本发明涉及一种抗体-药物缀合物的药物-连接物中间体的改进制备方法，以及一种抗体-药物缀合物的改进制备方法，其中使用上述方法。
背景技术：
具有与抗体(该抗体的抗原在癌细胞表面表达，并且该抗体还与能够细胞内在化的抗原结合，且因此可以将药物选择性地递送至癌细胞)缀合的有细胞毒性的药物的抗体-药物缀合物(adc)因此期望使药物在癌细胞内积聚并杀死癌细胞(非专利文献1至5)。
作为一种这样的抗体-药物缀合物，已知包含抗体和依喜替康(为拓扑异构酶i抑制剂)作为其组分的抗体-药物缀合物(专利文献1至5和非专利文献6、7)。由于这些抗体-药物缀合物发挥了优异的抗肿瘤作用和安全性，因此它们目前正在临床研究中。
作为用于制备上述抗体-药物缀合物的药物-连接物中间体的制备方法，已知专利文献1至4中描述的方法。
引用列表
专利文献
专利文献1:国际公开号wo2014/057687
专利文献2:国际公开号wo2015/098099
专利文献3:国际公开号wo2015/115091
专利文献4:国际公开号wo2015/155998
专利文献5:国际公开号wo2018/135501
非专利文献
非专利文献1:ducry,l.等人,bioconjugatechem.(2010)21,5-13.
非专利文献2:alley,s.c.等人,currentopinioninchemicalbiology(2010)14,529-537.
非专利文献3:damlen.k.expertopin.biol.ther.(2004)4,1445-1452.
非专利文献4:senterp.d.等人,naturebiotechnology(2012)30,631-637.
非专利文献5:howarda.等人,jclinoncol29:398-405.
非专利文献6:ogitaniy.等人,clinicalcancerresearch(2016)22(20),5097-5108.
非专利文献7:ogitaniy.等人,cancerscience(2016)107,1039-1046。
发明概述
技术问题
用于制备本发明的抗体-药物缀合物的药物-连接物中间体是由式(1)表示的化合物：
[化1]
作为制备由式(1)表示的化合物的方法，专利文献1-4中描述的方法是已知的。然而，尚不知道可以以晶体形式获得由式(1)表示的化合物，并且需要进行复杂的操作，例如必须通过色谱法进行纯化。因此需要开发工业上更好的制备方法。
本发明的一个目的是找到一种用于制备药物-连接物中间体的改进的、工业上优异的、无需通过色谱法纯化的方法。本发明的另一个目的是构建一种制备抗体-药物缀合物的改进方法，其中使用上述用于制备药物-连接物中间体的改进方法。
问题的解决方案
本发明人对用于制备药物-连接物中间体的方法进行了勤奋研究，结果令人惊奇地发现，可以获得晶体形式的由式(1)表示的化合物。本发明人还改进了由式(1)表示的化合物的制备方法，并且因此发现了无需通过色谱法纯化的工业上优异的制备方法。本发明人进一步构建了通过使用由式(1)表示的化合物的晶体制备抗体-药物缀合物的改进方法，并完成了本发明。
具体地，本发明涉及以下内容。
[1]由式(1)表示的化合物的晶体：
[化2]
[2]根据[1]的晶体，其中所述晶体在通过用铜kα辐射照射获得的粉末x射线衍射中在衍射角(2θ)为5.6±0.2º、15.5±0.2º和22.0±0.2º处显示主峰。
[3]由式(1)表示的化合物的晶体的制备方法：
[化3]
包括以下步骤：制备其中溶解有由式(1)表示的化合物的溶液；然后从溶液中沉淀出式(1)表示的化合物的晶体。
[4]根据[3]的制备方法，其中所述由式(1)表示的化合物的晶体在通过用铜kα辐射照射获得的粉末x射线衍射中在衍射角(2θ)为5.6±0.2º、15.5±0.2º和22.0±0.2º处显示主峰。
[5]根据[3]或[4]的制备方法，其中所述溶解有由式(1)表示的化合物的溶液包含低级酮和低级醇作为溶剂。
[6]根据[5]的制备方法，其中所述低级酮是丙酮。
[7]根据[5]的制备方法，其中所述低级酮是甲基乙基酮。
[8]根据[5]至[7]中任一项的制备方法，其中所述低级醇是1-丙醇。
[9]根据[5]至[7]中任一项的制备方法，其中所述低级醇是2-丁醇。
[10]根据[3]至[9]中任一项的制备方法，包括添加由式(1)表示的化合物的晶体的晶种的步骤。
[11]根据[3]至[10]中任一项的制备方法，其中所述由式(1)表示的化合物通过制备方法(i)制备，
其中所述制备方法(i)是包括以下步骤的制备方法：
使由式(b)表示的化合物的氨基和羧基的保护基脱保护：
[化4]
其中r1表示被保护基保护的氨基，且r2表示被保护基保护的羧基，
以将其转化为由式(8)表示的化合物：
[化5]
然后
使由式(8)表示的化合物与由式(c)表示的化合物缩合：
[化6]
其中x表示活性酯基或羧基，
以将其转化为由式(10)表示的化合物：
[化7]
然后
使由式(10)表示的化合物与由式(11)表示的化合物缩合以将其转化为由式(1)表示的化合物：
[化8]
[化9]
[12]根据[3]至[10]中任一项的制备方法，其中所述由式(1)表示的化合物通过制备方法(ii)制备，
其中所述制备方法(ii)是包括以下步骤的制备方法：
使由式(b)表示的化合物的氨基的保护基脱保护：
[化10]
其中r1表示被保护基保护的氨基，且r2表示被保护基保护的羧基，
以将其转化为由式(d)表示的化合物：
[化11]
其中r2表示与上述相同的含义；然后
使由式(d)表示的化合物与由式(c)表示的化合物缩合：
[化12]
其中x表示活性酯基或羧基，
以将其转化为由式(e)表示的化合物：
[化13]
其中r2表示与上述相同的含义；然后
使由式(e)表示的化合物的羧基的保护基脱保护以将其转化为由式(10)表示的化合物：
[化14]
然后
使由式(10)表示的化合物与由式(11)表示的化合物缩合以将其转化为由式(1)表示的化合物：
[化15]
[化16]
[13]根据[11]或[12]的制备方法，其包括以下步骤：将由式(10)表示的化合物溶解在含有1,2-二甲氧基乙烷的溶剂中；然后沉淀由式(10)表示的化合物的1,2-二甲氧基乙烷加合物的晶体。
[14]根据[13]的制备方法，其中所述由式(10)表示的化合物的1,2-二甲氧基乙烷加合物的晶体在通过用铜kα辐射照射获得的粉末x射线衍射中在衍射角(2θ)为19.0±0.2º和25.0±0.2º处显示主峰。
[15]根据[11]至[14]中任一项的制备方法，其中所述使由式(10)表示的化合物和由式(11)表示的化合物缩合以将其转化为由式(1)表示的化合物的步骤是在硫酸钠水溶液和四氢呋喃的两相体系中进行的。
[16]根据[3]至[10]中任一项的制备方法，其中所述由式(1)表示的化合物通过制备方法(iii)制备，
其中所述制备方法(iii)是包括以下步骤的制备方法：
使由式(b)表示的化合物的羧基的保护基脱保护：
[化17]
其中r1表示被保护基保护的氨基，且r2表示被保护基保护的羧基，
以将其转化为由式(f)表示的化合物：
[化18]
其中r1表示与上述相同的含义；然后
使由式(f)表示的化合物与由式(11)表示的化合物缩合以将其转化为由式(g)表示的化合物：
[化19]
[化20]
其中r1表示与上述相同的含义；然后
使由式(g)表示的化合物的氨基的保护基脱保护以将其转化为由式(16)表示的化合物：
[化21]
然后
使由式(16)表示的化合物与由式(c)表示的化合物缩合：
[化22]
其中x表示活性酯基或羧基，
以将其转化为由式(1)表示的化合物：
[化23]
[17]根据[11]至[16]中任一项的制备方法，其中所述由式(11)表示的化合物为甲磺酸盐的形式。
[18]根据[11]至[16]中任一项的制备方法，其中所述由式(11)表示的化合物为甲磺酸盐m-水合物的形式，其中m范围为0至3。
[19]根据[11]至[16]中任一项的制备方法，其中所述由式(11)表示的化合物为甲磺酸盐无水物的形式。
[20]根据[11]至[16]中任一项的制备方法，其中所述由式(11)表示的化合物为甲磺酸盐一水合物的形式。
[21]根据[11]至[16]中任一项的制备方法，其中所述由式(11)表示的化合物为甲磺酸盐二水合物的形式。
[22]根据[11]至[16]中任一项的制备方法，其中所述由式(11)表示的化合物为甲磺酸盐三水合物的形式。
[23]根据[11]至[22]中任一项的制备方法，其中所述由式(b)表示的化合物通过制备方法(iv)制备，
其中所述制备方法(iv)是包括以下步骤的制备方法：
使由式(h)表示的化合物与四乙酸铅反应：
[化24]
其中r3表示被保护基保护的氨基，
以将其转化为由式(j)表示的化合物：
[化25]
其中r3表示与上述相同的含义；然后
使由式(j)表示的化合物与由式(k)表示的化合物在酸或碱的存在下反应：
[化26]
其中r2表示与根据权利要求11-22中任一项的r2相同的含义，
以将其转化为由式(l)表示的化合物：
[化27]
其中r2和r3表示与上述相同的含义；然后
使由式(l)表示的化合物的氨基的保护基脱保护以将其转化为由式(m)表示的化合物：
[化28]
其中r2表示与上述相同的含义；然后
使由式(m)表示的化合物与由式(n)表示的化合物缩合：
[化29]
其中r1表示与根据[11]-[22]中任一项的r1相同的含义，
以将其转化为由式(b)表示的化合物：
[化30]
其中r1和r2表示与上述相同的含义。
[24]根据[23]的制备方法，其中所述使由式(h)表示的化合物与四乙酸铅反应以将其转化为由式(j)表示的化合物的步骤在乙酸的存在下进行。
[25]根据[23]或[24]的制备方法，其中所述使由式(j)表示的化合物与由式(k)表示的化合物反应以将其转化为由式(l)表示的化合物的步骤在氢氧化钠水溶液的存在下进行。
[26]根据[23]或[24]的制备方法，其中所述使由式(j)表示的化合物与由式(k)表示的化合物反应以将其转化为由式(l)表示的化合物的步骤在三(五氟苯基)硼烷的存在下进行。
[27]根据[23]至[26]中任一项的制备方法，其包括在使由式(l)表示的化合物的氨基的保护基脱保护以将其转化为由式(m)表示的化合物的步骤之后，加入酸以沉淀由式(m)表示的化合物和酸的盐的步骤。
[28]根据[27]的制备方法，其中所述酸是1-羟基苯并三唑。
[29]根据[11]至[28]中任一项的制备方法，其中r1是被苄氧羰基保护的氨基。
[30]根据[11]至[28]中任一项的制备方法，其中r1是被(9h-芴-9-基甲氧基)羰基保护的氨基。
[31]根据[11]至[30]中任一项的制备方法，其中r2是被苄基保护的羧基。
[32]根据[23]至[31]中任一项的制备方法，其中r3是被(9h-芴-9-基甲氧基)羰基保护的氨基。
[33]根据[11]至[32]中任一项的制备方法，其中x是(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基羰基。
[34]根据[3]至[10]中任一项的制备方法，其中由式(1)表示的化合物通过制备方法(v)制备，
其中所述制备方法(v)是包括以下步骤的制备方法：
使由式(2)表示的化合物与四乙酸铅反应：
[化31]
以将其转化为由式(3)表示的化合物：
[化32]
然后
使由式(3)表示的化合物与乙醇酸苄酯在酸或碱的存在下反应，以将其转化为由式(4)表示的化合物：
[化33]
然后
使由式(4)表示的化合物的氨基的保护基脱保护以将其转化为由式(5)表示的化合物：
[化34]
然后
使由式(5)表示的化合物与由式(6)表示的化合物缩合：
[化35]
以将其转化为由式(7)表示的化合物：
[化36]
然后
使由式(7)表示的化合物的氨基和羧基的保护基脱保护以将其转化为由式(8)表示的化合物：
[化37]
然后
使由式(8)表示的化合物与由式(9)表示的化合物缩合：
[化38]
以将其转化为由式(10)表示的化合物：
[化39]
然后
使由式(10)表示的化合物与由式(11)表示的化合物缩合：
[化40]
以将其转化为由式(1)表示的化合物：
[化41]
[35]根据[34]的制备方法，其包括以下步骤：将由式(10)表示的化合物溶解在含有1,2-二甲氧基乙烷的溶剂中；然后沉淀由式(10)表示的化合物的1,2-二甲氧基乙烷加合物的晶体。
[36]根据[35]的制备方法，其中所述由式(10)表示的化合物的1,2-二甲氧基乙烷加合物的晶体在通过用铜kα辐射照射获得的粉末x射线衍射中在衍射角(2θ)为19.0±0.2º和25.0±0.2º处显示主峰。
[37]根据[34]至[36]中任一项的制备方法，其中所述使由式(10)表示的化合物与由式(11)表示的化合物缩合以将其转化为由式(1)表示的化合物的步骤是在硫酸钠水溶液和四氢呋喃的两相体系中进行的。
[38]根据[3]至[10]中任一项的制备方法，其中所述由式(1)表示的化合物通过制备方法(vi)制备，
其中所述制备方法(vi)是包括以下步骤的制备方法：
使由式(2)表示的化合物与四乙酸铅反应：
[化42]
以将其转化为由式(3)表示的化合物：
[化43]
然后
使由式(3)表示的化合物与乙醇酸苄酯在酸或碱的存在下反应，以将其转化为由式(4)表示的化合物：
[化44]
然后
使由式(4)表示的化合物的氨基的保护基脱保护以将其转化为由式(5)表示的化合物：
[化45]
然后
使由式(5)表示的化合物与由式(12)表示的化合物缩合：
[化46]
以将其转化为由式(13)表示的化合物：
[化47]
然后
使由式(13)表示的化合物的羧基的保护基脱保护，以将其转化为由式(14)表示的化合物：
[化48]
然后
使由式(14)表示的化合物与由式(11)表示的化合物缩合：
[化49]
以将其转化为由式(15)表示的化合物：
[化50]
然后
使由式(15)表示的化合物的氨基的保护基脱保护以将其转化为由式(16)表示的化合物：
[化51]
然后
使由式(16)表示的化合物与由式(9)表示的化合物缩合：
[化52]
以将其转化为由式(1)表示的化合物：
[化53]
[39]根据[34]至[38]中任一项的制备方法，其中所述使由式(2)表示的化合物与四乙酸铅反应以将其转化为由式(3)表示的化合物的步骤在乙酸的存在下进行。
[40]根据[34]至[39]中任一项的制备方法，其中所述使由式(3)表示的化合物转化为由式(4)表示的化合物的步骤在氢氧化钠水溶液的存在下进行。
[41]根据[34]至[39]中任一项的制备方法，其中所述使由式(3)表示的化合物转化为由式(4)表示的化合物的步骤在三(五氟苯基)硼烷的存在下进行。
[42]根据[34]至[41]中任一项的制备方法，其包括在使由式(4)表示的化合物的氨基的保护基脱保护以将其转化为由式(5)表示的化合物的步骤之后，加入酸以沉淀由式(5)表示的化合物和酸的盐的步骤。
[43]根据[42]的制备方法，其中所述酸是1-羟基苯并三唑。
[44]根据[34]至[43]中任一项的制备方法，其中所述由式(6)表示的化合物通过包括以下步骤的方法制备：
使由式(23)表示的化合物与n-羟基琥珀酰亚胺缩合：
[化54]
以将其转化为由式(24)表示的化合物：
[化55]
然后
使由式(24)表示的化合物与l-苯丙氨酸缩合，以将其转化为由式(6)表示的化合物。
[45]根据[34]至[44]中任一项的制备方法，其中所述由式(9)表示的化合物通过包括以下步骤的方法制备：
使由式(17)表示的化合物与马来酸酐反应：
[化56]
以将其转化为由式(18)表示的化合物：
[化57]
然后
向由式(18)表示的化合物和含有n-羟基琥珀酰亚胺和2,6-二甲基吡啶的混合溶液中加入亚硫酰氯以将其转化为由式(9)表示的化合物。
[46]根据[34]至[45]中任一项的制备方法，其中所述由式(11)表示的化合物为甲磺酸盐的形式。
[47]根据[34]至[45]中任一项的制备方法，其中所述由式(11)表示的化合物为甲磺酸盐m-水合物的形式，其中m范围为0至3。
[48]根据[34]至[45]中任一项的制备方法，其中所述由式(11)表示的化合物为甲磺酸盐无水物的形式。
[49]根据[34]至[45]中任一项的制备方法，其中所述由式(11)表示的化合物为甲磺酸盐一水合物的形式。
