使用代谢工程化微生物的细胞外血红素生成方法与流程

本发明涉及具有细胞外生成血红素的能力的微生物变体，并且更具体地涉及具有细胞外生成血红素的能力的代谢工程化微生物变体，以及使用所述微生物变体生成血红素的方法。
背景技术：
：血红素是一种包含亚铁离子(fe2+)和原卟啉的卟啉衍生物，是在大多数原核和真核细胞中发现的有机金属化合物，作用是携带氧、消除活性氧和通过转移电子来生成能量。血红素在卫生保健和食品补充剂行业中广泛地用作生物可用性铁源。具体来说，氯化血红素是一种含有具有氯配体的高铁离子(fe3+)的氧化形式的血红素衍生物，并且用于治疗急性间歇性卟啉病，并且对血红素的需求因此日益增加。因此，数十年来非常关注血红素的有效生成。通过化学合成来合成血红素以及通过有机提取或酶促水解从植物组织和动物血液中分离血红素的常规方法的缺点在于，它们复杂，产率低，耗时，并且不是环境友好的。因此，已经尝试过若干次通过生物合成方法使用重组微生物(特别是大肠杆菌(e.coli))来生成血红素。然而，由于所生成的血红素在细胞中积累，不可避免地要从细胞中提取血红素以供未来使用血红素，因此这些尝试未能克服常规血红素生产的限制。虽然已经尝试过从使用微生物生成的血红素在细胞外生成血红素蛋白或血红素肽(ep0,631,631；us5,681,725；和us2016-0340411)，但是生成游离血红素仍然需要从细胞外分泌的血红素蛋白或血红素肽中提取游离血红素。因此，对于游离血红素的环境友好的经济的工业生产，需要实现游离血红素的细胞外生成。血红素是一种几乎所有微生物的必需化合物，但是在血红素以高浓度存在时，其在多种微生物中引起毒性(anzaldi等人,infect.immun.78,4977-4989,2010)。一些微生物通过将血红素或因血红素积累生成的毒性代谢物主动转运至细胞外部来获得血红素抗性。在大肠杆菌中，已知ccmabc基因编码血红素输出蛋白，所述血红素输出蛋白将细胞内合成的游离血红素直接递送至参与周质中的细胞色素c生物合成的蛋白质(feissner等人,mol.microbiol.61:219-231,2006)。虽然尚未报道所述基因是否参与对游离血红素引起的毒性的抗性，但是本发明人已确定，增强游离血红素的生物合成可以促进从ccmabc基因表达的血红素输出蛋白对血红素的细胞外分泌，由此使得能够在细胞外生成游离血红素。血红素的生物合成始于5-氨基酮戊酸(ala)的生物合成(图1)(layerg.等人,proteinsci.19:1137-1161,2010)。ala是通过两种不同途径(c4和c5途径)来合成，这取决于物种。古细菌、植物和大多数细菌具有c5途径，其通过由谷氨酰基-trna合酶(glurs)、谷氨酰基-trna还原酶(glutr)和谷氨酸-1-半醛2,1-氨基变位酶(gsam)催化的一系列反应将l-谷氨酸转化为ala。另一方面，动物(包括人)、真菌和紫色非硫光养菌具有c4途径，其通过ala合酶(alas)将l-甘氨酸和琥珀酰基-coa转化为ala。已经积极研究这两种途径以使用微生物生成ala(ding等人,j.ind.microbiol.biotechnol.44:1127-1135,2017.；zhang等人,sci.rep.5:8584,2015；kang等人,worldj.microbiol.biotechnol.33doi:10.1007/s11274-017-2366-7,2017)，但是还没有关于使用c5ala生物合成途径生成血红素的报道。在血红素生物合成途径的下游，通过胆色素原合酶(pbgs)缩合通过c4或c5途径合成的两分子ala以形成胆色素原(pbg)。通过胆色素原脱氨酶(pbgd)将四分子pbg缩合为1-羟甲基丁烷(hmb)，并且通过尿卟啉原iii合酶(uros)将hmb环化(图1)。然后，通过后续反应将尿卟啉原iii转化为原卟啉ix，所述后续反应包括由尿卟啉原iii脱羧酶(urod)、粪卟啉原iii氧化酶(cpo)和原卟啉原氧化酶(ppo)催化的脱羧反应，以及氧化反应。最后，亚铁螯合酶(fech)通过插入亚铁离子(fe2+)将原卟啉ix转化为血红素。已经尝试过若干次通过工程化大肠杆菌来生成血红素。在第一项研究中，构建了大肠杆菌变体，其组成性地过表达7种基因，包括编码c4途径的alas的荚膜红细菌(rhodobactercapsulatus)衍生的hema基因(hemarca)、大肠杆菌衍生的hemb、hemc和hemd和hemf基因、集胞藻属物种(synechocystissp.)衍生的heme以及枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)衍生的hemh。大肠杆菌变体在lb培养基中生成3.3±0.3μm(2.03±0.18mg/l)的血红素(kwons.j.等人,appl.environ.microbiol.69:4875-4883,2003)。然而，这种方法的产率低，因为前体(l-甘氨酸和琥珀酰基-coa)的供应受限并且使用并非最佳的血红素生物合成途径。在另一项研究中，在大肠杆菌中共表达编码alas的球形红细菌(rhodobactersphaeroides)衍生的hema基因(hemarsp)、编码nadp依赖性苹果酸脱氢酶的内源maeb和编码二羧酸转运蛋白的内源dcta。这种菌株在补充有10g/l琥珀酸盐和2g/l甘氨酸的lb培养基中生成6.4mg/l的血红素(kwono.h.等人,j.microbiol.biotechnol.19:604-609,2009)。在使用这种菌株进行的另一项研究中，在过表达内源coaa(编码泛酸激酶)、hemb、hemc、hemd和heme基因时，生成0.49μmolgdcw-1的血红素，但是未能观测到实际血红素浓度，因为没有描述生物质浓度(leem.j.等人j.microbiol.biotechnol.23:668-673,2013)。在近期研究中，研究者在250ml孵育器中通过连续培养生成了9.1μmolgdcw-1的血红素(此处，也未能观测到生物质浓度)(pranawidjajas.等人,j.microbiol.biotechnol.25:880-886,2015)。虽然可以通过上述重组大肠杆菌菌株生成血红素，但是血红素的最终效价极低，并且尚未报道游离血红素的细胞外分泌。血红素产量低的原因主要是由于使用次最佳途径来供应血红素生物合成的血红素前体。另外，l-甘氨酸和琥珀酸盐的添加对于大规模生产是不合意的。因此，需要通过生成用于有效生成血红素的高性能产血红素微生物和确认由于血红素产量增加引起的细胞外血红素分泌来生成有效生成细胞外游离血红素的重组微生物。因此，本发明人已付出大量努力来研发能够以高产率生成血红素并细胞外分泌所生成的血红素的微生物变体，并且因此已经发现，过表达血红素生物合成途径和能够增加大肠杆菌中血红素前体5-氨基酮戊酸的生成的c5途径的变体以高于常规产血红素菌株的产率生成血红素并且还细胞外生成血红素。本发明人还已经发现，细胞外分泌血红素的基因ccmabc的额外过表达进一步增加血红素的生成并且还增加细胞外游离血红素分泌，从而完成本发明。技术实现要素：技术问题本发明的目标是提供能够以高产率生成血红素并细胞外分泌所生成的血红素的微生物变体。本发明的另一个目标是提供通过使用所述微生物变体生成血红素的方法。技术方案为了实现上述目标，本发明提供了能够细胞外生成血红素的微生物变体，其中编码血红素输出蛋白的基因在具有参与生成5-氨基酮戊酸(ala)的生物合成途径的基因和参与从ala合成血红素的途径的基因的微生物中是过表达的。本发明还提供了生成血红素的方法，其包括以下步骤：(a)培养上述微生物变体以生成血红素；以及(b)获得所生成的血红素。附图说明图1显示了根据本发明的用于血红素生成的生物合成途径。以粗体显示的项指示，相应基因在根据本发明的heme7菌株中过表达。图2显示了在根据本发明的大肠杆菌菌株中以高产率生成血红素的策略。图3显示了通过根据本发明的heme1、heme2、heme3、heme4、heme5和heme6菌株的瓶培养生成的ala和血红素的量。图4显示了通过根据本发明的heme6菌株在tb、tb-fe7.5、lb、lb-fe7.5、mr-fe0和mr-fe7.5培养基中的瓶培养生成的血红素的量。图5显示了通过根据本发明的heme6菌株在具有各种浓度的feso47h2o的培养基中的瓶培养生成的血红素的量。图6显示了通过根据本发明的heme6菌株在各种培养温度下的瓶培养生成的血红素的量。图7显示了通过根据本发明的heme6菌株的分批培养生成的血红素的量。图8显示了通过根据本发明的heme6菌株的补料分批培养生成的血红素的量，在所述补料分批培养的同时改变培养期间引入的组分如下：(a)700g/l葡萄糖、8g/lmgso4·7h2o、20mg/lfeso4·7h2o；(b)700g/l葡萄糖、8g/lmgso4·7h2o、20mg/lfeso4·7h2o、5g/l(nh4)2so4；和(c)700g/l葡萄糖、8g/lmgso4·7h2o、20mg/lfeso4·7h2o、20g/ll-谷氨酸盐。图9显示了通过根据本发明的heme7菌株的补料分批培养生成的血红素的量，在所述补料分批培养的同时改变培养期间引入的组分如下：(a)700g/l葡萄糖、8g/lmgso4·7h2o、20mg/lfeso4·7h2o、5g/l(nh4)2so4；和(b)700g/l葡萄糖、8g/lmgso4·7h2o、20mg/lfeso4·7h2o、20g/ll-谷氨酸盐。具体实施方式除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。通常，本文使用的命名法和下文将描述的实验方法是本领域公知且常用的那些。血红素是一种有机金属化合物，其广泛地用于卫生保健和食品补充剂行业中。在常规领域中，血红素是通过化学合成、有机提取或酶促水解来生成，但是这种方法复杂并且产率低。由于这个原因，构建了大肠杆菌变体以便以高产率生成血红素。另外，构建了细胞外分泌所生成的血红素的大肠杆菌变体，使得之后易于回收游离血红素，与在细胞中积累所生成的血红素的常规大肠杆菌菌株不同。血红素是一种微生物的必需化合物，但是在血红素以高浓度存在时，其引起毒性。因此，一些微生物通过将血红素或因血红素积累生成的毒性代谢物主动转运至细胞外部来获得血红素抗性。在大肠杆菌的情况下，已知基因ccmabc编码血红素输出蛋白，所述血红素输出蛋白将血红素供应至参与细胞色素c生物合成的蛋白质(feissner等人,mol.microbiol.61:219-231,2006)。然而，尚未报道所述基因是否参与对游离血红素引起的毒性的抗性。然而，本发明人已确定，增强游离血红素的生物合成可以促进从ccmabc基因表达的血红素输出蛋白对血红素的细胞外分泌，由此使得能够在细胞外生成游离血红素。使用大肠杆菌的常规产血红素变体被设计为通过c4途径与l-甘氨酸和琥珀酸盐的供应一起从5-氨基酮戊酸生成血红素，但是血红素在这种变体中的最终效价极低。为了更有效地生成血红素，本发明人已经构建了利用将l-谷氨酸转化为5-氨基酮戊酸的c5途径的代谢工程化大肠杆菌菌株，并且通过使用各种策略增加了大肠杆菌中的血红素生成(图2)。首先，检查了c4和c5途径在不供料前体的情况下生成ala的能力。在确认c5途径的性能优于c4途径的性能后，使c5途径和血红素生物合成的下游途径的代谢基因过表达。然后，通过调节相关基因的表达水平来优化与血红素生物合成相关的代谢途径。为了进一步增加血红素的生成，缺失怀疑编码血红素降解酶的yfex基因以及乳酸和乙酸生物合成途径，并且确认通过分批发酵以高效价生成血红素。另外，确认细胞外分泌所生成的血红素。此外，构建了细胞外分泌血红素的过表达编码血红素输出蛋白的ccmabc基因的大肠杆菌变体，并且确认通过分批发酵以较高效率生成血红素。另外，确认细胞外分泌较高比例的所生成的血红素。因此，本发明涉及能够细胞外分泌血红素的微生物变体，其中编码血红素输出蛋白的基因在具有参与5-氨基酮戊酸(ala)的生物合成的基因和参与从ala生物合成血红素的基因的微生物中是过表达的。在本发明中，具有参与5-氨基酮戊酸(ala)的生物合成的基因和参与从ala生物合成血红素的基因的微生物包括引入了此类基因的微生物以及天然具有所述基因的微生物。