发明领域
公开了用于预防和/或治疗hiv的化合物、方法和药物组合物；包括通过施用治疗有效量的某些吲哚胺2,3-双加氧酶化合物预防aids和全身的免疫抑制的进展。还公开了制备此类化合物的方法以及使用所述化合物及其药物组合物的方法。
发明背景
吲哚胺-2,3-双加氧酶1(ido1)是一种含血红素的酶，其催化色氨酸的吲哚环氧化以生成n-甲酰基犬尿氨酸，该n-甲酰基犬尿氨酸快速地和组成性地转化为犬尿氨酸(kyn)和一系列下游代谢物。ido1是该色氨酸代谢的犬尿氨酸途径的限速步骤，并且在炎症的情况下ido1的表达是可诱导的。诱导ido1的刺激包括病毒或细菌产物，或与感染、肿瘤或无菌组织损伤有关的炎性细胞因子。kyn和几种下游代谢物具有免疫抑制作用：kyn对t细胞和nk细胞具有抗增殖和促凋亡作用(munn,shafizadeh等人1999,frumento,rotondo等人2002)，而代谢物如3-羟基邻氨基苯甲酸(3-haa)或3-haa氧化二聚产物朱红菌素酸(ca)抑制吞噬细胞功能(sekkai,guittet等人1997)，并诱导免疫抑制性调节性t细胞(treg)的分化，同时抑制肠道保护性的产生il-17或il-22的cd4+t细胞(th17和th22)的分化(favre,mold等人2010)。除了其它机制以外，ido1诱导可能在限制主动免疫反应期间的免疫病理学，促进免疫反应的分辨(resolution)以及促进胎儿耐受性中是重要的。然而，在慢性场合如癌症或慢性病毒或细菌感染中，ido1活性会阻止肿瘤或病原体的清除，并且如果活性是全身性的，ido1活性可能会导致全身性免疫功能障碍(boasso和shearer2008,li,huang等人2012)。除了这些免疫调节作用外，还已知ido1的代谢物(例如kyn和喹啉酸)具有神经毒性，并在几种神经功能障碍的病况和抑郁症中被发现升高。因此，ido1是抑制多种适应症的治疗靶标，例如用以促进肿瘤清除，成功清除难治的病毒或细菌感染，减少全身免疫功能障碍(表现为在hiv感染期间的持续的炎症或在败血症期间的免疫抑制)和预防或逆转神经学病况。
ido1和hiv感染中的持续的炎症:
尽管抗逆转录病毒疗法(art)在抑制hiv复制和减少aids相关病况的出现方面取得了成功，但接受art的hiv感染的患者具有比他们的未感染的对应人群更高的非aids发病率和死亡率的出现。这些非aids病况包括癌症、心血管疾病、骨质疏松症、肝病、肾病、虚弱和神经认知功能障碍(deeks2011)。若干研究表明，非aids发病率/死亡率与持续的炎症有关，与对应人群相比其在接受art的hiv感染的患者中保持升高(deeks2011)。因此，猜测尽管art进行了病毒学抑制，但持续的炎症和免疫功能障碍是这些非aids定义事件(nade)的一个原因。
hiv感染并杀死cd4+t细胞，特别偏好如驻留在粘膜表面的淋巴组织中的那些cd4+t细胞那样的细胞(mattapallil,douek等人2005)。这些细胞的丧失与对感染的炎症反应相结合，导致宿主与所有病原体(包括hiv本身，但扩展到先前存在的或获得的病毒感染、真菌感染以及皮肤和粘膜表面中的驻留细菌)之间的关系受到干扰。这种功能失调的宿主：病原体关系导致宿主对通常是小问题的过度反应并允许病原体在微生物丛中向外生长。因此，该功能失调的宿主：病原体相互作用会导致炎症加剧，进而导致更严重的功能障碍，从而引发恶性循环。由于炎症被认为会导致非aids发病率/死亡率，因此控制改变了的宿主：病原体相互作用的机制是治疗目标。
在未经治疗和治疗的hiv感染以及灵长类siv感染模型中，ido1的表达和活性增加(boasso,vaccari等人2007,favre,lederer等人2009,byakwaga,boum等人2014,hunt,sinclair等人2014,tenorio,zheng等人2014)。如酶底物和产物的血浆水平之比(kyn/tryp或k:t比)所示，ido1活性与其它炎症标志物相关并且是非aids发病率/死亡率的最强预测因子之一(byakwaga,boum等人2014,hunt,sinclair等人2014,tenorio,zheng等人2014)。此外，与ido1活性增加对免疫系统的预期影响相一致的特征是hiv和siv诱导的免疫功能障碍的主要特征，例如对抗原的t细胞增殖反应降低以及全身和肠道隔室中treg:th17的失衡(favre,lederer等人2009,favre,mold等人2010)。因此，我们和其他人猜测ido1在驱动免疫功能障碍和与非aids发病率/死亡率相关的炎症的恶性循环中起作用。因此，我们提议抑制ido1将在art抑制的hiv感染的人中减少炎症并降低nade的风险。
ido1和hiv以外的持续的炎症
如上所述，与治疗的慢性hiv感染相关的炎症可能是多种终末器官疾病的驱动因素[deeks2011]。但是，这些终末器官疾病并非hiv感染所独有，并实际上是在hiv感染人群中较早发生的常见衰老疾病。在未感染的普通人群中，病因不明的炎症是发病率和死亡率的主要相关因素[pinti,2016#88]。实际上，许多炎症标志物是共享的，例如il-6和crp。如果，如上面猜测的那样，ido1通过在gi道或全身组织中诱导免疫功能障碍而在hiv感染人群中引起持续的炎症，那么ido1也可能会导致炎症并因此在更广泛的人群中导致终末器官疾病。这些与炎症相关的终末器官疾病的例子有心血管疾病、代谢综合征、肝病(nafld，nash)、肾病、骨质疏松症和神经认知障碍。确实，ido1途径在文献中与肝病(italianassoc.forthestudyoftheliverconference2015的vivoli摘要]、糖尿病[baban,2010#89]、慢性肾病[schefold,2009#90]、心血管疾病[mangge,2014#92;mangge,2014#91]以及全身性老化和所有原因的死亡率[pertovaara,2006#93]有关。因此，ido1的抑制可用于减少一般人群的炎症，以减少与炎症和衰老相关的特定终末器官疾病的发生。
ido1和肿瘤学
ido表达可在多种人类癌症(例如；黑素瘤、胰腺癌、卵巢癌、aml、crc、前列腺癌和子宫内膜癌)中检测到，并且与不良预后相关(munn2011)。多种免疫抑制作用可归于ido的作用，包括诱导treg分化和过度激活，抑制teff免疫反应和降低的dc功能，所有这些都削弱了免疫识别并促进了肿瘤的生长(munn2011)。人脑肿瘤中ido的表达与存活率降低有关。垂直生长的和转基因的神经胶质瘤小鼠模型证明ido表达减少与treg浸润减少以及长期存活率增加之间存在相关性(wainwright,balyasnikova等人2012)。在人类黑素瘤中，高比例的肿瘤(36例中的33例)显示出ido升高，表明在建立特征在于mdsc以treg依赖性方式扩展、激活和募集的免疫抑制性肿瘤微环境(tme)中的重要作用(holmgaard,zamarin等人2015)。另外，已经在引流淋巴结和肿瘤本身中鉴定了表达宿主ido的免疫细胞(mellor和munn2004)。因此，肿瘤和宿主来源的ido均被认为有助于tme的免疫抑制状态。
ido的抑制是为重建针对癌症的免疫原性反应而提出的首要小分子药物策略之一(mellor和munn2004)。1-甲基色氨酸的d-对映体(d-1mt或indoximod)是第一个进入临床试验的ido抑制剂。尽管该化合物明确地抑制了ido的活性，但它是分离的酶的非常弱的抑制剂，并且仍在阐明该化合物的体内作用机理。incyte的研究者将通过筛选过程获得的命中化合物优化为具有足够的口服暴露的有效且选择性的抑制剂，以证明在小鼠黑素瘤模型中肿瘤生长的延迟(yue,douty等人2009)。该系列的进一步发展导致incb204360，其在瞬时转染人或小鼠酶的细胞系中对ido-1的抑制具有优于ido-2和tdo的高度选择性(liu,shin等人2010)。对于内源性地表达ido1的细胞系和原发性人类肿瘤，观察到相似的效力(ic50s~3-20nm)。当在dc和初始cd4+cd25-t细胞的共培养物中进行测试时，incb204360阻断这些t细胞向cd4+foxp3+tregs的转化。最后，当在具有免疫能力的小鼠的同系模型(pan02胰腺细胞)中进行测试时，口服给药的incb204360提供了肿瘤生长的显著剂量依赖性的抑制，但对植入免疫缺陷小鼠的同一肿瘤没有影响。相同研究者的其它研究表明，在具有免疫能力的小鼠的另一同系肿瘤模型中，ido1的抑制与全身性犬尿氨酸水平的抑制以及肿瘤生长的抑制之间存在相关性。基于这些临床前研究，incb24360进入了治疗转移性黑色瘤的临床试验(beatty,o'dwyer等人2013)。
鉴于色氨酸的分解代谢在维持免疫抑制中的重要性，因此，并不惊讶的是也已经检测到第二种色氨酸代谢酶tdo2被多种实体瘤(例如膀胱癌和肝癌、黑素瘤)过度表达。对104种人类细胞系的一项调查揭示，20/104具有tdo表达，17/104具有ido1且16/104表达两者(pilotte,larrieu等人2012)。类似于ido1的抑制，对tdo2的选择性抑制可有效逆转过度表达tdo2的肿瘤的免疫抵抗(pilotte,larrieu等人2012)。这些结果支持tdo2抑制和/或双重tdo2/ido1抑制作为改善免疫功能的可行治疗策略。
多项临床前研究已经表明，将ido-1抑制剂与针对ctla-4、pd-1和gitr的t细胞检查点调节性mab结合使用具有重要的，甚至是协同的价值。在每种情况下，在跨越各种鼠类模型的这些研究中均观察到了改善的免疫活性/功能的功效和相关的pd方面(balachandran,cavnar等人2011,holmgaard,zamarin等人2013,m.mautino2014,wainwright,chang等人2014)。incyteido1抑制剂(incb204360,epacadostat)已与ctla4阻滞剂(伊匹木单抗)联用进行了临床测试，但由于联用所见的剂量限制性不良事件，不清楚是否达到了有效剂量。相反，最近发布的一项组合了epacadostat与merck的pd-1mab(派姆单抗)的正在进行的试验的数据表明了该组合的改善的耐受性，从而允许更高剂量的ido1抑制剂。存在令人鼓舞的跨跃多种肿瘤类型的若干临床反应。然而，尚不清楚这种组合是否比派姆单抗的单药活性有所改善(gangadhar,hamid等人2015)。类似地，在最近完成了针对晚期肿瘤患者的1a期安全性和pk/pd研究之后，roche/genentech正在进行将ngl919/gdc-0919与pd-l1(mpdl3280a,atezo)和ox-40的两种mab结合使用。
ido1和慢性感染
ido1活性会产生犬尿氨酸途径代谢物如kyn和3-haa，其至少会损害t细胞、nk细胞和巨噬细胞活性(munn,shafizadeh等人1999,frumento,rotondo等人2002)(sekkai,guittet等人1997,favre,mold等人2010)。kyn水平或kyn/tryp比在慢性hiv感染(byakwaga,boum等人2014,hunt,sinclair等人2014,tenorio,zheng等人2014)、hbv感染(chen,li等人2009)、hcv感染(larrea,riezu-boj等人2007,asghar,ashiq等人2015)和tb感染(suzuki,suda等人2012)的场合下升高并与抗原特异性t细胞功能障碍相关(boasso,herbeuval等人2007,boasso,hardy等人2008,loughman和hunstad2012,ito,ando等人2014,lepiller,soulier等人2015)。因此，认为在这些慢性感染的情况下，ido1介导的病原体特异性t细胞反应的抑制在感染的持续性中起作用，并且ido1的抑制可能对促进清除和解决感染具有益处。
ido1和败血症
观察到败血症期间ido1表达和活性升高，并且kyn或kyn/tryp升高的程度对应于疾病严重性增加，包括死亡率增加(tattevin,monnier等人2010,darcy,davis等人2011)。在动物模型中，对ido1或ido1基因敲除的阻断可保护小鼠免受致死剂量的lps或盲肠结扎/穿孔模型中的死亡的影响(jung,lee等人2009,hoshi,osawa等人2014)。败血症的特征是在严重病例中的免疫抑制期(hotchkiss,monneret等人2013)，这可能表明ido1作为免疫功能障碍的介质的作用，并表明ido1的药理学抑制可为败血症提供临床益处。
ido1和神经学病症
除了免疫学场合外，ido1活性还与神经学场合中的疾病相关(在lovelaceneuropharmacology2016(lovelace,varney等人2016)中综述)。犬尿氨酸途径代谢物(例如3-羟基犬尿氨酸和喹啉酸)具有神经毒性，但与互生的具有神经保护作用的代谢物犬尿烯酸或吡啶甲酸平衡。其中已证明犬尿氨酸途径代谢物与疾病相关的神经变性和精神病症包括多发性硬化症、运动神经元病症如肌萎缩性侧索硬化症、亨廷顿氏病、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、重度抑郁症、精神分裂症、厌食症(lovelace,varney等人2016)。神经学疾病的动物模型已显示出弱的ido1抑制剂(例如1-甲基色氨酸)对疾病的某些影响，这表明ido1抑制可能为预防或治疗神经学和精神病症提供临床益处。
因此，将有效平衡上述特性的ido抑制剂发现为降低非aids发病率/死亡率的发生的慢性hiv感染的疾病改良疗法；和/或预防败血症的死亡率的疾病改良疗法；和/或增强对hiv、hbv、hcv和其它慢性病毒感染、慢性细菌感染、慢性真菌感染以及对肿瘤的免疫反应的免疫疗法；和/或用于治疗抑郁症或其它神经学/神经精神性病症将是本领域的进步。
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发明概述
简而言之，一方面，本发明公开了式i的化合物
或其药学上可接受的盐，其中：或其药学上可接受的盐，其中：
每个x都是ch，或一个x是n，且另外3个x是ch；
q1是键(即，不存在)、-c(o)c-或-c(o)-；
q2是键(即，不存在)或-c(o)-；
r1是不存在、卤素、c1-3烷基oh或c(o)oc1-3烷基；
r3是c5-9芳基或5-9元杂芳基，其中芳基和杂芳基包括双环并且杂芳基含有1-3个选自o、s和n的杂原子，并且其中r3可任选被取代基取代，所述取代基选自卤素、oh、c1-3烷基、oc1-3烷基、c1-3氟烷基、cn和nh2；和
r4是h、c1-3卤代烷基、苯基或c1-6烷基。
在另一方面，本发明公开了用于治疗将从ido的抑制中受益的疾病或病况的方法。
在另一方面，本发明公开了包含式i的化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物。
在另一方面，本发明提供了用于治疗的式i的化合物或其药学上可接受的盐。
在另一方面，本发明提供了用于治疗将从ido的抑制中受益的疾病或病况的式i的化合物或其药学上可接受的盐。
在另一方面，本发明提供了式i的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗将从ido的抑制中受益的疾病或病况的药物中的用途。
在另一方面，本发明公开了一种用于治疗至少部分地由病毒的逆转录病毒家族中的病毒介导的患者中的病毒感染的方法，该方法包括向所述患者施用包含式i的化合物或其药学上可接受的盐的组合物。在一些实施方案中，病毒感染由hiv病毒介导。
在另一方面，本发明的一个具体实施方案提供了一种治疗被hiv感染的对象的方法，该方法包括向该对象施用治疗有效量的式i的化合物或其药学上可接受的盐。
在又另一方面，本发明的一个具体实施方案提供了一种在具有感染hiv风险的对象中抑制hiv感染的进展的方法，该方法包括向该对象施用治疗有效量的式i的化合物或其药学上可接受的盐。在下文中进一步描述了那些和其它实施方案。
代表性实施方案的详述
优选地，每个x都是ch。
优选地，q1是c(o)o。
优选地，q2是c(o)。
优选地，r1是br、och3或不存在。
优选地，r3是吲哚、苯并二唑、苯基、吡啶基、二唑或嘧啶，并且其中r3可任选被取代基取代，所述取代基选自卤素、oh、c1-3烷基、oc1-3烷基、c1-3氟烷基、cn和nh2。更优选地，r3是吲哚或苯并二唑，并且可任选被取代基取代，所述取代基选自卤素、oh、c1-3烷基、oc1-3烷基、c1-3氟烷基、cn和nh2。最优选地，r3是未取代的吲唑。
优选地，r4是h、c1-4烷基、cf3或苯基。更优选地，r4是c1-4烷基。
优选地，与nh-q2-r3键合的碳原子的立体化学如下所描绘的
优选的药物组合物包括单位剂型。优选的单位剂型包括片剂。
特别地，预期本发明的化合物和组合物将可用于预防和/或治疗hiv；包括预防aids和全身的免疫抑制的进展。预期在许多情况下，这种预防和/或治疗将涉及用本发明的化合物与至少一种被认为对这种预防和/或治疗有用的其它药物组合进行治疗。例如，本发明的ido抑制剂可以与其它免疫疗法例如免疫检查点(pd1、ctla4、icos等)结合使用，并且可能与生长因子或细胞因子疗法(il21、il-7等)结合使用。