[50]根据[34]至[45]中任一项的制备方法，其中所述由式(11)表示的化合物为甲磺酸盐二水合物的形式。
[51]根据[34]至[45]中任一项的制备方法，其中所述由式(11)表示的化合物为甲磺酸盐三水合物的形式。
[52]由式(j)表示的化合物的制备方法，其包括以下步骤：
使由式(h)表示的化合物与四乙酸铅在乙酸的存在下反应：
[化58]
其中r3表示被保护基保护的氨基，
以将其转化为由式(j)表示的化合物：
[化59]
其中r3表示与上述相同的含义。
[53]根据[52]的制备方法，其中r3是被(9h-芴-9-基甲氧基)羰基保护的氨基。
[54]由式(l)表示的化合物的制备方法，其包括以下步骤：
使由式(j)表示的化合物与由式(k)表示的化合物在氢氧化钠水溶液或三(五氟苯基)硼烷的存在下反应：
[化60]
其中r3表示被保护基保护的氨基：
[化61]
其中r2表示被保护基保护的羧基，
以将其转化为由式(l)表示的化合物：
[化62]
其中r2和r3表示与上述相同的含义。
[55]根据[54]的制备方法，其中所述反应在氢氧化钠水溶液的存在下进行。
[56]根据[54]的制备方法，其中所述反应在三(五氟苯基)硼烷的存在下进行。
[57]根据[54]至[56]中任一项的制备方法，其中r2是被苄基保护的羧基。
[58]根据[54]至[57]中任一项的制备方法，其中r3是被(9h-芴-9-基甲氧基)羰基保护的氨基。
[59]由式(m)表示的化合物和酸的盐的制备方法，其包括以下步骤：
使由式(l)表示的化合物的氨基的保护基脱保护：
[化63]
其中r2表示被保护基保护的羧基，且r3表示被保护基保护的氨基，
以将其转化为由式(m)表示的化合物：
[化64]
其中r2表示与上述相同的含义;然后加入酸以沉淀由式(m)表示的化合物和酸的盐。
[60]根据[59]的制备方法，其中所述酸是1-羟基苯并三唑。
[61]根据[59]或[60]的制备方法，其中r2是被苄基保护的羧基。
[62]根据[59]至[61]中任一项的制备方法，其中r3是被(9h-芴-9-基甲氧基)羰基保护的氨基。
[63]由式(9)表示的化合物的制备方法，其包括以下步骤：
向由式(18)表示的化合物和含有n-羟基琥珀酰亚胺和2,6-二甲基吡啶的混合溶液中加入亚硫酰氯
[化65]
以将其转化为由式(9)表示的化合物：
[化66]
[64]根据[63]的制备方法，其中所述由式(18)表示的化合物通过包括以下步骤的方法制备：
使由式(17)表示的化合物与马来酸酐反应：
[化67]
[65]由式(10)表示的化合物的1,2-二甲氧基乙烷加合物的晶体的制备方法，其包括以下步骤：将由式(10)表示的化合物溶解在含有1,2-二甲氧基乙烷的溶剂中：
[化68]
然后沉淀由式(10)表示的化合物的1,2-二甲氧基乙烷加合物的晶体。
[66]根据[65]的制备方法，其中所述由式(10)表示的化合物的1,2-二甲氧基乙烷加合物的晶体在通过用铜kα辐射照射获得的粉末x射线衍射中在衍射角(2θ)为19.0±0.2º和25.0±0.2º处显示峰。
[67]由式(1)表示的化合物的制备方法，其包括以下步骤：使由式(10)表示的化合物：
[化69]
与由式(11)表示的化合物在硫酸钠水溶液和四氢呋喃的两相体系中缩合：
[化70]
以将其转化为由式(1)表示的化合物：
[化71]
[68]根据[67]的制备方法，其中所述由式(11)表示的化合物为甲磺酸盐的形式。
[69]根据[67]的制备方法，其中所述由式(11)表示的化合物为甲磺酸盐m-水合物的形式，其中m范围为0至3。
[70]根据[67]的制备方法，其中所述由式(11)表示的化合物为甲磺酸盐无水物的形式。
[71]根据[67]的制备方法，其中所述由式(11)表示的化合物为甲磺酸盐一水合物的形式。
[72]根据[67]的制备方法，其中所述由式(11)表示的化合物为甲磺酸盐二水合物的形式。
[73]根据[67]的制备方法，其中所述由式(11)表示的化合物为甲磺酸盐三水合物的形式。
[74]根据[3]至[73]中任一项的制备方法，其中不使用色谱法。
[75]由式(10)表示的化合物的1,2-二甲氧基乙烷加合物的晶体：
[化72]
[76]根据[75]的晶体，其中所述晶体在通过用铜kα辐射照射获得的粉末x射线衍射中在衍射角(2θ)为19.0±0.2º和25.0±0.2º处显示主峰。
[77]由式(5)表示的化合物和酸的盐：
[化73]
[78]根据[77]的盐，其中所述酸为1-羟基苯并三唑。
[79]抗体-药物缀合物的制备方法，其中使由式(19)表示的药物-连接物通过硫醚键与抗体缀合：
[化75]
其中a表示与抗体的连接位置，
其中通过根据[3]-[51]中任一项的方法制备的由式(1)表示的化合物的晶体用作起始材料：
[化74]
并且所述方法包括以下步骤：
i)使抗体还原；然后
ii)加入其中溶解有上述方法制备的由式(1)表示的化合物的晶体的溶液，以使所述溶液与还原的抗体反应。
[80]根据[79]的制备方法，其中所述抗体是抗-her2抗体、抗-her3抗体、抗-trop2抗体、抗-b7-h3抗体或抗-gpr20抗体。
[81]根据[80]的制备方法，其中所述抗体是抗-her2抗体。
[82]根据[81]的制备方法，其中所述抗-her2抗体是包含由seqidno：1的氨基酸残基1至449组成的氨基酸序列组成的重链和由seqidno：2的氨基酸残基1至214组成的氨基酸序列组成的轻链的抗体，或者包含由seqidno：1表示的氨基酸序列组成的重链和由seqidno：2表示的氨基酸序列组成的轻链的抗体。
[83]根据[81]或[82]的制备方法，其中在所述抗体-药物缀合物中每个抗体分子缀合的药物-连接物的平均单元数范围为7至8。
[84]根据[80]的制备方法，其中所述抗体是抗-her3抗体。
[85]根据[84]的制备方法，其中所述抗-her3抗体是包含由seqidno：3表示的氨基酸序列组成的重链和由seqidno：4表示的氨基酸序列组成的轻链的抗体，或所述抗体的变体，其中所述抗体重链羧基末端的赖氨酸残基缺失。
[86]根据[84]或[85]的制备方法，其中所述抗体-药物缀合物中每个抗体分子缀合的药物-连接物的平均单元数范围为7至8。
[87]根据[80]的制备方法，其中所述抗体是抗-trop2抗体。
[88]根据[87]的制备方法，其中所述抗-trop2抗体是包含由seqidno：5的氨基酸残基20至470组成的氨基酸序列组成的重链和由seqidno：6的氨基酸残基21至234组成的氨基酸序列组成的轻链的抗体，或所述抗体的变体，其中所述抗体重链羧基末端的赖氨酸残基缺失。
[89]根据[87]或[88]的制备方法，其中所述抗体-药物缀合物中每个抗体分子缀合的药物-连接物的平均单元数范围为3至5。
[90]根据[80]的制备方法，其中所述抗体是抗-b7-h3抗体。
[91]根据[90]的制备方法，其中所述抗-b7-h3抗体是包含由seqidno：7的氨基酸残基20至471组成的氨基酸序列组成的重链和由seqidno：8的氨基酸残基21至233组成的氨基酸序列组成的轻链的抗体，或所述抗体的变体，其中所述抗体重链羧基末端的赖氨酸残基缺失。
[92]根据[90]或[91]的制备方法，其中所述抗体-药物缀合物中每个抗体分子缀合的药物-连接物的平均单元数范围为3至5。
[93]根据[80]的制备方法，其中所述抗体是抗-gpr20抗体。
[94]根据[93]的制备方法，其中所述抗-gpr20抗体是包含由seqidno：9的氨基酸残基20至472组成的氨基酸序列组成的重链和由seqidno：10的氨基酸残基21至234组成的氨基酸序列组成的轻链的抗体，或所述抗体的变体，其中所述抗体重链羧基末端的赖氨酸残基缺失。
[95]根据[93]或[94]的制备方法，其中所述抗体-药物缀合物中每个抗体分子缀合的药物-连接物的平均单元数范围为7至8。
发明的有益效果
本发明能够获得晶体形式的由式(1)表示的化合物，并且能够提供具有给定质量的由式(1)表示的化合物。本发明还可以提供工业上优异而无需通过色谱法纯化的用于制备由式(1)表示的化合物的方法。本发明可以进一步提供一种用于制备抗体-药物缀合物的改进方法，其中使用了上述方法。
附图简述
[图1]图1显示了抗-her2抗体重链的氨基酸序列(seqidno：1)。
[图2]图2显示了抗-her2抗体轻链的氨基酸序列(seqidno：2)。
[图3]图3显示了由式(10)表示的化合物的1,2-二甲氧基乙烷加合物的晶体的粉末x射线衍射。
[图4]图4显示了由式(1)表示的化合物的晶体的粉末x射线衍射。
[图5]图5显示了抗-her3抗体重链的氨基酸序列(seqidno：3)。
[图6]图6显示了抗-her3抗体轻链的氨基酸序列(seqidno：4)。
[图7]图7显示了抗-trop2抗体重链的氨基酸序列(seqidno：5)。
[图8]图8显示了抗-trop2抗体轻链的氨基酸序列(seqidno：6)。
[图9]图9显示了抗-b7-h3抗体重链的氨基酸序列(seqidno：7)。
[图10]图10显示了抗-b7-h3抗体轻链的氨基酸序列(seqidno：8)。
[图11]图11显示了抗-gpr20抗体重链的氨基酸序列(seqidno：9)。
[图12]图12显示了抗-gpr20抗体轻链的氨基酸序列(seqidno：10)。
实施方案描述
以下，参照附图描述用于实施本发明的优选方式。给出下面描述的实施方案仅用于说明本发明的典型实施方案的一个实例，而无意于限制本发明的范围。
[抗体-药物缀合物]
本发明制备的抗体-药物缀合物是抗体-药物缀合物，其中使由式(19)表示的药物-连接物通过硫醚键与抗体缀合：
[化76]
其中a表示与抗体的连接位置。
在本发明中，抗体-药物缀合物中的由连接物和药物组成的部分结构称为“药物-连接物”。药物-连接物与在抗体中的链间二硫键位点(重链之间的两个位点和重链和轻链之间的两个位点)上形成的巯基(也就是说，半胱氨酸残基的硫原子)相连。
本发明的药物-连接物包括为拓扑异构酶i抑制剂的依喜替康作为组分。依喜替康是由式(11)表示的化合物：
[化77]
并且是具有抗肿瘤作用的喜树碱衍生物。
本发明中使用的抗体-药物缀合物也可以由式(20)表示：
[化78]
其中，所述药物-连接物通过硫醚键与抗体缀合。n的含义与所谓的缀合药物分子的平均数(dar；药物-抗体比值)相同，并且表示每个抗体分子缀合的药物-连接物的平均单元数。
迁移到癌细胞中后，用于本发明的抗体-药物缀合物释放出由式(22)表示的化合物：
[化79]
从而发挥抗肿瘤作用。
推断由式(22)表示的化合物是本发明制备的抗体-药物缀合物的抗肿瘤活性的原始来源，并且已经证实具有拓扑异构酶i抑制作用(ogitaniy.等人，clinicalcancerresearch,2016,oct15;22(20):5097-5108,epub2016mar29)。
推断由式(22)表示的化合物是通过分解由式(21)表示的化合物的缩醛胺结构而形成的：
[化80]
推断其是通过在本发明制备的抗体-药物缀合物的连接物部分上裂解而形成的。
已知通过本发明制备的抗体-药物缀合物具有旁观者效应(ogitaniy.等人，cancerscience(2016)107,1039-1046)。
通过以下过程发挥旁观者效应，其中根据本发明制备的抗体-药物缀合物在表达靶标的癌细胞中被内化，然后释放的由式(22)表示的化合物也对周围存在并且不表达靶标的癌细胞发挥抗肿瘤作用。
[用于制备抗体-药物缀合物的药物-连接物中间体]
用于制备本发明的抗体-药物缀合物的药物-连接物中间体是由式(1)表示的化合物：
[化81]
根据本发明，可以获得晶体形式的由式(1)表示的化合物，并且所述晶体可以优选地用于制备本发明的抗体-药物缀合物。
由式(1)表示的化合物的晶体质量例如可以根据指标如杂质含量、残留溶剂量和外观来评价。另外，例如，其可以通过使用在25℃/60%rh或40℃/75%rh的环境中持续3个月、6个月、12个月、24个月和36个月的保存稳定性作为指标来评价。
通过这样的质量评价，也可以确认相对于由式(1)表示的无定形化合物的优越性。
本发明的制备方法包括从其中溶解有由式(1)表示的化合物的溶液中沉淀由式(1)表示的化合物的晶体，以制备由式(1)表示的化合物的晶体。结果，可以制备具有给定质量的由式(1)表示的化合物的高纯度晶体。
在用铜kα辐射照射获得的粉末x射线衍射中，由式(1)表示的化合物的晶体优选在衍射角(2θ)为5.6º、15.5º和22.0º处显示主峰。由于粉末x射线衍射中的衍射角(2θ)通常会导致在±0.2º范围内的误差，因此应理解，上述衍射角的值包括在±0.2º范围内的数值(关于通过粉末x射线衍射进行测量和评价的技术常识，参见例如japanesepharmacopoeia,第16版,p.64-68(2.58x-射线粉末衍射法)或japanesepharmacopoeia,第17版,p.71-74(2.58x-射线粉末衍射法))。
因此，具有与上述衍射角完全一致的衍射角的晶体与在衍射角(2θ)为5.6±0.2º、15.5±0.2º和22.0±0.2º处具有主峰的晶体相同，并且二者都包括在本发明中。在本发明中，术语“±0.2º”是指相对于特定数值在-0.2º至+0.2º范围内的数值。例如，术语“5.6±0.2º”是指在5.4º至5.8º范围内的数值。
用于沉淀由式(1)表示的化合物的晶体的溶液优选为含有丙酮和低级醇作为溶剂的溶液。同样地，含有低级酮和低级醇作为溶剂的溶液也可以优选用作用于沉淀由式(1)表示的化合物的晶体的溶液。
在本发明中，术语“低级酮”是指具有3至6个碳原子的酮。其实例可以包括丙酮、甲基乙基酮、甲基丙基酮、甲基异丙基酮、甲基丁基酮、甲基异丁基酮、甲基叔丁基酮、乙基乙基酮、乙基丙基酮和乙基异丙基酮，并且可以优选地例示丙酮和甲基乙基酮，并且可以更优选地例示丙酮。
在本发明中，术语“低级醇”是指具有1-4个碳原子的醇。其实例可以包括甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-甲基-1-丙醇、2-丁醇和叔丁醇，并且可以优选地例示1-丙醇和2-丁醇，可以更优选地例示1-丙醇。
因此，用于沉淀由式(1)表示的化合物的晶体的溶液优选为含有丙酮和1-丙醇的溶液或含有丙酮和2-丁醇的溶液，并且更优选含有丙酮和1-丙醇的溶液。
由式(1)表示的化合物的晶体的沉淀也可以通过将由式(1)表示的化合物的晶体的晶种添加到含有由式(1)表示的化合物的溶液中来进行。
由式(1)表示的化合物的晶体的晶种可以通过直接进行上述方法获得，但是优选可以通过色谱法纯化少量的由式(1)表示的化合物，然后将其溶于含有丙酮和1-丙醇的溶剂或含有丙酮和2-丁醇的溶剂中，并从溶液中结晶而获得。
由式(1)表示的化合物可以参照国际公开号wo2014/057687、国际公开号wo2015/098099、国际公开号wo2015/115091、国际公开号wo2015/155998等中的描述制备，但是，可以优选使用通过下述制备方法(i)、(ii)、(iii)、(v)、(vi)和(ix)制备的化合物。结果，可以以高收率制备由式(1)表示的化合物的晶体，而无需在所有步骤中使用色谱法。
[制备方法(i)]
制备方法(i)是通过步骤1-3将由式(b)表示的化合物转化为由式(1)表示的化合物的方法。在下文中，将详细描述步骤1至3。
[化82]
在该方案中，r1表示被保护基保护的氨基，并且优选表示被苄氧羰基保护的氨基，r2表示被保护基保护的羧基，并且优选表示被苄基保护的羧基，且x表示活性酯基或羧基，并且优选表示(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基羰基。
步骤1:
该步骤是使由式(b)表示的化合物的氨基和羧基的保护基脱保护以将其转化为由式(8)表示的化合物的步骤。
由式(b)表示的化合物的氨基和羧基的保护基的脱保护可以通过本领域公知的方法进行(参见例如peterg.m.wuts,theodoraw.greene,greene'sprotectivegroupsinorganicsynthesis第4版(2007),wiley-interscience)。