在本发明中，微生物变体的特征可以在于，参与5-氨基酮戊酸(ala)的生物合成的基因和参与从ala生物合成血红素的基因是过表达的。需要前体5-氨基酮戊酸(ala)来生物合成血红素，并且c4途径和c5途径二者都可以供应ala。虽然报道了使用c4途径和c5途径二者生成ala的例子，但是本发明首次将c5途径应用至变体用于血红素的生物合成。可以用于本发明中的微生物可以是能够从碳源生成谷氨酸的微生物，但是不限于此。具有使用c4途径生物合成血红素的能力的常规微生物的问题在于，需要在培养期间添加ala前体(琥珀酸和甘氨酸)，并且由于甘氨酸的细胞毒性，不允许以高浓度添加甘氨酸。另外，即使在添加琥珀酸盐和甘氨酸时，血红素的最终效价也不高于约6.4mg/l。在本发明中，为了构建具有生成血红素的强大能力的微生物变体，分别构建了具有c4途径和c5途径的微生物变体，并检查了其生成血红素的能力。可以用于本发明中的微生物变体的例子可以包括细菌、古细菌、酵母、真菌、原生动物(鞭毛虫、阿米巴虫(amoebozoa)、领鞭虫、有孔虫、囊泡藻)、动物细胞、微藻和植物细胞，更优选地大肠杆菌(escherichiacoli)、芽孢杆菌属物种(bacillussp.)、棒状杆菌属物种(corynebacteriumsp.)、乳杆菌属物种(lactobacillussp.)、乳球菌属物种(lactococcussp.)、假单胞菌属物种(pseudomonassp.)、组囊藻属物种(anacystissp.)、鱼腥藻属物种(anabaenasp.)、绿菌属物种(chlorobiumsp.)、绿屈挠菌属物种(chloroflexussp.)、梭菌属物种(clostridiumsp.)、甲烷菌(methanobacteria)、丙酸杆菌属物种(propionibacteriumsp.)、红假单胞菌属物种(rhodopseudomonassp.)、红细菌属物种(rhodobactersp.)、小红卵菌属物种(rhodovulumsp.)、链球菌属物种(streptococcussp.)、酵母菌属物种(saccharomycessp.)、裂殖酵母属物种(schizosaccharomycessp.)、耶氏酵母属物种(yarrowiasp.)和曲霉菌属物种(aspergillussp.)，进一步优选地，大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌(corynebacteriumglutamicum)、短乳杆菌(lactobacillusbrevis)、干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)、罗伊乳杆菌(lactobacillusreuteri)、乳酸乳球菌(lactococcuslactis)、黑曲霉菌(aspergillusniger)、酿酒酵母(saccharomycesescerevisiae)和裂殖酵母(saccharomycespombe)，但不限于此。在本发明的一个例子中，在不添加前体的情况下培养分别引入了c4途径和c5途径的大肠杆菌菌株时，在c5途径中生成了更多ala。因此，在本发明中，使用c5途径进行血红素生物合成。在本发明中，参与c5生物合成途径的基因可以选自编码谷氨酰基-trna合酶(glurs)的gltx、编码谷氨酰基-trna还原酶(glutr)的hema和编码谷氨酸-1-半醛2,1-氨基变位酶(gsam)的heml，并且参与从ala合成血红素的途径的基因可以选自编码胆色素原合酶(pbgs)的hemb、编码胆色素原脱氨酶(pbgd)的hemc、编码尿卟啉原iii合酶(uros)的hemd、编码尿卟啉原iii脱羧酶(urod)的heme、编码粪卟啉原iii氧化酶(cpo)的hemf、编码原卟啉原氧化酶(ppo)的hemg和编码亚铁螯合酶(fech)的hemh。在本发明中，变体的特征可以在于编码血红素输出蛋白的基因是过表达的。在本发明中，变体可以缺少编码血红素降解酶或血红素中间体降解酶的基因，并且编码血红素降解酶或血红素中间体降解酶的基因可以是yfex基因。在另一个例子中，通过以下方式构建了大肠杆菌变体：在大肠杆菌菌株中共过表达血红素生物合成途径的基因与过表达的c5途径基因，优化用于表达每种酶的载体，缺失参与乙酸和乳酸生成的基因，以及缺失yfex基因(其在血红素降解中的参与有争论)。这种大肠杆菌变体在使用补充有7.5mg/lfeso47h2o的lb培养基的瓶培养中生成了7.13mg/l的血红素。因此，在本发明中，首次确认敲除yfex基因增加血红素的生成。本发明的另一个方面涉及如下变体，其中在微生物中缺失yfex基因，在所述微生物中使ala的c4途径过表达。另外，在本发明的另一个例子中，将如上所述构建的大肠杆菌变体菌株在含有5g/l酵母提取物和浓度调节至7.5mg/l的feso47h2o的mr培养基中瓶培养，并且因此生成了7.45mg/l的血红素。此外，进行培养时间和温度的优化，通过iptg诱导蛋白质过表达，然后在30℃下进行60小时培养，并且因此生成了7.78mg/l的血红素。在本发明的仍另一个例子中，使用上述大肠杆菌变体在优化条件下进行分批发酵，并且因此在培养56小时时生成了总共14.24mg/l的血红素，并且在细胞外发现了1.18mg/l(8.29％)的所生成的血红素。在本发明的仍另一个例子中，在补料分批培养工艺中培养大肠杆菌变体，并且因此在培养56小时时生成了49.18mg/l的血红素，并且在细胞外发现了16.77mg/l(34.10％)的所生成的血红素。在本发明的又另一个例子中，使用补充有(nh4)2so4的培养基进行补料分批培养以克服关于氮缺乏的问题，因为每摩尔血红素需要4个氮(n)原子，并且因此生成了104.90mg/l的血红素。在细胞外发现了54.61mg/l(52.06％)的所生成的血红素。在本发明的又另一个例子中，使用补充有l-谷氨酸盐(代替(nh4)2so4的c5ala生物合成途径的前体)的培养基进行补料分批培养，并且因此在培养64小时时生成了228.46mg/l的血红素，并且在细胞外发现了131.90mg/l(57.734％)的所生成的血红素。考虑到上述结果，可以看出细胞外分泌的血红素的比例随着所生成血红素的总量增加而增加。因此，得出结论，由于高细胞内浓度的血红素具有细胞毒性，可以促进血红素输出蛋白的功能或表达，如由本发明人确立的假说。因此，得出结论，在使已知编码血红素输出蛋白的ccmabc基因过表达时，将进一步促进血红素的细胞外分泌，并且因此由细胞内游离血红素引起的毒性会降低并且血红素的生成也会增加。基于这个结论，尝试过表达ccmabc基因的方法。因此，在另一个方面中，本发明涉及生成血红素的方法，其包括以下步骤：培养能够细胞外分泌血红素的微生物变体，其中使参与生成5-氨基酮戊酸(ala)的c5生物合成途径的基因和参与从ala合成血红素的途径的基因过表达并且使编码血红素输出蛋白的基因过表达，以生成血红素；以及回收所生成的血红素。在本发明的一个例子中，在补料分批工艺中在(nh4)2so4存在下培养通过在上述产血红素大肠杆菌菌株中过表达编码血红素输出蛋白的ccmabc基因构建的菌株，并且因此在培养64小时时生成了114.79mg/l的血红素，并且在细胞外发现了71.91mg/l(62.64％)的所生成的血红素。在本发明的另一个例子中，在补料分批工艺中在谷氨酸盐存在下培养本发明的菌株，并且因此在培养72小时时生成了246.69mg/l的血红素，并且在细胞外发现了164.12mg/l(66.53％)的所生成的血红素。在使用本发明的微生物变体生成血红素时，在一个例子中，以114.79mg/l或246.69mg/l的量生成了血红素，这取决于是否添加前体。与生成了6.4mg/l血红素的常规产血红素大肠杆菌变体的产率相比，这个量对应于高17.9倍或高38.5倍的产率。另外，在本发明中，首次确认随着微生物生成的血红素的量增加，细胞外血红素的比例也增加。此外，首次确认在使血红素输出蛋白基因ccmabc过表达时，细胞外血红素的比例增加，并且细胞所生成的血红素的总量也增加。在下文中，将参考实施例进一步详细地描述本发明。对于本领域普通技术人员来说应清楚的是，这些实施例仅用于说明目的，并且不被视为限制本发明的范围。用于这些实施例和以下实施例的限制酶购自newenglandbiolabs(美国)和enzynomics(韩国)，并且pcr聚合酶购自biofact(韩国)，并且dna连接酶购自elpisbiotech(韩国)。其他有单独指示。实施例1：用于高效生成血红素的ala生物合成途径的选择1-1：表达c4和c5ala生物合成基因的载体(prsf-c4和prsf-c5)的构建通过以下程序构建能够在大肠杆菌菌株bl21(de3)中表达c4和c5ala生物合成基因的prsf-c4和prsf-c5载体(studier等人,j.mol.biol.189:113-130,1986)。通过将源自球形红细菌2.4.1的氨基酮戊酸合酶(alas)基因(hemarsp)以及源自大肠杆菌的maeb和coaa基因插入质粒prsfduet-1(novagen，美国)中来构建能够表达c4ala生物合成基因的质粒prsf-c4。为了扩增源自球形红细菌2.4.1的hemarsp基因，合成根据大肠杆菌的密码子使用进行密码子优化的hemarsp基因(seqidno:1)(genotech，韩国)，由此制备模板，并使用所述模板和seqidno:2和3的引物进行pcr。使用大肠杆菌bl21(de3)的基因组dna作为模板并且还分别使用seqidno:6和7的引物以及seqidno:8和9的引物扩增源自大肠杆菌的maeb基因(seqidno:4)和coaa基因(seqidno:5)。在这时，通过在用于扩增过程中的seqidno:7的引物中所含的核糖体结合位点(rbs)的序列将核糖体结合位点(rbs)的序列添加至经扩增的coaa基因的5'端。[表1]分别用bglii和xhoi、saci和sali以及ncoi和ecori切割所扩增的序列，然后依序插入用相同的限制酶切割的prsfduet-1载体(novagen，美国)中，由此构建prsf-c4。通过以下方式构建能够表达c5ala生物合成基因的载体prsf-c5：插入源自大肠杆菌的gltx基因(seqidno:10)、heml基因(seqidno:11)和负反馈抗性hema(hemafbr)基因(seqidno:12)。使用大肠杆菌bl21(de3)的基因组dna作为模板，并且还分别使用seqidno:13和seqidno:14的引物、seqidno:15和seqidno:16的引物以及seqidno:17和seqidno:18的引物扩增每种基因。在这时，通过在用于扩增过程中的seqidno:15的引物中所含的核糖体结合位点(rbs)的序列将核糖体结合位点(rbs)的序列添加至经扩增的heml基因的5'端。另外，通过在seqidno:17的引物中所含的编码苏氨酸和亮氨酸的核苷酸序列将源自bl21(de3)的hema基因转化为负反馈抗性hema(hemafbr)。[表2]分别用ndei和xhoi、ncoi和bamhi以及saci和noti切割所扩增的gltx、hemafbr和heml基因序列，然后依序插入用相同的限制酶切割的prsfduet-1载体(novagen，美国)中，由此构建prsf-c5。1-2：过表达c4和c5ala生物合成基因的大肠杆菌bl21(de3)菌株之间的ala生成的比较为了比较在不供料相应途径使用的前体(用于c4ala生物合成途径的甘氨酸和琥珀酸和用于c5ala生物合成途径的谷氨酸)的情况下培养分别引入了c4和c5ala生物合成途径的菌株时获得的ala生成，将在实施例1-1中构建的prsf-c4和prsf-c5载体各自引入大肠杆菌bl21(de3)菌株中，由此构建大肠杆菌c4菌株和大肠杆菌c5菌株(表3)。作为阴性对照，使用大肠杆菌bl21(de3)(表3)。[表3]菌株描述bl21(de3)大肠杆菌bl21(de3)c4具有prsf-c4的大肠杆菌bl21(de3)c5具有prsf-c5的大肠杆菌bl21(de3)使用表3中所示的每种菌株接种5ml补充有25μg/ml卡那霉素的lb培养基(10g/lnacl、10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母提取物)，然后在37℃和220rpm下培养12小时。