在治疗hiv中的常见实践是采用超过一种的有效药剂。因此，根据本发明的另一个实施方案，提供了一种用于预防或治疗至少部分地由病毒的逆转录病毒家族中的病毒介导的哺乳动物中的病毒感染的方法，该方法包括向已经被诊断出患有所述病毒感染或处于发展所述病毒感染的危险中的哺乳动物施用如式i中所定义的化合物，其中所述病毒为hiv病毒，并且进一步包括施用治疗有效量的一种或多种对hiv病毒具有活性的药剂，其中所述对hiv病毒具有活性的药剂选自核苷酸逆转录酶抑制剂；非核苷酸逆转录酶抑制剂；蛋白酶抑制剂；进入、附着和融合抑制剂；整合酶抑制剂；成熟抑制剂；cxcr4抑制剂；和ccr5抑制剂。此类其它药物的例子是多替拉韦、bictegravir和cabotegravir。
“药学上可接受的盐”是指衍生自本领域众所周知的多种有机和无机抗衡离子的药学上可接受的盐，并且仅作为示例包括钠、钾、钙、镁、铵和四烷基铵盐，并且当分子含有碱性官能团时，包括有机或无机酸的盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、乙酸盐、马来酸盐和草酸盐。合适的盐包括p.heinrichstahl,camilleg.wermuth(编),handbookofpharmaceuticalsaltsproperties,selection,anduse；2002中所述的那些。
本发明还包括本文所述化合物的药学上可接受的盐。如本文所用，“药学上可接受的盐”是指所公开的化合物的衍生物，其中母体化合物通过将现有的酸或碱基团转化为其盐形式而被修饰。药学上可接受的盐的实例包括但不限于碱性残基如胺的无机或有机酸盐；酸性残基如羧酸的碱或有机盐；等等。本发明的药学上可接受的盐包括由例如无毒的无机或有机酸形成的母体化合物的常规无毒的盐。本发明的药学上可接受的盐可以通过常规化学方法由含有碱性或酸性基团的母体化合物合成。通常，这些盐可以通过将这些化合物的游离酸或碱形式与化学计量的合适的碱或酸在水中或在有机溶剂中或在两者的混合物中反应来制备；通常，非水介质如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或acn是优选的。
本文所用的短语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内，适用于与人类和动物的组织接触而不具有过度的毒性、刺激性、过敏反应或其它问题或并发症，与合理的获益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
在一个实施方案中，含有式i的化合物或其盐的药物制剂是适于口服或肠胃外施用的制剂。在另一个实施方案中，所述制剂是长效肠胃外制剂。在另一个实施方案中，所述制剂是纳米颗粒制剂。
本发明涉及可用作免疫抑制的新疗法的化合物、组合物和药物组合物。尽管不希望受到任何特定理论的束缚，但认为本发明的化合物能够利用分子氧或活性氧抑制催化i-trp对n-甲酰基犬尿氨酸的氧化吡咯环裂解反应的酶。
因此，在本发明的另一个实施方案中，提供了一种用于预防和/或治疗hiv的方法；包括预防aids和全身的免疫抑制的进展。
实施例
本发明的化合物可以由本领域技术人员按照以下一般合成方案制备。
下列实施例用于更充分地描述制造和使用上述发明的方式。应当理解，这些实施例决不用于限制本发明的真正范围，而是出于说明性目的而给出。在下面的实施例和合成方案中，以下缩写具有以下含义。如果未定义缩写，则其具有其被普遍接受的含义。
缩写含义
℃摄氏度
dcm二氯甲烷
dea二乙胺
diean,n-二异丙基乙胺
dmfn,n-二甲基甲酰胺
dmso二甲基亚砜
esi电喷雾电离
h或hr小时
hatu(1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1h-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓
3-氧化物六氟磷酸盐)
hplc高效液相色谱
j耦合常数，hz
lcms液相色谱-质谱
m摩尔的
mg毫克
min分钟
ml毫升
mm毫摩尔的
mmol毫摩尔
µl或ul微升
µm或um微摩尔的
ms质谱
n当量的
nbsn-溴代丁二酰亚胺
nmr核磁共振
pe石油醚
ppm百万分率
rt室温
rf保留因子
tea三乙胺
tfa三氟乙酸
thf四氢呋喃
tlc薄层色谱。
设备描述
1hnmr谱在varian400光谱仪上记录。化学位移以百万分率(ppm,δ单位)表示。耦合常数以赫兹(hz)为单位。分裂模式描述了明显多重性并被指定为s(单峰)、d(二重峰)、t(三重峰)、q(四重峰)、quint(五重峰)、m(多重峰)、br(宽峰)。
在具有sq检测器的watersacquityuplc上使用watersbehc18,2.1x50mm,1.7µm，使用梯度洗脱法记录分析型低分辨率质谱(ms)。溶剂a:0.1%甲酸(fa)/水。溶剂b:0.1%fa/乙腈；30%b持续0.5分钟，随后是30-100%b历经2.5分钟。
实施例1:(s)-6-溴-4-(1h-吲哚-7-甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯
步骤1:6-溴-4-氧代螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯的制备
在螺旋盖的压力容器中，向1-(5-溴-2-羟基苯基)乙-1-酮(2.00g,9.30mmol)在meoh(15ml)中的搅拌溶液中加入吡咯烷(0.385ml,4.65mmol)。将得到的橙黄色溶液在室温搅拌30分钟，然后用4-氧代哌啶-1-甲酸乙酯(1.59g,9.30mmol)在meoh(3ml)中的溶液处理。将反应容器密封并加热至80℃。4小时后，lcms表明反应完全。将容器冷却至室温，在此期间固体结晶。将悬浮液在冰水浴中冷却30分钟，并将固体通过真空过滤收集，用两份冰冷的meoh洗涤。真空干燥，得到为浅棕褐色固体的标题化合物(3.02g,88%)。lcms(esi)m/zc16h18brno4的计算值：367.04.实测值：368.12(m+1)+.1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ7.68-7.81(m,2h),7.07(d,j=9.0hz,1h),4.01(q,j=7.0hz,2h),3.67-3.81(m,2h),3.15(brs,2h),2.86(s,2h),1.87(m,2h),1.54-1.70(m,2h),1.15(t,j=7.0hz,3h)。
步骤2:(s)-6-溴-4-((s)-1,1-二甲基乙基亚磺酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯的制备
在氮气气氛下，在螺旋盖的玻璃压力容器中，向6-溴-4-氧代螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯(1.00g,2.72mmol)和(s)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(0.658g,5.43mmol)在无水thf(12ml)中的搅拌溶液中加入ti(oet)4(1.71ml,8.15mmol)。密封容器，并将溶液在80℃的油浴中加热。通过lcms监测原料向亚胺中间体的转化。24小时后，转化几乎完成。将该溶液冷却至室温，然后在冰水浴中冷却至0℃。用nabh4(0.514g,13.6mmol)处理溶液。在0℃下搅拌30分钟后，使混合物温热至室温。18小时后，lcms表明亚胺中间体完全转化为所需的胺产物，该胺产物为非对映异构体的92:8混合物。将浑浊的溶液冷却至0℃，并通过缓慢加入meoh淬灭直至气体逸出停止。将所得混合物用饱和盐水溶液(6ml)处理，以得到浓稠的浅黄色悬浮液。通过经由中度烧结漏斗过滤除去固体。用etoac(3x)洗涤滤饼。将滤液用饱和盐水(1x)洗涤，经na2so4干燥，并在减压下浓缩。使残余物进行快速色谱(硅胶,20-100%etoac/dcm,梯度洗脱)以得到为白色固体的标题化合物(0.732g,57%产率)。lcms(esi)m/zc20h29brn2o4s的计算值：472.10.实测值：473.19(m+1)+.1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.73(d,j=2.0hz,1h),7.23-7.31(m,1h),6.74(d,j=8.6hz,1h),4.52-4.64(m,1h),4.13(q,j=7.0hz,2h),3.93(brs,2h),3.42-3.53(m,2h),2.97-3.35(m,2h),2.03-2.09(m,1h),1.41-2.01(m,4h),1.16-1.33(m,12h)。
步骤3:(s)-4-氨基-6-溴螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯盐酸盐的制备
在0℃下，通过逐滴添加向(s)-6-溴-4-(((s)-叔丁基亚磺酰基)氨基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯(0.200g,0.422mmol)在无水meoh(5ml)中的搅拌悬浮液中加入4nhcl/二噁烷(0.106ml,0.422mmol)。然后使溶液温热至室温。3小时后，将溶液用另一份4nhcl/二噁烷(0.10ml)处理，并继续在室温搅拌。另外2小时后，lcms表明反应完全。将该溶液在减压下浓缩至干。将残余物重新溶解在meoh中，并再次浓缩至干，以得到为棕褐色固体的标题化合物，产率为定量产率。使用该物质而不经进一步纯化。1hnmr(400mhz,甲醇-d4)δ7.62(d,j=1.6hz,1h),7.43(dd,j=8.8,2.2hz,1h),6.91(d,j=9.0hz,1h),4.66(dd,j=11.5,6.8hz,1h),4.11(q,j=7.3hz,2h),3.94-4.03(m,1h),3.83-3.92(m,1h),3.29-3.49(m,1h),2.99-3.15(m,1h),2.32(dd,j=13.3,6.6hz,1h),1.73-1.96(m,4h),1.52-1.63(m,1h),1.24(t,j=7.0hz,3h)。
步骤4:(s)-6-溴-4-(1h-吲哚-7-甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯的制备
向(s)-4-氨基-6-溴螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯盐酸盐(85.0mg,0.210mmol)和1h-吲哚-7-甲酸(37.1mg,0.230mmol)在dmf(3ml)中的搅拌溶液中加入diea(0.110ml,0.629mmol)，然后加入hatu(0.119g,0.314mmol)。将得到的溶液在室温搅拌。18小时后，将溶液用2m氨/meoh(2ml)处理，搅拌另外20分钟，然后在etoac和10%柠檬酸水溶液之间分配。分离相后，将etoac相用10%柠檬酸水溶液(1x)、饱和nahco3水溶液(2x)洗涤，经na2so4干燥并在减压下浓缩至干。使残余物进行快速色谱(硅胶,20-100%etoac/己烷,梯度洗脱)以得到为白色固体的标题化合物(65mg,61%产率)。手性分析型hplc表明对映体纯度为98%[chiralpakad柱(4.6mmx250mm,5µ);流动相：1:1etoh/己烷;流速：1ml/min;进样量：8ul(1mg/mlconc.);在254nm下监测]。lcms(esi)m/zc25h26brn3o4的计算值：511.11.实测值：512.16(m+1)+.1hnmr(400mhz,cdcl3)δ10.30(brs,1h),7.85(d,j=7.8hz,1h),7.44(d,j=1.6hz,1h),7.34-7.39(m,2h),7.31(dd,j=8.8,2.2hz,1h),7.13(t,j=7.6hz,1h),6.79(d,j=8.6hz,1h),6.61(t,j=2.7hz,1h),6.47(d,j=8.6hz,1h),5.51-5.62(m,1h),4.14(q,j=7.0hz,2h),3.96(brs,2h),3.30-3.42(m,1h),3.06-3.19(m,1h),2.30(dd,j=13.5,6.4hz,1h),1.55-1.99(m,5h),1.58-1.26(t,j=7.2hz,3h)。
实施例2:(s)-6-溴-4-(1h-吲唑-7-甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯
根据本文对(s)-6-溴-4-(1h-吲哚-7-甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯的合成所描述的方法，由(s)-4-氨基-6-溴螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯盐酸盐和1h-吲唑-7-甲酸制备标题化合物，产率为58%。手性分析型hplc表明对映体纯度为99%[regis(s,s)whelk-o1柱(4.6mmx250mm,5µ);流动相：1:1etoh/己烷;流速：1ml/min;进样量：5ul(1mg/mlconc.);在254nm下监测]。lcms(esi)m/zc24h25brn4o4的计算值：512.11.实测值：513.19(m+1)+.1hnmr(400mhz,cdcl3)δ11.75(brs,1h),8.15(s,1h),7.98(d,j=7.8hz,1h),7.59(d,j=7.4hz,1h),7.43(d,j=1.6hz,1h),7.17-7.36(m,2h),6.80(d,j=8.6hz,1h),6.57(brs,1h),5.52-5.70(m,1h),3.75-4.20(m,4h),3.28-3.44(m,1h),3.02-3.20(m,1h),2.34(dd,j=13.5,6.4hz,1h),1.47-2.01(m,5h),1.19-1.31(m,3h)。
实施例3:(r)-6-溴-4-(1h-吲唑-7-甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯
根据本文对(s)-6-溴-4-(1h-吲唑-7-甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯的合成所描述的顺序，由6-溴-4-氧代螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯和(r)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺开始，以3个步骤制备标题化合物。手性分析型hplc表明对映体纯度为99%[regis(s,s)whelk-o1柱(4.6mmx250mm,5µ);流动相：1:1etoh/己烷;流速：1ml/min;进样量：5ul(1mg/mlconc.);在254nm下监测]。lcms(esi)m/zc24h25brn4o4的计算值：512.11.实测值：513.24(m+1)+.1hnmr(400mhz,cdcl3)δ11.75(brs,1h),8.15(s,1h),7.98(d,j=7.8hz,1h),7.59(d,j=7.4hz,1h),7.43(d,j=1.6hz,1h),7.17-7.36(m,2h),6.80(d,j=8.6hz,1h),6.57(brs,1h),5.52-5.70(m,1h),3.75-4.20(m,4h),3.28-3.44(m,1h),3.02-3.20(m,1h),2.34(dd,j=13.5,6.4hz,1h),1.47-2.01(m,5h),1.19-1.31(m,3h)。
实施例4:(s)-6-溴-4-(1h-吲哚-7-甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸甲酯
根据本文对(s)-6-溴-4-(1h-吲哚-7-甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯的合成所描述的顺序，由1-(5-溴-2-羟基苯基)乙酮和4-氧代哌啶-1-甲酸甲酯开始，以4个步骤制备标题化合物。lcms(esi)m/zc24h24brn3o4的计算值：497.10.实测值：498.20(m+1)+.1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ11.23(brs,1h),8.91(d,j=8.2hz,1h),7.74(d,j=7.8hz,1h),7.69(d,j=7.4hz,1h),7.26-7.37(m,3h),7.05(t,j=7.6hz,1h),6.83(d,j=8.6hz,1h),6.49(dd,j=2.9,2.2hz,1h),5.36-5.47(m,1h),3.68-3.86(m,2h),3.58(s,3h),3.24-3.37(m,1h),3.06(brs,1h),2.16(dd,j=13.3,6.6hz,1h),1.95-2.05(m,1h)1.50-1.87(m,4h)。
