液的吸光度绘制标准曲线，从标准曲线上查出与消化液的吸光度对应的硒含量。

(4)样品无机硒测定

取样品1.0g左右干菌体于50ml蒸馏水中，置于超声波震荡仪中超声震荡30min,小火微沸30min,过滤，定容50ml,吸取10ml上清液，精确加入甲苯4ml，猛烈振摇萃取3min，静置分层，取甲苯层滤液于lcm比色皿中，在波长425nm处测定吸光度。用标准硒工作液的吸光度绘制标准曲线，从标准曲线上查出对应的无机硒含量。

(5)样品有机硒含量测定

有机硒含量用测定的总硒含量减去样品中无机硒的含量即可得到。

8结果

本实施例得到的制品中硒元素含量：30.31mg/g；花生四烯酸含量为：0.16g/g。

实施例2-19

实施例2-19的高山被孢霉发酵方法和检测方法与实施例1基本相同，各实施例的主要不同之处主要在于硒盐的添加操作，区别之处见表1。

表1

注：表中“-”代表未添加。

其中实施例16、17和对比例2所采用的菌株是为该菌株由嘉必优生物工程(武汉)有限公司于2013年9月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为cctccno:m2013419。

对比例1

方法与实施例1基本相同，不同之处在于，发酵过程中不添加硒盐。

对比例2

方法与实施例1基本相同，不同之处在于，使用保藏编号为cctccno:m2013419的菌种发酵生产花生四烯酸，且发酵过程中不添加硒盐。

各实施例和对比例的检侧结果见表2。

表2

表中：“-”代表为检测，生物量dw(g/l)是指每l初始发酵液得到的干菌体质量。

上述实施例的结果说明，无论是cctccm201542或是cctccno:m20134191菌株，发酵中富硒与常规发酵相比，硒盐的添加能够有效提高每克干菌体中花生四烯酸油脂含油量。实施例中显示高山被孢霉在发酵初始阶段对硒较为敏感，在初始阶段添加硒的实施例生物量低下，硒造成其生长代谢皆受到阻碍，油脂不仅产量降低，单位每克菌体内的油脂含量也会降低，而太晚的添加时间硒无法及时的参与代谢中，即使增加硒浓度和富硒助剂的浓度也无法有效增加每克干菌体的含油量。添加硒盐的量过少使得最后制品中硒元素的含量非常少，而高山被孢霉对硒盐的耐受较低和转化能力都较低，未富集时，5mg/l的添加浓度就显示出转化限制，更高浓度的硒盐明显降低高山被孢霉的生物量。

从实施例中能够看到富硒过程中采用了富集培养的实施例能够承受更高的硒盐浓度，富硒后的高山被孢霉减小了单个细胞接受硒盐的毒性，能够维持高山被孢霉的生物量不受较大影响，单位体积和单位重量内的生物硒含量更高，并且采用新型的富集发酵罐效果更好。富硒工艺中加入了富硒助剂能够有效提升富硒量，突破其转化限制，实施例12、14显示添加有富硒助剂在有机硒含量、生物量、花生四烯酸油脂方面都要高，并且提高了高山被孢霉的富硒上限；由于富集时高山被孢霉因为密度高而引起的菌丝缠绕问题，而富硒助剂十二烷基磺酸钠除了能够提高硫的来源还能够有效解决菌丝缠绕的问题，在生物量上带来的优势最为优越；所用的保藏编号为cctccm2015421的产花生四烯酸菌种，比其出发菌株cctccno:m2013419在富硒方面的效果稍有优势。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。