为了使用所述菌株生成ala，将1ml预培养物转移至50ml相同的新鲜培养基中，然后在250-ml锥形瓶中在37℃和200rpm下培养，直至od600达到约0.6为止。接下来，将1mmiptg添加至培养基中，然后将细胞在30℃和200rpm下培养48小时。在培养后，收集样品以分析ala的生成，然后通过先前所报道的方法预处理并分析样品(burnham,methodsenzymol.17a,195-204,1970)。因此，显示在bl21(de3)菌株(阴性对照)、c4菌株和c5菌株中分别生成了0.02g/l、0.31g/l和1.74g/l的ala，指示在不供料前体时，通过c5ala生物合成途径的ala生成比通过c4ala生物合成途径的ala生成高至少5倍(图2a)。因此，决定在随后的产血红素菌株的构建中使用c5ala生物合成途径进行ala生物合成。实施例2：引入了c5ala生物合成途径的产血红素菌株的构建2-1：过表达血红素生成的靶基因的选择为了从通过ala生物合成途径生成的ala生成血红素，需要从hemb、hemc、hemd、heme、hemf、hemg和hemh基因表达的酶(图1)。由于大肠杆菌内源性地具有所述基因，野生型菌株也可以生成血红素，但是仅以其存活所需量生成血红素。由于这个原因，所生成的血红素主要以与蛋白质结合的形式存在，并且因此在野生型菌株中难以检测到游离血红素。因此，为了过度生成游离血红素，需要通过过表达所述基因增加参与从ala生成血红素的代谢通量。然而，得出结论，在使所述基因都过表达时，可能由于蛋白质的过表达而对产血红素菌株的代谢造成超负荷。因此，仅选择由于表达强度不足以在大肠杆菌bl21(de3)菌株中过度生成血红素而需要额外过表达的基因，并且仅选择性过表达最少血红素生物合成基因，以使因蛋白质过表达引起的菌株超负荷最小化，并且使血红素的过度生成最大化。(a)血红素生成对hemb和hemh基因的过表达的需要的确认据报道，在使血红素生物合成基因中的hemb基因(seqidno:19)和hemh基因(seqidno:20)过表达时，在血红素生成中用作前体的ala的生成减少(zhang等人,sci.rep.5,8584,2015)，并且相反，在两种基因的表达水平下降时，从ala生成血红素的代谢途径的代谢减少(li等人,femsmicrobiol.lett.350,209-215,2014)。因此，得出结论，有效的血红素过度生成需要hemb和hemh基因的过表达。通过以下程序构建过表达两种基因并且不干扰过表达c5ala生物合成途径的质粒的载体pet-hembh。分别使用seqidno:21和22的引物以及seqidno:23和24的引物从大肠杆菌bl21(de3)菌株的基因组dna扩增hemb和hemh基因。[表4]seqidno:核苷酸序列seqidno:215′-ggaattccatatgacagacttaatccaacgc-3′seqidno:225′-ccgctcgagttaacgcagaatcttcttctcag-3′seqidno:235′-ggaattccatatgcgtcagactaaaaccgg-3′seqidno:245′-ccgctcgagttagcgatacgcggcaac-3′用ndei和xhoi切割每个所扩增的序列，然后插入用相同的限制酶切割的petduet-1载体(novagen，美国)中，由此构建pet-hemb和pet-hemh。使用seqidno:25和26的引物从大肠杆菌bl21(de3)菌株的基因组dna扩增hemb基因，并用ncoi和bamhi切割每个所扩增的序列，然后插入用相同的限制酶切割的pet-hemh载体(novagen，美国)中，由此构建pet-hembh。[表5]seqidno核苷酸序列seqidno:255′-catgccatgggtacagacttaatccaacgc-3′seqidno:265′-cgcggatccttaacgcagaatcttcttctcag-3′将所构建的pet-hemb、pet-hemh和pet-hembh各自引入重组大肠杆菌c5菌株中，由此构建大肠杆菌c5-b、c5-h和c5-bh菌株(表6)。[表6]菌株描述c5-b具有prsf-c5和pet-hemb的大肠杆菌bl21(de3)c5-h具有prsf-c5和pet-hemh的大肠杆菌bl21(de3)c5-bh具有prsf-c5和pet-hembh的大肠杆菌bl21(de3)为了鉴定所构建的大肠杆菌菌株中的ala生成、血红素和血红素生物合成中间体(尿卟啉原iii、粪卟啉原iii和原卟啉ix)的概况，使用上文表6中所示的每种菌株接种5ml含有25μg/ml卡那霉素和50μg/ml氨苄西林的lb培养基(10g/lnacl、10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母提取物)，然后在37℃和220rpm下培养12小时。对于血红素生成的主要培养，将1ml预培养物转移至50ml含有相同抗生素的lb-fe7.5培养基(10g/lnacl、10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母提取物、7.5mg/lfeso47h2o)中，然后将细胞在250-ml锥形瓶中在37℃和200rpm下培养，直至od600达到约0.6为止。接下来，将1mmiptg添加至培养基中，然后将细胞在30℃和200rpm下培养48小时。在培养后，收集样品以分析ala的生成，然后通过先前所报道的方法预处理并分析样品(burnham,methodsenzymol.17a,195-204,1970)。另外，为了分析血红素的生成，从每种培养基中收集1ml样品并离心，并且将所收集的细胞再悬浮于500μl1mnaoh水溶液中，并通过超声波破碎来裂解。过滤所制备的样品，然后通过先前已知的使用hplc的方法测量其中的血红素浓度(lee等人,j.microbiol.biotechnol.22,1653-1658,2012)。为了确认血红素生物合成中间体，使用与用于分析血红素生成相同的样品，但是使用先前所报道的使用hplc-ms的方法(pranawidjaja等人,j.microbiol.biotechnol.25,880-886,2015；bu等人,j.chromatogr.banalyt.technol.biomed.lifesci.783,411-423,2003)。因此，如所预期，与其他两种菌株相比，c5-bh菌株生成了大量血红素生物合成中间体(尿卟啉原iii和粪卟啉原iii)(表7)。另外，所发现的ala的量在c5-bh中小于在c5-b和c5-h中。然而，在所有三种菌株中都无法检测到游离血红素。[表7](b)血红素的过度生成对hemc、hemd、heme、hemf和hemg基因的过表达的需要的确认为了在血红素生物合成基因中除了hemb和hemh基因以外的其余五种基因(hemc(seqidno:27)、hemd(seqidno:28)、heme(seqidno:29)、hemf(seqidno:30)、hemg(seqidno:31))中选择其过表达是血红素的过度生成所需的基因，使五种基因各自在c5-bh菌株中过表达，然后分析血红素的生成和血红素生物合成中间体的生成的概况。通过以下程序构建分别过表达五种基因的质粒pcdf-hemc、pcdf-hemd、pcdf-heme、pcdf-hemf和pcdf-hemg。分别使用seqidno:32和33的引物、seqidno:34和35的引物、seqidno:36和37的引物、seqidno:38和39的引物以及seqidno:40和41的引物从大肠杆菌bl21(de3)菌株的基因组dna扩增hemc、hemd、heme、hemf和hemg基因。[表8]用ncoi和bamhi、ncoi和bamhi、ncoi和ecori、ncoi和bamhi以及ncoi和saci切割每种所扩增的基因，然后插入用相同的限制酶切割的pcdfduet-1载体(novagen，美国)中，由此分别构建pcdf-hemc、pcdf-hemd、pcdf-heme、pcdf-hemf和pcdf-hemg。将所构建的pcdf-hemc、pcdf-hemd、pcdf-heme、pcdf-hemf和pcdf-hemg各自引入重组大肠杆菌c5-bh菌株中，由此构建大肠杆菌c5-bch、c5-bdh、c5-beh、c5-bfh和c5-bgh菌株(表9)。[表9]为了鉴定所构建的大肠杆菌菌株中的ala、血红素和血红素生物合成中间体(尿卟啉原iii、粪卟啉原iii和原卟啉ix)的生成的概况，使用上文表9中所示的每种菌株接种5ml含有25μg/ml卡那霉素和50μg/ml氨苄西林的lb培养基(10g/lnacl、10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母提取物)，然后在37℃和220rpm下培养12小时。对于血红素生成的主要培养，将1ml预培养物转移至50ml含有相同抗生素的lb-fe7.5培养基(10g/lnacl、10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母提取物、7.5mg/lfeso47h2o)中，然后将细胞在250-ml锥形瓶中在37℃和200rpm下培养，直至od600达到约0.6为止。接下来，将1mmiptg添加至培养基中，然后将细胞在30℃和200rpm下培养48小时。在培养后，收集样品以分析ala的生成，然后通过先前所报道的方法预处理并分析样品(burnham,methodsenzymol.17a,195-204,1970)。另外，为了分析血红素的生成，从每种培养基中收集1ml样品并离心，并且将所收集的细胞再悬浮于500μl1mnaoh水溶液中，并通过超声波破碎来裂解。过滤所制备的样品，然后通过先前已知的使用hplc的方法测量其中的血红素浓度(lee等人,j.microbiol.biotechnol.22,1653-1658,2012)。为了确认血红素生物合成中间体，使用与用于分析血红素生成相同的样品，但是使用先前所报道的使用hplc-ms的方法(pranawidjaja等人,j.microbiol.biotechnol.25,880-886,2015；bu等人,j.chromatogr.banalyt.technol.biomed.lifesci.783,411-423,2003)。因此，虽然在所有五种菌株中都没有检测到血红素(图2b)，但是所检测到的尿卟啉原iii的信号在c5-bch和c5-bdh菌株中高于在c5-bh菌株中(表7)，并且所检测到的粪卟啉原iii的信号在c5-bdh、c5-beh和c5-bfh菌株中高于在c5-bh菌株中。具体来说，在c5-bdh菌株中，检测到了在c5-bh菌株中没有检测到的原卟啉ix。基于以上结果，得出结论，hemc、hemd、heme和hemf基因的过表达是血红素的有效生成所必需的。[表10]然而，在ala和血红素生物合成中间体的生成方面(表10)，c5-bgh菌株与c5-bh菌株没有显著不同(表7)。为了再次确认hemg的过表达是否是血红素过度生成所必需的，通过以下程序，基于c5-bh菌株构建过表达hemc、hemd、heme和hemf基因的菌株heme1，并且基于c5-bh菌株构建过表达所有hemc、hemd、heme、hemf和hemg基因的菌株heme2。通过以下程序构建过表达hemc、hemd、heme和hemf基因的质粒pcdf-hemcdef。分别使用seqidno:42和43的引物、seqidno:44和45的引物、seqidno:46和47的引物以及seqidno:48和49的引物从大肠杆菌bl21(de3)菌株的基因组dna扩增hemc、hemd、heme和hemf基因。在这时，通过在用于扩增过程中的seqidno:44和48的引物中所含的核糖体结合位点(rbs)的序列将核糖体结合位点(rbs)的序列添加至经扩增的hemd和hemf基因的5'端。