实施例5:(s)-6-溴-4-(1h-吲唑-7-甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸甲酯
根据本文对(s)-6-溴-4-(1h-吲唑-7-甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯的合成所描述的顺序，由1-(5-溴-2-羟基苯基)乙酮和4-氧代哌啶-1-甲酸甲酯开始，以4个步骤制备标题化合物。lcms(esi)m/zc23h23brn4o4的计算值：498.09.实测值：499.24(m+1)+.1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ13.18(brs,1h),9.06(d,j=7.0hz,1h),8.16(s,1h),7.96(dd,j=13.5,7.6hz,2h),7.27-7.39(m,2h),7.19(t,j=7.6hz,1h),6.84(d,j=8.6hz,1h),5.36-5.49(m,1h),3.66-3.87(m,2h),3.58(s,3h),3.21-3.38(m,1h),2.97-3.16(m,1h),2.19(dd,j=13.3,6.3hz,1h),1.98(t,j=12.5hz,1h),1.52-1.89(m,4h)。
实施例6:(s)-6-溴-4-(1h-吲唑-7-甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸异丙酯
步骤1:6-溴-4-氧代螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸叔丁酯的制备
在螺旋盖的压力容器中，向1-(5-溴-2-羟基苯基)乙-1-酮(10.0g,46.5mmol)在meoh(80ml)中的搅拌溶液中加入吡咯烷(1.92ml,23.3mmol)。将得到的橙黄色溶液在室温搅拌30分钟，然后用4-氧代哌啶-1-甲酸叔丁酯(9.27g,46.5mmol)处理。将反应容器密封并加热至80℃。18小时后，lcms表明反应完全。将溶液冷却至室温，并在减压下浓缩至浆状物。将残余物在etoac和10%柠檬酸水溶液之间分配，并分离相。用etoac(1x)萃取水相。将合并的etoac溶液用10%柠檬酸水溶液(1x)、饱和nahco3水溶液(2x)洗涤，经na2so4干燥，并在减压下浓缩。使残余物进行快速色谱(硅胶,0-60%etoac/己烷,梯度洗脱)，然后从己烷结晶以得到为白色固体的标题化合物(16.1g,88%产率)。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.96(d,j=2.3hz,1h),7.56(dd,j=9.0,2.3hz,1h),6.88(d,j=9.0hz,1h),3.86(brs,2h),3.11-3.23(m,2h),2.70(s,2h),1.94-2.04(m,2h),1.54-1.67(m,2h),1.44(s,9h)。
步骤2:(s)-6-溴-4-((s)-1,1-二甲基乙基亚磺酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸叔丁酯的制备
根据本文对(s)-6-溴-4-((s)-1,1-二甲基乙基亚磺酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯的合成所描述的程序，由6-溴-4-氧代螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸叔丁酯和(s)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺制备标题化合物，产率为90%。lcms(esi)m/zc22h33brn2o4s的计算值：500.13.实测值：501.23(m+1)+.1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.74(s,1h),7.24-7.33(m,1h),6.75(d,j=8.6hz,1h),4.52-4.65(m,1h),3.87(brs,2h),3.48(d,j=6.3hz,1h),2.96-3.34(m,2h),2.03-2.13(m,1h),1.07-2.01(m,23h)。
步骤3:(s)-4-氨基-6-溴螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸叔丁酯的制备
在0℃下，通过逐滴添加向(s)-6-溴-4-(((s)-叔丁基亚磺酰基)氨基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸叔丁酯(3.00g,5.98mmol)在meoh(30ml)中的搅拌溶液中加入4nhcl/二噁烷(1.50ml,5.98mmol)。将该溶液在0℃下搅拌30分钟，然后使其温热至室温。3小时后，lcms表明反应完全。将溶液用2m氨/meoh(8.97ml,18.0mmol)处理，并在减压下浓缩。将残余物在dcm和10%na2co3水溶液之间分配，并分离相。用dcm(2x)萃取水相。将合并的dcm溶液经na2so4干燥并在减压下浓缩至干。将残余物从己烷结晶以得到为白色固体的标题化合物(1.87g,79%产率)。lcms(esi)m/zc18h25brn2o3的计算值：396.11.实测值：397.26(m+1)+.1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.57(d,j=2.0hz,1h),7.22(dd,j=8.6,2.3hz,1h),6.70(d,j=8.6hz,1h),3.67-4.06(m,3h),3.23-3.38(m,1h),2.98-3.12(m,1h),2.05(dd,j=13.3,6.3hz,1h),1.34-1.86(m,16h)。
步骤4:(s)-6-溴-4-(1h-吲唑-7-甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸叔丁酯的制备
向(s)-4-氨基-6-溴螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸叔丁酯(1.51g,3.80mmol)和1h-吲唑-7-甲酸(0.678g,4.18mmol)在dmf(15ml)中的搅拌溶液中加入diea(2.00ml,11.4mmol)，然后加入hatu(1.88g,4.94mmol)。将得到的溶液在室温搅拌。2小时后，lcms表明反应完全。将该溶液在etoac和10%柠檬酸水溶液之间分配，并分离相。将水相用etoac萃取一次。合并的etoac溶液用10%柠檬酸水溶液(2x)、饱和nahco3水溶液(2x)洗涤，经na2so4干燥，并在减压下浓缩。将粗产物通过快速色谱(硅胶,0-100%etoac/己烷,梯度洗脱)纯化以得到为白色固体的标题化合物(1.87g,91%产率)。lcms(esi)m/zc26h29brn4o4的计算值：540.14.实测值：541.33(m+1)+.1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.13(s,1h),7.96(d,j=8.2hz,1h),7.60(d,j=7.4hz,1h),7.42(d,j=2.0hz,1h),7.28(dd,j=8.8,2.2hz,1h),7.19(t,j=7.6hz,1h),6.77(d,j=8.6hz,1h),6.67(brs,1h),5.53-5.67(m,1h),3.75-3.99(m,2h),2.96-3.38(m,2h),2.34(dd,j=13.5,6.4hz,1h),1.76-1.96(m,3h),1.54-1.74(m,2h),1.45(s,9h)。
步骤5:(s)-n-(6-溴螺[色满-2,4'-哌啶]-4-基)-1h-吲唑-7-甲酰胺二盐酸盐的制备
向(s)-6-溴-4-(1h-吲唑-7-甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸叔丁酯(1.80g,3.32mmol)在dcm(35ml)中的搅拌溶液中加入4nhcl/二噁烷(12.5ml,49.9mmol)。将所得溶液在室温搅拌。18小时后，lcms表明反应完全。将悬浮液在减压下浓缩至干。将残余物悬浮在dcm中，并再次蒸发，以得到为白色固体的标题化合物，产率为定量产率。lcms(esi)m/zc21h21brn4o2的计算值：440.09.实测值：441.21(m+1)+.1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ9.00-9.31(m,3h),8.17(s,1h),7.97(dd,j=7.4,4.7hz,2h),7.31-7.39(m,2h),7.19(t,j=7.6hz,1h),6.89(d,j=9.4hz,1h),5.39-5.51(m,1h),3.08-3.28(m,2h),2.91-3.05(m,1h),2.23(dd,j=13.7,6.3hz,1h),1.80-2.12(m,5h)。
步骤6:(s)-6-溴-4-(1h-吲唑-7-甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸异丙酯的制备
在0℃下，向(s)-n-(6-溴螺[色满-2,4'-哌啶]-4-基)-1h-吲唑-7-甲酰胺二盐酸盐(50mg,0.097mmol)在dcm(4ml)中的搅拌悬浮液中加入tea(68ul,0.49mmol)。通过逐滴添加用1.0m氯甲酸异丙酯/phme(97ul,0.097mmol)处理所得溶液。30分钟后，tlc和lcms表明反应完全。将该溶液用2m氨/meoh(3ml)处理，搅拌另外10分钟，然后在减压下浓缩至干。将残余物进行rp-hplc(c18,10-100%mecn/水(含0.1%fa))纯化以得到为白色固体的标题化合物(35mg,68%产率)。lcms(esi)m/zc25h27brn4o4的计算值：526.12.实测值：527.29(m+1)+.1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.14(s,1h),7.98(d,j=7.8hz,1h),7.58(d,j=7.4hz,1h),7.43(d,j=2.0hz,1h),7.31(dd,j=8.6,2.3hz,1h),7.21(t,j=7.6hz,1h),6.80(d,j=8.6hz,1h),6.54(d,j=8.2hz,1h),5.52-5.65(m,1h),4.85-4.98(m,1h),3.96(brs,2h),3.28-3.41(m,1h),3.04-3.18(m,1h),2.34(dd,j=13.5,6.4hz,1h),1.79-1.98(m,3h),1.48-1.77(m,2h),1.24(d,j=5.9hz,6h)。
实施例7:(s)-4-(1h-吲唑-7-甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯
使(s)-6-溴-4-(1h-吲唑-7-甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯(0.400g,0.779mmol)在meoh(30ml)中的溶液在60psi下在10%pd(c)(0.250g,0.235mmol)的存在下进行氢化。3小时后，lcms表明反应完全。将容器用氮气吹扫，通过过滤除去催化剂，并将滤液在减压下浓缩至干。将残余物溶于dcm。将溶液用饱和nahco3水溶液(2x)洗涤，经na2so4干燥并在减压下浓缩至干。使残余物进行快速色谱(硅胶,0-100%etoac/dcm,梯度洗脱)以得到为白色固体的标题化合物(0.224g,66%产率)。lcms(esi)m/zc24h26n4o4的计算值：434.20.实测值：435.31(m+1)+.1hnmr(400mhz,cdcl3)δ11.8(brs,1h),8.13(s,1h),7.96(d,j=7.8hz,1h),7.55(d,j=7.4hz,1h),7.33(d,j=7.4hz,1h),7.14-7.27(m,2h),6.87-6.97(m,2h),6.58(brs,1h),5.54-5.67(m,1h),4.13(q,j=7.0hz,2h),3.97(brs,2h),3.29-3.43(m,1h),3.06-3.23(m,1h),2.37(dd,j=13.3,6.6hz,1h),1.80-2.02(m,3h),1.55-1.77(m,2h),1.26(t,j=7.03hz,3h)。
实施例8:(s)-6-溴-4-(1h-吲哚-4-甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯
根据本文对(s)-6-溴-4-(1h-吲哚-7-甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯的合成所描述的程序，由(s)-4-氨基-6-溴螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯盐酸盐和1h-吲哚-4-甲酸制备标题化合物，产率为90%。lcms(esi)m/zc25h26brn3o4的计算值：511.11.实测值：512.28(m+1)+.1hnmr(400mhz,甲醇-d4)δ7.57(d,j=8.2hz,1h),7.49-7.40(m,2h),7.37(d,j=2.7hz,1h),7.28(d,j=8.2hz,1h),7.17(t,j=7.6hz,1h),6.87(d,j=2.3hz,1h),6.81(d,j=9.0hz,1h),5.60-5.50(m,1h),4.12(q,j=7.0hz,2h),4.02-3.86(m,2h),3.52-3.34(m,1h),3.24-3.07(m,1h),2.28-2.16(m,1h),2.07-1.91(m,2h),1.90-1.61(m,3h),1.26(t,j=7.0hz,3h)。
实施例9:4'-(1h-吲唑-7-甲酰胺基)-6'-甲氧基-3',4'-二氢螺[哌啶-4,2'-吡喃并[3,2-b]吡啶]-1-甲酸乙酯
步骤1:2-溴-6-甲氧基吡啶-3-醇的制备
在0℃下向6-甲氧基吡啶-3-醇(6.00g,48.0mmol)在mecn(130ml)和水(25ml)的搅拌溶液中加入nbs(9.39g,52.7mmol)。使反应混合物温热至室温，并通过lcms监测反应进程。一旦反应完成，就将混合物与冰水(120ml)混合，并用etoac(2x)萃取。合并的etoac溶液用盐水洗涤，经na2so4干燥，并在减压下浓缩。将粗物质通过快速色谱(硅胶,30%etoac/pe)纯化以得到为淡黄色固体的标题化合物(6.0g,61%产率)。lcms(esi)m/zc6h6brno2的计算值：202.96.实测值：204.00(m+1)+。
步骤2:3-(苄基氧基)-2-溴-6-甲氧基吡啶的制备
向2-溴-6-甲氧基吡啶-3-醇(6.00g,29.4mmol)在丙酮(120ml)中的搅拌溶液中加入苄基溴(3.85ml,32.3mmol)，然后加入k2co3(8.14g,58.8mmol)，并将所得混合物在65℃下搅拌。16小时后，将混合物冷却至室温，过滤以除去固体，滤饼用丙酮洗涤，并将滤液在减压下浓缩。使残余物进行快速色谱(硅胶,30%etoac/pe)以得到为淡黄色液体的标题化合物(6.00g,69%产率)。lcms(esi)m/zc13h12brno2的计算值：293.01.实测值：294.08(m+1)+。
步骤3:3-(苄基氧基)-6-甲氧基吡啶甲腈的制备
向3-(苄基氧基)-2-溴-6-甲氧基吡啶(6.00g,18.4mmol)在dmf(100ml)中的搅拌溶液中加入cucn(6.58g,73.4mmol)。将所得混合物加热至150℃。16小时后，将混合物冷却至室温，并用etoac(300ml)稀释。过滤混合物以除去固体，并在减压下浓缩滤液。使粗残余物进行快速色谱(硅胶,20%etoac/pe)以得到为淡黄色液体的标题化合物(3.50g,75%)。lcms(esi)m/zc14h12n2o2的计算值：240.09.实测值：241.08(m+1)+。