在r1为被苄氧羰基保护的氨基，且r2为被苄基保护的羧基的情况下，该步骤优选通过以下方法进行。
由式(b)表示的化合物的氨基和羧基的保护基的脱保护不受其方法的限制，只要反应进行即可。其可以优选在氢气气氛下使用钯催化剂、铂催化剂、镍催化剂、钌催化剂或铑催化剂进行，可以更优选使用钯催化剂进行，并且甚至可以更优选使用钯碳进行，并且甚至可以更优选使用5％的钯碳。该步骤中使用的5％钯碳的量不受限制，只要反应进行即可。相对于由式(b)表示的化合物，其优选为5至40重量％。
该步骤中使用的溶剂没有特别限制，只要反应不受抑制即可。其实例可包括乙腈、二氯甲烷、氯仿、甲醇、乙醇、乙醚、1,2-二甲氧基乙烷、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、1,4-二噁烷、乙酸乙酯、己烷、戊烷、庚烷、环己烷、乙基环己烷、苯、甲苯、氯苯、丙酮、2-丁酮、n,n-二甲基甲酰胺、n,n-二甲基乙酰胺、1-甲基-2-吡咯烷酮、二甲基亚砜和水，以及它们的混合溶剂，并且可以优选地例示四氢呋喃和水的混合溶剂。
该步骤的反应温度不受限制，只要反应进行即可。优选为10至40℃。该步骤的反应时间不受限制，只要反应进行即可。优选为1至5小时。
步骤2:
该步骤是使由式(8)表示的化合物与由式(c)表示的化合物缩合以将其转化为由式(10)表示的化合物的步骤。作为由式(c)表示的化合物，可以使用市售产品或通过已知方法制备的化合物，或通过符合下述制备方法(vii)的方法制备的化合物。在x为(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基羰基的情况下，该步骤可优选通过以下方法进行。
在该步骤中使用的由式(c)表示的化合物的量不受限制，只要反应进行即可。相对于由式(8)表示的化合物，其优选为1-4当量。
该步骤优选采用碱。该步骤中使用的碱没有特别限制，只要反应进行即可。其实例可以包括三乙胺、三丁胺、二异丙基乙胺、n-甲基吗啉、n-甲基吡咯烷和n-甲基哌啶，并且可以优选地例示n,n-二异丙基乙胺。该步骤中使用的n,n-二异丙基乙胺的量不受限制，只要反应进行即可。相对于由式(8)表示的化合物，其优选为0.5-2当量。
该步骤中使用的溶剂没有特别限制，只要反应不受抑制即可。其实例可包括乙腈、二氯甲烷、氯仿、甲醇、乙醇、乙醚、1,2-二甲氧基乙烷、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、1,4-二噁烷、乙酸乙酯、己烷、戊烷、庚烷、环己烷、乙基环己烷、苯、甲苯、氯苯、丙酮、2-丁酮、n,n-二甲基甲酰胺、n,n-二甲基乙酰胺、1-甲基-2-吡咯烷酮、二甲基亚砜和水，以及它们的混合溶剂，并且可以优选地例示乙腈和水的混合溶剂。
该步骤的反应温度不受限制，只要反应进行即可。优选为10至40℃。该步骤的反应时间不受限制，只要反应进行即可。优选为7至30小时。
由式(10)表示的化合物可以优选作为1,2-二甲氧基乙烷加合物的晶体获得。
由式(10)表示的化合物的1,2-二甲氧基乙烷加合物的晶体质量可以例如根据指标如杂质含量、残留溶剂量和外观来评价。另外，其例如可以通过使用在25℃/60%rh或40℃/75%rh的环境中持续3个月、6个月、12个月、24个月和36个月的保存稳定性作为指标来评价。通过这样的质量评价，也可以确认相对于由式(10)表示的无定形化合物的优越性。
在用铜kα辐射照射获得的粉末x射线衍射中，由式(10)表示的化合物的1,2-二甲氧基乙烷加合物的晶体优选在衍射角(2θ)为19.0º和25.0º处显示主峰。由于粉末x射线衍射中的衍射角(2θ)通常会导致在±0.2º范围内的误差，因此应理解，上述衍射角的值包括在±0.2º范围内的数值(关于通过粉末x射线衍射进行测量和评价的技术常识，参见例如japanesepharmacopoeia,第16版,p.64-68(2.58x-射线粉末衍射法)或japanesepharmacopoeia,第17版,p.71-74(2.58x-射线粉末衍射法))。
因此，具有与上述衍射角完全一致的衍射角的晶体与在衍射角(2θ)为19.0±0.2º和25.0±0.2º处具有主峰的晶体相同，并且二者都包括在本发明中。
步骤3:
该步骤是使由式(10)表示的化合物与由式(11)表示的化合物缩合以将其转化为由式(1)表示的化合物的步骤。由式(11)表示的化合物可以优选以甲磺酸盐的形式使用，可以更优选以甲磺酸盐m-水合物的形式使用，其中m为0至3，并且甚至可以更优选以甲磺酸盐无水物、甲磺酸盐一水合物、甲磺酸盐二水合物或甲磺酸盐三水合物的形式使用，并且甚至可以更优选以甲磺酸盐二水合物的形式使用，但它们都可以用于本发明的制备方法。上述水合物中的水分子数可以通过调节获得或干燥晶体时的湿度来控制。
在该步骤中使用的由式(11)表示的化合物的量不受限制，只要反应进行即可。相对于由式(10)表示的化合物，其优选为0.5-2当量。
由式(10)表示的化合物可以优选被衍生化为活性酯，并与由式(11)表示的化合物缩合。在该步骤中衍生化为活性酯不受其方法的限制，只要反应进行即可。例如，可以通过使用缩合剂如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(wscd-hcl)或n,n'-二环己基碳二亚胺(dcc)，并与添加剂如1-羟基苯并三唑(hobt)、1-羟基-7-氮杂苯并三唑(hoat)、n-羟基琥珀酰亚胺、氰基(羟基亚氨基)乙酸乙酯或对硝基苯酚反应来进行，并且可以优选使用3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和氰基(羟基亚氨基)乙酸乙酯进行。该步骤中使用的3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的量不受限制，只要反应进行即可。相对于由式(10)表示的化合物，其优选为0.5-2当量。该步骤中使用的氰基(羟基亚氨基)乙酸乙酯的量不受限制，只要反应进行即可。相对于由式(10)表示的化合物，其优选为0.02-0.2当量。
该步骤优选采用碱。该步骤中使用的碱没有特别限制，只要反应进行即可。其实例可以包括三乙胺、三丁胺、二异丙基乙胺、n-甲基吗啉、n-甲基吡咯烷和n-甲基哌啶，并且可以优选地例示n-甲基吗啉。该步骤中使用的n-甲基吗啉的量不受限制，只要反应进行即可。相对于由式(10)表示的化合物，其优选为0.5-2当量。
该步骤中使用的溶剂没有特别限制，只要反应不受抑制即可。其实例可包括乙腈、二氯甲烷、氯仿、甲醇、乙醇、乙醚、1,2-二甲氧基乙烷、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、1,4-二噁烷、乙酸乙酯、己烷、戊烷、庚烷、环己烷、乙基环己烷、苯、甲苯、氯苯、丙酮、2-丁酮、n,n-二甲基甲酰胺、n,n-二甲基乙酰胺、1-甲基-2-吡咯烷酮、二甲基亚砜和水，以及它们的混合溶剂，并且可优选地例示四氢呋喃和水的混合溶剂。
用碱中和由式(11)表示的化合物的甲磺酸盐以制备游离形式，然后进行反应。在此，由式(11)表示的化合物的甲磺酸盐是亲水的，而由式(11)表示的化合物的游离形式是亲脂的。因此，为了使一系列反应有效地进行，该步骤可以优选在水层和有机层的两相体系中进行。在有机层含有四氢呋喃的情况下，具有高离子强度的水溶液例如硫酸钠水溶液可以优选地用作与其不易混溶的水层。
该步骤的反应温度不受限制，只要反应进行即可。优选为10至40℃。该步骤的反应时间不受限制，只要反应进行即可。优选为0.5至2小时。
[制备方法(ii)]
制备方法(ii)是通过步骤4至7将由式(b)表示的化合物转化为由式(1)表示的化合物的方法。在下文中，将详细描述步骤4至7。
[化83]
在该方案中，r1表示被保护基保护的氨基，r2表示被保护基保护的羧基，且x表示活性酯基或羧基，并且优选表示(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基羰基。
步骤4:
该步骤是使由式(b)表示的化合物的氨基的保护基脱保护以将其转化为由式(d)表示的化合物的步骤。
由式(b)表示的化合物的氨基的保护基的脱保护可以通过本领域公知的方法进行(参见例如peterg.m.wuts,theodoraw.greene,greene'sprotectivegroupsinorganicsynthesis第4版(2007),wiley-interscience)。
步骤5:
该步骤是使由式(d)所示的化合物与由式(c)所示的化合物缩合以将其转化为由式(e)所示的化合物的步骤。
该步骤可以以与制备方法(i)的步骤2中相同的方式进行。
步骤6:
该步骤是使由式(e)表示的化合物的羧基的保护基脱保护以将其转化为由式(10)表示的化合物的步骤。
由式(b)表示的化合物的羧基的保护基的脱保护可以通过本领域公知的方法进行(参见例如peterg.m.wuts,theodoraw.greene,greene'sprotectivegroupsinorganicsynthesis第4版(2007),wiley-interscience)。
由式(10)表示的化合物可以优选以与制备方法(i)的步骤2中相同的方式作为1,2-二甲氧基乙烷加合物的晶体获得。
步骤7:
该步骤是使由式(10)表示的化合物与由式(11)表示的化合物缩合以将其转化为由式(1)表示的化合物的步骤。
该步骤可以以与制备方法(i)的步骤3中相同的方式进行。
[制备方法(ⅲ)]
制备方法(iii)是通过步骤8至11将由式(b)表示的化合物转化为由式(1)表示的化合物的方法。在下文中，将详细描述步骤8至11。
[化84]
在该方案中，r1表示被保护基保护的氨基，并且优选表示被(9h-芴-9-基甲氧基)羰基保护的氨基，r2表示被保护基保护的羧基，并且优选表示被苄基保护的羧基，且x表示活性酯基或羧基，并且优选表示(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基羰基。
步骤8:
该步骤是使由式(b)表示的化合物的羧基的保护基脱保护以将其转化为由式(f)表示的化合物的步骤。
由式(b)表示的化合物的羧基的保护基的脱保护可以通过本领域公知的方法进行(参见例如peterg.m.wuts,theodoraw.greene,greene'sprotectivegroupsinorganicsynthesis第4版(2007),wiley-interscience)。
在r2为被苄基保护的羧基的情况下，该步骤可优选通过以下方法进行。
由式(b)表示的化合物的羧基的保护基的脱保护不受其方法的限制，只要反应进行即可。可以优选在氢气气氛下使用钯催化剂、铂催化剂、镍催化剂、钌催化剂或铑催化剂进行，可以更优选使用钯催化剂进行，并且甚至可以更优选使用钯碳进行，并且甚至可以更优选使用钯碳-乙二胺络合物。在该步骤中使用的钯碳-乙二胺络合物的量不受限制，只要反应进行即可。相对于由式(b)表示的化合物，其优选为34至136重量％。
该步骤中使用的溶剂没有特别限制，只要反应不受抑制即可。其实例可包括乙腈、二氯甲烷、氯仿、甲醇、乙醇、乙醚、1,2-二甲氧基乙烷、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、1,4-二噁烷、乙酸乙酯、己烷、戊烷、庚烷、环己烷、乙基环己烷、苯、甲苯、氯苯、丙酮、2-丁酮、n,n-二甲基甲酰胺、n,n-二甲基乙酰胺、1-甲基-2-吡咯烷酮、二甲基亚砜和水，以及它们的混合溶剂，并且可优选例示四氢呋喃和水的混合溶剂。
该步骤的反应温度优选为10至40℃，但不限于此，只要反应进行即可。该步骤的反应时间优选为1至54小时，但不限于此，只要反应进行即可。
步骤9:
该步骤是使由式(f)表示的化合物与由式(11)表示的化合物缩合以将其转化为由式(g)表示的化合物的步骤。
由式(f)表示的化合物可以优选地被衍生化为活性酯并与由式(11)表示的化合物缩合。在该步骤中使用的由式(11)表示的化合物的量不受限制，只要反应进行即可。相对于由式(f)表示的化合物，其优选为0.7-1.3当量。在该步骤中衍生化为活性酯不受其方法的限制，只要反应进行即可。例如，其可以通过使用缩合剂如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(wscd-hcl)或n,n'-二环己基碳二亚胺(dcc)，并与添加剂如1-羟基苯并三唑(hobt)、1-羟基-7-氮杂苯并三唑(hoat)、n-羟基琥珀酰亚胺、氰基(羟基亚氨基)乙酸乙酯或对硝基苯酚反应来进行，并且可以优选使用3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和1-羟基苯并三唑进行。该步骤中使用的3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的量不受限制，只要反应进行即可。相对于由式(f)表示的化合物，其优选为0.7-1.3当量。该步骤中使用的1-羟基苯并三唑的量不受限制，只要反应进行即可。相对于由式(f)表示的化合物，其优选为0.7-1.3当量。
该步骤优选采用碱。该步骤中使用的碱没有特别限制，只要反应进行即可。其实例可以包括三乙胺、三丁胺、二异丙基乙胺、n-甲基吗啉、n-甲基吡咯烷和n-甲基哌啶，并且可以优选地例示三乙胺。在该步骤中使用的三乙胺的量不受限制，只要反应进行即可。相对于由式(f)表示的化合物，其优选为0.7-1.3当量。
该步骤中使用的溶剂没有特别限制，只要反应不受抑制即可。其实例可包括乙腈、二氯甲烷、氯仿、甲醇、乙醇、乙醚、1,2-二甲氧基乙烷、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、1,4-二噁烷、乙酸乙酯、己烷、戊烷、庚烷、环己烷、乙基环己烷、苯、甲苯、氯苯、丙酮、2-丁酮、n,n-二甲基甲酰胺、n,n-二甲基乙酰胺、1-甲基-2-吡咯烷酮、二甲基亚砜和水，以及它们的混合溶剂，并且可以优选地例示四氢呋喃。
该步骤的反应温度不受限制，只要反应进行即可。优选为10至40℃。该步骤的反应时间不受限制，只要反应进行即可。优选为1至4小时。
步骤10:
该步骤是使由式(g)表示的化合物的氨基的保护基脱保护以将其转化为由式(16)表示的化合物的步骤。
由式(g)表示的化合物的氨基的保护基的脱保护可以通过本领域公知的方法进行(参见例如peterg.m.wuts,theodoraw.greene,greene'sprotectivegroupsinorganicsynthesis第4版(2007),wiley-interscience)。
在r1是被(9h-芴-9-基甲氧基)羰基保护的氨基的情况下，该步骤优选可以通过以下方法进行。
由式(g)表示的化合物的氨基的保护基的脱保护不受特别限制，只要反应进行即可。其可以使用例如1,8-二氮杂双环[5,4,0]-7-十一碳烯、三甲基胍、1,5,7-三氮杂双环[4,4,0]癸-5-烯或7-甲基-1,5,7-三氮杂双环[4,4,0]癸-5-烯、1,5-二氮杂双环[4,3,0]-5-壬烯进行，并且可以优选使用1,8-二氮杂双环[5,4,0]-7-十一碳烯进行。该步骤中使用的1,8-二氮杂双环[5,4,0]-7-十一碳烯的量不受限制，只要反应进行即可。相对于由式(15)表示的化合物，其优选为0.5-2当量。
该步骤中使用的溶剂没有特别限制，只要反应不受抑制即可。其实例可包括乙腈、二氯甲烷、氯仿、甲醇、乙醇、乙醚、1,2-二甲氧基乙烷、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、1,4-二噁烷、乙酸乙酯、己烷、戊烷、庚烷、环己烷、乙基环己烷、苯、甲苯、氯苯、丙酮、2-丁酮、n,n-二甲基甲酰胺、n,n-二甲基乙酰胺、1-甲基-2-吡咯烷酮、二甲基亚砜和水，以及它们的混合溶剂，并且可以优选地例示四氢呋喃。
该步骤的反应温度不受限制，只要反应进行即可。优选为10至40℃。该步骤的反应时间不受限制，只要反应进行即可。优选为1至5小时。
步骤11:
该步骤是使由式(16)表示的化合物与由式(c)表示的化合物缩合以将其转化为由式(1)表示的化合物的步骤。作为由式(c)表示的化合物，可以使用市售产品、通过已知方法制备的化合物，或通过符合下述制备方法(vii)的方法制备的化合物。在x为(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基羰基的情况下，该步骤可优选通过以下方法进行。
在该步骤中使用的由式(c)表示的化合物的量不受限制，只要反应进行即可。相对于由式(16)表示的化合物，其优选为0.5-2当量。
该步骤优选采用碱。该步骤中使用的碱没有特别限制，只要反应进行即可。其实例可以包括三乙胺、三丁胺、二异丙基乙胺、n-甲基吗啉、n-甲基吡咯烷和n-甲基哌啶，并且可以优选地例示三乙胺。该步骤中使用的三乙胺的量不受限制，只要反应进行即可。相对于由式(16)表示的化合物，其优选为0.75-6当量。
该步骤可以优选进一步使用对甲苯磺酸吡啶鎓。该步骤中使用的对甲苯磺酸吡啶鎓的量不受限制，只要反应进行即可。相对于由式(16)表示的化合物，其优选为1-4当量。
该步骤中使用的溶剂没有特别限制，只要反应不受抑制即可。其实例可包括乙腈、二氯甲烷、氯仿、甲醇、乙醇、乙醚、1,2-二甲氧基乙烷、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、1,4-二噁烷、乙酸乙酯、己烷、戊烷、庚烷、环己烷、乙基环己烷、苯、甲苯、氯苯、丙酮、2-丁酮、n,n-二甲基甲酰胺、n,n-二甲基乙酰胺、1-甲基-2-吡咯烷酮、二甲基亚砜、吡啶和水，以及它们的混合溶剂，并且可优选地例示吡啶、乙腈和四氢呋喃的混合溶剂。
该步骤的反应温度不受限制，只要反应进行即可。优选为10至40℃。该步骤的反应时间不受限制，只要反应进行即可。优选为1.5至7小时。
作为制备方法(i)至(iii)中由式(b)表示的化合物，可以优选使用通过以下制备方法(iv)制备的化合物。
[制备方法(iv)]
制备方法(iv)是通过步骤12至15将由式(h)表示的化合物转化为由式(b)表示的化合物的方法。在下文中，将详细描述步骤12至15。
[化85]
在该方案中，r1表示被保护基保护的氨基，并且优选表示被苄氧羰基或(9h-芴-9-基甲氧基)羰基保护的氨基，r2表示被保护基保护的羧基，并且优选表示被苄基保护的羧基，r3表示被保护基保护的氨基，并且优选表示被(9h-芴-9-基甲氧基)羰基保护的氨基，且x表示活性酯基或羧基，并且优选表示(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基羰基。
步骤12:
该步骤是使由式(h)表示的化合物与四乙酸铅反应以将其转化为由式(j)表示的化合物的步骤。作为由式(h)表示的化合物，可以使用市售产品或参照已知方法制备的化合物。在该步骤中使用的四乙酸铅的量不受限制，只要反应进行即可。相对于由式(h)表示的化合物，其优选为1至3当量。
该步骤可以优选在乙酸或吡啶存在下进行，并且可以更优选在乙酸存在下进行。
该步骤中使用的溶剂没有特别限制，只要反应不受抑制即可。其实例可包括乙腈、1,2-二甲氧基乙烷、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、1,4-二噁烷、乙酸乙酯、n,n-二甲基甲酰胺、n,n-二甲基乙酰胺、1-甲基-2-吡咯烷酮和二甲基亚砜，以及它们的混合溶剂，并且可以优选地例示四氢呋喃。
该步骤的反应温度不受限制，只要反应进行即可。优选为45-85℃，更优选为实现加热至四氢呋喃回流的温度。该步骤的反应时间不受限制，只要反应进行即可。优选为0.5至3小时。
步骤13:
该步骤是使由式(j)表示的化合物与由式(k)表示的化合物在酸或碱的存在下反应以将其转化为由式(l)表示的化合物的步骤。在该步骤中使用的由式(k)表示的化合物的量不受限制，只要反应进行即可。相对于由式(j)表示的化合物，其优选为1至4当量。
该步骤可以在碱或酸的存在下进行。在该步骤中使用的碱优选是氢氧化钠水溶液。在该步骤中使用的氢氧化钠水溶液的量不受限制，只要反应进行即可。相对于由式(j)表示的化合物，其优选为0.5至2当量。该步骤中使用的酸优选为三(五氟苯基)硼烷。在该步骤中使用的三(五氟苯基)硼烷的量不受限制，只要反应进行即可。相对于由式(j)表示的化合物，其优选为0.01-0.1当量。
该步骤中使用的溶剂没有特别限制，只要反应不受抑制即可。其实例可以包括1,2-二甲氧基乙烷、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃和1,4-二噁烷，并且可以优选地例示1,2-二甲氧基乙烷。
该步骤的反应温度不受限制，只要反应进行即可。优选为-10至15℃。该步骤的反应时间不受限制，只要反应进行即可。优选为0.5至6小时。
步骤14:
该步骤是使由式(l)表示的化合物的氨基的保护基脱保护以将其转化为由式(m)表示的化合物的步骤。
由式(l)表示的化合物的氨基的保护基的脱保护可以通过本领域公知的方法进行(参见例如peterg.m.wuts,theodoraw.greene,greene'sprotectivegroupsinorganicsynthesis第4版(2007),wiley-interscience)。
在r3是被(9h-芴-9-基甲氧基)羰基保护的氨基的情况下，该步骤可优选通过以下方法进行。
由式(l)表示的化合物的氨基的保护基的脱保护不受特别限制，只要反应进行即可。其可以使用例如1,8-二氮杂双环[5,4,0]-7-十一碳烯、三甲基胍、1,5,7-三氮杂双环[4,4,0]癸-5-烯或7-甲基-1,5,7-三氮杂双环[4,4,0]癸-5-烯、1,5-二氮杂双环[4,3,0]-5-壬烯进行，并且可以优选使用1,8-二氮杂双环[5,4,0]-7-十一碳烯进行。该步骤中使用的1,8-二氮杂双环[5,4,0]-7-十一碳烯的量不受限制，只要反应进行即可。相对于由式(l)表示的化合物，其优选为0.25-1当量。
该步骤中使用的溶剂没有特别限制，只要反应不受抑制即可。其实例可包括乙腈、二氯甲烷、氯仿、甲醇、乙醇、乙醚、1,2-二甲氧基乙烷、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、1,4-二噁烷、乙酸乙酯、己烷、戊烷、庚烷、环己烷、乙基环己烷、苯、甲苯、氯苯、丙酮、2-丁酮、n,n-二甲基甲酰胺、n,n-二甲基乙酰胺、1-甲基-2-吡咯烷酮、二甲基亚砜和水，以及它们的混合溶剂，并且可以优选地例示乙腈和n,n-二甲基乙酰胺。
该步骤的反应温度不受限制，只要反应进行即可。优选为10至40℃。该步骤的反应时间不受限制，只要反应进行即可。优选为2至8小时。
由式(m)表示的化合物可以通过与酸形成盐而从反应溶液中沉淀出来，并优选分离和纯化。结果，可以除去副产物，该副产物可能是抑制后续步骤中反应的因素。
上述酸优选为1-羟基苯并三唑。在该步骤中使用的1-羟基苯并三唑也可以在下一步骤15中用作缩合剂之一。同样，除1-羟基苯并三唑以外的酸可优选用于该步骤，只要其用作缩合剂之一。
步骤15:
该步骤是使由式(m)表示的化合物与由式(n)表示的化合物缩合以将其转化为由式(b)表示的化合物的步骤。作为由式(n)表示的化合物，可以使用市售产品、通过已知方法制备的化合物或通过符合下述制备方法(viii)的方法制备的化合物。在该步骤中使用的由式(n)表示的化合物的量不受限制，只要反应进行。相对于由式(m)表示的化合物，其优选为0.7-1.3当量。
由式(m)表示的化合物可以优选地被衍生化为活性酯并与由式(n)表示的化合物缩合。例如，衍生化为活性酯可以通过使用缩合剂如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(wscd-hcl)或n,n'-二环己基碳二亚胺(dcc)，并与添加剂如1-羟基苯并三唑(hobt)、1-羟基-7-氮杂苯并三唑(hoat)、n-羟基琥珀酰亚胺、氰基(羟基亚氨基)乙酸乙酯或对硝基苯酚反应来进行，并且可以优选使用3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和1-羟基苯并三唑进行。该步骤中使用的3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的量不受限制，只要反应进行即可。相对于由式(5)表示的化合物，其优选为0.7-1.3当量。该步骤中使用的1-羟基苯并三唑的量不受限制，只要反应进行即可。相对于由式(m)表示的化合物，其优选为0.7-1.3当量。
在由式(m)表示的化合物为1-羟基苯并三唑盐的形式的情况下，该步骤可优选在不添加新鲜的1-羟基苯并三唑的情况下进行。
该步骤中使用的溶剂没有特别限制，只要反应不受抑制即可。其实例可包括乙腈、二氯甲烷、氯仿、甲醇、乙醇、乙醚、1,2-二甲氧基乙烷、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、1,4-二噁烷、乙酸乙酯、己烷、戊烷、庚烷、环己烷、乙基环己烷、苯、甲苯、氯苯、丙酮、2-丁酮、n,n-二甲基甲酰胺、n,n-二甲基乙酰胺、1-甲基-2-吡咯烷酮、二甲基亚砜和水，以及它们的混合溶剂，并且可以优选地例示乙腈和水的混合溶剂。
在步骤14中没有分离出由式(m)表示的化合物并且该步骤由此连续进行的情况下，步骤14中使用的溶剂可以原样用作该步骤的溶剂。
该步骤的反应温度不受限制，只要反应进行即可。优选为-10至15℃。该步骤的反应时间不受限制，只要反应进行即可。优选为1.5至7小时。
在更具体的方面，由式(1)表示的化合物可以优选通过以下制备方法(v)或(vi)制备并使用。
[制备方法(v)]
制备方法(v)是通过步骤16至22将由式(2)表示的化合物转化为由式(1)表示的化合物的方法。在下文中，将详细描述步骤16至22。
[化86]
步骤16:
该步骤是使由式(2)表示的化合物与四乙酸铅反应以将其转化为由式(3)表示的化合物的步骤。作为由式(2)表示的化合物，可以使用市售产品或参照已知方法制备的化合物。该步骤可以以与制备方法(iv)的步骤12中相同的方式进行。
步骤17:
该步骤是使由式(3)表示的化合物与乙醇酸苄酯在酸或碱的存在下反应以将其转化为由式(4)表示的化合物的步骤。该步骤可以与制备方法(iv)的步骤13中相同的方式进行。
步骤18:
该步骤是使由式(4)表示的化合物的氨基的保护基脱保护以将其转化为由式(5)表示的化合物的步骤。该步骤可以以与制备方法(iv)的步骤14中相同的方式进行。
步骤19:
该步骤是使由式(5)表示的化合物与由式(6)表示的化合物缩合以将其转化为由式(7)表示的化合物的步骤。作为由式(6)表示的化合物，可以使用市售产品、通过已知方法制备的化合物或通过下述制备方法(viii)制备的化合物。该步骤可以以与制备方法(iv)的步骤15中相同的方式进行。
步骤20:
该步骤是使由式(7)表示的化合物的氨基和羧基的保护基脱保护以将其转化为由式(8)表示的化合物的步骤。该步骤可以以与制备方法(i)的步骤1中相同的方式进行。
步骤21:
该步骤是使由式(8)表示的化合物与由式(9)表示的化合物缩合以将其转化为由式(10)表示的化合物的步骤。该步骤可以以与制备方法(i)的步骤2中相同的方式进行。
步骤22:
该步骤是使由式(10)表示的化合物与由式(11)表示的化合物缩合以将其转化为由式(1)表示的化合物的步骤。该步骤可以以与制备方法(i)的步骤3中相同的方式进行。
[制备方法(vi)]
制备方法(vi)是通过步骤23至30将由式(2)表示的化合物转化为由式(1)表示的化合物的方法。在下文中，将详细描述步骤23至30。
[化87]
步骤23:
该步骤是使由式(2)表示的化合物与四乙酸铅反应以将其转化为由式(3)表示的化合物的步骤。作为由式(2)表示的化合物，可以使用市售产品或参照已知方法制备的化合物。该步骤可以以与制备方法(iv)的步骤12中相同的方式进行。
步骤24:
该步骤是使由式(3)表示的化合物与乙醇酸苄酯在酸或碱的存在下反应以将其转化为由式(4)表示的化合物的步骤。该步骤可以以与制备方法(iv)的步骤13中相同的方式进行。
步骤25:
该步骤是使由式(4)表示的化合物的氨基的保护基脱保护以将其转化为由式(5)表示的化合物的步骤。该步骤可以以与制备方法(iv)的步骤14中相同的方式进行。
步骤26:
该步骤是使由式(5)表示的化合物与由式(12)表示的化合物缩合以将其转化为由式(13)表示的化合物的步骤。作为由式(13)表示的化合物，可以使用市售产品或通过已知方法制备的化合物。该步骤可以以与制备方法(iv)的步骤15中相同的方式进行。
步骤27:
该步骤是使由式(13)表示的化合物的羧基的保护基脱保护以将其转化为由式(14)表示的化合物的步骤。该步骤可以以与制备方法(iii)的步骤8中相同的方式进行。
步骤28:
该步骤是使由式(14)表示的化合物与由式(11)表示的化合物缩合以将其转化为由式(15)表示的化合物的步骤。该步骤可以以与制备方法(iii)的步骤9中相同的方式进行。
步骤29:
该步骤是使由式(15)表示的化合物的氨基的保护基脱保护以将其转化为由式(16)表示的化合物的步骤。该步骤可以以与制备方法(iii)的步骤10中相同的方式进行。
步骤30:
该步骤是使由式(16)表示的化合物与由式(9)表示的化合物缩合以将其转化为由式(1)表示的化合物的步骤。该步骤可以以与制备方法(iii)的步骤11中相同的方式进行。
[制备方法(vii)]
由式(9)表示的化合物可以优选通过下述制备方法(vii)来制备和使用。结果，可以抑制可能影响在后续步骤中制备的化合物的质量的杂质，并且这可以有助于高质量地获得由式(1)表示的化合物。
[化88]
步骤31:
该步骤是使由式(17)表示的化合物与马来酸酐缩合以将其转化为由式(18)表示的化合物的步骤。该步骤中使用的马来酸酐的量不受限制，只要反应进行即可。相对于由式(17)表示的化合物，其优选为0.7-1.3当量。
该步骤优选在乙酸中进行。
该步骤的反应温度不受限制，只要反应进行即可。优选为80至120℃。该步骤的反应时间不受限制，只要反应进行即可。优选为8至32小时。
步骤32:
该步骤是使由式(18)表示的化合物与n-羟基琥珀酰亚胺缩合以将其转化为由式(9)表示的化合物的步骤。该步骤中使用的n-羟基琥珀酰亚胺的量不受限制，只要反应进行即可。相对于由式(17)表示的化合物，其优选为0.7-1.3当量。
由式(18)表示的化合物可以被衍生化为活性酯、混合酸酐或酰卤等，并且与n-羟基琥珀酰亚胺缩合，或者可以优选被衍生化为酰卤并且与n-羟基琥珀酰亚胺缩合。
可以优选通过使用亚硫酰氯来衍生化为酰卤。在该步骤中使用的亚硫酰氯的量不受限制，只要反应进行即可。相对于由式(18)表示的化合物，其优选为0.5-1.5当量。在该步骤中，优选使用碱。该步骤中使用的碱优选为2,6-二甲基吡啶。该步骤中使用的2,6-二甲基吡啶的量不受限制，只要反应进行即可。相对于由式(18)表示的化合物，其优选为1-3当量。
该步骤中使用的溶剂没有特别限制，只要反应不受抑制即可。其实例可包括乙腈、二氯甲烷、氯仿、乙醚、1,2-二甲氧基乙烷、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、乙酸乙酯、己烷、戊烷、庚烷、环己烷、乙基环己烷、苯、甲苯和氯苯，以及它们的混合溶剂，并且优选地例示乙腈。
该步骤的反应温度不受限制，只要反应进行即可。优选为-25℃至0℃。该步骤的反应时间不受限制，只要反应进行即可。优选为0.5至2小时。
[制备方法(viii)]
由式(6)表示的化合物可以通过以下制备方法(viii)来制备并使用。
[化89]
步骤33:
该步骤是使由式(23)表示的化合物与n-羟基琥珀酰亚胺缩合以将其转化为由式(24)表示的化合物的步骤。该步骤中使用的由式(23)表示的化合物的量不受限制，只要反应进行即可。相对于由式(23)表示的化合物，其优选为0.7-1.5当量。
由式(23)表示的化合物可以被衍生化为活性酯、混合酸酐或酰卤等，并与n-羟基琥珀酰亚胺缩合，并且可优选被衍生化为活性酯化形式并与n-羟基琥珀酰亚胺缩合。