[表11]用ndei和bglii、bglii和xhoi、ncoi和saci以及saci和psti切割每个所扩增的序列，然后依序插入用相同的限制酶切割的pcdfduet-1载体(novagen，美国)中，由此构建pcdf-hemcdef。通过以下程序构建过表达hemc、hemd、heme、hemf和hemg基因的质粒pcdf-hemcdefg。分别使用seqidno:50和51的引物从大肠杆菌bl21(de3)菌株的基因组dna扩增hemg基因。在这时，通过在用于扩增过程中的seqidno:50的引物中所含的核糖体结合位点(rbs)的序列将核糖体结合位点(rbs)的序列添加至经扩增的hemg基因的5'端。[表12]用psti和noti切割每个所扩增的序列，然后插入用相同的限制酶切割的pcdf-hemcdef载体(novagen，美国)中，由此构建pcdf-hemcdefg。将所构建的pcdf-hemcdef和pcdf-hemcdefg各自引入重组大肠杆菌c5-bh菌株中，由此构建大肠杆菌heme1和heme2菌株(图2c和表13)。[表13]为了鉴定在所构建的大肠杆菌菌株中的ala和血红素的生成的概况，使用上文表13中所示的每种菌株接种5ml含有25μg/ml卡那霉素、50μg/ml氨苄西林和100μg/ml链霉素的lb培养基(10g/lnacl、10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母提取物)，然后在37℃和220rpm下培养12小时。对于血红素生成的主要培养，使用1ml培养基(其中所培养细胞正在生长)接种50ml含有相同抗生素的lb-fe7.5培养基(10g/lnacl、10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母提取物、7.5mg/lfeso47h2o)，然后将细胞在250-ml锥形瓶中在37℃和200rpm下培养，直至od600达到约0.6为止。接下来，将1mmiptg添加至培养基中，然后将细胞在30℃和200rpm下培养48小时。在培养后，收集样品以分析ala的生成，然后预处理并分析样品。另外，为了分析血红素的生成，从每种培养基中收集1ml样品并离心，并且将所收集的细胞再悬浮于500μl1mnaoh水溶液中，并通过超声波破碎来裂解。过滤所制备的样品，然后使用hplc测量其中的血红素浓度。因此，在heme1和heme2菌株中分别检测到0.14mg/l和0.53mg/l的血红素(图3)。根据其中hemg基因额外过表达的heme2菌株中的血红素生成比heme1菌株中的血红素生成高至少3倍的事实得出结论，需要hemc、hemd、heme、hemf和hemg基因在c5-bh菌株中都过表达以有效地过度生成血红素。2-2：用于增加的血红素生成的血红素生物合成基因的过表达水平的调节由于在实施例2-1中构建的heme2菌株中，ala的生成(308mg/l)显著高于血红素的生成(0.53mg/l)，因此认为ala生物合成途径的代谢通量是过量的。根据菌株中可以过表达的蛋白质的总量有限的假设，通过以下程序，通过增强负责从ala生成血红素的代谢蛋白质的表达和减少负责相对过量的产ala途径的代谢蛋白质的表达来增加血红素的生成。(a)质粒pcdf-hemal的构建基于拷贝数低于质粒prsfduet-1(novagen，美国)的质粒pcdfduet-1，使c5ala生物合成途径的基因过表达，使得ala生物合成途径的表达水平可以相对于使用prsf-c5时有所降低，并且因此还可以降低相应途径的代谢。另外，没有使编码在c5ala生物合成途径中将谷氨酸转化为谷氨酰基-trna的谷氨酰基trna合成酶(glurs)的基因gltx过表达，使得可以增加其他蛋白质的过表达水平。基于pcdfduet-1，通过以下程序构建过表达c5ala生物合成途径的质粒pcdf-hemal。分别使用seqidno:15和16的引物以及seqidno:17和18的引物从大肠杆菌bl21(de3)菌株的基因组dna扩增heml和负反馈抗性hema(hemafbr)基因。在这时，通过在用于扩增过程中的seqidno:15的引物中所含的核糖体结合位点(rbs)的序列将核糖体结合位点(rbs)的序列添加至经扩增的heml基因的5'端。另外，通过插入在seqidno:17的引物中所含的编码苏氨酸和亮氨酸的核苷酸序列将源自bl21(de3)的hema基因转化为负反馈抗性hema(hemafbr)。分别用ncoi和bamhi以及saci和noti切割所扩增的dna片段，然后依序插入用相同的限制酶切割的质粒pcdfduet-1(novagen，美国)中，由此构建pcdf-hemal。(b)质粒prsf-hembcd的构建基于拷贝数高于质粒petduet-1的质粒prsfduet-1，使参与从ala生成血红素的代谢途径的上游的hemb、hemc和hemd基因过表达，使得从ala生成血红素的代谢途径的通量增加。基于prsfduet-1，通过以下程序构建过表达hemb、hemc、hemd基因的质粒prsf-hembcd。分别使用seqidno:25和26的引物、seqidno:42和43的引物以及seqidno:44和45的引物从大肠杆菌bl21(de3)菌株的基因组dna扩增hemb、hemc和hemd基因。在这时，通过在用于扩增过程中的seqidno:44的引物中所含的核糖体结合位点(rbs)的序列将核糖体结合位点(rbs)的序列添加至经扩增的hemd基因的5'端。分别用ncoi和bamhi、ndei和bglii以及bglii和xhoi切割所扩增的dna片段，然后依序插入用相同的限制酶切割的prsfduet-1载体(novagen，美国)中，由此构建prsf-hembcd。(c)质粒pet-hemefgh的构建基于拷贝数高于质粒pcdfduet-1的质粒petduet-1，使参与从ala生成血红素的代谢途径的下游的heme、hemf、hemg和hemh基因过表达，使得从ala生成血红素的代谢途径的通量增加。基于petduet-1，通过以下程序构建过表达heme、hemf、hemg和hemh基因的质粒pet-hemefgh。分别使用seqidno:46和47的引物、seqidno:48和49的引物、seqidno:50和51的引物以及seqidno:23和24的引物从大肠杆菌bl21(de3)菌株的基因组dna扩增heme、hemf、hemg和hemh基因。在这时，通过在用于扩增过程中的seqidno:48和50的引物中所含的核糖体结合位点(rbs)的序列将核糖体结合位点(rbs)的序列添加至经扩增的hemf和hemg基因的5'端。分别用ncoi和saci、saci和psti、psti和noti以及ndei和xhoi切割所扩增的序列，然后依序插入用相同的限制酶切割的petduet-1载体(novagen，美国)中，由此构建pet-hemefgh。(d)重组大肠杆菌heme3的构建将所构建的pcdf-hemal、prsf-hembcd和pet-hemefgh质粒一起引入大肠杆菌bl21(de3)菌株中，由此构建大肠杆菌heme3菌株(图2d和表14)。[表14]为了鉴定在所构建的大肠杆菌菌株中的ala和血红素生成的概况，使用上文表14中所示的每种菌株接种5ml含有25μg/ml卡那霉素、50μg/ml氨苄西林和100μg/ml链霉素的lb培养基(10g/lnacl、10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母提取物)，然后在37℃和220rpm下培养12小时。对于血红素生成的主要培养，将1ml预培养物转移至50ml含有相同抗生素的lb-fe7.5培养基(10g/lnacl、10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母提取物、7.5mg/lfeso47h2o)中，然后将细胞在250-ml锥形瓶中在37℃和200rpm下培养，直至od600达到约0.6为止。接下来，将1mmiptg添加至培养基中，然后将细胞在30℃和200rpm下培养48小时。在培养后，收集样品以分析ala的生成，然后通过先前所报道的方法预处理并分析样品(burnham,methodsenzymol.17a,195-204,1970)。另外，为了分析血红素的生成，从每种培养基中收集1ml样品并离心，并且将所收集的细胞再悬浮于500μl1mnaoh水溶液中，并通过超声波破碎来裂解。过滤所制备的样品，然后通过先前已知的使用hplc的方法测量其中的血红素浓度(lee等人,j.microbiol.biotechnol.22,1653-1658,2012)。因此，与heme2菌株(0.53mg/l)相比，heme3菌株中血红素的生成增加至3.79mg/l(图2d和图3)。换言之，可以通过调节血红素生物合成途径的基因的表达水平增加血红素的生成。实施例3：用于增加的血红素生成的竞争性代谢途径的缺失对于增加的血红素生成，可以缺失与血红素生物合成途径竞争的代谢途径。首先，为了增加从葡萄糖至谷氨酸的代谢通量，可以防止用作c5ala生物合成的前体的糖酵解代谢物被转化为诸如乙酸或乳酸等副产物。另外，可以防止所生成的血红素被降解，由此增加血红素的生成。3-1：用于增加的血红素生成的ldha和pta基因的缺失为了在本发明的使用c5ala生物合成途径的菌株中增加葡萄糖转化为谷氨酸的产率和代谢，需要防止丙酮酸和乙酰基-coa(其为糖酵解的代谢物)分别被转化为乳酸和乙酸。基于先前报道指示可以通过缺失参与将丙酮酸转化为乳酸的ldha基因和参与将乙酰基-coa转化为乙酸的pta基因来增加谷氨酸的生成(vuoristo等人,ambexpress5,61,2015)，通过以下程序从heme3缺失ldha和pta基因。(a)用于基因缺失的dna片段的构建为了使用先前报道的λred重组工程技术缺失ldha和pta基因(datsenko等人,proc.natl.acad.sci.usa97,6640-6645,2000)，构建了基因缺失所需的dna片段。分别使用seqidno:52和53的引物以及seqidno:54和55的引物扩增待用于从质粒pecmulox(kim等人,femsmicrobiol.lett.278,78-85,2008)缺失ldha基因的dna片段(δldha::cat)和用于缺失pta基因的dna片段(δpta::cat)。[表15](b)从bl21(de3)缺失ldha基因为了使用上文构建的dna片段缺失ldha基因，将质粒pkd46(datsenko等人,proc.natl.acad.sci.usa97,6640-6645,2000)引入bl21(de3)菌株中，然后将所述菌株接种至5ml含有50μg/ml氨苄西林的lb培养基(10g/lnacl、10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母提取物)中，并且在30℃和200rpm下培养过夜。使用1ml培养液中的所培养细胞接种100ml补充有50μg/ml氨苄西林和1mm阿拉伯糖的lb培养基，然后在30℃和200rpm下培养，直至od600达到约0.6为止。收获所培养的细胞，用冷却至0℃的10％甘油洗涤两次，然后再悬浮于150μl的相同水溶液中。接下来，通过电穿孔将用于缺失ldha基因的所构建的dna片段(δldha::cat)引入细胞中，然后通过在含有8.5μg/ml氯霉素的lb琼脂培养基(10g/lnacl、10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母提取物、15g/l琼脂)上在37℃下培养来选择引入了氯霉素抗性基因(cat)同时缺少ldha基因的菌落。在确认在用于菌落选择的37℃培养期间从所选菌落中移除质粒pkd46后，将质粒pjw168(wild等人,gene223,55-66,1998)再次引入所述菌落中，随后在含有50μg/ml氨苄西林和1mmiptg的lb琼脂培养基(10g/lnacl、10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母提取物、15g/l琼脂)上在30℃下培养所述菌落，由此移除氯霉素抗性基因(cat)。