步骤4:1-(3-(苄基氧基)-6-甲氧基吡啶-2-基)乙酮的制备
在室温下，向3-(苄基氧基)-6-甲氧基吡啶甲腈(3.00g,11.7mmol)在thf(30ml)中的搅拌溶液中缓慢加入3mmemgbr/thf(39.1ml,117mmol)。16小时后，将溶液通过加入1nhcl水溶液淬灭，搅拌1小时，然后通过加入2mnaoh水溶液碱化。所得混合物用etoac(2x)萃取。合并的萃取物经na2so4干燥并在减压下浓缩。粗物质通过快速色谱(硅胶,20%etoac/己烷)纯化以得到标题化合物，产率为29%。lcms(esi)m/zc15h15no3的计算值：257.11.实测值：258.07(m+1)+。
步骤5:1-(3-羟基-6-甲氧基吡啶-2-基)乙酮的制备
使1-(3-(苄基氧基)-6-甲氧基吡啶-2-基)乙酮(1.10g,3.12mmol)在meoh(10ml)中的溶液在10%pd/c(0.531g)的存在下进行氢化。16小时后，将容器用氮气吹扫，通过过滤除去催化剂，并将滤液在减压下浓缩至干。使残余物进行快速色谱(硅胶,10%etoac/pe)以得到标题化合物(0.50g,90%产率)。lcms(esi)m/zc8h9no3的计算值：167.06.实测值：168.06(m+1)+。
步骤6:6'-甲氧基-4'-氧代-3',4'-二氢螺[哌啶-4,2'-吡喃并[3,2-b]吡啶]-1-甲酸乙酯的制备
在螺旋盖的压力容器中，向1-(3-羟基-6-甲氧基吡啶-2-基)乙酮(0.480g,2.70mmol)在meoh(3ml)中的搅拌溶液中加入吡咯烷(0.379ml,4.59mmol)，然后加入4-氧代哌啶-1-甲酸乙酯(0.601g,3.51mmol)。密封容器，并将溶液加热至80℃。4小时后，将溶液冷却至室温，并在减压下浓缩。将残余物溶于etoac。将溶液用盐水洗涤，经na2so4干燥，并浓缩至干。将粗产物通过快速色谱(硅胶,10%etoac/pe)纯化以得到标题化合物，产率为54%。lcms(esi)m/zc16h20n2o5的计算值：320.14.实测值：321.37(m+1)+。
步骤7:4'-(羟基亚胺基)-6'-甲氧基-3',4'-二氢螺[哌啶-4,2'-吡喃并[3,2-b]吡啶]-1-甲酸乙酯的制备
向6'-甲氧基-4'-氧代-3',4'-二氢螺[哌啶-4,2'-吡喃并[3,2-b]吡啶]-1-甲酸乙酯(0.450g,1.31mmol)在meoh(3ml)中的搅拌溶液中加入羟胺盐酸盐(0.363g,5.23mmol)、乙酸钾(0.513g,5.23mmol)和tea(0.728ml,5.23mmol)。将所得混合物在70℃加热20小时，然后冷却至室温。过滤混合物以除去固体，并将滤液在减压下浓缩至干。使粗残余物进行快速色谱(硅胶,10%etoac/pe)以得到为白色固体的标题化合物(0.420g,94%产率)。lcms(esi)m/zc16h21n3o5的计算值：335.15.实测值：336.42(m+1)+。
步骤8:4'-氨基-6'-甲氧基-3',4'-二氢螺[哌啶-4,2'-吡喃并[3,2-b]吡啶]-1-甲酸乙酯的制备
向4'-(羟基亚胺基)-6'-甲氧基-3',4'-二氢螺[哌啶-4,2'-吡喃并[3,2-b]吡啶]-1-甲酸酯(0.420g,1.25mmol)在1:1meoh/水(8ml)中的搅拌溶液中加入锌粉(0.819g,12.5mmol)，然后加入甲酸(0.721ml,18.8mmol)。在室温搅拌16小时后，将固体通过过滤除去，并将滤液在减压下浓缩以得到为褐色固体的标题化合物(0.370g,89%产率)，将其用于下一步骤而不经进一步纯化。lcms(esi)m/zc16h23n3o4的计算值：321.17.实测值：322.12(m+1)+。
步骤9:4'-(1h-吲唑-7-甲酰胺基)-6'-甲氧基-3',4'-二氢螺[哌啶-4,2'-吡喃并[3,2-b]吡啶]-1-甲酸乙酯的制备
向1h-吲唑-7-甲酸(0.106g,0.652mmol)在dcm(5ml)中的搅拌溶液中加入hatu(0.310g,0.815mmol)，然后加入diea(0.474ml,2.72mmol)。在室温下搅拌10分钟后，用4'-氨基-6'-甲氧基-3',4'-二氢螺[哌啶-4,2'-吡喃并[3,2-b]吡啶]-1-甲酸乙酯(0.180g,0.560mmol)处理溶液。16小时后，将溶液在减压下浓缩至干，并将残余物悬浮在水(5ml)中。将混合物搅拌10分钟，并将水溶液轻轻倒出从而离开固体，然后将固体溶于dcm中。dcm溶液经na2so4干燥并在减压下浓缩至干。粗产物通过反相hplc(c18,10-100%mecn/水(含10mmnh4hco3/水))纯化以得到为灰白色固体的标题化合物(33mg,13%产率)。lcms(esi)m/zc24h27n5o5的计算值：465.20.实测值：466.16(m+1)+.1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ13.06(brs,1h),8.83(d,j=7.7hz,1h),8.14(s,1h),7.94(t,j=8.4hz,2h),7.28(d,j=8.8hz,1h),7.19(t,j=7.6hz,1h),6.68(d,j=8.8hz,1h),5.23-5.40(m,1h),4.05(q,j=7.0hz,2h),3.73-3.87(m,2h),3.63(s,3h),3.05-3.42(m,2h),2.30(dd,j=13.6,6.6hz,1h),2.03-2.16(m,1h),1.57-1.95(m,4h),1.19(t,j=7.0hz,3h)。
实施例10-49是使用类似于本文对实施例1-9所描述的那些的方法制备的。
实施例10:(s)-4-(2-氨基苯甲酰胺基)-6-溴螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯
实施例11:(s)-6-溴-4-(1h-吲唑-7-甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸丙酯
实施例12:(s)-6-溴-4-(1h-吲唑-4-甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯
实施例13:4-(1h-吲唑-7-甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯
实施例14:(s)-6-溴-4-(2-羟基苯甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯
实施例15:4-(1h-吲哚-7-甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯
实施例16:6'-溴-4'-(1h-吲唑-7-甲酰胺基)-3',4'-二氢螺[哌啶-4,2'-吡喃并[2,3-c]吡啶]-1-甲酸乙酯
实施例17:5-溴-4-(1h-吲哚-7-甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯
实施例18:6-(羟基甲基)-4-(1h-吲唑-7-甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯
实施例19:4-(1h-吲唑-7-甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1',6-二甲酸1'-乙酯6-甲酯
实施例20:(s)-6-溴-4-(2-甲氧基苯甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯
实施例21:6-溴-4-(烟酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯
实施例22:(s)-n-(6-溴-1'-丁酰基螺[色满-2,4'-哌啶]-4-基)-1h-吲唑-7-甲酰胺
实施例23:6'-溴-4'-(1h-吲唑-7-甲酰胺基)-3',4'-二氢螺[哌啶-4,2'-吡喃并[2,3-b]吡啶]-1-甲酸乙酯
实施例24:7-溴-4-(1h-吲哚-7-甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯
实施例25:(s)-6-溴-4-(6-羟基吡啶甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯
实施例26:4-(1h-吡唑并[4,3-c]吡啶-7-甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯
实施例27:4-(1h-吲哚-7-甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸叔丁酯
实施例28:(s)-6-溴-4-(1h-吲唑-7-甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸叔丁酯
实施例29:4'-(1h-吲唑-7-甲酰胺基)-3',4'-二氢螺[哌啶-4,2'-吡喃并[3,2-b]吡啶]-1-甲酸乙酯
实施例30:4-(5-氟烟酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯
实施例31:(s)-6-溴-4-(1h-吲唑-7-甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸苯酯
实施例32:(s)-6-溴-4-(1h-咪唑-2-甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯
实施例33:4'-(1h-吲唑-7-甲酰胺基)-3',4'-二氢螺[哌啶-4,2'-吡喃并[2,3-c]吡啶]-1-甲酸乙酯
实施例34:4-(吡啶甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯
实施例35:6'-甲氧基-4'-(烟酰胺基)-3',4'-二氢螺[哌啶-4,2'-吡喃并[3,2-b]吡啶]-1-甲酸乙酯
实施例36:(r)-6-溴-4-(1h-吲哚-7-甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯
实施例37:(r)-6-溴-4-(1h-吲唑-7-甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯
实施例38:4-(1-甲基-1h-吲哚-7-甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯
实施例39:4-(1h-苯并[d]咪唑-7-甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯
实施例40:4-((5-(三氟甲基)-1,3,4-噻二唑-2-基)氨基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯
实施例41:4-(烟酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯
实施例42:4'-(1h-吲唑-7-甲酰胺基)-3',4'-二氢螺[哌啶-4,2'-吡喃并[2,3-b]吡啶]-1-甲酸乙酯
实施例43:4-(1-甲基-1h-吡唑-5-甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯
实施例44:(s)-6-溴-4-(1h-吡唑-5-甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯
实施例45:4-(嘧啶-2-甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯
实施例46:4-(3-甲氧基吡啶甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯
实施例47:4-(1-甲基-1h-咪唑-2-甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯
实施例48:4-(5-氰基烟酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯
实施例49:4'-(1h-吲唑-7-甲酰胺基)-3',4'-二氢螺[哌啶-4,2'-吡喃并[3,2-c]吡啶]-1-甲酸乙酯
实施例50:半((s)-(7-((6-溴-1'-(乙氧基羰基)螺[色满-2,4'-哌啶]-4-基)氨基甲酰基)-2h-吲唑-2-基)甲基磷酸酯)2-氨基-2-(羟基甲基)丙烷-1,3-二醇盐
6-溴-4-氧代螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯的制备
向1-(5-溴-2-羟基苯基)乙-1-酮(40.00g,186.0mmol)在meoh(300ml)中的搅拌溶液中加入吡咯烷(6.6g,93.0mmol)。将所得橙黄色溶液在室温搅拌30分钟，然后用4-氧代哌啶-1-甲酸乙酯(31.8g,186.0mmol)溶液处理。在80℃下搅拌14小时后，将反应混合物冷却至室温，在此期间固体结晶。将混合物在冰水浴中冷却30分钟，并且固体通过真空过滤收集，用两份冰冷的meoh洗涤。真空干燥，得到为浅黄色固体的标题化合物(63.5g,92.8%)。lcms(esi)m/zc16h18brno4的计算值：367.04.实测值：368.14/370.13(m/m+2)+。
(s)-6-溴-4-((s)-1,1-二甲基乙基亚磺酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯的制备
向6-溴-4-氧代螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯(50.00g,136.3mmol)和(s)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(33.0g,272.6mmol)在无水thf(250ml)中的搅拌溶液中加入ti(oet)4(86ml,408.9mmol)。使所得混合物在80℃在氮气气氛下加热。20小时后，将溶液冷却至-35℃，并用nabh4(25.8g,681.0mmol)处理。在-35℃下搅拌30分钟后，使混合物温热至-20℃并搅拌过夜。lcms表明亚胺中间体完全转化为所需的胺产物，该胺产物为非对映异构体的92:8混合物。将浑浊的溶液冷却至0℃，并通过缓慢加入meoh淬灭直至气体逸出停止。所得混合物用饱和盐水溶液处理，以得到浓稠的浅黄色悬浮液。过滤除去固体。用etoac(3x)洗涤滤饼。将滤液用饱和盐水(1x)洗涤，经na2so4干燥，并在减压下浓缩。使残余物进行快速色谱(硅胶,20-100%etoac/dcm,梯度洗脱)以得到为白色固体的标题化合物(37.9g,59%产率)。lcms(esi)m/zc20h29brn2o4s的计算值：472.10.实测值：473.41/475.52(m/m+2)+。
(s)-4-氨基-6-溴螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯盐酸盐的制备
在0℃下，向(s)-6-溴-4-(((s)-叔丁基亚磺酰基)氨基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯(30.1g,63.6mmol)在无水meoh(200ml)中的搅拌悬浮液中逐滴加入4nhcl/二噁烷(25.0ml,95.4mmol)，然后将混合物在室温搅拌3小时。将该溶液在减压下浓缩至干。将残余物重新溶解在meoh中，并再次浓缩至干以得到为棕褐色固体的标题化合物，产率为定量产率，将其用于下一步骤而不经进一步纯化。lcms(esi)m/zc16h21brn2o3的计算值：368.07.实测值：369.16/371.22(m/m+2)+。
(s)-6-溴-4-(1h-吲唑-7-甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯的制备