活性酯化可优选通过使用3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐来进行。在该步骤中使用的3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的量不受限制，只要反应进行即可。相对于由式(23)表示的化合物，其优选为0.7-1.5当量。
该步骤中使用的溶剂没有特别限制，只要反应不受抑制即可。其实例可包括乙腈、二氯甲烷、氯仿、甲醇、乙醇、乙醚、1,2-二甲氧基乙烷、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、1,4-二噁烷、乙酸乙酯、己烷、戊烷、庚烷、环己烷、乙基环己烷、苯、甲苯、氯苯、丙酮、2-丁酮、n,n-二甲基甲酰胺、n,n-二甲基乙酰胺、1-甲基-2-吡咯烷酮、二甲基亚砜和水，以及它们的混合溶剂，并且可优选地例示乙腈。
该步骤的反应温度不受限制，只要反应进行即可。优选为10至40℃。该步骤的反应时间不受限制，只要反应进行即可。优选为2至8小时。
步骤34:
该步骤是使由式(24)表示的化合物与l-苯丙氨酸缩合以将其转化为由式(6)表示的化合物的步骤。在该步骤中使用的l-苯丙氨酸的量不受限制，只要反应进行即可。相对于由式(24)表示的化合物，其优选为0.7-1.3当量。
该步骤优选采用碱。该步骤中使用的碱没有特别限制，只要反应进行即可。其实例可以包括三乙胺、三丁胺、二异丙基乙胺、n-甲基吗啉、n-甲基吡咯烷和n-甲基哌啶，并且可以优选地例示三乙胺。在该步骤中使用的三乙胺的量不受限制，只要反应进行即可。相对于由式(24)表示的化合物，其优选为0.7-1.3当量。
该步骤中使用的溶剂没有特别限制，只要反应不受抑制即可。其实例可包括乙腈、二氯甲烷、氯仿、甲醇、乙醇、乙醚、1,2-二甲氧基乙烷、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、1,4-二噁烷、乙酸乙酯、己烷、戊烷、庚烷、环己烷、乙基环己烷、苯、甲苯、氯苯、丙酮、2-丁酮、n,n-二甲基甲酰胺、n,n-二甲基乙酰胺、1-甲基-2-吡咯烷酮、二甲基亚砜和水，以及它们的混合溶剂，并且可以优选地例示乙腈和水的混合溶剂。
该步骤的反应温度不受限制，只要反应进行即可。优选由式(23)表示的化合物。该步骤的反应时间不受限制，只要反应进行即可。优选为1至4小时。
[制备方法(ix)]
由式(1)表示的化合物也可以通过以下制备方法(ix)来制备并使用。
[化90]
在该方案中，r1表示被保护基保护的氨基，r2表示被保护基保护的羧基，r3表示被保护基保护的氨基，且x表示活性酯基或羧基，并且优选表示(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基羰基。
步骤35:
该步骤是使由式(h)表示的化合物与四乙酸铅反应以将其转化为由式(j)表示的化合物的步骤。作为由式(h)表示的化合物，可以使用市售产品或参照已知方法制备的化合物。该步骤可以以与制备方法(iv)的步骤12中相同的方式进行。
步骤36:
该步骤是使由式(j)表示的化合物与由式(k)表示的化合物在酸或碱的存在下反应以将其转化为由式(l)表示的化合物的步骤。该步骤可以以与制备方法(iv)的步骤13中相同的方式进行。
步骤37:
该步骤是使由式(l)表示的化合物的羧基的保护基脱保护以将其转化为由式(o)表示的化合物的步骤。
由式(l)表示的化合物的羧基的保护基的脱保护可以通过本领域公知的方法进行(参见例如peterg.m.wuts,theodoraw.greene,greene'sprotectivegroupsinorganicsynthesis第4版(2007),wiley-interscience)。
步骤38:
该步骤是使由式(o)表示的化合物与由式(11)表示的化合物缩合以将其转化为由式(p)表示的化合物的步骤。
由式(o)表示的化合物可以优选地被衍生化为活性酯并且与由式(11)表示的化合物缩合。
步骤39:
该步骤是使由式(p)表示的化合物的氨基的保护基脱保护以将其转化为由式(25)表示的化合物的步骤。
由式(p)表示的化合物的羧基的保护基的脱保护可以通过本领域公知的方法进行(参见例如peterg.m.wuts,theodoraw.greene,greene'sprotectivegroupsinorganicsynthesis第4版(2007),wiley-interscience)。
步骤40:
该步骤是使由式(25)表示的化合物与由式(n)表示的化合物缩合以将其转化为由式(g)表示的化合物的步骤。
由式(n)表示的化合物可以优选被衍生化为活性酯并与由式(25)表示的化合物缩合。
步骤41:
该步骤是使由式(g)表示的化合物的氨基的保护基脱保护以将其转化为由式(16)表示的化合物的步骤。该步骤可以以与制备方法(iii)的步骤10中相同的方式进行。
步骤42:
该步骤是使由式(16)表示的化合物与由式(c)表示的化合物缩合以将其转化为由式(1)表示的化合物的步骤。该步骤可以以与制备方法(iii)的步骤11中相同的方式进行。
[用于制备抗体-药物缀合物的抗体]
用于制备本发明的抗体-药物缀合物的抗体可以源自任何物种，并且优选地是源自人、大鼠、小鼠或兔的抗体。在抗体衍生自人类物种以外的物种的情况下，优选使用公知技术将其嵌合或人源化。本发明的抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体，并且优选为单克隆抗体。
用于制备本发明的抗体-药物缀合物的抗体是优选具有能够靶向癌细胞的特征的抗体，并且优选是具有例如识别癌细胞的特性、结合癌细胞的特性、在癌细胞中内化的特性和/或针对癌细胞的杀细胞活性的抗体。
抗体对癌细胞的结合活性可以使用流式细胞术确认。可以使用以下测定法来确认抗体内化进入肿瘤细胞：(1)使用与治疗性抗体结合的二抗(荧光标记的)在荧光显微镜下可视化掺入到细胞中的抗体的测定法(celldeathanddifferentiation(2008)15,751-761)，(2)使用与治疗性抗体结合的二抗(荧光标记的)测量细胞中掺入的荧光强度的测定法(molecularbiologyofthecell,vol.15,5268-5282,2004年12月)，或(3)使用与治疗性抗体结合的免疫毒素的mab-zap测定法，其中毒素在掺入细胞后释放以抑制细胞生长(biotechniques28:162-165,2000年1月)。作为免疫毒素，可以使用白喉毒素催化结构域和蛋白质g的重组复合蛋白。
抗体的抗肿瘤活性可以通过确定对细胞生长的抑制活性来在体外确认。例如，培养过量表达所述抗体的靶蛋白的癌细胞系，并将所述抗体以不同的浓度添加到培养系统中以确定对病灶形成、集落形成和球状体生长的抑制活性。可以例如通过将抗体给予具有高表达靶蛋白的移植癌细胞系的裸鼠并确定癌细胞的变化来在体内确认抗肿瘤活性。
由于在抗体-药物缀合物中缀合的化合物发挥抗肿瘤作用，因此优选但非必要地是抗体本身应具有抗肿瘤作用。为了特异性和选择性地发挥抗肿瘤化合物对癌细胞的细胞毒活性，重要的也是优选的是抗体应具有内在迁移到癌细胞中的特性。
用于制备本发明的抗体-药物缀合物的抗体可以通过本领域已知的程序获得。例如，可以使用本领域通常进行的方法获得本发明的抗体，该方法包括用抗原性多肽免疫动物并收集和纯化体内产生的抗体。抗原的来源不限于人类，并且可以用来源于非人类动物如小鼠、大鼠等的抗原免疫动物。在这种情况下，可以测试与获得的异源抗原结合的抗体与人抗原的交叉反应性，以筛选适用于人类疾病的抗体。
或者，根据本领域已知的方法将产生针对抗原的抗体的抗体生成细胞与骨髓瘤细胞融合(例如，kohlerandmilstein,nature(1975)256,p.495-497；和kennet,r.ed.,monoclonalantibodies,p.365-367,plenumpress,n.y.(1980))以建立杂交瘤，进而可以从中获得单克隆抗体。
可以通过对宿主细胞进行基因工程改造以产生编码抗原蛋白的基因来获得抗原。具体地，制备允许表达抗原基因的载体，并将其转移至宿主细胞以表达该基因。这样表达的抗原可以被纯化。抗体也可以通过用上述基因工程化的表达抗原的细胞或表达抗原的细胞系对动物进行免疫的方法获得。
用于制备本发明的抗体-药物缀合物的抗体优选是为了降低对人的异源抗原性而通过人工修饰获得的重组抗体，例如嵌合抗体或人源化抗体，或者优选是仅具有来自人的抗体的基因序列的抗体，即人抗体。这些抗体可以使用已知方法来产生。
作为嵌合抗体，即抗体可变区和恒定区来源于不同物种的抗体，例如，可以例示小鼠或大鼠来源的抗体可变区与人来源的抗体恒定区相连的嵌合抗体(proc.natl.acad.sci.usa,81,6851-6855,(1984))。
作为人源化抗体，可以例示通过仅将异源抗体的互补决定区(cdr)整合到人源抗体中而获得的抗体(nature(1986)321,pp.522-525)，通过cdr移植方法将异源抗体框架的氨基酸残基的一部分以及该异源抗体的cdr序列移植到人抗体而获得的抗体(wo90/07861)，以及使用基因转化诱变策略人源化的抗体(美国专利号5821337)。
作为人抗体，可以例示通过使用具有人染色体片段(包括人抗体的重链和轻链的基因)的人抗体产生小鼠产生的抗体(参见tomizuka,k.等人,naturegenetics(1997)16,p.133-143;kuroiwa,y.等人,nucl.acidsres.(1998)26,p.3447-3448;yoshida,h.等人,animalcelltechnology:basicandappliedaspectsvol.10,p.69-73(kitagawa,y.,matsuda,t.和iijima,s.eds.),kluweracademicpublishers,1999;tomizuka,k.等人,proc.natl.acad.sci.usa(2000)97,p.722-727等)。或者，可以例示通过噬菌体展示获得的抗体，选自人抗体文库的抗体(参见wormstone,i.m.等人,investigativeophthalmology&visualscience.(2002)43(7),p.2301-2308;carmen,s.等人,briefingsinfunctionalgenomicsandproteomics(2002),1(2),p.189-203;siriwardena,d.等人,ophthalmology(2002)109(3),p.427-431等)。
在本发明中，还包括用于制备本发明的抗体-药物缀合物的抗体的修饰变体。修饰变体是指通过对根据本发明的抗体进行化学或生物修饰而获得的变体。化学修饰的变体的实例包括包含化学部分与氨基酸骨架的连接的变体；包含化学部分与n-连接或o-连接的碳水化合物链的连接的变体等。生物修饰的变体的实例包括通过翻译后修饰(例如n-连接或o-连接的糖基化，n-或c-末端加工，脱酰胺，天冬氨酸的异构化或甲硫氨酸的氧化)获得的变体，以及其中通过在原核宿主细胞中表达已将甲硫氨酸残基添加至n末端的变体。此外，在修饰变体的含义中还包括被标记以能够检测或分离根据本发明的抗体或抗原的抗体，例如，酶标记的抗体、荧光标记的抗体和亲和力标记的抗体。根据本发明的抗体的这种修饰的变体可用于改善抗体的稳定性和血液滞留，降低其抗原性，检测或分离抗体或抗原等。
此外，通过调节与根据本发明的抗体连接的聚糖的修饰(糖基化、去岩藻糖基化等)，可以增强抗体依赖性细胞的细胞毒性活性。作为调节抗体的聚糖修饰的技术，已知wo99/54342、wo00/61739、wo02/31140等。然而，该技术不限于此。在根据本发明的抗体中，还包括调节聚糖的修饰的抗体。
已知在培养的哺乳动物细胞中产生的抗体的重链的羧基末端的赖氨酸残基缺失(journalofchromatographya,705:129-134(1995))，并且还已知在培养的哺乳动物细胞中产生的抗体的重链的羧基末端的两个氨基酸残基(甘氨酸和赖氨酸)缺失，并且新位于羧基末端的脯氨酸残基被酰胺化(analyticalbiochemistry,360:75-83(2007))。然而，重链序列的这种缺失和修饰不影响抗体的抗原结合亲和力和效应子功能(补体的激活，抗体依赖性细胞的细胞毒性等)。因此，在根据本发明的抗体中，还包括经历这种修饰的抗体和抗体的功能片段，并且还包括其中在重链的羧基末端缺失了1个或2个氨基酸的缺失变体，通过缺失变体的酰胺化获得的变体(例如，其中羧基末端脯氨酸残基已被酰胺化的重链)等。在根据本发明的抗体的重链的羧基末端具有缺失的缺失变体的类型不限于上述变体，只要保留了抗原结合亲和力和效应子功能即可。构成根据本发明的抗体的两条重链可以是选自全长重链和上述缺失变体的一种类型，或者可以是选自其的两种类型的组合。每种缺失变体的量的比率可受产生根据本发明的抗体的培养的哺乳动物细胞的类型和培养条件的影响；但是，可以优选地例示羧基末端的一个氨基酸残基在根据本发明的抗体的两条重链中都缺失的抗体。
作为根据本发明的抗体的同种型，例如，可以例示igg(igg1、igg2、igg3、igg4)，并且可以优选地例示igg1或igg2。
适用于制备本发明的抗体-药物缀合物的抗体的实例可以包括但不特别限于抗-her2抗体、抗-her3抗体、抗-trop2抗体、抗-b7-h3抗体、抗-cd3抗体、抗-cd30抗体、抗-cd33抗体、抗-cd37抗体、抗-cd56抗体、抗-cd98抗体、抗-dr5抗体、抗-egfr抗体、抗-epha2抗体、抗-fgfr2抗体、抗-fgfr4抗体、抗-folr1抗体、抗-vegf抗体和抗-gpr20抗体，并且可以优选地例示抗-her2抗体、抗-her3抗体、抗-trop2抗体、抗-b7-h3抗体和抗-gpr20抗体。
在本发明中，术语“抗-her2抗体”是指与her2(人表皮生长因子受体2型；erbb-2)特异性结合的抗体，优选具有通过结合到her2而在her2表达细胞中内化的活性。
抗-her2抗体的实例可以包括曲妥珠单抗(美国专利号5821337)和帕妥珠单抗(国际公开号wo01/00245)，并且可以优选地例示曲妥珠单抗。
在本发明中，术语“曲妥珠单抗”是包含由seqidno：1的氨基酸残基1-449组成的氨基酸序列组成的重链(图1)和由seqidno：2的氨基酸残基1-214组成的氨基酸序列组成的轻链(图2)的人源化抗her2单克隆抗体。
在本发明中，术语“抗-her3抗体”是指与her3(人表皮生长因子受体3型；erbb-3)特异性结合的抗体，优选具有通过结合到表达her3的细胞表面上的her3而在her3表达细胞中内化的活性。
抗-her3抗体的实例可以包括patritumab(u3-1287)、u1-59(国际公开号wo2007/077028)、mm-121(seribantumab)、国际公开号wo2008/100624中描述的抗erbb3抗体、rg-7116(鲁妥珠单抗)和ljm-716(elgemtumab)，并且可以优选地例示patritumab和u1-59。
在本发明中，术语“抗-trop2抗体”是指与trop2(tacstd2：肿瘤相关钙信号转导因子2；egp-1)特异性结合的抗体，优选具有通过结合到trop2而在trop2表达细胞中内化的活性。
抗-trop2抗体的实例可包括htina1-h1l1(国际公开号wo2015/098099)。
在本发明中，术语“抗-b7-h3抗体”是指与b7-h3(b细胞抗原＃7同源物3；pd-l3；cd276)特异性结合的抗体，优选具有通过结合到b7-h3而在b7-h3表达细胞中内化的活性。
抗-b7-h3抗体的实例可以包括m30-h1-l4(国际公开号wo2014/057687)。
在本发明中，术语“抗-gpr20抗体”是指与gpr20(g蛋白偶联受体20)特异性结合的抗体，优选具有通过结合到gpr20而在gpr20表达细胞中内化的活性。
抗-gpr20抗体的实例可以包括h046-h4e/l7(国际公开号wo2018/135501)。
[抗体与药物-连接物中间体之间的缀合]
本发明的抗体-药物缀合物可以通过使由式(1)表示的化合物与具有硫醇基(可替代地，称为巯基)的抗体反应来制备。