通过测序来确认从所构建的菌株bl21(de3)δldha(表16)缺失ldha基因。[表16]菌株描述bl21(de3)δldha大肠杆菌bl21(de3)δldha(c)从bl21(de3)δldha缺失pta基因为了使用上文构建的dna片段缺失pta基因，将质粒pkd46(datsenko等人,proc.natl.acad.sci.usa97,6640-6645,2000)引入bl21(de3)菌株中，然后使用所述菌株接种5ml含有50μg/ml氨苄西林的lb培养基(10g/lnacl、10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母提取物)，并且在30℃和200rpm下培养过夜。将1ml培养液中的所培养细胞转移至100ml补充有50μg/ml氨苄西林和1mm阿拉伯糖的lb培养基，然后在30℃和200rpm下培养，直至od600达到约0.6为止。收获所培养的细胞，用冷却至0℃的10％甘油洗涤两次，然后再悬浮于150μl的相同水溶液中。接下来，通过电穿孔将用于缺失pta基因的所构建的dna片段(δpta::cat)引入细胞中，然后通过在含有8.5μg/ml氯霉素的lb琼脂培养基(10g/lnacl、10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母提取物、15g/l琼脂)上在37℃下培养来选择引入了氯霉素抗性基因(cat)同时缺少pta基因的菌落。在确认在用于菌落选择的37℃培养期间从所选菌落中移除质粒pkd46后，将质粒pjw168(wild等人,gene223,55-66,1998)再次引入所述菌落中，随后在含有50μg/ml氨苄西林和1mmiptg的lb琼脂培养基(10g/lnacl、10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母提取物、15g/l琼脂)上在30℃下培养所述菌落，由此移除氯霉素抗性基因(cat)。通过测序来确认从所构建的菌株bl21(de3)δptaδldha缺失pta基因。[表17]菌株描述bl21(de3)δptaδldha大肠杆菌bl21(de3)δptaδldha(d)重组大肠杆菌heme5的构建将实施例2-2中构建的pcdf-hemal、prsf-hembcd和pet-hemefgh质粒一起引入表17中所示的菌株bl21(de3)δptaδldha中，由此构建大肠杆菌heme5菌株(表18)。[表18]为了鉴定在所构建的大肠杆菌菌株中的ala和血红素生成的概况，使用上文表18中所示的菌株接种5ml含有25μg/ml卡那霉素、50μg/ml氨苄西林和100μg/ml链霉素的lb培养基(10g/lnacl、10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母提取物)，然后在37℃和220rpm下培养12小时。对于血红素生成的主要培养，将1ml预培养物转移至50ml含有相同抗生素的lb-fe7.5培养基(10g/lnacl、10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母提取物、7.5mg/lfeso47h2o)中，然后将细胞在250-ml锥形瓶中在37℃和200rpm下培养，直至od600达到约0.6为止。接下来，将1mmiptg添加至培养基中，然后将细胞在30℃和200rpm下培养48小时。在培养后，收集样品以分析ala的生成，然后通过先前所报道的方法预处理并分析样品(burnham,methodsenzymol.17a,195-204,1970)。另外，为了分析血红素的生成，从每种培养基中收集1ml样品并离心，并且将所收集的细胞再悬浮于500μl1mnaoh水溶液中，并通过超声波破碎来裂解。过滤所制备的样品，然后通过先前已知的使用hplc的方法测量其中的血红素浓度(lee等人,j.microbiol.biotechnol.22,1653-1658,2012)。因此，与heme3菌株(3.79mg/l)相比，heme5菌株中血红素的生成增加至4.17mg/l(图3)。3-2：用于增加的血红素生成的yfex基因的缺失先前研究报道，从yfex基因表达的蛋白质是从血红素中移除fe2+离子的血红素去螯合酶(letoffe等人,proc.natl.acad.sci.usa106,11719-11724,2009)，但是另一项研究报道，yfex基因的表达产物不是血红素去螯合酶，而是将卟啉原转化为卟啉的过氧化物酶(dailey等人,mbio2,e00248-00211,2011)。然而，仍另一项研究报道，yfex基因的过表达破坏血红素的内稳态(turlin等人,microbiologyopen3,849-859,2014)。虽然还没有发现yfex基因的确切功能，但是认为缺失yfex基因可以增加血红素的生成。因此，通过以下程序检查了缺失yfex基因对血红素生成的影响。(a)用于基因缺失的dna片段的构建为了使用先前报道的λred重组工程技术缺失yfex基因(datsenko等人,proc.natl.acad.sci.usa97,6640-6645,2000)，构建了基因缺失所需的dna片段。使用seqidno:56和57的引物从质粒pecmulox(kim等人,femsmicrobiol.lett.278,78-85,2008)扩增待用于缺失yfex基因的dna片段(δyfex::cat)。[表19](b)从bl21(de3)缺失yfex基因为了使用上文构建的dna片段缺失yfex基因，将质粒pkd46(datsenko等人,proc.natl.acad.sci.usa97,6640-6645,2000)引入bl21(de3)菌株中，然后使用所述菌株接种5ml含有50μg/ml氨苄西林的lb培养基(10g/lnacl、10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母提取物)，并且在30℃和200rpm下培养过夜。将1ml培养液中的所培养细胞转移至100ml补充有50μg/ml氨苄西林和1mm阿拉伯糖的lb培养基，然后在30℃和200rpm下培养，直至od600达到约0.6为止。收获所培养的细胞，用冷却至0℃的10％甘油洗涤两次，然后再悬浮于150μl的相同水溶液中。接下来，通过电穿孔将用于缺失yfex基因的所构建的dna片段(δyfex::cat)引入细胞中，然后通过在含有8.5μg/ml氯霉素的lb琼脂培养基(10g/lnacl、10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母提取物、15g/l琼脂)上在37℃下培养来选择引入了氯霉素抗性基因(cat)同时缺少yfex基因的菌落。在确认在用于菌落选择的37℃培养期间从所选菌落中移除质粒pkd46后，将质粒pjw168(wild等人,gene223,55-66,1998)再次引入所述菌落中，随后在含有50μg/ml氨苄西林和1mmiptg的lb琼脂培养基(10g/lnacl、10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母提取物、15g/l琼脂)上在30℃下培养所述菌落，由此移除氯霉素抗性基因(cat)。通过测序来确认从所构建的菌株bl21(de3)δyfex(表20)缺失yfex基因。[表20]菌株描述bl21(de3)δyfex大肠杆菌bl21(de3)δyfex(c)重组大肠杆菌heme4的构建将实施例2-2中构建的pcdf-hemal、prsf-hembcd和pet-hemefgh质粒一起引入表20中所示的菌株bl21(de3)δyfex中，由此构建大肠杆菌heme4菌株(表21)。[表21]为了鉴定在所构建的大肠杆菌菌株中的ala和血红素生成的概况，使用上文表21中所示的菌株接种5ml含有25μg/ml卡那霉素、50μg/ml氨苄西林和100μg/ml链霉素的lb培养基(10g/lnacl、10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母提取物)，然后在37℃和220rpm下培养12小时。对于血红素生成的主要培养，将1ml预培养物转移至50ml含有相同抗生素的lb-fe7.5培养基(10g/lnacl、10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母提取物、7.5mg/lfeso47h2o)中，然后将细胞在250-ml锥形瓶中在37℃和200rpm下培养，直至od600达到约0.6为止。接下来，将1mmiptg添加至培养基中，然后将细胞在30℃和200rpm下培养48小时。在培养后，收集样品以分析ala的生成，然后通过先前所报道的方法预处理并分析样品(burnham,methodsenzymol.17a,195-204,1970)。另外，为了分析血红素的生成，从每种培养基中收集1ml样品并离心，并且将所收集的细胞再悬浮于500μl1mnaoh水溶液中，并通过超声波破碎来裂解。过滤所制备的样品，然后通过先前已知的使用hplc的方法测量其中的血红素浓度(lee等人,j.microbiol.biotechnol.22,1653-1658,2012)。因此，与heme3菌株(3.79mg/l)相比，heme4菌株中血红素的生成增加至6.21mg/l(图3)。3-3：用于增加的血红素生成的pta、ldha和yfex基因的缺失如实施例3-1和3-2中所述，与heme3菌株中的血红素生成(3.79mg/l)相比，缺少pta和ldha基因的heme5菌株(4.17mg/ml血红素)和缺少yfex基因的heme4菌株(6.21mg/ml血红素)各自的血红素生成有所增加。因此，为了检查在实施例3-1和实施例3-2的基因缺失策略一起使用时是否可以进一步增加血红素生成，通过以下程序构建并分析缺少所有三种基因的菌株。(a)用于基因缺失的dna片段的构建为了使用先前报道的λred重组工程技术缺失yfex基因(datsenko等人,proc.natl.acad.sci.usa97,6640-6645,2000)，构建了基因缺失所需的dna片段。使用seqidno:56和57的引物从质粒pecmulox(kim等人,femsmicrobiol.lett.278,78-85,2008)扩增待用于缺失yfex基因的dna片段(δyfex::cat)。(b)从bl21(de3)δpl缺失yfex基因为了使用上文构建的dna片段缺失yfex基因，将质粒pkd46(datsenko等人,proc.natl.acad.sci.usa97,6640-6645,2000)引入bl21(de3)δpl菌株中，然后使用所述菌株接种5ml含有50μg/ml氨苄西林的lb培养基(10g/lnacl、10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母提取物)，并且在30℃和200rpm下培养过夜。将1ml培养液中的所培养细胞转移至100ml补充有50μg/ml氨苄西林和1mm阿拉伯糖的lb培养基，然后在30℃和200rpm下培养，直至od600达到约0.6为止。收获所培养的细胞，用冷却至0℃的10％甘油洗涤两次，然后再悬浮于150μl的相同水溶液中。接下来，通过电穿孔将用于缺失yfex基因的所构建的dna片段(δyfex::cat)引入细胞中，然后通过在含有8.5μg/ml氯霉素的lb琼脂培养基(10g/lnacl、10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母提取物、15g/l琼脂)上在37℃下培养来选择引入了氯霉素抗性基因(cat)同时缺少yfex基因的菌落。在确认在用于菌落选择的37℃培养期间从所选菌落中移除质粒pkd46后，将质粒pjw168(wild等人,gene223,55-66,1998)再次引入所述菌落中，随后在含有50μg/ml氨苄西林和1mmiptg的lb琼脂培养基(10g/lnacl、10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母提取物、15g/l琼脂)上在30℃下培养所述菌落，由此移除氯霉素抗性基因(cat)。