向(s)-4-氨基-6-溴螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯盐酸盐(27.6g,68.0mmol)和1h-吲哚-7-甲酸(9.9g,61.8mmol)在dmf(300ml)中的搅拌溶液中加入diea(32.6ml,185.4mmol)，然后加入hatu(23.8g,68.0mmol)。在室温下搅拌15小时后，将所得溶液在etoac和10%柠檬酸水溶液之间分配。分离相后，将etoac相用10%柠檬酸水溶液(1x)、饱和nahco3水溶液(2x)洗涤，经na2so4干燥并在减压下浓缩至干。使残余物进行快速色谱(硅胶,20-100%etoac/己烷)以得到为白色固体的标题化合物(22.3g,71.2%产率)。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ11.78(s,1h),8.15(s,1h),7.98(d,j=8.0hz,1h),7.60(d,j=7.2hz,1h),7.44(d,j=1.9hz,1h),7.31(dd,j=8.7,2.3hz,1h),7.24-7.18(m,1h),6.80(d,j=8.7hz,1h),6.61(s,1h),5.65-5.57(m,1h),4.14(q,j=7.1hz,2h),4.05-3.85(m,2h),3.43-3.31(m,1h),3.20-3.05(m,1h),2.39-2.31(m,1h),1.97-1.82(m,3h),1.76-1.65(m,2h),1.27(t,j=7.1hz,3h).lcms(esi)m/zc24h25brn4o4的计算值：512.11.实测值：513.15/515.14(m/m+2)+。
(s)-6-溴-4-(2-(((二叔丁氧基磷酰基)氧基)甲基)-2h-吲唑-7-甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯的制备
向(s)-6-溴-4-(1h-吲唑-7-甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯(10.8g,21.1mmol)和cs2co3(20.6g,63.2mmol)在dmf(100ml)中的搅拌悬浮液中加入二-叔丁基(氯甲基)磷酸酯(8.2g,31.6mmol)、nai(3.5g,23.2mmol)。在55℃下搅拌5小时后，将所得混合物在etoac和水之间分配。将有机层分离并用饱和nacl水溶液(2x)洗涤，经na2so4干燥并在减压下浓缩至干以得到为黄色胶状物的标题化合物(10.3g,66.5%产率)，将其用于下一步骤而不进行纯化。lcms(esi)m/zc33h44brn4o8p的计算值：734.21.实测值：735.50/737.63(m/m+2)+。
(s)-6-溴-4-(2-((膦酸氧基)甲基)-2h-吲唑-7-甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯的制备
向(s)-6-溴-4-(2-(((二叔丁氧基磷酰基)氧基)甲基)-2h-吲唑-7-甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯(405mg,0.55mmol)在dcm(4ml)中的搅拌溶液中加入4mhcl/二噁烷(4.1ml,16.5mmol)。在25℃下搅拌3小时后，将所得混合物在减压下浓缩以得到残余物，将其在高真空下干燥。通过在mcn/水(9:1)中重结晶纯化所得残余物以得到为白色固体的标题化合物(233mg,68%产率)。1hnmr(400mhz,dmso)δ9.40(d,j=8.3hz,1h),8.76(s,1h),8.13(dd,j=7.0,0.9hz,1h),8.08-8.02(m,1h),7.42(d,j=2.0hz,1h),7.37-7.25(m,2h),6.87(d,j=8.7hz,1h),6.18-6.05(m,2h),5.51-5.41(m,1h),4.05(q,j=7.1hz,2h),3.88-3.73(m,2h),3.38-3.24(m,1h),3.17-3.04(m,1h),2.37-2.27(m,1h),2.06-1.98(m,1h),1.89-1.73(m,3h),1.70-1.61(m,1h),1.19(t,j=7.1hz,3h).lcms(esi)m/zc25h28brn4o8p的计算值：622.08.实测值：623.17/625.11(m/m+2)+。
(s)-6-溴-4-(2-((膦酸氧基)甲基)-2h-吲唑-7-甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯,双2-氨基-2-(羟基甲基)-1,3-丙烷二醇盐的制备
向(s)-6-溴-4-(2-((膦酸氧基)甲基)-2h-吲唑-7-甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯(250mg,0.40mmol)在水(2.0ml)中的悬浮液中加入三(羟基甲基)氨基甲烷(97mg,0.80mmol)的水(2.0ml)溶液以提供澄清溶液。30分钟后，将混合物用乙腈(8ml)稀释直至浑浊，并接种一些晶体。在环境温度下继续搅拌4小时。将固体过滤，用mecn/水(9:1)洗涤，并真空干燥以提供为白色固体的标题化合物(300mg,86%产率)。1hnmr(400mhz,dmso)δ9.44(d,j=7.8hz,1h),8.82(s,1h),8.08(d,j=6.8hz,1h),7.99(d,j=8.2hz,1h),7.42(s,1h),7.33(d,j=8.6hz,1h),7.23(t,j=7.6hz,1h),6.85(d,j=8.7hz,1h),6.00-5.87(m,2h),5.48-5.39(m,1h),4.81(br,16h),3.37(s,12h),3.30-3.23(m,1h),3.15-3.05(m,1h),2.38-2.28(m,1h),2.04-1.97(m,1h),1.87-1.71(m,3h),1.68-1.59(m,1h),1.19(t,j=6.9hz,3h)。
实施例51
(s)-6-溴-4-(1-(乙氧基羰基)-1h-吲唑-7-甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯的制备
在0℃下，向(s)-6-溴-4-(1h-吲唑-7-甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯(150mg,0.30mmol)和dipea(0.16ml,0.90mmol)在dcm(2ml)中的搅拌悬浮液中逐滴加入氯甲酸乙酯(0.045ml,0.45mmol)。20分钟后，将反应混合物在dcm和nahco3水溶液之间分配。分离层，并且有机层用盐水洗涤，经na2so4干燥并浓缩，以得到粗产物，其通过制备型hplc(c18,10-100%mecn/h2o(含0.5%甲酸))纯化以得到为白色固体的标题化合物(47mg,27%产率)。1hnmr(400mhz,dmso)δ9.41(d,j=8.3hz,1h),9.20(s,1h),8.19(dd,j=6.9,1.0hz,1h),8.03(dd,j=8.6,0.9hz,1h),7.44(d,j=2.0hz,1h),7.40-7.32(m,2h),6.89(d,j=8.7hz,1h),5.48-5.41(m,1h),4.52(q,j=7.1hz,2h),4.04(q,j=7.1hz,2h),3.86-3.74(m,2h),3.27-3.09(m,2h),2.41-2.35(m,1h),2.02-1.75(m,4h),1.70-1.62(m,1h),1.35(t,j=7.1hz,3h),1.18(t,j=7.1hz,3h).lcms(esi)m/zc27h29brn4o6的计算值：584.13.实测值：585.611/587.61(m/m+2)+。
实施例52
(s)-4-(1-乙酰基-1h-吲唑-7-甲酰胺基)-6-溴螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯的制备
在0℃下，向(s)-6-溴-4-(1h-吲唑-7-甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯(150mg,0.3mmol)和dipea(0.16ml,0.9mmol)在dcm(2ml)中的搅拌悬浮液中逐滴加入乙酰氯(0.03ml,0.45mmol)。2小时后，将反应混合物在dcm和nahco3水溶液之间分配。分离层，并且有机层用盐水洗涤，经na2so4干燥并浓缩，以得到粗产物，将其通过制备型hplc(c18,10-100%mecn/h2o(含0.5%甲酸))纯化以得到为白色固体的标题化合物(56mg,34%产率)。1hnmr(400mhz,dmso)δ9.21(s,1h),9.18(d,j=7.9hz,1h),8.16(dd,j=6.9,0.8hz,1h),8.06-8.01(m,1h),7.51(d,j=1.9hz,1h),7.39-7.33(m,2h),6.88(d,j=8.7hz,1h),5.47-5.41(m,1h),4.05(q,j=7.1hz,2h),3.83-3.75(m,2h),3.30-3.21(m,1h),3.15-3.06(m,1h),2.80(s,3h),2.42-2.34(m,1h),2.00-1.94(m,1h),1.85-1.65(m,4h),1.19(t,j=7.1hz,3h).lcms(esi)m/zc26h27brn4o5的计算值：554.12.实测值：555.14/557.09(m/m+2)+。
实施例53:半((s)-(7-((6-溴-1'-(甲氧基羰基)螺[色满-2,4'-哌啶]-4-基)氨基甲酰基)-2h-吲唑-2-基)甲基磷酸酯)2-氨基-2-(羟基甲基)丙烷-1,3-二醇盐
6-溴-4-氧代螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸叔丁酯的制备
向1-(5-溴-2-羟基苯基)乙-1-酮(20.0g,93.0mmol)在meoh(160ml)中的搅拌溶液中加入吡咯烷(3.3g,46.5mmol)。将所得橙黄色溶液在室温搅拌30分钟，然后用4-氧代哌啶-1-甲酸叔丁酯(18.5g,93.0mmol)溶液处理。将反应混合物加热至80℃。在该温度下搅拌14小时后，将反应混合物冷却至室温。将残余物在etoac和10%柠檬酸水溶液之间分配，并分离相。用etoac(1x)萃取水相。合并的etoac溶液用10%柠檬酸水溶液(1x)、饱和nahco3水溶液(2x)洗涤，经na2so4干燥，并在减压下浓缩。通过在pe/ea中重结晶纯化残余物，以得到为浅黄色固体的标题化合物(17g,46%)。lcms(esi)m/zc18h22brno4的计算值：395.07.实测值：296.1/298.1(m-100/m-98)+。
6-溴螺[色满-2,4'-哌啶]-4-酮的制备
向6-溴-4-氧代螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸叔丁酯(39.1g,98.90mmol)在dcm(240.0ml)中的溶液中加入4mhcl/二噁烷(123.6ml)。在室温下搅拌1.5小时后，将反应混合物在真空下浓缩以得到为hcl盐的标题化合物(32.7g,定量产率)，将其直接用于下一步骤。lcms(esi)m/zc13h14brno2的计算值：295.02.实测值：296.14/298.14(m/m+2)+。
(s)-6-溴-4-(1h-吲唑-7-甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸异丙酯的制备
在0℃下，向(s)-n-(6-溴螺[色满-2,4'-哌啶]-4-基)-1h-吲唑-7-甲酰胺二盐酸盐(30.5g,92.10mmol)在dcm(300ml)中的搅拌悬浮液中加入dipea(48.0ml,276.2mmol)。将所得溶液用氯甲酸甲酯(11.0ml,138.15mmol)逐滴处理。60分钟后，将反应混合物在dcm和10%柠檬酸水溶液之间分配，并分离相。用dcm(1x)萃取水相。合并的etoac溶液用10%柠檬酸水溶液(1x)、饱和nahco3水溶液(2x)洗涤，经na2so4干燥，并在减压下浓缩。通过在pe/ea中重结晶纯化残余物以得到为浅黄色固体的标题化合物(28.8g,89%产率)。lcms(esi)m/zc15h16brno4的计算值：353.03.实测值：354.13/356.13(m/m+2)+。
6-溴-4-氧代螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸甲酯的制备
向6-溴-4-氧代螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸甲酯(28.80g,81.30mmol)和(s)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(19.7g,162.6mmol)在无水thf(300ml)中的搅拌溶液中加入ti(oet)4(51.0ml,243.9mmol)。将所得混合物在80℃在氮气气氛下加热。20小时后，将溶液冷却至室温，然后冷却至-35℃。用nabh4(15.4g,406.5mmol)处理该溶液。在-35℃下搅拌30分钟后，使混合物温热至-20℃并在该温度下搅拌过夜。lcms表明亚胺中间体完全转化为所需的胺产物，该胺产物为非对映异构体的96:4混合物。将浑浊的溶液冷却至0℃，并通过缓慢加入meoh淬灭直至气体逸出停止。所得混合物用饱和盐水溶液处理以得到浓稠的浅黄色悬浮液。通过经由中度烧结漏斗过滤除去固体。将滤液用饱和盐水(1x)洗涤，经na2so4干燥，并在减压下浓缩。使残余物进行快速色谱(硅胶,20-100%etoac/dcm,梯度洗脱)以得到为白色固体的标题化合物(28.7g,77%产率)。lcms(esi)m/zc19h27brn2o4s的计算值：458.09.实测值：459.23/461.23(m/m+2)+。
(s)-4-氨基-6-溴螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸甲酯盐酸盐的制备
在0℃下，向(s)-6-溴-4-(((s)-叔丁基亚磺酰基)氨基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸甲酯(26.9g,58.3mmol)在无水meoh(200ml)中的搅拌悬浮液中逐滴加入4nhcl/二噁烷(58.3ml,233.2mmol)。然后使溶液温热至室温。3小时后，将溶液在减压下浓缩至干。将残余物重新溶解于meoh中，并再次浓缩至干，以得到为棕褐色固体的标题化合物(20.8g,定量产率)，将其用于下一步骤而不经进一步纯化。lcms(esi)m/zc15h19brn2o3的计算值：354.06.实测值：355.61/357.32(m/m+2)+。
(s)-6-溴-4-(1h-吲唑-7-甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸甲酯的制备
向(s)-4-氨基-6-溴螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸甲酯盐酸盐(15.0g,38.5mmol)和1h-吲哚-7-甲酸(5.6g,35mmol)在dmf(150ml)中的搅拌溶液中加入diea(18.3ml,105mmol)，然后加入hatu(14.6g,38.5mmol)。将所得溶液在室温下搅拌。18小时后，将溶液在etoac和10%柠檬酸水溶液之间分配。分离相后，将etoac相用10%柠檬酸水溶液(1x)、饱和nahco3水溶液(2x)洗涤，经na2so4干燥并在减压下浓缩至干。使残余物进行快速色谱(硅胶,20-100%etoac/己烷)以得到为白色固体的标题化合物(10.1g,53%产率)。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.16(s,1h),7.98(d,j=8.0hz,1h),7.60(d,j=7.3hz,1h),7.44(d,j=1.7hz,1h),7.31(dd,j=8.7,2.3hz,1h),7.22(t,j=7.7hz,1h),6.80(d,j=8.7hz,1h),6.61(d,j=8.4hz,1h),5.65-5.57(m,1h),4.05-3.83(m,2h),3.70(s,3h),3.42-3.31(m,1h),3.18-3.08(m,1h),2.39-2.30(m,1h),1.97-1.82(m,3h),1.75-1.60(m,2h).没有观察到吲唑环中的氮质子。lcms(esi)m/zc23h23brn4o4的计算值：498.09.实测值：499.28/501.28(m/m+2)+。
(s)-6-溴-4-(2-(((二叔丁氧基磷酰基)氧基)甲基)-2h-吲唑-7-甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸甲酯的制备