优选将本发明的由式(1)表示的化合物的晶体溶解在溶剂中以制备含有由式(1)表示的化合物的溶液，然后可以将其用于反应中。用于该步骤的溶剂没有特别限制，只要反应不受抑制即可。优选地，可以使用含有二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺或n-甲基吡咯烷酮的溶剂，并且可以更优选地使用含有二甲基亚砜的溶剂。
具有巯基的抗体可以通过本领域公知的方法获得(hermanson,g.t,bioconjugatetechniques,pp.56-136,pp.456-493,academicpress(1996))。例如，通过在抗体内每个链间二硫键使用0.3至3摩尔当量的还原剂如三(2-羧基乙基)膦盐酸盐(tcep)，并在含有螯合剂如乙二胺四乙酸(edta)的缓冲溶液中与抗体反应，可以获得具有在抗体内部分或完全还原的链间二硫键的具有巯基的抗体。
此外，通过对每个具有巯基的抗体使用2至20摩尔当量的由式(1)表示的化合物，可以制备其中每个抗体分子缀合2至8个药物分子的抗体-药物缀合物。
每个所制备的抗体-药物缀合物的抗体分子的缀合药物分子的平均数目可以例如通过基于在280nm和370nm的两种波长下测量抗体-药物缀合物及其缀合物前体的uv吸光度的计算方法(uv方法)，或基于通过用还原剂处理抗体-药物缀合物而获得的片段的hplc测量定量的计算方法(hplc方法)来确定。
可以参照国际公开号wo2014/057687、国际公开号wo2015/098099、国际公开号wo2015/115091、国际公开号wo2015/155998和国际公开号wo2018/135501等中的描述进行抗体与药物连接物中间体(由式(1)表示的化合物)之间的缀合以及每个抗体-药物缀合物的抗体分子的缀合药物分子的平均数目的计算。
在本发明中，术语“抗-her2抗体-药物缀合物”是指抗体-药物缀合物，其中抗体-药物缀合物中的抗体是抗-her2抗体。
抗-her2抗体优选为包含由seqidno：1的氨基酸残基1-449组成的氨基酸序列组成的重链和由seqidno：2的氨基酸残基1-214组成的氨基酸序列组成的轻链的抗体，或包含由seqidno：1表示的氨基酸序列组成的重链和由seqidno：2表示的氨基酸序列组成的轻链的抗体。
根据本发明制备的抗-her2抗体-药物缀合物中每个抗体分子缀合的药物-连接物的平均单元数优选为2至8，更优选为3至8，甚至更优选为7至8，甚至更优选为7.5至8，并且甚至更优选为约8。
可以参考国际公开号wo2015/115091等中的描述，通过使用由本发明的制备方法制备的由式(1)表示的化合物的晶体来制备抗-her2抗体-药物缀合物。
在本发明中，术语“抗-her3抗体-药物缀合物”是指抗体-药物缀合物，使得抗体-药物缀合物中的抗体是抗-her3抗体。
抗-her3抗体优选为包含由seqidno：3表示的氨基酸序列组成的重链和由seqidno：4表示的氨基酸序列组成的轻链的抗体，或该抗体的变体，其中抗体重链羧基末端的赖氨酸残基缺失。
根据本发明制备的抗-her3抗体-药物缀合物中每个抗体分子缀合的药物-连接物的平均单元数优选为2至8，更优选为3至8，甚至更优选为7至8，甚至更优选为7.5至8，并且甚至更优选为约8。
可以参考国际公开号wo2015/155998等中的描述，通过使用由本发明的制备方法制备的由式(1)表示的化合物的晶体来制备抗-her3抗体-药物缀合物。
在本发明中，术语“抗-trop2抗体-药物缀合物”是指抗体-药物缀合物，使得抗体-药物缀合物中的抗体是抗-trop2抗体。
抗-trop2抗体优选为包含由seqidno：5的氨基酸残基20-470组成的氨基酸序列组成的重链和由seqidno：6的氨基酸残基21-234组成的氨基酸序列组成的轻链的抗体，或该抗体的变体，其中抗体重链羧基末端的赖氨酸残基缺失。
在根据本发明制备的抗-trop2抗体-药物缀合物中每个抗体分子缀合的药物连接物的平均单元数优选为2至8，更优选3至5，甚至更优选3.5至4.5，并且甚至更优选约4。
可以参考国际公开号wo2015/098099等中的描述，通过使用由本发明的制备方法制备的由式(1)表示的化合物的晶体来制备抗-trop2抗体-药物缀合物。
在本发明中，术语“抗-b7-h3抗体-药物缀合物”是指抗体-药物缀合物，使得抗体-药物缀合物中的抗体是抗-b7-h3抗体。
抗-b7-h3抗体优选为包含由seqidno：7的氨基酸残基20-471组成的氨基酸序列组成的重链和由seqidno：8的氨基酸残基21-233组成的氨基酸序列组成的轻链的抗体，或该抗体的变体，其中抗体重链羧基末端的赖氨酸残基缺失。
根据本发明制备的抗-b7-h3抗体-药物缀合物中每个抗体分子缀合的药物-连接物的平均单元数优选为2至8，更优选3至5，甚至更优选3.5至4.5，甚至更优选约4。
可以参考国际公开号wo2014/057687等中的描述，通过使用由本发明的制备方法制备的由式(1)表示的化合物的晶体来制备抗-b7-h3抗体-药物缀合物。
在本发明中，术语“抗-gpr20抗体-药物缀合物”是指抗体-药物缀合物，使得抗体-药物缀合物中的抗体是抗-gpr20抗体。
抗-gpr20抗体优选为包含由seqidno：9的氨基酸残基20-472组成的氨基酸序列组成的重链和由seqidno：10的氨基酸残基21-234组成的氨基酸序列组成的轻链的抗体，或该抗体的变体，其中抗体重链羧基末端的赖氨酸残基缺失。
根据本发明制备的抗-gpr20抗体-药物缀合物中每个抗体分子缀合的药物-连接物的平均单元数优选为2至8，更优选3至8，甚至更优选7至8，甚至更优选为7.5至8，并且甚至更优选为约8。
可以参考国际公开号wo2018/135501等中的描述，通过使用由本发明的制备方法制备的由式(1)表示的化合物的晶体来制备抗-gpr20抗体-药物缀合物。
[药物组合物]
本发明制备的抗体-药物缀合物可以含有至少一种药学上合适的成分并被给药。药学上合适的成分可以根据本发明制备的抗体-药物缀合物的剂量、给药浓度等，从本领域通常使用的制剂添加剂等中适当选择并施用。例如，本发明制备的抗体-药物缀合物可以以药物组合物的形式给药，所述药物组合物含有缓冲剂如组氨酸缓冲剂，赋形剂如蔗糖或海藻糖，和表面活性剂如聚山梨酯80或聚山梨酯20。
含有本发明制备的抗体-药物缀合物的药物组合物可以预期通过作为全身疗法施用于患者以及另外通过局部施用于癌组织而发挥治疗作用。
含有本发明制备的抗体-药物缀合物的药物组合物可以优选用于哺乳动物，并且可以更优选用于人。
含有本发明制备的抗体-药物缀合物的药物组合物可以优选用作注射剂，可以更优选用作水性注射剂或冻干注射剂，并且甚至可以更优选用作冻干注射剂。
在含有本发明制备的抗体-药物缀合物的药物组合物是水性注射剂的情况下，优选地，可以将其用合适的稀释剂稀释，然后通过滴注静脉内给药。稀释剂的实例可包括葡萄糖溶液(优选5％葡萄糖溶液)和生理盐水。
在含有本发明制备的抗体-药物缀合物的药物组合物是冻干注射剂的情况下，优选地，可以将其溶解在注射用水中，然后，可以用合适的稀释剂稀释必要量，然后通过滴注静脉内给药。稀释剂的实例可包括葡萄糖溶液(优选5％葡萄糖溶液)和生理盐水。
可以用于将含有本发明制备的抗体-药物缀合物的药物组合物给药的给药途径的实例可以包括静脉内、皮内、皮下、肌内和腹膜内途径，并且可以优选地例示静脉内途径。
本发明制备的抗体-药物缀合物可以以每天一次至每180天一次的间隔向人给药，优选可以以每周一次、每2周一次、每3周一次或每4周一次的间隔给药，并且甚至更优选地可以以每三周一次的间隔给药。另外，本发明制备的抗体-药物缀合物可以以每剂约0.001至100mg/kg的剂量给药，并且优选可以以每剂0.8至12.4mg/kg的剂量给药。在本发明制备的抗体-药物缀合物是抗her2抗体-药物缀合物的情况下，其可以优选以每剂5.4、6.4或7.4mg/kg的剂量给药，并且更优选地可以以每剂5.4mg/kg或6.4mg/kg的剂量给药。
含有本发明制备的抗体-药物缀合物的药物组合物可以用于治疗癌症，并且可以优选地用于治疗选自以下的至少一种类型的癌症：乳腺癌、胃癌(也称为胃腺癌)、结直肠癌(也称为结肠和直肠癌、并且包括结肠癌和直肠癌)、肺癌(包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、食道癌、唾液腺癌、食管胃交界腺癌、胆管癌、佩吉特氏病、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌肉瘤、尿路上皮癌、前列腺癌、膀胱癌、胃肠道间质瘤、消化道间质瘤、子宫宫颈癌、鳞状细胞癌、腹膜癌、肝癌、肝细胞癌、结肠癌、直肠癌、子宫内膜癌、子宫癌、肾癌、外阴癌、甲状腺癌、阴茎癌、白血病、恶性淋巴瘤、浆细胞瘤、骨髓瘤、神经上皮组织肿瘤、神经鞘瘤、头颈癌、皮肤癌、咽喉癌、胆囊癌、胆管癌、间皮瘤和肉瘤，并且在本发明制备的抗体-药物缀合物是抗her2抗体-药物缀合物的情况下，例如，它可以更优选地用于治疗选自以下的至少一种类型的癌症：乳腺癌、胃癌、结直肠癌、非小细胞肺癌、食道癌、唾液腺癌、食管胃交界腺癌、胆管癌、佩吉特氏病、胰腺癌、卵巢癌和子宫癌肉瘤，并且甚至可以更优选用于治疗选自以下的至少一种类型的癌症：乳腺癌、胃癌、结直肠癌、非小细胞肺癌、食道癌、唾液腺癌、食管胃交界腺癌、胆管癌和佩吉特氏病，并且甚至可以更优选地用于治疗乳腺癌、胃癌、结直肠癌或非小细胞肺癌。
含有本发明制备的抗体-药物缀合物的药物组合物可以选择性地用作用于药物疗法的药剂，这是治疗癌症的主要方法，结果，可以延迟癌细胞的发展，抑制其生长，并进一步杀死癌细胞。这些效果可以使癌症患者摆脱由癌症引起的症状，或者实现癌症患者qol的改善，并且通过维持癌症患者的生命来达到治疗效果。即使本发明的药物组合物和治疗方法没有完成杀死癌细胞，但其可以通过抑制或控制癌细胞的生长而在实现长期生存的同时实现癌症患者更高的qol。
在这种药物疗法中，含有本发明制备的抗体-药物缀合物的药物组合物可以单独用作药剂，此外，其可以与辅助疗法中的其他疗法组合使用，并且可以与外科手术、放射疗法、激素疗法等组合。此外，它还可以用作新辅助疗法中药物疗法的药剂。
除了如上所述的治疗用途以外，例如，对于含有本发明制备的抗体-药物缀合物的药物组合物，还可以预期预防作用，例如抑制小的转移性癌细胞的生长并进一步杀死它们。例如，可以期望在转移过程中抑制和杀死体液中的癌细胞的作用，或者例如在植入任何组织后立即抑制和杀死小癌细胞的作用。因此，可以预期抑制癌转移或预防作用，特别是在手术切除癌症之后。
包含本发明制备的抗体-药物缀合物的药物组合物可以与其他癌症治疗剂组合给药。可以相应地增强抗癌作用。用于该目的的其他癌症治疗剂的实例可包括5-氟尿嘧啶(5-fu)、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗、紫杉醇、卡铂、顺铂、吉西他滨、卡培他滨、伊立替康(cpt-11)、多西他赛、培美曲塞、索拉非尼、长春花碱、长春瑞滨、依维莫司、坦螺旋霉素、贝伐单抗、奥沙利铂、拉帕替尼、曲妥珠单抗-美坦新偶联物(t-dm1)或国际公开号wo2003/038043中所述的药剂、lh-rh类似物(亮丙瑞林、戈舍瑞林等)、磷酸雌莫司汀、雌激素拮抗剂(他莫昔芬、雷洛昔芬等)和芳香酶抑制剂(阿那曲唑、来曲唑、依西美坦等)，但不受限制，只要它们是具有抗肿瘤活性的药剂即可。
实施例
下面通过实施例更详细地描述本发明。然而，本发明不限于这些。
在实施例中，术语“1h-nmr”和“13c-nmr”是指“核磁共振谱”。在括号中，cdcl3是指氘代氯仿，是一种测量溶剂；dmso-d6是指氘代二甲基亚砜，是一种测量溶剂；d2o是指氘代水，是一种测量溶剂；meoh-d4是指氘代甲醇，是一种测量溶剂。tms(四甲基硅烷)用作内标。1h-nmr中多重性的含义为s=单峰，d=二重峰，t=三重峰，q=四重峰，m=多重峰，brs=宽单峰。
(实施例1)
n-[(苄基氧基)羰基]甘氨酰基甘氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯
[化91]
向n-[(苄基氧基)羰基]甘氨酰基甘氨酸(200.00g,0.751mol)和乙腈(2.0l)的混合物中加入n-羟基琥珀酰亚胺(95.10g,0.826mol)和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(172.80g,0.901mol)，并将所得混合物在室温搅拌约4小时。将反应溶液冷却至1℃并搅拌约3小时。过滤沉淀，并用乙腈(400ml)洗涤过滤分离的粉末。在减压下在40℃干燥所得粉末以获得n-[(苄基氧基)羰基]甘氨酰基甘氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(221.6g,0.610mol,收率:81.2%)。
(实施例2)
n-[(苄基氧基)羰基]甘氨酰基甘氨酰基-l-苯丙氨酸
[化92]
向l-苯丙氨酸(80.0g,0.487mol)、乙腈(400ml)和水(400ml)的混合物中加入三乙胺(74.7ml,0.536mol)和n-[(苄基氧基)羰基]甘氨酰基甘氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(212.4g,0.585mol)，并将所得混合物在室温搅拌约2小时。将水(800ml)和浓盐酸(40.6ml)加入反应溶液中，然后加入n-[(苄基氧基)羰基]甘氨酰基甘氨酰基-l-苯丙氨酸(80mg)，并将所得混合物在室温搅拌约6小时。过滤沉淀，并用水(160ml)洗涤过滤分离的粉末。将所得粉末在减压下在40℃干燥以获得n-[(苄基氧基)羰基]甘氨酰基甘氨酰基-l-苯丙氨酸(157.2g,0.380mol,收率:78.0%)。
(实施例3)
乙酸({n-[(9h-芴-9-基甲氧基)羰基]甘氨酰基}氨基)甲酯
[化93]
向n-[(9h-芴-基甲氧基)羰基]甘氨酰基甘氨酸(650.0g,1.834mol)中加入四氢呋喃(9.75l)和乙酸(1.95l)，并通过温热至40℃溶解所得混合物。向其中加入四乙酸铅(1301.3g,2.935mol)，并将所得混合物回流约1.5小时。冷却至室温后，滤出不溶物，然后用乙酸乙酯(3.25l)洗涤过滤分离的不溶物，并将洗液与滤液合并。向所得溶液中加入20(w/v)%柠檬酸三钠二水合物水溶液(3.25l)，搅拌所得混合物并分离为有机层和水层。除去水层。用20(w/v)%柠檬酸三钠二水合物水溶液(3.25l)洗涤所得有机层两次，然后在减压下将有机层浓缩至6.5l。向残留物中加入水(1.95l)，然后加入乙酸({n-[(9h-芴-9-基甲氧基)羰基]甘氨酰基}氨基)甲酯(0.65g)，并将所得混合物在室温搅拌约1小时。向其中滴加水(6.5l)，并将所得混合物冷却至0-5℃并搅拌约3小时。过滤沉淀，并用冷30(v/v)%四氢呋喃水溶液(2.6l)洗涤过滤分离的粉末。将所得粉末在减压下在40℃干燥以获得乙酸({n-[(9h-芴-9-基甲氧基)羰基]甘氨酰基}氨基)甲酯(617.1g,1.675mol,收率:91.3%)。
(实施例4)
[({n-[(9h-芴-9-基甲氧基)羰基]甘氨酰基}氨基)甲氧基]乙酸苄酯
[化94]