通过测序来确认从所构建的菌株bl21(de3)δptaδldhaδyfex(表22)缺失yfex基因。[表22]菌株描述bl21(de3)δptaδldhaδyfex大肠杆菌bl21(de3)δptaδldhaδyfex(c)重组大肠杆菌heme6的构建将实施例2-2中构建的pcdf-hemal、prsf-hembcd和pet-hemefgh质粒一起引入表22中所示的菌株bl21(de3)δptaδldhaδyfex中，由此构建大肠杆菌heme6菌株(图2e和表23)。[表23]为了鉴定在所构建的大肠杆菌菌株中的ala和血红素的生成的概况，使用上文表23中所示的菌株接种5ml含有25μg/ml卡那霉素、50μg/ml氨苄西林和100μg/ml链霉素的lb培养基(10g/lnacl、10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母提取物)，然后在37℃和220rpm下培养12小时。对于血红素生成的主要培养，将1ml预培养物转移至50ml含有相同抗生素的lb-fe7.5培养基(10g/lnacl、10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母提取物、7.5mg/lfeso47h2o)中，然后将细胞在250-ml锥形瓶中在37℃和200rpm下培养，直至od600达到约0.6为止。接下来，将1mmiptg添加至培养基中，然后将细胞在30℃和200rpm下培养48小时。在培养后，收集样品以分析ala的生成，然后通过先前所报道的方法预处理并分析样品(burnham,methodsenzymol.17a,195-204,1970)。另外，为了分析血红素的生成，从每种培养液中收集1ml样品并离心，并且将所收集的细胞再悬浮于500μl1mnaoh水溶液中，并通过超声波破碎来裂解。过滤所制备的样品，然后通过先前已知的使用hplc的方法测量其中的血红素浓度(lee等人,j.microbiol.biotechnol.22,1653-1658,2012)。因此，与heme3菌株(3.79mg/l)、heme5菌株(4.17mg/ml)和heme4菌株(6.21mg/ml)相比，heme6菌株中血红素的生成增加至7.13mg/l(图2e和图3)。实施例4：用于增加的血红素生成的培养条件优化4-1：产血红素培养基的优化：基础培养基组成的选择为了进一步增加实施例3中构建的heme6菌株中的血红素生成，优化用于培养所述菌株的培养基的组成。在lb-fe7.5、tb-fe7.5和mr-fe7.5培养基中的每一种中培养heme6菌株，所述培养基是通过将7.5mg/lfeso47h2o分别添加至lb培养基(10g/lnacl、10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母提取物)、tb培养基(16.43g/lk2hpo4·3h2o、2.31g/lkh2po4、4g/l甘油、12g/l胰蛋白胨、24g/l酵母提取物)和mr-fe0培养基(6.67g/lkh2po4、4g/l(nh4)2hpo4、0.8g/lmgso47h2o、0.8g/l柠檬酸、5g/l酵母提取物、5ml/l痕量金属溶液，ph7.0)中来获得，并且测量每种培养基中的血红素生成。痕量金属溶液i的组成如下：0.5mhcl、2g/lcacl2、2.2g/lznso47h2o、0.5g/lmnso44h2o、1g/lcuso45h2o、0.1g/l(nh4)6mo7o244h2o和0.02g/lna2b4o710h2o。为了鉴定在所述培养基中培养的heme6菌株中的血红素的生成的概况，使用上文表23中所示的菌株接种5ml含有25μg/ml卡那霉素、50μg/ml氨苄西林和100μg/ml链霉素的lb培养基(10g/lnacl、10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母提取物)，然后在37℃和220rpm下培养12小时。对于血红素生成的主要培养，将1ml预培养物转移至50ml补充有25μg/ml卡那霉素、50μg/ml氨苄西林和100μg/ml链霉素的新鲜的六种培养基中，然后将细胞在250-ml锥形瓶中在37℃和200rpm下培养，直至od600达到约0.6为止。接下来，将1mmiptg添加至培养基中，然后将细胞在30℃和200rpm下培养48小时。为了分析血红素的生成，从每种培养液中收集1ml样品并离心，并且将所收集的细胞再悬浮于500μl1mnaoh水溶液中，并通过超声波破碎来裂解。过滤所制备的样品，然后通过先前已知的使用hplc的方法测量其中的血红素浓度(lee等人,j.microbiol.biotechnol.22,1653-1658,2012)。因此，确认在mr-fe7.5培养基中培养heme6菌株时，生成了最大量的血红素(7.45mg/l)(图4)。4-2：产血红素培养基的优化：铁离子浓度的选择基于实施例4-1中所选mr-fe7.5培养基中的血红素生成与mr-fe0培养基中的血红素生成显著不同的事实，检查了铁离子浓度是否对血红素生成具有显著影响。因此，优化了铁离子浓度以进一步增加heme6菌株中的血红素生成。基于实施例4-1的mr-fe0培养基，将0、10、20、40、60和100mg/lfeso47h2o添加至培养基中，由此分别制备mr-fe0、mr-fe10、mr-fe20、mr-fe40、mr-fe60和mr-fe100培养基。为了鉴定在所述培养基中培养的heme6菌株中的血红素的生成的概况，使用上文表23中所示的菌株接种5ml含有25μg/ml卡那霉素、50μg/ml氨苄西林和100μg/ml链霉素的lb培养基(10g/lnacl、10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母提取物)，然后在37℃和220rpm下培养12小时。对于血红素生成的主要培养，将1ml预培养物转移至50ml补充有25μg/ml卡那霉素、50μg/ml氨苄西林和100μg/ml链霉素的新鲜的六种培养基中，然后将细胞在250-ml锥形瓶中在37℃和200rpm下培养，直至od600达到约0.6为止。接下来，将1mmiptg添加至培养基中，然后将细胞在30℃和200rpm下培养48小时。为了分析血红素的生成，从每种培养基中收集1ml样品并离心，并且将所收集的细胞再悬浮于500μl1mnaoh水溶液中，并通过超声波破碎来裂解。过滤所制备的样品，然后通过先前已知的使用hplc的方法测量其中的血红素浓度(lee等人,j.microbiol.biotechnol.22,1653-1658,2012)。因此，确认在培养基含有20mg/lfeso47h2o时(mr-fe20培养基)，生成了最大量的血红素(图5)。4-3：培养温度优化为了选择待用于通过heme6菌株生成血红素的最佳培养温度，通过以下程序培养菌株。使用上文表23中所示的菌株接种5ml含有25μg/ml卡那霉素、50μg/ml氨苄西林和100μg/ml链霉素的lb培养基(10g/lnacl、10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母提取物)，然后在37℃和220rpm下培养12小时。对于血红素生成的主要培养，将1ml预培养物转移至50ml补充有25μg/ml卡那霉素、50μg/ml氨苄西林和100μg/ml链霉素的新鲜的mr-fe20培养基中，然后将细胞在250-ml锥形瓶中在37℃和200rpm下培养，直至od600达到约0.6为止。接下来，将1mmiptg添加至培养基中，然后将细胞在24℃、30℃和37℃以及200rpm下培养72小时，并且在最初24小时中以6小时间隔以及在最初24小时后以12小时间隔进行取样。为了分析血红素的生成，从培养液中收集1ml样品并离心，并且将所收集的细胞再悬浮于500μl1mnaoh水溶液中，并通过超声波破碎来裂解。过滤所制备的样品，然后通过先前已知的使用hplc的方法测量其中的血红素浓度(lee等人,j.microbiol.biotechnol.22,1653-1658,2012)。因此，确认当在1mmiptg存在下在30℃下将菌株培养60小时时，生成了最大量的血红素(7.78g/l)(图6)。实施例5：通过分批发酵和补料分批发酵进行的细胞外游离血红素生成5-1：通过分批发酵进行的细胞外游离血红素生成尚未报道使用发酵罐进行发酵用于血红素生成的例子。因此，基于实施例4中优化的培养条件，使用heme6菌株进行分批发酵。使用表23中所示的菌株接种5ml补充有25μg/ml卡那霉素、50μg/ml氨苄西林和100μg/ml链霉素的lb培养基(10g/lnacl、10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母提取物)，然后在37℃和220rpm下培养12小时。对于血红素生成的主要培养，将1ml预培养物转移至200ml补充有25μg/ml卡那霉素、50μg/ml氨苄西林和100μg/ml链霉素的新鲜的mr-fe20培养基中，然后将细胞在500-ml锥形瓶中在37℃和200rpm下培养12小时。接下来，将培养物转移至6.6-lbioflo3000发酵罐(newbrunswickscientificco.，新泽西州爱迪生)中，所述发酵罐含有1.8l补充有25μg/ml卡那霉素、50μg/ml氨苄西林、100μg/ml链霉素和20g/l葡萄糖的mr-fe20培养基(ph7.0；通过以200rpm搅拌和以2l/min供应空气在30℃下空气饱和)。在发酵期间，将温度维持在30℃，并通过50％nh4oh将ph维持在7.0。另外，通过增加搅动速度至高达1000rpm将溶解氧(do)水平维持在初始do水平的40％。在od600达到5时，将1mmiptg添加至细胞中，并且对于血红素生成的分析，以8小时间隔进行取样。为了分析血红素的生成，从培养液中收集1ml样品并离心，并且将所收集的细胞再悬浮于500μl1mnaoh水溶液中，并通过超声波破碎来裂解。过滤所制备的培养基和所裂解的细胞样品，然后通过先前已知的使用hplc的方法测量其中的血红素浓度(lee等人,j.microbiol.biotechnol.22,1653-1658,2012)。因此，在56小时生成了最大量的血红素(总共14.24mg/l)，并且在培养基中检测到1.18mg/l(8.29％)的所生成的血红素。56小时的总生产力为0.25mg/l/h(图7)。重要的是，在这个实施例中可以通过分批发酵检测到1mg/l或更多的细胞外游离血红素。5-2：通过补料分批发酵进行的细胞外游离血红素生成基于在实施例5-1中获得的分批发酵结果，进行补料分批发酵以生成较大量的血红素。使用表23中所示的菌株接种5ml补充有25μg/ml卡那霉素、50μg/ml氨苄西林和100μg/ml链霉素的lb培养基(10g/lnacl、10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母提取物)，然后在37℃和220rpm下培养12小时。对于血红素生成的主要培养，将1ml预培养物转移至200ml补充有25μg/ml卡那霉素、50μg/ml氨苄西林和100μg/ml链霉素的新鲜的mr-fe20培养基中，然后将细胞在500-ml锥形瓶中在37℃和200rpm下培养12小时。接下来，将培养物转移至6.6-lbioflo3000发酵罐(newbrunswickscientificco.，新泽西州爱迪生)中，所述发酵罐含有1.8l补充有25μg/ml卡那霉素、50μg/ml氨苄西林、100μg/ml链霉素和20g/l葡萄糖的mr-fe20培养基(ph7.0；通过以200rpm搅拌和以2l/min供应空气在30℃下空气饱和)。在发酵期间，将温度维持在30℃，并通过50％nh4oh将ph维持在7.0。另外，通过增加搅动速度至高达1000rpm将溶解氧(do)水平维持在初始do水平的40％。