向(s)-6-溴-4-(1h-吲唑-7-甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯(10g,20.0mmol)和cs2co3(19.6g,60.0mmol)在dmf(80ml)中的搅拌悬浮液中加入二-叔丁基(氯甲基)磷酸酯(7.8g,30mmol)、nai(3.3g,22mmol)。在55℃下搅拌5小时后，将所得混合物在etoac和水之间分配。将有机层分离并用饱和nacl水溶液(2x)洗涤，经na2so4干燥，并在减压下浓缩至干以得到为黄色胶状物的标题化合物(14.7g,定量产率)，将其用于下一步骤而不进行纯化。lcms(esi)m/zc32h42brn4o8p的计算值：720.19.实测值：721.41/723.56(m/m+2)+。
(s)-6-溴-4-(2-((膦酸氧基)甲基)-2h-吲唑-7-甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸甲酯的制备
向(s)-6-溴-4-(2-(((二叔丁氧基磷酰基)氧基)甲基)-2h-吲唑-7-甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸甲酯(405mg,0.55mmol)在dcm(4ml)中的搅拌溶液中加入4mhcl/二噁烷(4.1ml,16.5mmol)。在25℃下搅拌3小时后，将所得混合物在减压下浓缩，以得到残余物，将其在高真空下干燥。通过在mcn/水(9:1)中重结晶纯化所得残余物以得到为白色固体的标题化合物(233mg,68%产率)。1hnmr(400mhz,dmso)δ9.40(d,j=8.2hz,1h),8.76(s,1h),8.17-7.99(m,2h),7.42(s,1h),7.38-7.23(m,2h),6.86(d,j=8.7hz,1h),6.20-6.01(m,2h),5.52-5.40(m,1h),3.86-3.75(m,2h),3.61(s,3h),3.40-3.27(m,3h),3.14-3.09(m,1h),2.36-2.29(m,1h),2.07-1.93(m,2h),1.84-1.76(m,2h),1.70-1.61(m,1h).lcms(esi)m/zc24h26brn4o8p的计算值：608.07.实测值：607.68/609.67(m/m+2)+。
(s)-6-溴-4-(2-((膦酸氧基)甲基)-2h-吲唑-7-甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸甲酯,双2-氨基-2-(羟基甲基)-1,3-丙烷二醇盐的制备
向(s)-6-溴-4-(2-((膦酸氧基)甲基)-2h-吲唑-7-甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸甲酯(10.7g,17.6mmol)在水(30.0ml)中的悬浮液中加入三(羟基甲基)氨基甲烷(4.5g,37.1mmol)的水(20.0ml)溶液以提供澄清溶液。60分钟后，将混合物用乙腈(300ml)稀释直至浑浊并接种一些晶体。在环境温度下继续搅拌4小时。将固体通过过滤收集，用mecn/水(9:1)洗涤并真空干燥以提供为白色固体的标题化合物(300mg,86%产率)。1hnmr(400mhz,dmso)δ9.44(d,j=8.2hz,1h),8.80(s,1h),8.08(dd,j=7.0,0.9hz,1h),7.99(dd,j=8.4,0.9hz,1h),7.43(d,j=1.8hz,1h),7.33(dd,j=8.7,2.4hz,1h),7.26-7.19(m,1h),6.85(d,j=8.7hz,1h),5.99-5.87(m,2h),5.48-4.61(m,13h),3.85-3.72(m,2h),3.61(s,3h),3.36(s,12h),3.32-3.26(m,1h),3.15-3.05(m,1h),2.36-2.29(m,1h),2.03-1.97(m,1h),1.86-1.72(m,3h),1.68-1.60(m,1h)。
实施例54
(s)-4-(1h-吲唑-7-甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸甲酯的制备
向(s)-6-溴-4-(1h-吲唑-7-甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸甲酯(6.5g,13.0mmol)在etoh(60ml)中的溶液中加入10%pd/c(4.1g)，并将其在55℃在氢气氛下搅拌16小时。通过硅藻土过滤反应混合物，并将滤液浓缩并进行快速色谱(硅胶,0-10%meoh/dcm)以得到为白色固体的标题化合物(2.5g,46%产率)。1hnmr(400mhz,dmso)δ13.15(s,1h),9.01(d,j=8.5hz,1h),8.17(s,1h),7.97(t,j=7.1hz,2h),7.30-7.10(m,3h),6.96-6.80(m,2h),5.54-5.43(m,1h),3.89-3.72(m,2h),3.61(s,3h),3.39(s,1h),3.15-3.03(m,1h),2.25-2.15(m,1h),2.07-1.98(m,1h),1.89-1.69(m,3h),1.67-1.58(m,1h).lcms(esi)m/zc23h24n4o4的计算值：420.18.实测值：421.35(m+1)+。
实施例55:半((s)-(7-((1'-(乙氧基羰基)螺[色满-2,4'-哌啶]-4-基)氨基甲酰基)-2h-吲唑-2-基)甲基磷酸酯)2-氨基-2-(羟基甲基)丙烷-1,3-二醇盐
4-氧代螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯的制备
向1-(2-羟基苯基)乙-1-酮(20.00g,146.9mmol)在meoh(200ml)中的搅拌溶液中加入吡咯烷(6ml,73.45mmol)。将所得橙黄色溶液在室温搅拌30分钟，然后用4-氧代哌啶-1-甲酸乙酯(25.0g,146.9mmol)溶液处理。在80℃下搅拌14小时后，将反应混合物冷却至室温，在此期间固体结晶。将混合物在冰水浴中冷却30分钟，并且固体通过真空过滤收集，用两份冰冷的meoh洗涤。真空干燥得到为浅黄色固体的标题化合物(33.3g,73%)。lcms(esi)m/zc16h19no4的计算值：289.13.实测值：290.27(m+1)+。
(s)-4-(((s)-叔丁基亚磺酰基)氨基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯的制备
向4-氧代螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯(33.3g,115.1mmol)和(s)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(21.2g,172.6mmol)在无水thf(300ml)中的搅拌溶液中加入ti(oet)4(78.7g,345.3mmol)。将所得混合物在80℃在氮气气氛下加热。20小时后，将溶液冷却至-35℃，并用nabh4(21.7g,575.5mmol)处理。在-35℃下搅拌30分钟后，使混合物温热至-20℃并搅拌过夜。lcms表明亚胺中间体完全转化为所需的胺产物，该胺产物为非对映异构体的92:8混合物。将浑浊的溶液冷却至0℃，并通过缓慢加入meoh淬灭直至气体逸出停止。所得混合物用饱和盐水溶液处理以得到浓稠的浅黄色悬浮液。过滤除去固体。用etoac(3x)洗涤滤饼。滤液用饱和盐水(1x)洗涤，经na2so4干燥，并在减压下浓缩。使残余物进行快速色谱(硅胶,20-100%etoac/dcm,梯度洗脱)以得到为白色固体的标题化合物(25.6g,56.0%产率)。lcms(esi)m/zc20h30n2o4s的计算值：394.19.实测值：395.35(m+1)+。
(s)-4-氨基螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯的制备
在0℃下，向(s)-4-(((s)-叔丁基亚磺酰基)氨基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯(30.0g,76mmol)在无水meoh(200ml)中的搅拌悬浮液中逐滴加入4nhcl/二噁烷(19ml,76mmol)。然后使溶液温热至室温。将该溶液在减压下浓缩至干。将残余物重新溶解在meoh中，并再次浓缩至干以得到为棕褐色固体的标题化合物，产率为定量产率。使用该物质而不经进一步纯化。lcms(esi)m/zc16h22n2o3的计算值：290.16.实测值：291.36(m+1)+。
(s)-4-(1h-吲唑-7-甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯的制备
向(s)-4-氨基螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯(28g,96.43mmol)和1h-吲哚-7-甲酸(15.6g,96.43mmol)在dmf(300ml)中的搅拌溶液中加入diea(50ml,289.29mmol)，然后加入hatu(55g,144.65mmol)。将所得溶液在室温搅拌。8小时后，将溶液在etoac和10%柠檬酸水溶液之间分配。分离相后，将etoac相用10%柠檬酸水溶液(1x)，饱和nahco3水溶液(2x)洗涤，经na2so4干燥并在减压下浓缩至干。使残余物进行快速色谱(硅胶,20-100%etoac/己烷)以得到为白色固体的标题化合物(23g,55%产率)。lcms(esi)m/zc24h26n4o4的计算值：434.20.实测值：435.32(m+1)+。
(s)-4-(2-(((二叔丁氧基磷酰基)氧基)甲基)-2h-吲唑-7-甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯的制备
向(s)-4-(1h-吲唑-7-甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯(1.56g,3.6mmol)、nai(593mg,3.96mmol)和cs2co3(3.5g,10.8mmol)在dmf(20ml)中的搅拌悬浮液中加入二-叔丁基(氯甲基)磷酸酯(1.4g,5.4mmol)。在55℃下搅拌5小时后，将所得混合物在etoac和水之间分配。分离层后，将有机层用饱和nacl水溶液(2x)洗涤，经na2so4干燥，并在减压下浓缩至干以得到为黄色胶状物的标题化合物(2.2g,94%产率)，将其用于下一步骤而不进行纯化。lcms(esi)m/zc33h45brn4o8p的计算值：656.30.实测值：657.42(m+1)+。
(s)-4-(2-((膦酸氧基)甲基)-2h-吲唑-7-甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯的制备
向(s)-4-(2-(((二叔丁氧基磷酰基)氧基)甲基)-2h-吲唑-7-甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯(2.2g,3.35mmol)在二噁烷(5ml)中的搅拌溶液中加入4mhcl/二噁烷(5ml,20mmol)。在25℃搅拌3小时后，将所得混合物在减压下浓缩，以得到残余物，将其通过在mcn/水(9:1)中重结晶纯化以得到为白色固体的标题化合物(654mg,36%产率)。lcms(esi)m/zc25h29n4o8p的计算值：544.17.实测值：545.24(m+1)+。
(s)-4-(2-((膦酸氧基)甲基)-2h-吲唑-7-甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯,双2-氨基-2-(羟基甲基)-1,3-丙烷二醇盐的制备
向(s)-4-(2-((膦酸氧基)甲基)-2h-吲唑-7-甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯(100mg,0.184mmol)在水(1.0ml)中的悬浮液中加入三(羟基甲基)氨基甲烷(47mg,0.387mmol)的水(1.5ml)溶液以提供澄清溶液。30分钟后，将混合物用乙腈(10ml)稀释直至浑浊，并接种一些晶体。在环境温度下继续搅拌2小时。将固体过滤，用mecn/水(9:1)洗涤，并真空干燥以提供为白色固体的标题化合物(120mg,85%产率)。1hnmr(400mhz,dmso)δ9.40(d,j=8.3hz,1h),8.79(s,1h),8.09(d,j=6.9hz,1h),7.97(d,j=8.3hz,1h),7.29(d,j=7.5hz,1h),7.25-7.12(m,2h),6.92-6.82(m,2h),5.89(d,j=11.3hz,2h),5.50-5.43(m,1h),4.75(br,12h),4.05(q,j=7.0hz,2h),3.80(t,j=15.5hz,2h),3.37(s,12h),3.32-3.23(m,1h),3.18-3.08(m,1h),2.37-2.29(m,1h),2.00-1.92(m,1h),1.85-1.58(m,4h),1.19(t,j=7.1hz,3h)。
实施例56:半((s)-(7-((1-(乙氧基羰基)-6'-甲氧基-3',4'-二氢螺[哌啶-4,2'-吡喃并[3,2-b]吡啶]-4'-基)氨基甲酰基)-2h-吲唑-2-基)甲基磷酸酯)2-氨基-2-(羟基甲基)丙烷-1,3-二醇盐
6-甲氧基吡啶-3-醇的制备
在室温下向(6-甲氧基吡啶-3-基)硼酸(25g,163mmol)在dcm(300ml)中的溶液中逐滴加入过氧化氢并将混合物搅拌4小时。将所得混合物用固体na2so3淬灭，并用水、盐水洗涤，经na2so4干燥。将所得溶液浓缩，以得到粗产物，将其通过快速色谱(硅胶,0-10%etoac/pe)纯化以得到标题化合物(18g,88%产率)。lcms(esi)m/zc6h7no2的计算值：125.05.实测值：126.14(m+1)+。
2-溴-6-甲氧基吡啶-3-醇的制备
在0℃下，向6-甲氧基吡啶-3-醇(17g,136mmol)在乙腈(170ml)和水(25ml)中的搅拌溶液中加入nbs(26.6g,149mmol)，然后将其在60℃下搅拌过夜。将所得混合物在etoac和h2o之间分配。分离层，并将有机层用盐水洗涤，经na2so4干燥，过滤并浓缩，以得到粗产物，将其通过快速色谱(硅胶,0-50%etoac/pe)纯化以得到标题化合物(22g,79%产率)。lcms(esi)m/zc6h6brno2的计算值：202.96.实测值：204.09/206.07(m/m+2)+。
3-(苄基氧基)-2-溴-6-甲氧基吡啶的制备
向2-溴-6-甲氧基吡啶-3-醇(22g,108mmol)和k2co3(44g,324mmol)在dmf(300ml)中的搅拌悬浮液中加入bnbr(24g,140mmol)，并将其在40℃下搅拌过夜。将所得混合物在etoac和h2o之间分配。分离层，并将有机层用盐水洗涤，经na2so4干燥。将所得溶液浓缩以得到粗产物，将其通过快速色谱(硅胶,0-30%etoac/pe)纯化以得到标题化合物(33g,100%产率)。lcms(esi)m/zc13h12brno2的计算值：293.01.实测值：294.09/296.08(m/m+2)+。
3-(苄基氧基)-6-甲氧基吡啶甲腈的制备
向3-(苄基氧基)-2-溴-6-甲氧基吡啶(33g,113mmol)在dmf(500ml)中的搅拌溶液中加入cucn(40.5g,452mmol)，并将其在150℃下搅拌6小时。通过过滤除去固体，并将滤液在etoac和h2o之间分配。分离层，并将有机层用盐水洗涤，经na2so4干燥。将所得溶液浓缩以得到粗产物，将其通过快速色谱(硅胶,0-30%etoac/pe)纯化以得到标题化合物(21g,77%产率)。lcms(esi)m/zc14h12n2o2的计算值：240.09.实测值：241.26(m+1)+。
1-(3-(苄基氧基)-6-甲氧基吡啶-2-基)乙酮的制备
在0℃下，向3-(苄基氧基)-6-甲氧基吡啶甲腈(20g,83.3mmol)在thf(200ml)中的搅拌溶液中加入甲基溴化镁(139ml,417mmol)，并使其在室温下搅拌16小时。将反应混合物用1nhcl(300ml)淬灭，并搅拌另外1小时。然后将其用2m氢氧化钠溶液碱化并用etoac(2x200ml)萃取。分离层，并将有机层用盐水洗涤，经na2so4干燥。将所得溶液浓缩，以得到粗产物，将其通过快速色谱(硅胶,0-30%etoac/pe)纯化以得到标题化合物(12.6g,59%产率)。lcms(esi)m/zc15h15no3的计算值：257.11.实测值：258.24(m+1)+。
1-(3-羟基-6-甲氧基吡啶-2-基)乙酮的制备
在室温下，向1-(3-(苄基氧基)-6-甲氧基吡啶-2-基)乙酮(12g,46.7mmol)在thf(200ml)中的溶液中加入10%pd/c(6g)，并将其在氢气气氛下搅拌16小时。通过硅藻土过滤反应混合物，并浓缩滤液以得到标题化合物(7.3g,94%产率)，将其直接用于下一步骤。lcms(esi)m/zc8h9no3的计算值：167.06.实测值：168.17(m+1)+。