向乙酸({n-[(9h-芴-9-基甲氧基)羰基]甘氨酰基}氨基)甲酯(610.0g,1.656mol)和1,2-二甲氧基乙烷(9.15l)的混合物中加入乙醇酸苄酯(470ml,3.312mol)，并将所得混合物冷却至0-5℃。向其中加入10mol/l氢氧化钠溶液(162.6ml,1.626mol)，并将所得混合物搅拌约1小时。向其中加入乙酸(47.4ml)，并将所得混合物在1℃搅拌约1小时。然后，向其中滴加水(2.0l)，然后加入({n-[(9h-芴-9-基甲氧基)羰基]甘氨酰基}氨基)甲氧基]乙酸苄酯(0.61g)，并将所得混合物在0-5℃搅拌约1小时。向其中滴加水(4.7l)，并将所得混合物在0-5℃搅拌约2.5小时。过滤沉淀，并用冷50(v/v)%1,2-二甲氧基乙烷水溶液(2.44l)洗涤过滤分离的粉末。向所得湿粉末中加入1,2-二甲氧基乙烷(9.15l)，并通过在室温搅拌约30分钟溶解所得混合物。向其中加入水(3.66l)，然后加入[({n-[(9h-芴-9-基甲氧基)羰基]甘氨酰基}氨基)甲氧基]乙酸苄酯(0.61g)，并将所得混合物在室温搅拌约1小时。向其中滴加水(3.05l)，并将所得混合物在室温搅拌约1小时。冷却至0-5℃并搅拌约1小时后，过滤沉淀，并用冷50(v/v)%1,2-二甲氧基乙烷水溶液(2.44l)洗涤过滤分离的粉末。向所得湿粉末中加入1,2-二甲氧基乙烷(9.0l)，并通过在室温搅拌约30分钟溶解所得混合物。向其中加入水(3.6l)，然后加入[({n-[(9h-芴-9-基甲氧基)羰基]甘氨酰基}氨基)甲氧基]乙酸苄酯(0.01g)，并将所得混合物在室温搅拌约1小时。向其中滴加水(3.0l)，并将所得混合物在室温搅拌约1小时。冷却至0-5℃并搅拌约1小时后，过滤沉淀，并用冷50%(v/v)1,2-二甲氧基乙烷水溶液(2.4l)洗涤过滤分离的粉末。向所得湿粉末中加入1,2-二甲氧基乙烷(9.0l)，并通过在室温搅拌约20分钟溶解所得混合物。向其中加入水(3.6l)，然后加入[({n-[(9h-芴-9-基甲氧基)羰基]甘氨酰基}氨基)甲氧基]乙酸苄酯(0.15g)，并将所得混合物在室温搅拌约2小时。向其中滴加水(3.0l)，并将所得混合物在室温搅拌约1小时。冷却至0-5℃并搅拌约2小时后，过滤沉淀，并用冷50(v/v)%1,2-二甲氧基乙烷水溶液(2.4l)洗涤过滤分离的粉末。将所得粉末在减压下在40℃干燥以获得粗制[({n-[(9h-芴-9-基甲氧基)羰基]甘氨酰基}氨基)甲氧基]乙酸苄酯。向所得粗制[({n-[(9h-芴-9-基甲氧基)羰基]甘氨酰基}氨基)甲氧基]乙酸苄酯中加入甲苯(12l)，并通过加热至70℃溶解所得混合物。冷却至0-5℃并搅拌约2小时后，过滤沉淀，并用冷甲苯(2.4l)洗涤过滤分离的粉末。将所得粉末在减压下在40℃干燥以获得[({n-[(9h-芴-9-基甲氧基)羰基]甘氨酰基}氨基)甲氧基]乙酸苄酯(575.5g,1.213mol,收率:73.2%)。
(实施例5)
甘氨酰基甘氨酰基-l-苯丙氨酰基-n-[(羧基甲氧基)甲基]甘氨酰胺
[化95]
向[({n-[(9h-芴-9-基甲氧基)羰基]甘氨酰基}氨基)甲氧基]乙酸苄酯(340.0g,0.717mol)和乙腈(10.2l)的混合物中加入1,8-二氮杂双环[5,4,0]-7-十一碳烯(53.6ml,0.358mol)，并将所得混合物在室温搅拌约2小时。冷却至0-5℃后，向其中加入1-羟基苯并三唑一水合物(132.0g,0.862mol)和n-[(苄基氧基)羰基]甘氨酰基甘氨酰基-l-苯丙氨酸(311.0g,0.752mol)，然后分批加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(158.0g,0.824mol)，并将所得混合物在0-5℃搅拌约1小时。向其中加入10(w/v)%磷酸盐缓冲溶液(ph3,3.4l)，并将所得混合物温热至室温。分离为有机层和水层并除去水层后，在减压下将有机层浓缩至3.7l。向残留物中加入乙酸乙酯(3.4l)和水(1.7l)，并将所得混合物分离为有机层和水层。除去水层。向其中加入10(w/v)%碳酸氢钾水溶液(3.4l)，并将所得混合物分离为有机层和水层。除去水层。向其中加入10(w/v)%碳酸氢钾水溶液(3.4l)，并将所得混合物搅拌并分离为有机层和水层。除去水层。向其中加入水(3.4l)，并搅拌所得混合物。分离为有机层和水层并除去水层后，将有机层在减压下浓缩至1.5l。向残留物中加入2-甲氧基乙醇(3.74l)，并将所得混合物在减压下浓缩至3.06l。将残余物转移至20l高压釜中，然后向其中加入四氢呋喃(1.36l)、水(3.4l)和5%钯碳(72.6g,水含量:53.2%)，并将气氛换为氢气。在室温搅拌约19小时后，将气氛换为氮气，然后向其中加入水(360ml)，并将所得混合物在室温搅拌约30分钟。通过过滤分离钯碳，然后用水(1.36l)洗涤钯碳，并将洗液与滤液合并。向其中加入乙酸乙酯(0.85l)和正庚烷(2.55l)，并将所得混合物搅拌，然后分离为有机层和水层。将有机层取出并在减压下浓缩至1.6l。向残余物中加入水(221ml)和2-甲氧基乙醇(126ml)，然后加入甘氨酰基甘氨酰基-l-苯丙氨酰基-n-[(羧基甲氧基)甲基]甘氨酰胺(0.34g)，并将所得混合物加热至40℃并搅拌约19小时。向其中滴加乙醇(3.4l)，并将所得混合物在室温搅拌约18小时。过滤沉淀，并用乙醇(1.02l)洗涤过滤分离的粉末。将所得粉末在减压下在40℃干燥以获得甘氨酰基甘氨酰基-l-苯丙氨酰基-n-[(羧基甲氧基)甲基]甘氨酰胺(243.7g,0.576mol,收率:80.3%)。
(实施例6)
[(甘氨酰基氨基)甲氧基]乙酸苄酯1h-苯并三唑-1-醇
[化96]
向[({n-[(9h-芴-9-基甲氧基)羰基]甘氨酰基}氨基)甲氧基]乙酸苄酯(50.00g,105.4mmol)和乙腈(1.5l)的混合物中加入1,8-二氮杂双环[5,4,0]-7-十一碳烯(8.02g,52.7mmol)，并将所得混合物在室温搅拌约4小时。在室温下向其中分批加入1-羟基苯并三唑一水合物(35.51g,231.9mmol)，并将所得混合物搅拌约30分钟。将反应混合物冷却至1℃并搅拌约11小时。过滤沉淀，并用乙腈(250ml)洗涤过滤分离的粉末。将所得粉末在减压下在40℃干燥以获得[(甘氨酰基氨基)甲氧基]乙酸苄酯1h-苯并三唑-1-醇(38.98g,100.6mol,收率:95.4%)。
(实施例7)
n-[(苄基氧基)羧基]甘氨酰基甘氨酰基-l-苯丙氨酰基-n-{[2-(苄基氧基)-2-氧代乙氧基]甲基}甘氨酰胺
[化97]
向n-[(苄基氧基)羰基]甘氨酰基甘氨酰基-l-苯丙氨酸(10.99g,26.58mmol)、乙腈(120ml)和水(20ml)的混合物中加入[(甘氨酰基氨基)甲氧基]乙酸苄酯1h-苯并三唑-1-醇(10.00g,25.81mmol)，并将所得混合物冷却至2℃。向其中加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(5.70g,29.73mmol)，并将所得混合物在0-5℃搅拌约3.5小时。将乙醇(100ml)和水(150ml)加入反应溶液中，并将所得混合物在室温搅拌14小时。向其中分批加入水(130ml)，并将所得混合物搅拌2小时，然后冷却至1℃并搅拌约1小时。过滤沉淀，并用乙腈:水=1:2(60ml)洗涤过滤分离的粉末。将所得粉末在减压下在40℃干燥以获得n-[(苄基氧基)羧基]甘氨酰基甘氨酰基-l-苯丙氨酰基-n-{[2-(苄基氧基)-2-氧代乙氧基]甲基}甘氨酰胺(15.34g,23.68mmol,收率:91.7%)。
(实施例8)
甘氨酰基甘氨酰基-l-苯丙氨酰基-n-[(羧基甲氧基)甲基]甘氨酰胺
[化98]
向n-[(苄基氧基)羧基]甘氨酰基甘氨酰基-l-苯丙氨酰基-n-{[2-(苄基氧基)-2-氧代乙氧基]甲基}甘氨酰胺(15.0g,23.16mmol)、四氢呋喃(315ml)和水(210ml)的混合物中加入5%钯碳(3.31g,水含量:54.7%)，并将气氛换为氢气。在室温搅拌约2.5小时后，将气氛换为氮气。通过过滤分离钯碳，然后用水(60ml)洗涤钯碳，并将洗液与滤液合并。将所得滤液在减压下浓缩至240ml。向残余物中加入乙醇(150ml)，并将所得混合物在减压下浓缩至180ml。向残余物中加入乙醇(150ml)，并将所得混合物在减压下浓缩至135ml。向残余物中加入乙醇(150ml)，并将所得混合物在减压下浓缩至90ml。向残余物中加入乙醇(300ml)，并将所得混合物搅拌17小时。过滤沉淀，并用乙醇(75ml)洗涤过滤分离的粉末。将所得粉末在减压下在40℃干燥以获得甘氨酰基甘氨酰基-l-苯丙氨酰基-n-[(羧基甲氧基)甲基]甘氨酰胺(8.95g,21.14mmol,收率:91.3%)。
(实施例9)
6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酸
[化99]
在25-30℃历经1小时向6-氨基己酸(2.5kg,19.1mol)在乙酸(10l)中的溶液中滴加马来酸酐(1.87kg,19.1mol)在乙酸(10l)中的溶液，并将所得混合物在与上述相同的温度下搅拌2小时。向所得浆液中滴加硫酸(0.93kg,9.55mol)，并将所得混合物加热至100℃，然后搅拌16小时。将反应溶液冷却至30℃，然后在减压下浓缩至7.0l。历经1小时在搅拌条件下将所得浓缩物(约7.0l)滴加至0-5℃的冷水(20l)中，并将所得混合物在与上述相同的温度下搅拌1小时。过滤沉淀，并用冷水(5.0l)洗涤过滤分离的粉末。将所得粉末在减压下在40℃干燥以获得6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酸(1.46kg,6.95mol,收率:36.4%)。
在25-30℃将所得6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酸(1.40kg,6.66mol)溶于乙酸(2.1l)和纯水(1.4l)的混合溶液中。向溶液中加入纯水(0.7l)，然后将所得混合物冷却至20-25℃，然后搅拌2小时。历经1小时向所得悬浮液中滴加纯水(7.0l)，并将所得混合物冷却至0-5℃，然后搅拌1小时。过滤沉淀，并用冷水(2.1l)洗涤过滤分离的粉末。将所得粉末在减压下在40℃干燥以获得6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酸(1.27kg,6.02mol,收率:90.4%)。
(实施例10)
1-{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1h-吡咯-2,5-二酮
[化100]
向6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酸(5.0g,23.6mmol)、n-羟基琥珀酰亚胺(3.0g,26.0mmol)和乙腈(50ml)的混合物中加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(5.45g,28.4mmol)，并将所得混合物在室温搅拌约3.5小时。向其中加入水(100ml)和甲苯(100ml)，并将所得混合物搅拌，然后分离为有机层和水层。除去水层。用水(50ml)洗涤有机层两次，并将有机层在减压下浓缩至25ml。将残余物装入硅胶筒(kp-sil10g)，然后使甲苯:丙酮=9:1(100ml)通过该筒，回收洗脱液并在减压下浓缩至25ml。向残余物中加入1-丁醇(50ml)，然后加入1-{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1h-吡咯-2,5-二酮(10mg)，并将所得混合物在室温搅拌1小时。向其中滴加1-丁醇(50ml)，并将所得混合物冷却至-10℃并搅拌。过滤沉淀并用冷1-丁醇(20ml)洗涤过滤分离的粉末。将所得粉末在减压下在40℃干燥以获得1-{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1h-吡咯-2,5-二酮(6.52g,21.1mmol,收率:89.4%)。
(实施例11)
1-{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1h-吡咯-2,5-二酮
[化101]
将6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酸(1.1kg,5.21mol)、n-羟基琥珀酰亚胺(0.72kg,6.25mol)和乙腈(11l)的混合溶液冷却至-15℃。向其中加入2,6-二甲基吡啶(1.34kg,12.50mol)，然后在-15℃至-10℃历经1小时滴加亚硫酰氯(0.74kg,6.25mol)。向其中加入水(11l)和甲苯(11l)，并将所得混合物搅拌，然后分离为有机层和水层。除去水层。有机层用0-5℃的冷水(11l)洗涤两次并用0-5℃的20%盐水(11l)洗涤，并将有机层在减压下浓缩至5.5l。然后，向残余物中加入甲苯(5.5l)，并将所得混合物在减压下再次浓缩至5.5l。用被甲苯润湿的中性硅胶(silicagel60n,3.3kg)填充漏斗，然后使浓缩物通过其中，并用甲苯:丙酮=9:1(29l)洗涤漏斗以获得滤液。将所得滤液在减压下浓缩至5.5l，然后向残余物中加入1-丁醇(8.8l)，然后将所得混合物在20-25℃搅拌16小时。向其中滴加1-丁醇(13.2l)，并将所得混合物冷却至-15℃并搅拌1小时。过滤沉淀，并用冷1-丁醇(4.4l)洗涤过滤分离的粉末。将所得粉末在减压下在40℃干燥以获得1-{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1h-吡咯-2,5-二酮(1.45kg,4.72mol,收率:90.5%)。
(实施例12)
n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]甘氨酰基甘氨酰基-l-苯丙氨酰基-n-[(羧基甲氧基)甲基]甘氨酰胺
[化102]
向1-{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1h-吡咯-2,5-二酮(291.3g,0.945mol)在乙腈(1.8l)中的溶液中加入甘氨酰基甘氨酰基-l-苯丙氨酰基-n-[(羧基甲氧基)甲基]甘氨酰胺(200.0g,0.472mol)、水(4.2l)和n,n-二异丙基乙胺(48.8g,0.378mol)，并将所得混合物在室温搅拌约9小时。向其中加入乙酸异丙酯(2.0l)、无水磷酸二氢钠(400.0g)和无水磷酸氢二钠(26.0g)，并将所得混合物搅拌，然后分离为有机层和水层。除去有机层。向其中加入四氢呋喃(1.0l)、乙酸乙酯(1.0l)和无水磷酸二氢钠(160.0g)，并将所得混合物搅拌，然后分离为有机层和水层。除去水层。向其中加入10(w/v)%磷酸盐缓冲溶液(ph3.4,0.6l)，并搅拌所得混合物。分离为有机层和水层并除去水层后，将有机层在减压下浓缩至1.0l。向残余物中加入1,2-二甲氧基乙烷(4.0l)，并将所得混合物在减压下浓缩至1.0l。向残余物中加入1,2-二甲氧基乙烷(4.0l)和乙腈(0.4l)，并将所得混合物在减压下浓缩至1.0l。向残余物中加入乙腈(20ml)，测量溶液的水含量，结果为6.1%(相当于18.8ml水)。向其中加入水(19ml)，然后加入n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]甘氨酰基甘氨酰基-l-苯丙氨酰基-n-[(羧基甲氧基)甲基]甘氨酰胺(0.2g)，然后滴加1,2-二甲氧基乙烷(0.8l)，并将所得混合物在室温搅拌约16小时。向其中滴加1,2-二甲氧基乙烷(3.2l)，并将所得混合物在减压下浓缩至4.0l。向残余物中加入1,2-二甲氧基乙烷(1.0l)，并将所得混合物冷却至0-5℃并搅拌约19.5小时。过滤沉淀，并用1,2-二甲氧基乙烷(0.8l)洗涤过滤分离的粉末。将所得粉末在减压下在40℃干燥以获得n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]甘氨酰基甘氨酰基-l-苯丙氨酰基-n-[(羧基甲氧基)甲基]甘氨酰胺(268.3g,0.435mol,收率:92.1%)。
(实施例13)
n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]甘氨酰基甘氨酰基-l-苯丙氨酰基-n-[(羧基甲氧基)甲基]甘氨酰胺的1,2-二甲氧基乙烷加合物
[化103]