在补料分批发酵期间，使用ph稳态方法供应供料溶液(700g/l葡萄糖、8g/lmgso47h2o、20mg/lfeso47h2o)。在od600达到5时，将1mmiptg添加至培养基中，并且对于血红素生成的分析，以8小时间隔进行取样。为了分析血红素的生成，从培养基中收集1ml样品并离心，并且将所收集的细胞再悬浮于500μl1mnaoh水溶液中，并通过超声波破碎来裂解。过滤所制备的培养基和所裂解的细胞样品，然后通过先前已知的使用hplc的方法测量其中的血红素浓度(lee等人,j.microbiol.biotechnol.22,1653-1658,2012)。因此，在56小时生成了最大量的血红素(总共49.18mg/l)，并且在培养基中检测到16.77mg/l(34.10％)的所生成的血红素。在32小时，od600达到了最大值(67.2)(图8a)。5-3：通过供应有(nh4)2so4的菌株的补料分批发酵进行的细胞外游离血红素生成基于需要4个氮原子生成一分子血红素的事实，得出结论，可以通过供应氮源来增加血红素的生成。为了验证所述假说，在供应(nh4)2so4作为氮源的同时进行补料分批发酵。将表23中所示的菌株接种至5ml补充有25μg/ml卡那霉素、50μg/ml氨苄西林和100μg/ml链霉素的lb培养基(10g/lnacl、10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母提取物)中，然后在37℃和220rpm下培养12小时。对于血红素生成的主要培养，将1ml培养基(其中所培养细胞正在生长)接种至200ml补充有25μg/ml卡那霉素、50μg/ml氨苄西林和100μg/ml链霉素的新鲜的mr-fe20培养基中，然后将细胞在500-ml锥形瓶中在37℃和200rpm下培养12小时。接下来，将培养物接种至6.6-lbioflo3000发酵罐(newbrunswickscientificco.，新泽西州爱迪生)中，所述发酵罐含有1.8l补充有25μg/ml卡那霉素、50μg/ml氨苄西林、100μg/ml链霉素和20g/l葡萄糖的mr-fe20培养基(ph7.0；通过以200rpm搅拌和以2l/min供应空气在30℃下空气饱和)。在发酵期间，将温度维持在30℃，并通过50％nh4oh将ph维持在7.0。另外，通过增加搅动速度至高达1000rpm将溶解氧(do)水平维持在初始do水平的40％。在补料分批发酵期间，使用ph稳态方法供应供料溶液(700g/l葡萄糖、8g/lmgso47h2o、20mg/lfeso47h2o)。在od600达到5时，将1mmiptg添加至培养基中，并且对于血红素生成的分析，以8小时间隔进行取样。为了分析血红素的生成，从培养基中收集1ml样品并离心，并且将所收集的细胞再悬浮于500μl1mnaoh水溶液中，并通过超声波破碎来裂解。过滤所制备的培养基和所裂解的细胞样品，然后通过先前已知的使用hplc的方法测量其中的血红素浓度(lee等人,j.microbiol.biotechnol.22,1653-1658,2012)。因此，在56小时生成了最大量的血红素(总共104.90mg/l)，并且在培养基中检测到54.61mg/l(52.06％)的所生成的血红素。在48小时，od600达到了最大值(93.8)(图8b)。5-4：通过供应有谷氨酸盐的菌株的补料分批发酵进行的细胞外游离血红素生成本发明中构建的heme6菌株具有在不供应ala生成前体的情况下显示世界上最高的血红素生成的优点，如上文实施例中所证实。谷氨酸(c5ala生物合成途径的前体)相对便宜并且显示无细胞毒性，这与甘氨酸(c4ala生物合成途径的前体)不同，甘氨酸相对昂贵并且具有细胞毒性。因此，为了检查本发明中构建的heme6菌株的最大产血红素能力，在供应谷氨酸盐作为氮源的同时进行补料分批发酵。使用表23中所示的菌株接种5ml补充有25μg/ml卡那霉素、50μg/ml氨苄西林和100μg/ml链霉素的lb培养基(10g/lnacl、10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母提取物)，然后在37℃和220rpm下培养12小时。对于血红素生成的主要培养，将1ml预培养物转移至200ml补充有25μg/ml卡那霉素、50μg/ml氨苄西林和100μg/ml链霉素的新鲜的mr-fe20培养基中，然后将细胞在500-ml锥形瓶中在37℃和200rpm下培养12小时。接下来，将培养物接种至6.6-lbioflo3000发酵罐(newbrunswickscientificco.，新泽西州爱迪生)中，所述发酵罐含有1.8l补充有25μg/ml卡那霉素、50μg/ml氨苄西林、100μg/ml链霉素和20g/l葡萄糖的mr-fe20培养基(ph7.0；通过以200rpm搅拌和以2l/min供应空气在30℃下空气饱和)。在发酵期间，将温度维持在30℃，并通过50％nh4oh将ph维持在7.0。另外，通过增加搅动速度至高达1000rpm将溶解氧(do)水平维持在初始do水平的40％。在补料分批发酵期间，使用ph稳态方法供应供料溶液(700g/l葡萄糖、8g/lmgso47h2o、20mg/lfeso47h2o、20g/l谷氨酸盐)。在od600达到5时，将1mmiptg添加至培养基中，并且对于血红素生成的分析，以8小时间隔进行取样。为了分析血红素的生成，从培养基中收集1ml样品并离心，并且将所收集的细胞再悬浮于500μl1mnaoh水溶液中，并通过超声波破碎来裂解。过滤所制备的培养基和所裂解的细胞样品，然后通过先前已知的使用hplc的方法测量其中的血红素浓度(lee等人,j.microbiol.biotechnol.22,1653-1658,2012)。因此，在64小时生成了最大量的血红素(总共228.46mg/l)，并且在培养基中检测到131.90mg/l(57.734％)的所生成的血红素。在48小时，od600达到了最大值(172.8)(图8c)。实施例6：通过血红素输出蛋白的过表达增加的血红素生成和对血红素的细胞外分泌的促进6-1：过表达血红素输出蛋白基因ccmabc的菌株的构建在实施例5中，可以确认，随着血红素的总产量增加，细胞外分泌的血红素的比例逐渐增加。这支持在本发明开始前提出的假说，在细胞毒性血红素(anzaldi等人,infect.immun.78,4977-4989,2010)过度生成时，可以促进通过血红素输出蛋白ccmabc的细胞外血红素分泌(schulz等人,proc.natl.acad.sci.usa96,6462-6467,1999)以将游离血红素分泌至细胞外空间。另外，得出结论，当ccmabc基因在相同的情况下过表达时，可以进一步促进血红素的细胞外分泌。因此，通过以下程序构建过表达ccmabc基因的菌株。(a)质粒pacyc-ccmabc的构建通过以下程序构建质粒pacyc-ccmabc，其过表达编码血红素输出蛋白的ccma基因(seqidno:58)、ccmb基因(seqidno:59)和ccmc基因(seqidno:60)。分别使用seqidno:61和62的引物、seqidno:63和64的引物以及seqidno:65和66的引物从大肠杆菌bl21(de3)菌株的基因组dna扩增ccma、ccmb和ccmc基因。在这时，通过在用于扩增过程中的seqidno:65的引物中所含的核糖体结合位点(rbs)的序列将核糖体结合位点(rbs)的序列添加至经扩增的ccmc基因的5'端。[表24]分别用ncoi和bamhi、ecori和sali以及ndei和xhoi切割所扩增的序列，然后依序插入用相同的限制酶切割的pacycduet-1载体(novagen，美国)中，由此构建pacyc-ccmabc。(b)重组大肠杆菌heme7的构建将所构建的pacyc-ccmabc质粒一起引入表23中所示的heme6菌株中，由此构建大肠杆菌heme7菌株(表25)。[表25]6-2：通过供应有(nh4)2so4的heme7菌株的补料分批发酵进行的细胞外游离血红素生成为了确认在实施例6-1中构建的过表达血红素输出蛋白基因ccmabc的heme7菌株的产血红素能力，在供应(nh4)2so4作为氮源的同时进行补料分批发酵。使用表25中所示的菌株接种5ml补充有25μg/ml卡那霉素、50μg/ml氨苄西林、100μg/ml链霉素和17μg/ml氯霉素的lb培养基(10g/lnacl、10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母提取物)，然后在37℃和220rpm下培养12小时。对于血红素生成的主要培养，将1ml预培养物转移至200ml补充有25μg/ml卡那霉素、50μg/ml氨苄西林、100μg/ml链霉素和17μg/ml氯霉素的新鲜的mr-fe20培养基中，然后将细胞在500-ml锥形瓶中在37℃和200rpm下培养12小时。接下来，将培养物转移至6.6-lbioflo3000发酵罐(newbrunswickscientificco.，新泽西州爱迪生)中，所述发酵罐含有1.8l补充有25μg/ml卡那霉素、50μg/ml氨苄西林、100μg/ml链霉素、17μg/ml氯霉素和20g/l葡萄糖的mr-fe20培养基(ph7.0；通过以200rpm搅拌和以2l/min供应空气在30℃下空气饱和)。在发酵期间，将温度维持在30℃，并通过50％nh4oh将ph维持在7.0。另外，通过增加搅动速度至高达1000rpm将溶解氧(do)水平维持在初始do水平的40％。在补料分批发酵期间，使用ph稳态方法供应供料溶液(700g/l葡萄糖、8g/lmgso47h2o、20mg/lfeso47h2o、5g/l(nh4)2so4)。在od600达到5时，将1mmiptg添加至培养基中，并且对于血红素生成的分析，以8小时间隔进行取样以确认血红素的生成。因此，在64小时生成了最大量的血红素(总共114.79mg/l)，并且在培养基中检测到71.91mg/l(62.64％)的所生成的血红素。在56小时，od600达到了最大值(76.9)(图9a)。在如这个实施例的假说中所提出的使ccmabc基因过表达时，与实施例5-3的补料分批发酵结果相比，血红素的细胞外分泌比率可以增加10.58％，并且血红素的总产量可以增加9.89mg/l。6-3：通过供应有谷氨酸盐的heme7菌株的补料分批发酵进行的细胞外游离血红素生成为了检查在供应实施例6-1中构建的过表达血红素输出蛋白基因ccmabc的heme7菌株的c5ala生物合成途径的前体时的最高血红素生成，在供应谷氨酸盐作为氮源的同时进行补料分批发酵。使用表25中所示的菌株接种5ml补充有25μg/ml卡那霉素、50μg/ml氨苄西林、100μg/ml链霉素和17μg/ml氯霉素的lb培养基(10g/lnacl、10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母提取物)，然后在37℃和220rpm下培养12小时。对于血红素生成的主要培养，将1ml预培养物转移至200ml补充有25μg/ml卡那霉素、50μg/ml氨苄西林、100μg/ml链霉素和17μg/ml氯霉素的新鲜的mr-fe20培养基中，然后将细胞在500-ml锥形瓶中在37℃和200rpm下培养12小时。接下来，将培养物转移至6.6-lbioflo3000发酵罐(newbrunswickscientificco.，新泽西州爱迪生)中，所述发酵罐含有1.8l补充有25μg/ml卡那霉素、50μg/ml氨苄西林、100μg/ml链霉素、17μg/ml氯霉素和20g/l葡萄糖的mr-fe20培养基(ph7.0；通过以200rpm搅拌和以2l/min供应空气在30℃下空气饱和)。在发酵期间，将温度维持在30℃，并通过50％nh4oh将ph维持在7.0。另外，通过增加搅动速度至高达1000rpm将溶解氧(do)水平维持在初始do水平的40％。在补料分批发酵期间，使用ph稳态方法供应供料溶液(700g/l葡萄糖、8g/lmgso47h2o、20mg/lfeso47h2o、20g/l谷氨酸盐)用于连续葡萄糖供应。在od600达到5时，将1mmiptg添加至培养基中，并且对于血红素生成的分析，以8小时间隔进行取样以确认血红素的生成。