6'-甲氧基-4'-氧代-3',4'-二氢螺[哌啶-4,2'-吡喃并[3,2-b]吡啶]-1-甲酸乙酯的制备
在室温下，向1-(3-羟基-6-甲氧基吡啶-2-基)乙酮(7.3g,43.7mmol)在甲醇(150ml)中的搅拌溶液中加入吡咯烷(5.3g,75.5mmol)和4-氧代哌啶-1-甲酸乙酯(9.73g,56.8mmol)，然后将反应混合物加热至80℃并在该温度下搅拌14小时。将所得混合物在etoac和h2o之间分配。分离层，并将有机层用盐水洗涤，经na2so4干燥并浓缩，以得到粗产物，将其通过快速色谱(硅胶,0-50%etoac/pe)纯化以得到标题化合物(8.8g,63%产率)。lcms(esi)m/zc16h20n2o5的计算值：320.14.实测值：321.24(m+1)+。
(s)-4'-(((s)-叔丁基亚磺酰基)氨基)-6'-甲氧基-3',4'-二氢螺[哌啶-4,2'-吡喃并[3,2-b]吡啶]-1-甲酸乙酯的制备
在室温下，向6'-甲氧基-4'-氧代-3',4'-二氢螺[哌啶-4,2'-吡喃并[3,2-b]吡啶]-1-甲酸乙酯(8.8g,27.5mmol)和(s)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(6.7g,55.3mmol)在thf(200ml)中的搅拌溶液中加入ti(oet)4(19g,83.3mmol)。将所得混合物在80℃在氮气气氛下加热。20小时后，将溶液冷却至室温，然后冷却至-35℃。用nabh4(5.2g,137.4mmol)处理溶液。在-35℃下搅拌30分钟后，使混合物温热至-10℃并在该温度下搅拌过夜。18小时后，lcms表明亚胺中间体完全转化为所需的胺产物，该胺产物为非对映异构体的75:25混合物。将浑浊的溶液冷却至0℃，并通过缓慢加入meoh淬灭直至气体逸出停止。所得混合物用饱和盐水溶液处理以得到浓稠的浅黄色悬浮液。通过经由中度烧结漏斗过滤除去固体。将滤液用饱和盐水(1x)洗涤，经na2so4干燥，并在减压下浓缩，以得到残余物，将其通过快速色谱(硅胶,20-100%etoac/dcm,梯度洗脱)纯化以得到为白色固体的标题化合物(4.6g,39%产率)。lcms(esi)m/zc20h31n3o5s的计算值：425.20.实测值：426.38(m+1)+。
(s)-4'-氨基-6'-甲氧基-3',4'-二氢螺[哌啶-4,2'-吡喃并[3,2-b]吡啶]-1-甲酸乙酯的制备
向(s)-4'-((s)-1,1-二甲基乙基亚磺酰胺基)-6'-甲氧基-3',4'-二氢螺[哌啶-4,2'-吡喃并[3,2-b]吡啶]-1-甲酸乙酯(4.6g,10.8mmol)在甲醇(50ml)中的搅拌溶液中逐滴加入hcl/二噁烷(4mol/l,5.4ml,21.6mmol)。然后使溶液温热至室温。3小时后，将溶液在减压下浓缩至干。将残余物重新溶解在meoh中，并再次浓缩至干以得到为棕褐色固体的标题化合物(3.5g,100%产率)，将其用于下一步骤而不经进一步纯化。lcms(esi)m/zc16h23n3o4的计算值：321.17.实测值：322.27(m+1)+。
(s)-4'-(1h-吲唑-7-甲酰胺基)-6'-甲氧基-3',4'-二氢螺[哌啶-4,2'-吡喃并[3,2-b]吡啶]-1-甲酸乙酯的制备
向(s)-4'-氨基-6'-甲氧基-3',4'-二氢螺[哌啶-4,2'-吡喃并[3,2-b]吡啶]-1-甲酸乙酯(4.5g,12.6mmol)和1h-吲唑-7-甲酸(2.17g,13.4mmol)在dmf(100ml)中的搅拌溶液中加入dipea(8.8ml,50.6mmol)，然后分批加入hatu(5.6g,14.7mmol)，并将所得混合物在室温搅拌2小时。然后将混合物在etoac和饱和nahco3水溶液之间分配。分离层，并将有机层用盐水洗涤，经na2so4干燥并浓缩以得到粗产物，将其通过快速色谱(硅胶,0-60%etoac/pe)纯化以得到标题化合物(5g,85%产率)。1hnmr(400mhz,dmso)δ13.10(s,1h),8.86(s,1h),8.16(s,1h),7.99-7.89(m,2h),7.28(d,j=8.8hz,1h),7.19(t,j=7.6hz,1h),6.69(d,j=8.7hz,1h),5.38-5.28(m,1h),4.05(q,j=7.1hz,2h),3.85-3.73(m,2h),3.64(s,3h),3.30-3.21(m,1h),3.18-3.07(m,1h),2.35-2.25(m,1h),2.13-2.03(m,1h),1.91-1.79(m,2h),1.77-1.60(m,2h),1.19(t,j=7.1hz,3h).lcms(esi)m/zc24h27n5o5的计算值：465.20.实测值：466.36(m+1)+。
(s)-4'-(2-((二叔丁氧基磷酰基氧基)甲基)-2h-吲唑-7-甲酰胺基)-6'-甲氧基-3',4'-二氢螺[哌啶-4,2'-吡喃并[3,2-b]吡啶]-1-甲酸乙酯的制备
向(s)-4'-(1h-吲唑-7-甲酰胺基)-6'-甲氧基-3',4'-二氢螺[哌啶-4,2'-吡喃并[3,2-b]吡啶]-1-甲酸乙酯(800mg,1.72mmol)在dmf(15ml)中的搅拌溶液中加入二-叔丁基氯甲基磷酸酯(667mg,2.58mmol)、cs2co3(1.68g,5.16mmol)和nai(284mg,1.89mmol)。在55℃下搅拌5小时后，将所得混合物在etoac和水之间分配。将有机层分离，并用饱和nacl水溶液(2x)洗涤，经na2so4干燥，并在减压下浓缩至干，以得到为黄色胶状物的标题化合物(1.2g,100%产率)。lcms(esi)m/zc33h46n5o9p的计算值：687.30.实测值：688.30(m+1)+。
(s)-6'-甲氧基-4'-(2-((膦酸氧基)甲基)-2h-吲唑-7-甲酰胺基)-3',4'-二氢螺[哌啶-4,2'-吡喃并[3,2-b]吡啶]-1-甲酸乙酯的制备
在室温下，向(s)-4'-(2-((二叔丁氧基磷酰基氧基)甲基)-2h-吲唑-7-甲酰胺基)-6'-甲氧基-3',4'-二氢螺[哌啶-4,2'-吡喃并[3,2-b]吡啶]-1-甲酸乙酯(1.2g,1.75mmol)在dcm(20ml)中的搅拌溶液中加入4mhcl/二噁烷(4.4ml,17.4mmol)并搅拌1小时。将反应混合物浓缩，以得到粗产物，将其通过glison(c18,20-100%mecn/h2o)纯化以得到标题化合物(450mg,45%产率)。1hnmr(400mhz,dmso)δ9.49(d,j=6.0hz,1h),8.73(s,1h),8.12(dd,j=7.0,0.8hz,1h),8.03(d,j=8.4hz,1h),7.33-7.23(m,2h),6.73(d,j=8.8hz,1h),6.11-6.00(m,2h),5.26-5.19(m,1h),4.06(q,j=7.0hz,2h),3.82-3.71(m,5h),3.50-3.25(m,3h),3.17-3.10(m,1h),2.70-2.64(m,1h),1.94-1.85(m,2h),1.83-1.72(m,2h),1.70-1.62(m,1h),1.20(t,j=7.1hz,3h).lcms(esi)m/zc25h30n5o9p的计算值：575.18.实测值：576.30(m+1)+。
(s)-6'-甲氧基-4'-(2-((膦酸氧基)甲基)-2h-吲唑-7-甲酰胺基)-3',4'-二氢螺[哌啶-4,2'-吡喃并[3,2-b]吡啶]-1-甲酸乙酯,双2-氨基-2-(羟基甲基)-1,3-丙烷二醇盐的制备
向(s)-6'-甲氧基-4'-(2-(膦酸氧基甲基)-2h-吲唑-7-甲酰胺基)-3',4'-二氢螺[哌啶-4,2'-吡喃并[3,2-b]吡啶]-1-甲酸乙酯(60mg,0.104mmol)在h2o(0.5ml)中的搅拌悬浮液中加入2-氨基-2-(羟基甲基)丙烷-1,3-二醇(25.3mg,0.209mmol)的h2o(0.5ml)溶液，并将其在室温下搅拌30分钟。将反应混合物用mecn(3ml)稀释直至浑浊并接种一些晶体。在环境温度下继续搅拌2小时。固体通过过滤收集，用mecn/水(9:1)洗涤并真空干燥以提供标题化合物(51mg,60%产率)。1hnmr(400mhz,dmso)δ9.61(d,j=5.5hz,1h),8.77(s,1h),8.08(d,j=7.0hz,1h),7.98(d,j=8.2hz,1h),7.30(d,j=8.8hz,1h),7.26-7.16(m,1h),6.72(d,j=8.8hz,1h),5.87(d,j=10.8hz,2h),5.23-4.64(m,13h),4.09-4.01(m,2h),3.85-3.67(m,5h),3.35(s,12h),3.29-3.22(m,1h),3.18-3.10(m,1h),2.72-2.65(m,1h),1.97-1.83(m,2h),1.81-1.58(m,3h),1.20(t,j=7.0hz,3h).lcms(esi)m/z实测值：576.30(m+1)+。
实施例57
(s)-4'-((叔丁氧基羰基)氨基)-6'-甲氧基-3',4'-二氢螺[哌啶-4,2'-吡喃并[3,2-b]吡啶]-1-甲酸乙酯的制备
向(s)-4'-氨基-6'-甲氧基-3',4'-二氢螺[哌啶-4,2'-吡喃并[3,2-b]吡啶]-1-甲酸乙酯(370mg,1.04mmol)在thf(15ml)中的搅拌溶液中加入boc2o(337mg,1.56mmol)和dipea(536mg,4.15mmol)。在室温下搅拌过夜后，将所得混合物在etoac和h2o之间分配。分离层，并将有机层用盐水洗涤，经na2so4干燥并浓缩，以得到粗产物，将其通过快速色谱(硅胶,0-30%etoac/pe)纯化以得到标题化合物(488mg,100%产率)。lcms(esi)m/zc21h31n3o6的计算值：421.22.实测值：422.30(m+1)+。
(s)-(6'-甲氧基-3',4'-二氢螺[哌啶-4,2'-吡喃并[3,2-b]吡啶]-4'-基)氨基甲酸叔丁酯的制备
向(s)-4'-((叔丁氧基羰基)氨基)-6'-甲氧基-3',4'-二氢螺[哌啶-4,2'-吡喃并[3,2-b]吡啶]-1-甲酸乙酯(488mg,1.06mmol)在乙醇(20ml)中的搅拌溶液中加入naoh(25mol/l,0.46ml,10.6mmol)，并将其在80℃下搅拌过夜。将所得混合物在dcm和h2o之间分配。分离层，并将有机层用盐水洗涤，经na2so4干燥并浓缩以得到标题化合物(263mg,65%产率)，将其直接用于下一步骤。
(s)-4'-((叔丁氧基羰基)氨基)-6'-甲氧基-3',4'-二氢螺[哌啶-4,2'-吡喃并[3,2-b]吡啶]-1-甲酸甲酯的制备
在0℃下，向(s)-(6'-甲氧基-3',4'-二氢螺[哌啶-4,2'-吡喃并[3,2-b]吡啶]-4'-基)氨基甲酸叔丁酯(263mg,0.754mmol)和tea(0.32ml,2.261mmol)在dcm(3ml)中的搅拌溶液中分批加入氯甲酸甲酯(0.09ml,1.13mmol)。搅拌1小时后，将所得混合物在dcm和水之间分配。分离层，并将有机层用盐水洗涤，经na2so4干燥并浓缩。残余物通过柱色谱(硅胶,0~50%ea/pe)纯化以得到标题化合物(240mg,78%产率)。lcms(esi)m/zc20h29n3o6的计算值：407.21.实测值：408.86(m+1)+。
(s)-4'-氨基-6'-甲氧基-3',4'-二氢螺[哌啶-4,2'-吡喃并[3,2-b]吡啶]-1-甲酸甲酯的制备
向(s)-4'-((叔丁氧基羰基)氨基)-6'-甲氧基-3',4'-二氢螺[哌啶-4,2'-吡喃并[3,2-b]吡啶]-1-甲酸甲酯(160mg,0.393mmol)在dcm(4ml)中的搅拌溶液中加入hcl/二噁烷(4mol/l,1ml,3.93mmol)，并将其在室温下搅拌1小时。浓缩反应混合物以得到为棕褐色固体的标题化合物(120mg,99%产率)，将其直接用于下一步骤。lcms(esi)m/zc15h21n3o4的计算值：307.15.实测值：308.72(m+1)+。
(s)-4'-(1h-吲唑-7-甲酰胺基)-6'-甲氧基-3',4'-二氢螺[哌啶-4,2'-吡喃并[3,2-b]吡啶]-1-甲酸甲酯的制备
向(s)-4'-氨基-6'-甲氧基-3',4'-二氢螺[哌啶-4,2'-吡喃并[3,2-b]吡啶]-1-甲酸甲酯(70mg,0.227mmol)、1h-吲唑-7-甲酸(44mg,0.273mmol)和dipea(0.2ml,1.136mmol)在dmf(3ml)中的搅拌溶液中加入hatu(113mg,0.295mmol)，并将其在室温下搅拌1小时。将反应混合物在etoac和水之间分配。分离层，并将有机层用盐水洗涤，经na2so4干燥并浓缩，以得到粗产物，其通过制备型hplc(c18,40-100%mecn/h2o(含0.5%甲酸))纯化以得到为白色固体的标题化合物(62mg,61%产率)。1hnmr(400mhz,dmso)δ13.10(s,1h),8.86(s,1h),8.16(s,1h),8.00-7.88(m,2h),7.28(d,j=8.8hz,1h),7.22-7.15(m,1h),6.69(d,j=8.7hz,1h),5.43-5.27(m,1h),3.87-3.71(m,2h),3.62(d,j=11.2hz,6h),3.31-3.23(m,1h),3.18-3.06(m,1h),2.36-2.24(m,1h),2.13-2.03(m,1h),1.92-1.80(m,2h),1.79-1.70(m,1h),1.69-1.60(m,1h).lcms(esi)m/zc23h25n5o5的计算值：451.19.实测值：452.35(m+1)+。
实施例58:(s)-6'-溴-4'-(2-((膦酸氧基)甲基)-2h-吲唑-7-甲酰胺基)-3',4'-二氢螺[哌啶-4,2'-吡喃并[2,3-c]吡啶]-1-甲酸乙酯
2-溴-5-(甲氧基甲氧基)吡啶的制备
在0℃下，向6-溴吡啶-3-醇(25g,144mmol)在thf(300ml)中的溶液中分批加入nah(60%，于矿物油中)(7.5g,187mmol)。在该温度下搅拌1小时后，向反应混合物中加入溴(甲氧基)甲烷(23.3g,187mmol)。在室温下搅拌另外2小时后，将所得混合物在etoac和饱和nh4cl水溶液之间分配。分离层，并将有机层用盐水洗涤，经na2so4干燥并浓缩，以得到粗产物，将其通过快速色谱(硅胶,0-30%etoac/pe)纯化以得到标题化合物(24g,77%产率)。lcms(esi)m/zc7h8brno2的计算值：216.97.实测值：218.09/220.08(m/m+2)+。
1-(2-溴-5-(甲氧基甲氧基)吡啶-4-基)乙-1-醇的制备
在-78℃下，向2-溴-5-(甲氧基甲氧基)吡啶(24g,110mmol)在thf(300ml)中的搅拌溶液中逐滴加入lda(2mol/l,82ml,165mmol)。在该温度下搅拌1小时后，历经10分钟将乙醛(10ml,165mmol)加入到反应混合物中。在室温下搅拌过夜后，将所得混合物在etoac和饱和nh4cl水溶液之间分配。分离层，并将有机层用盐水洗涤，经na2so4干燥并浓缩以得到粗产物，将其通过快速色谱(硅胶,0-50%etoac/pe)纯化以得到标题化合物(27g,94%产率)。lcms(esi)m/zc9h12brno3的计算值：261.00.实测值：262.11/264.11(m/m+2)+。
1-(2-溴-5-(甲氧基甲氧基)吡啶-4-基)乙-1-酮的制备
在0℃下，向1-(2-溴-5-(甲氧基甲氧基)吡啶-4-基)乙-1-醇(27g,103mmol)在dcm(600ml)中的溶液中加入dmp(110g,259mmol)。使反应混合物温热至室温，并搅拌3小时。滤出固体，并将滤液浓缩以得到粗产物，将其通过快速色谱(硅胶,0-30%etoac/pe)纯化以得到标题化合物(22g,82%产率)。lcms(esi)m/zc9h10brno3的计算值：258.98.实测值：260.11/262.10(m/m+2)+。
1-(2-溴-5-羟基吡啶-4-基)乙-1-酮的制备
在0℃下，向1-(2-溴-5-(甲氧基甲氧基)吡啶-4-基)乙酮(22g,84.6mmol)在二噁烷(300ml)中的搅拌溶液中加入hcl/二噁烷(4mol/l,64ml,254mmol)。在温度下搅拌过夜后，将反应混合物用4nnaoh中和至ph7-8，并用ea萃取。分离层，并将有机层用盐水洗涤，经na2so4干燥并浓缩以得到标题化合物(16.4g,90%产率)。lcms(esi)m/zc7h6brno2的计算值：214.96.实测值：216.06/218.07(m/m+2)+。