因此，在72小时生成了最大量的血红素(总共246.69mg/l)，并且在培养基中检测到164.12mg/l(66.529％)的所生成的血红素。在64小时，od600达到了最大值(142.8)(图9b)。在使ccmabc基因过表达时，与实施例5-4的补料分批发酵结果相比，血红素的细胞外分泌比率可以增加8.759％，并且血红素的总产量可以增加18.23mg/l。实施例7：谷氨酸棒状杆菌中血红素的生成为了检查用于研发生成并且细胞外分泌游离血红素的大肠杆菌菌株的策略是否也可以应用于在其他菌株中生成血红素，将c5ala生物合成途径引入广泛地用于生成氨基酸(包括谷氨酸)的谷氨酸棒状杆菌中(由于已证实谷氨酸棒状杆菌对人体无害)，并且生成了血红素。谷氨酸棒状杆菌是一种过表达谷氨酸的好氧微生物，具有从谷氨酸生成ala的c5生物合成途径和从ala生成血红素的血红素生物合成途径，类似于大肠杆菌。为了过表达谷氨酸棒状杆菌的对应于c5生物合成途径的hema和heml基因，分别使用seqidno:67和68的引物以及seqidno:69和70的引物从谷氨酸棒状杆菌atcc13032的基因组dna扩增hema和heml基因。在这个过程中，将两个氨基酸(赖氨酸)插入从hema基因表达的蛋白质的第二氨基酸与第三氨基酸之间，并且由此修饰hema基因的序列，使得hema蛋白将显示对负反馈的抗性(hemafbr)。通过gibson组装将两种所扩增的基因一起克隆至pekex1质粒的ecori位点中，由此构建在引入谷氨酸棒状杆菌中时表达hemafbr和heml蛋白的pekex1-hemal质粒。[表26]另外，为了如上文实施例2-1的(a)中所示检查编码参与从ala生成血红素的蛋白质的基因中hemb和hemh基因的过表达，构建过表达hemb和hemh基因的载体。为此，分别使用seqidno:71和72的引物以及seqidno:73和74的引物从谷氨酸棒状杆菌atcc13032的基因组dna扩增hemb和hemh基因。另外，使用seqidno:75和76的引物扩增pces208-spc质粒，然后通过gibson组装与所扩增的hemb和hemh基因组装在一起，由此构建pces-hembh质粒。[表27]将所构建的pekex1-hemal质粒或两种质粒(pekex1-hemal和pces-hembh)引入工业谷氨酸棒状杆菌s112菌株中，由此构建谷氨酸棒状杆菌s112-al和s112-al-bh菌株。[表28]对于用于检查两种所构建的谷氨酸棒状杆菌菌株(s112-al和s112-al-bh)的产血红素能力的瓶培养，使用每种菌株接种在250-ml带挡板烧瓶中所含的10ml具有下文表29的组成的种子培养基，然后在30℃和200rpm下培养约12小时，直至od600达到20为止。[表29]组分浓度葡萄糖40.0g/lmgso47h2o0.4g/lfeso47h2o10.0mg/lmnso45h2o10.0mg/lkh2po41.0g/l尿素4.0g/l硫胺-hcl200μg/l生物素50.0μg/l大豆水解物55.0ml/lph7.0接下来，将100μl培养物接种至在250-ml带挡板烧瓶中所含的10ml具有下文表30的组成的主要培养基中，然后在30℃和200rpm下培养48小时。[表30]因此，确认在不过表达血红素生物合成相关基因的谷氨酸棒状杆菌s112中，不生成血红素，而在s112-al和s112-al-bh菌株中，血红素在细胞中分别以0.77±0.23mg/l和1.64±0.30mg/l(基于培养体积)的量积累。因此，确认通过过表达c5生物合成途径和血红素生物合成途径，甚至可以在谷氨酸棒状杆菌中生成血红素。工业实用性根据本发明，血红素是一种越来越多地用作治疗卟啉病的健康食品或食品补充剂的有机金属化合物，可以在细胞外分泌并且使用微生物变体而不是常规化学合成或酶促合成以高产率生成，并且因此可以以环境友好、经济并且简单的方式进行使用所生成的血红素所需的纯化工艺。尽管已经参考具体特征详细描述了本发明，但是对于本领域技术人员来说清楚的是，此描述仅用于优选实施方案并且不限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围将由所附权利要求及其等同物限定。文本文件参见所见的序列表。序列表<110>韩国科学技术院<120>使用代谢工程化微生物的细胞外血红素生成方法<130>pf-b2220<140>pct/kr2018/015748<141>2018-12-12<150>kr10-2017-0170185<151>2017-12-12<150>kr10-2018-0158452<151>2018-12-10<160>76<170>patentinversion3.5<210>1<211>1224<212>dna<213>人工序列<220><223>hema-rsp<400>1atggattataacctggcactggataccgcgctgaatcgtctgcataccgaaggtcgttac60cgcacgtttattgatatcgaacgtcgcaaaggcgccttcccgaaagcaatgtggcgcaaa120ccggatggtagcgaaaaagaaattaccgtttggtgcggcaacgattatctgggtatgggc180cagcatccggtggttctgggtgcgatgcacgaagccctggatagtaccggtgcaggcagc240ggcggtacgcgtaacattagcggcaccacgctgtatcataaacgcctggaagcggaactg300gccgatctgcacggcaaagaagcggccctggtgtttagctctgcatacatcgcgaacgat360gccaccctgagcacgctgccgcagctgatcccgggtctggtgattgttagcgataaactg420aaccatgcatctatgattgaaggtatccgtcgctctggcaccgaaaaacatatcttcaaa480cacaacgatctggatgatctgcgtcgcatcctgacgagtattggtaaagatcgtccgatc540ctggttgcgtttgaaagcgtgtattctatggatggtgatttcggccgcattgaagaaatc600tgcgatattgcagatgaatttggcgcgctgaaatatattgatgaagttcacgcggtgggc660atgtacggtccgcgtggcggtggcgtggcagaacgtgatggtctgatggatcgcatcgat720attatcaatggcaccctgggcaaagcctatggcgttttcggtggctacattgcagcgagt780agcaaaatgtgtgatgccgtgcgcagctacgcaccgggttttatcttctctaccagtctg840ccgccggtggttgccgcaggtgcggccgcatctgttcgtcatctgaaaggcgatgtggaa900ctgcgcgaaaaacaccagacgcaggcgcgtattctgaaaatgcgcctgaaaggtctgggc960ctgccgattatcgatcatggtagtcacatcgtgccggttcatgtgggcgatccggttcac1020tgcaaaatgattagcgatatgctgctggaacattttggtatctatgttcagccgattaac1080ttcccgaccgtgccgcgtggcacggaacgtctgcgctttaccccgtctccggtgcatgat1140agtggcatgatcgatcacctggttaaagcgatggatgtgctgtggcagcactgtgcactg1200aatcgcgcggaagtggttgcctaa1224<210>2<211>28<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>2catgccatggattataacctggcactgg28<210>3<211>27<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>3ccggaattcttaggcaaccacttccgc27<210>4<211>2280<212>dna<213>人工序列<220><223>maeb基因<400>4atggatgaccagttaaaacaaagtgcacttgatttccatgaatttccagttccagggaaa60atccaggtttctccaaccaagcctctggcaacacagcgcgatctggcgctggcctactca120ccaggcgttgccgcaccttgtcttgaaatcgaaaaagacccgttaaaagcctacaaatat180accgcccgcggtaacctggtggcggtgatctctaacggtacggcggtgctggggttaggc240aacattggcgcgctggcaggcaaaccggtgatggaaggcaagggcgttctgtttaagaaa300ttcgccgggattgatgtatttgacattgaagttgacgaactcgacccggacaaatttatt360gaagttgtcgccgcgctcgaaccaaccttcggcggcatcaacctcgaagacattaaagcg420ccagaatgtttctatattgaacagaaactgcgcgagcggatgaatattccggtattccac480gacgatcagcacggcacggcaattatcagcactgccgccatcctcaacggcttgcgcgtg540gtggagaaaaacatctccgacgtgcggatggtggtttccggcgcgggtgccgcagcaatc600gcctgtatgaacctgctggtagcgctgggtctgcaaaaacataacatcgtggtttgcgat660tcaaaaggcgttatctatcagggccgtgagccaaacatggcggaaaccaaagccgcatat720gcggtggtggatgacggcaaacgtaccctcgatgatgtgattgaaggcgcggatattttc780ctgggctgttccggcccgaaagtgctgacccaggaaatggtgaagaaaatggctcgtgcg840ccaatgatcctggcgctggcgaacccggaaccggaaattctgccgccgctggcgaaagaa900gtgcgtccggatgccatcatttgcaccggtcgttctgactatccgaaccaggtgaacaac960gtcctgtgcttcccgttcatcttccgtggcgcgctggacgttggcgcaaccgccatcaac1020gaagagatgaaactggcggcggtacgtgcgattgcagaactcgcccatgcggaacagagc1080gaagtggtggcttcagcgtatggcgatcaggatctgagctttggtccggaatacatcatt1140ccaaaaccgtttgatccgcgcttgatcgttaagatcgctcctgcggtcgctaaagccgcg1200atggagtcgggcgtggcgactcgtccgattgctgatttcgacgtctacatcgacaagctg1260actgagttcgtttacaaaaccaacctgtttatgaagccgattttctcccaggctcgcaaa1320gcgccgaagcgcgttgttctgccggaaggggaagaggcgcgcgttctgcatgccactcag1380gaactggtaacgctgggactggcgaaaccgatccttatcggtcgtccgaacgtgatcgaa1440atgcgcattcagaaactgggcttgcagatcaaagcgagcgttgattttgag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