6'-溴-4'-氧代-3',4'-二氢螺[哌啶-4,2'-吡喃并[2,3-c]吡啶]-1-甲酸乙酯的制备
在室温下向1-(2-溴-5-羟基吡啶-4-基)乙-1-酮(16g,74.8mmol)在甲醇(300ml)中的搅拌溶液中加入吡咯烷(9g,126mmol)和4-氧代哌啶-1-甲酸乙酯(16.6g,96.9mmol)，并将其加热至80℃。搅拌14小时后，将所得混合物在etoac和h2o之间分配。分离层，并将有机层用盐水洗涤，经na2so4干燥并浓缩以得到粗产物，将其通过快速色谱(硅胶,0-50%etoac/pe)纯化以得到标题化合物(24g,87%产率)。lcms(esi)m/zc15h17brn2o4的计算值：368.04.实测值：369.10/371.10(m/m+2)+。
(s)-6'-溴-4'-(((s)-叔丁基亚磺酰基)氨基)-3',4'-二氢螺[哌啶-4,2'-吡喃并[2,3-c]吡啶]-1-甲酸乙酯的制备
向6'-溴-4'-氧代-3',4'-二氢螺[哌啶-4,2'-吡喃并[2,3-c]吡啶]-1-甲酸酯(14g,37.9mmol)和(s)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(9.2g,75.9mmol)在thf(300ml)中的搅拌溶液中加入ti(oet)4(26g,113.9mmol)。将所得混合物在80℃在氮气气氛下加热。20小时后，将溶液冷却至室温，然后冷却至-35℃。将溶液用nabh4(7.2g,190mmol)处理，并将其在-35℃下搅拌30分钟。然后使混合物温热至-20℃并在此温度下搅拌过夜。lcms表明亚胺中间体完全转化为所需的胺产物，该胺产物为非对映异构体的92:8混合物。将浑浊的溶液冷却至0℃，并通过缓慢加入meoh淬灭直至气体逸出停止。所得混合物用饱和盐水溶液处理以得到浓稠的浅黄色悬浮液。通过经由中度烧结漏斗过滤除去固体。将滤液用饱和盐水(1x)洗涤，经na2so4干燥，并在减压下浓缩。残余物通过快速色谱(硅胶,0-30%etoac/dcm)纯化以得到标题化合物(5.7g,32%产率)。lcms(esi)m/zc19h28brn3o4s的计算值：473.10.实测值：474.22/476.23(m/m+2)+。
(s)-4'-氨基-6'-溴-3',4'-二氢螺[哌啶-4,2'-吡喃并[2,3-c]吡啶]-1-甲酸乙酯的制备
向(s)-6'-溴-4'-(((s)-叔丁基亚磺酰基)氨基)-3',4'-二氢螺[哌啶-4,2'-吡喃并[2,3-c]吡啶]-1-甲酸乙酯(5.7g,12.0mmol)在meoh(50ml)中的搅拌溶液中逐滴加入hcl/二噁烷(4mol/l,6ml,24.0mmol)。然后使溶液温热至室温。3小时后，将溶液在减压下浓缩至干。将残余物重新溶解在meoh中，并再次浓缩至干以得到为棕褐色固体的标题化合物(4.5g,100%产率)。lcms(esi)m/zc15h20brn3o3的计算值：369.07.实测值：370.10/372.11(m/m+2)+。
(s)-6'-溴-4'-(1h-吲唑-7-甲酰胺基)-3',4'-二氢螺[哌啶-4,2'-吡喃并[2,3-c]吡啶]-1-甲酸乙酯的制备
向(s)-4'-氨基-6'-溴-3',4'-二氢螺[哌啶-4,2'-吡喃并[2,3-c]吡啶]-1-甲酸乙酯(4.5g,11.1mmol)和1h-吲唑-7-甲酸(1.93g,11.9mmol)在dmf(100ml)中的搅拌溶液中加入dipea(8ml,44.4mmol)，然后加入hatu(5g,13.1mmol)。在室温下搅拌3小时后，将反应混合物在etoac和饱和nahco3水溶液之间分配。分离层，并将有机层用盐水洗涤，经na2so4干燥并浓缩以得到粗产物，将其通过快速色谱(硅胶,0-60%etoac/pe)纯化以得到标题化合物(3.9g,64%产率)。1hnmr(400mhz,cdcl3)δ11.90(br,1h),8.14(s,1h),8.04-7.96(m,2h),7.72(d,j=6.8hz,1h),7.40(s,1h),7.22(t,j=7.7hz,1h),6.92(br,1h),5.73-5.63(m,1h),4.14(q,j=7.1hz,2h),4.05-3.88(m,2h),3.43-3.28(m,1h),3.19-3.04(m,1h),2.41-2.32(m,1h),1.96-1.88(m,2h),1.79-1.63(m,3h),1.27(t,j=7.1hz,3h).lcms(esi)m/zc23h24brn5o4的计算值：513.10.实测值：514.18/516.17(m/m+2)+。
(s)-6'-溴-4'-(2-(((二叔丁氧基磷酰基)氧基)甲基)-2h-吲唑-7-甲酰胺基)-3',4'-二氢螺[哌啶-4,2'-吡喃并[2,3-c]吡啶]-1-甲酸乙酯的制备
向(s)-6'-溴-4'-(1h-吲唑-7-甲酰胺基)-3',4'-二氢螺[哌啶-4,2'-吡喃并[2,3-c]吡啶]-1-甲酸乙酯(800mg,1.55mmol)、cs2co3(1.52g,4.66mmol)和nai(255mg,1.70mmol)在dmf(20ml)中的搅拌悬浮液中加入二-叔丁基氯甲基磷酸酯(604mg,2.34mmol)。在55℃下搅拌5小时后，将所得混合物在etoac和水之间分配。将有机层分离，并用饱和nacl水溶液(2x)洗涤，经na2so4干燥，并在减压下浓缩至干以得到为黄色胶状物的标题化合物(1.25g,100%产率)。lcms(esi)m/zc32h43brn5o8p的计算值：735.20.实测值：736.40/738.36(m/m+2)+。
(s)-6'-溴-4'-(2-((膦酸氧基)甲基)-2h-吲唑-7-甲酰胺基)-3',4'-二氢螺[哌啶-4,2'-吡喃并[2,3-c]吡啶]-1-甲酸乙酯的制备
向(s)-6'-溴-4'-(2-(((二叔丁氧基磷酰基)氧基)甲基)-2h-吲唑-7-甲酰胺基)-3',4'-二氢螺[哌啶-4,2'-吡喃并[2,3-c]吡啶]-1-甲酸乙酯(1.25g,1.70mmol)在dcm(12ml)中的搅拌溶液中加入hcl/二噁烷(4mol/l,4.2ml,16.98mmol)。在25℃下搅拌2小时后，将所得混合物在减压下浓缩，以得到残余物，将其通过glison(c18,20-100%mecn/h2o)纯化以得到标题化合物(530mg,50%产率)。1hnmr(400mhz,dmso)δ9.45(d,j=8.1hz,1h),8.77(s,1h),8.15-8.00(m,3h),7.42(s,1h),7.29(dd,j=8.3,7.1hz,1h),6.20-6.07(m,2h),5.48-5.39(m,1h),4.05(q,j=7.0hz,2h),3.94-3.39(m,4h),3.36-3.28(m,1h),3.16-3.07(m,1h),2.38-2.30(m,1h),2.17-2.08(m,1h),1.90-1.75(m,3h),1.71-1.63(m,1h),1.19(t,j=7.1hz,3h).lcms(esi)m/zc24h27brn5o8p的计算值：623.08.实测值：624.20/626.20(m/m+2)+。
实施例59
(s)-6-溴-4-(3-(羟基甲基)-1h-吲唑-7-甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯的制备
将(s)-6-溴-4-(1h-吲唑-7-甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯(1.0g,1.95mmol)、cs2co3(952mg,2.92mmol)和37%福尔马林(5ml)在乙醇(19ml)和thf(1ml)中的悬浮液在85℃下搅拌5天。冷却至室温后，将所得反应混合物在乙酸乙酯和h2o之间分配。有机层用盐水洗涤，经na2so4干燥并在减压下浓缩以得到粗产物，将其通过制备型hplc(c18,30-100%mecn/h2o(含0.5%甲酸))纯化以得到为白色固体的标题化合物(300mg,28%产率)。1hnmr(400mhz,dmso)δ12.94(s,1h),9.07(d,j=8.0hz,1h),8.08(d,j=7.9hz,1h),7.97(d,j=7.2hz,1h),7.41-7.29(m,2h),7.20(t,j=7.6hz,1h),6.87(d,j=8.4hz,1h),5.52-5.43(m,1h),5.31(s,1h),4.83(s,2h),4.05(q,j=7.0hz,2h),3.87-3.73(m,2h),3.32-3.19(m,1h),3.14-3.00(m,1h),2.28-2.17(m,1h),2.07-1.98(m,1h),1.87-1.70(m,3h),1.67-1.58(m,1h),1.19(t,j=7.1hz,3h).lcms(esi)m/zc25h27brn4o5的计算值：542.12.实测值：543.36/545.36(m/m+2)+。
实施例60
(s)-4-((7-((6-溴-1'-(乙氧基羰基)螺[色满-2,4'-哌啶]-4-基)氨基甲酰基)-1h-吲唑-3-基)甲氧基)-4-氧代丁酸的制备
在0℃下，向(s)-6-溴-4-(3-(羟基甲基)-1h-吲唑-7-甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯(80mg,0.147mmol)和dmap(5mg,0.04mmol)在吡啶(1ml)中的搅拌溶液中加入二氢呋喃-2,5-二酮(73mg,0.736mmol)，并将其在室温搅拌过夜。在减压下浓缩反应混合物以得到粗产物，将其通过制备型hplc(c18,20-100%mecn/h2o(含0.5%甲酸))纯化以得到为白色固体的标题化合物(28mg,29%)。1hnmr(400mhz,dmso)δ13.25(s,1h),12.29(br,1h),9.09(d,j=8.5hz,1h),8.04-7.96(m,2h),7.37-7.30(m,2h),7.25(t,j=7.7hz,1h),6.87(d,j=8.5hz,1h),5.49-5.38(m,3h),4.05(q,j=7.0hz,2h),3.85-3.73(m,2h),3.29-3.23(m,1h),3.11-3.03(m,1h),2.60-2.53(m,2h),2.49-2.46(m,2h),2.25-2.19(m,1h),2.05-1.98(m,1h),1.86-1.72(m,3h),1.66-1.59(m,1h),1.19(t,j=7.1hz,3h).lcms(esi)m/zc29h31brn4o8的计算值：642.13.实测值：643.29/645.24(m/m+2)+。
实施例61
(s)-4-(3-(乙酰氧基甲基)-1h-吲唑-7-甲酰胺基)-6-溴螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯的制备
在0℃下，向(s)-6-溴-4-(3-(羟基甲基)-1h-吲唑-7-甲酰胺基)螺[色满-2,4'-哌啶]-1'-甲酸乙酯(86mg,0.158mmol)、tea(0.65ml,0.474mmol)和dmap(7.0mg,0.057mmol)在干燥dmf(1ml)中的溶液中逐滴加入乙酰氯(15mg,1.9mmol)。在室温搅拌过夜后，将混合物在减压下浓缩以得到粗产物，将其通过制备型hplc(c18,30-100%mecn/h2o(含0.5%甲酸))纯化以得到为白色固体的标题化合物(20mg,21%)。1hnmr(400mhz,dmso)δ13.26(s,1h),9.09(d,j=7.9hz,1h),8.01(dd,j=15.6,7.6hz,2h),7.38-7.31(m,2h),7.25(t,j=7.7hz,1h),6.87(d,j=8.6hz,1h),5.51-5.38(m,3h),4.05(q,j=7.1hz,2h),3.86-3.74(m,2h),3.30-3.25(m,1h),3.13-3.05(m,1h),2.25-2.19(m,1h),2.08-1.98(m,4h),1.86-1.72(m,3h),1.66-1.58(m,1h),1.19(t,j=7.1hz,3h).lcms(esi)m/zc27h29brn4o6的计算值：584.13.实测值：585.32/587.31(m/m+2)+。
pbmcido1测定：
数据显示于表1中。通过高通量细胞测定，利用犬尿氨酸(通过质谱)和细胞毒性的检测作为终点对本发明的化合物进行测试。为了进行质谱和细胞毒性测定，用人干扰素-γ(ifn-γ)(sigma-aldrichcorporation,st.louis,mo)和来自明尼苏达沙门菌(salmonellaminnesota)的脂多糖(lps)(invivogen,sandiego,ca)刺激人外周血单核细胞(pbmc)(pb003f;allcells®,alameda,ca)以诱导吲哚胺2,3-双加氧酶(ido1)的表达。具有ido1抑制特性的化合物减少了细胞通过色氨酸分解代谢途径产生的犬尿氨酸的量。使用celltiter-glo®试剂(ctg)(promegacorporation,madison,wi)(其基于atp的发光检测，atp是代谢活性细胞的指示剂)测量由于化合物处理的作用导致的细胞毒性。
在测定准备中，将测试化合物在dmso中从5mm的典型最高浓度3倍连续稀释，并以0.5μl铺板在384孔聚苯乙烯透明底部组织培养处理的带盖板(greinerbio-one,kremsmünster,austria)中以生成11点剂量响应曲线。低对照孔(0%犬尿氨酸或100%细胞毒性)在存在未刺激的(-ifn-γ/-lps)pbmc的情况下含有0.5μldmso(用于质谱测定)或者在没有细胞的情况下含有0.5μldmso(用于细胞毒性测定)，并且高对照孔(100%犬尿氨酸或0%细胞毒性)在存在刺激的(+ifn-γ/+lps)pbmc的情况下含有0.5μldmso(用于质谱和细胞毒性测定二者)。
洗涤pbmc的冷冻原液，并在补充了10%v/v热灭活的胎牛血清(fbs)(thermofisherscientific,inc.,waltham,ma)和1x青霉素-链霉素抗生素溶液(thermofisherscientific,inc.,waltham,ma)的rpmi1640培养基(thermofisherscientific,inc.,waltham,ma)中回收。在补充的rpmi1640培养基中将细胞稀释至1,000,000个细胞/ml。将50μl的细胞悬液(用于质谱测定)或单独的培养基(用于细胞毒性测定)添加到先前制备的384孔化合物板上的低对照孔中，分别产生50,000个细胞/孔或0个细胞/孔。将ifn-γ和lps分别以100ng/ml和50ng/ml的终浓度添加到剩余的细胞悬液中，并且将50μl的刺激的细胞添加到384孔化合物板上的所有剩余的孔中。然后将带盖板置于37℃、5%co2的增湿培养箱中保持2天。
温育后，将384孔板从培养箱中移出并使其平衡至室温保持30分钟。对于细胞毒性测定，根据制造商的指示制备celltiter-glo®，并向每个板孔中添加40μl。在室温下温育20分钟后，在envision®multilabelreader(perkinelmerinc.,waltham,ma)上读取发光。对于质谱测定，在384孔聚丙烯v形底板(greinerbio-one,kremsmünster,austria)中，将来自化合物处理的板的每个孔的10μl上清液添加到40μl乙腈(含有10μm内标以进行归一化)中以提取有机分析物。在以2000rpm离心10分钟后，将来自乙腈提取板的每孔的10μl添加到384孔聚丙烯v形底板中的90μl无菌蒸馏水中，以在rapidfire300(agilenttechnologies,santaclara,ca)和4000qtrapms(sciex,framingham,ma)上分析犬尿氨酸和内标。使用agilenttechnologies的rapidfireintegrator软件对ms数据进行积分，并对数据进行了归一化以作为犬尿氨酸与内标的比进行分析。
在使用公式100-(100*((u-c2)/(c1-c2)))(其中u是未知值，c1是高(100%犬尿氨酸；0%抑制)对照孔的平均值并且c2是低(0%犬尿氨酸；100%抑制)对照孔的平均值)归一化后，将质谱测定中的剂量响应的数据标绘为ido1抑制百分比与化合物浓度的关系。在使用公式100-(100*((u-c2)/(c1-c2)))(其中u是未知值，c1是高(0%细胞毒性)对照孔的平均值并且c2是低(100%细胞毒性)对照孔的平均值)归一化后，将细胞毒性测定中的剂量响应的数据标绘为细胞毒性百分比与化合物浓度的关系。
使用方程y=a+((b-a)/(1+(10x/10c)d))(其中a是最小响应，b是最大响应，c是log(xc50)并且d是希尔斜率(hillslope))进行曲线拟合。将每种测试化合物的结果记录为质谱测定的pic50值和细胞毒性测定的pcc50值(上面的方程中的-c)。