向1-{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1h-吡咯-2,5-二酮(72.8g,0.236mol)在乙腈(450.0ml)中的溶液中加入甘氨酰基甘氨酰基-l-苯丙氨酰基-n-[(羧基甲氧基)甲基]甘氨酰胺(50.0g,0.118mol)、水(1050.0ml)和n,n-二异丙基乙胺(16.5ml,0.095mol)，并将所得混合物在室温搅拌约15小时。向其中加入乙酸异丙酯(500.0ml)、无水磷酸二氢钠(100.0g)和无水磷酸氢二钠(6.5g)，并将所得混合物搅拌，然后分离为有机层和水层。除去有机层。向其中加入乙酸异丙酯(500.0ml)，并将所得混合物搅拌，然后分离为有机层和水层。除去有机层。向其中加入1,2-二甲氧基乙烷(250.0ml)、乙酸乙酯(250.0ml)、乙腈(25.0ml)和无水磷酸二氢钠(400.0g)，并将所得混合物搅拌，然后分离为有机层和水层。除去水层。向其中加入乙腈(750.0ml)、水(113.0ml)、氯化钠(30.0g)、无水磷酸二氢钠(7.5g)和磷酸(85%,1.5g,0.012mol)，搅拌所得混合物并分离为有机层和水层。除去水层。向其中加入水(113.0ml)、氯化钠(30.0g)和无水磷酸二氢钠(7.5g)，搅拌所得混合物并分离为有机层和水层。除去水层。向其中加入水(113ml)、氯化钠(30.0g)和无水磷酸二氢钠(7.5g)，并搅拌所得混合物。分离为有机层和水层并除去水层后，将有机层在减压下浓缩至500.0ml。向残余物中加入1,2-二甲氧基乙烷(750.0ml)，然后将所得混合物在减压下浓缩至500.0ml。测量溶液的水含量，结果为6.9%(相当于31.3g水)。向其中加入水(9.5ml)和1,2-二甲氧基乙烷(1.0l)，然后将所得混合物在室温下搅拌约13小时。向其中滴加1,2-二甲氧基乙烷(250.0ml)，并将所得混合物在室温搅拌约5小时，然后在减压下浓缩至1.0l。向残余物中滴加1,2-二甲氧基乙烷(1.0l)，并将所得混合物在室温搅拌约1小时，然后在减压下浓缩至1.0l。向残余物中滴加1,2-二甲氧基乙烷(250.0ml)，并将所得混合物在室温搅拌约16小时。然后过滤沉淀，并用1,2-二甲氧基乙烷(250.0l)洗涤过滤分离的粉末。向所得湿粉末中加入1,2-二甲氧基乙烷(2.0l)和水(65.0ml)，并将所得混合物加热至45℃。搅拌30分钟后，通过过滤分离氯化钠，然后用1,2-二甲氧基乙烷/水(97/3,150ml)洗涤氯化钠，并将洗液与滤液合并。将所得混合物在减压下浓缩至1.0l。向残余物中加入1,2-二甲氧基乙烷(1.0l)，并将所得混合物在室温搅拌约3小时，然后在减压下浓缩至1.0l。向残余物中滴加1,2-二甲氧基乙烷(1.0l)，并将所得混合物在减压下浓缩至1.0l。向残余物中滴加1,2-二甲氧基乙烷(250.0ml)，并将所得混合物在室温搅拌约16小时。然后过滤沉淀，并用1,2-二甲氧基乙烷(250ml)洗涤过滤分离的粉末。将所得粉末在减压(4kpa)在25℃下干燥以获得晶体形式的n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]甘氨酰基甘氨酰基-l-苯丙氨酰基-n-[(羧基甲氧基)甲基]甘氨酰胺(65.7g,0.107mol,收率:90.3%)的1,2-二甲氧基乙烷加合物。
粉末x-射线衍射：
对标题化合物的晶体进行粉末x-射线衍射，该粉末x-射线衍射是通过用铜kα辐射照射而获得的。结果示于表1和图3。在衍射角(2θ)为19.0°和25.0°处观察到主峰。
(实施例14)
n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]甘氨酰基甘氨酰基-l-苯丙氨酰基-n-[(2-{[(1s,9s)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1h,12h-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-1-基]氨基}-2-氧代乙氧基)甲基]甘氨酰胺
[化104]
向(1s,9s)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1h,12h-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-1-铵甲磺酸盐二水合物(总量:154.6g,用2.95%水含量值校正后的内在含量:150.0g,0.282mol)在四氢呋喃(1.8l)中的悬浮液中加入5(w/v)%硫酸钠水溶液(1.5l)和n-甲基吗啉(28.5g,0.282mol)，并将所得混合物在32℃搅拌约1小时。向其中加入氰基(羟基亚氨基)乙酸乙酯(8.0g,56.3mmol)、n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]甘氨酰基甘氨酰基-l-苯丙氨酰基-n-[(羧基甲氧基)甲基]甘氨酰胺(总量:232.0g,转化为2.50%1,2-二甲氧基乙烷后的内在含量:226.2g,0.367mol)和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(108.2g,0.564mol)，并将所得混合物在29-32℃搅拌约1小时，然后分离为有机层和水层。除去水层。向其中加入乙酸乙酯(1.8l)和5(v/v)%乙酸水溶液(0.45l)，搅拌所得混合物并分离为有机层和水层。除去水层。向其中加入活性碳(15.0g,kyoryokushirasagi(由osakagaschemicalsco.,ltd.制造))，并将所得混合物在室温搅拌约30分钟。然后通过过滤分离活性碳，然后用四氢呋喃(0.45l)洗涤活性碳，并将洗液与滤液合并。将所得混合物在减压下浓缩至0.75l。向残余物中加入1-丙醇(1.5l)，并将所得混合物在减压下浓缩至0.75l。向残余物中加入丙酮:1-丙醇=1:1(3.0l)。向其中加入n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]甘氨酰基甘氨酰基-l-苯丙氨酰基-n-[(2-{[(1s,9s)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1h,12h-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-1-基]氨基}-2-氧代乙氧基)甲基]甘氨酰胺(0.15g)，并将所得混合物在室温搅拌约45小时。过滤沉淀，并用丙酮:1-丙醇=1:1(0.6l)洗涤过滤分离的粉末。通过加入四氢呋喃(1.5l)和水(0.3l)溶解所得湿粉末，并将溶液在减压下浓缩至0.75l。向残余物中加入1-丙醇(1.5l)，并将所得混合物在减压下浓缩至0.75l。向残余物中加入丙酮:1-丙醇=1:1(3.0l)。向其中加入n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]甘氨酰基甘氨酰基-l-苯丙氨酰基-n-[(2-{[(1s,9s)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1h,12h-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-1-基]氨基}-2-氧代乙氧基)甲基]甘氨酰胺(0.15g)，并将所得混合物在室温搅拌约24小时。过滤沉淀，并用丙酮:1-丙醇=1:1(0.6l)洗涤通过过滤分离的晶体。将所得晶体在减压下在40℃下干燥以获得晶体形式的n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]甘氨酰基甘氨酰基-l-苯丙氨酰基-n-[(2-{[(1s,9s)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1h,12h-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-1-基]氨基}-2-氧代乙氧基)甲基]甘氨酰胺(254.6g,收率:87.3%)。
粉末x-射线衍射：
对标题化合物的晶体进行粉末x-射线衍射，该粉末x-射线衍射是通过用铜kα射线照射而获得的。结果示于表2和图4。在衍射角(2θ)为5.6º、15.5º和22.0º处观察到主峰。
(实施例15)
乙酸({n-[(9h-芴-9-基甲氧基)羰基]甘氨酰基}氨基)甲酯
[化105]
在氮气气氛下向n-9-芴基甲氧基羰基甘氨酰基甘氨酸(2.85kg,8.04mol)在无水四氢呋喃(38.0kg)中的悬浮液中加入乙酸(2.41kg,40.1mol)和四乙酸铅(iv)(5.35kg,12.0mol)，并将所得混合物回流1.5小时。冷却至室温后，通过过滤分离沉淀的固体，并用四氢呋喃(10.1kg)洗涤由此通过过滤分离的固体。将所得滤液和洗液在减压下浓缩直至液体的量变为约16l。向所得浓缩物中加入乙酸乙酯(26kg)、10%柠檬酸水溶液(17.1l)和20%盐水(5.7l)，并将所得混合物搅拌，然后分离为有机层和水层。将所得有机层分离为有机层和水层并用10%柠檬酸水溶液(17.1l)、9%碳酸氢钠水溶液(28.5l)和20%盐水(14.3l)按此顺序洗涤。向所得有机层中加入硅胶60(5.7kg)和乙酸乙酯(10.3kg)，并搅拌所得混合物1小时。然后，通过过滤分离固体，并用乙酸乙酯(7.7kg)洗涤由此通过过滤分离的固体。将所得滤液和洗液在减压下浓缩直至液体量变为约5l。向残余物中加入环戊基甲基醚(24.5kg)。将所得混合物在减压下再次浓缩直至液体量变为约5l。向所得浓缩物中加入环戊基甲基醚(14.7kg)，并将所得混合物在约5℃搅拌1小时。过滤沉淀的固体，并用冷却至约5℃的环戊基甲基醚(4.9kg)洗涤所得晶体。将所得晶体在减压下在40℃干燥以获得为无色固体的标题化合物(2.01kg,收率:68%)。
(实施例16)
[({n-[(9h-芴-9-基甲氧基)羰基]甘氨酰基}氨基)甲氧基]乙酸苄酯
[化106]
在氮气气氛下向乙酸({n-[(9h-芴-9-基甲氧基)羰基]甘氨酰基}氨基)甲酯(2.01kg,5.46mol)在无水1,2-二甲氧基乙烷(21kg)中的悬浮液中加入乙醇酸苄酯(1.81kg,10.9mol)，并将所得混合物冷却至约0℃。向其中加入三(五氟苯基)硼烷(142g,0.27mol)，并将所得混合物在与上述相同的温度下搅拌3小时。然后，向其中加入乙酸乙酯(27.1kg)和10%碳酸氢钾水溶液，将所得混合物加热至室温并分离为有机层和水层。将所得有机层分离为有机层和水层并通过加入10%盐水(20.1l)洗涤。将所得有机层在减压下浓缩直至液体量变为约4l。向残余物中加入甲醇(15.7kg)。将所得混合物在减压下浓缩直至液体量变为约4l。向所得浓缩物中加入甲醇(7.8kg)。将所得混合物在减压下浓缩直至液体量变为约4l。向所得浓缩物中加入甲醇(12.5kg)，并将所得混合物冷却至约5℃并搅拌1小时。过滤沉淀的晶体，并用冷却至约5℃的甲醇(4.7kg)洗涤所得晶体。将所得固体在减压下在40℃下干燥以获得标题化合物(2.28kg,收率:88%)。
(实施例17)
[({n-[(9h-芴-9-基甲氧基)羰基]甘氨酰基甘氨酰基-l-苯丙氨酰基}氨基)甲氧基]乙酸苄酯
[化107]
在氮气气氛下向[({n-[(9h-芴-9-基甲氧基)羰基]甘氨酰基}氨基)甲氧基]乙酸苄酯(2.28kg,4.81mol)在n,n-二甲基乙酰胺(15.0kg)中的溶液中加入1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(0.37kg,2.4mol)，并将所得混合物在室温搅拌30分钟。向其中加入吡啶鎓对甲苯磺酸盐(0.60kg,2.4mol)、1-羟基苯并三唑一水合物(0.74kg,4.8mol)、n-[(9h-芴-9-基甲氧基)羰基]甘氨酰基甘氨酰基-l-苯丙氨酸(2.19kg,4.37mol)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(0.84kg,4.37mol)，并将所得混合物在室温搅拌3小时。向其中加入乙酸乙酯(21.0kg)和10%盐水(34l)，并将所得混合物搅拌，然后分离为有机层和水层。将所得有机层分离为有机层和水层并用10%柠檬酸水溶液(11.4l)洗涤。向所得有机层中加入四氢呋喃(20kg)和15%碳酸氢钾水溶液(22.8l)，搅拌所得混合物并分离为有机层和水层。将所得有机层分离为有机层和水层并用10%盐水(22.8l)洗涤。将所得有机层在减压下浓缩直至液体量变为约6.8l。向残余物中加入2-丙醇(12.4kg)。将所得混合物在减压下再次浓缩直至液体量变为约6.8l。在约50℃温热下向所得浓缩物中加入2-丙醇(30.2kg)。将所得混合物在与上述相同的温度下搅拌1小时，然后冷却至约5℃，并进一步搅拌2小时。过滤沉淀的固体，并用冷却至约5℃的2-丙醇(14.2kg)洗涤通过过滤分离的固体。将所得晶体2悬浮在2-丙醇(36kg)中，并将悬浮液在约5℃搅拌1小时。然后，过滤沉淀的固体，并用冷却至约5℃的2-丙醇(28.5kg)洗涤通过过滤分离的固体。将所得晶体在减压下在50℃下干燥以获得标题化合物(3.34kg,收率:94%)。
(实施例18)
n-[(9h-芴-9-基甲氧基)羰基]甘氨酰基甘氨酰基-l-苯丙氨酰基-n-[(羧基甲氧基)甲基]甘氨酰胺
[化108]
向[({n-[(9h-芴-9-基甲氧基)羰基]甘氨酰基甘氨酰基-l-苯丙氨酰基}氨基)甲氧基]乙酸苄酯(367g,0.499mol)在四氢呋喃(5.88kg)和水(1.61l)中的悬浮液中加入钯碳-乙二胺复合物(28g)，并将所得混合物在室温在常压的氢气气氛下搅拌1小时至3小时。通过过滤分离催化剂，并用四氢呋喃(1.63kg)洗涤由此通过过滤分离的催化剂以获得滤液和洗液。将上述反应和过滤分离催化剂的操作反复进行9次，并将所得9份滤液和洗液合并。将所得混合物在减压下浓缩直至液体量变为约17l。向所得浓缩物中加入2-丙醇(39kg)，并将在减压下浓缩直至液体量变为约17l的操作反复进行3次。向所得浓缩物中加入乙酸乙酯(45kg)，并将所得混合物在室温搅拌6小时。将该悬浮液在约5℃进一步搅拌1小时。过滤沉淀的固体，并用冷却至约5℃的2-丙醇和乙酸乙酯的1:3混合溶液(23.1l)洗涤通过过滤分离的固体。将所得晶体在减压下在40℃下干燥以获得粗制形式的标题化合物(2.18kg,收率:75%)。将所得的粗制形式(400g,0.62mol)悬浮于四氢呋喃(2.4l)和乙酸乙酯(5.6l)中。向悬浮液中加入1%硫酸氢钾水溶液(4l)，并通过温热至约32℃并搅拌来溶解所得混合物。分离为有机层和水层后，将所得有机层分离为有机层和水层并用水(2l)洗涤。将所得有机层在减压下浓缩直至液体量变为约2l。向所得浓缩物中加入乙腈(6l)，并将所得混合物在减压下浓缩直至液体量变为约2.8l。结果，使固体沉淀。向其中加入乙酸乙酯(6l)，并将所得混合物在室温搅拌18小时，然后冷却至约5℃并搅拌3小时。过滤沉淀的固体并用乙腈和乙酸乙酯的1:2混合溶液(7l)洗涤通过过滤分离的晶体。将所得固体在减压下在40℃下干燥以获得标题化合物(356g,收率:89%)。
(实施例19)
n-[(9h-芴-9-基甲氧基)羰基]甘氨酰基甘氨酰基-l-苯丙氨酰基-n-[(2-{[(1s,9s)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1h,12h-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-1-基]氨基}-2-氧代乙氧基)甲基]甘氨酰胺
[化109]
在氮气气氛下向(1s,9s)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1h,12h-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-1-铵甲磺酸盐二水合物(260g,0.458mol)在二甲基亚砜(1.8l)和四氢呋喃(1.3l)中的悬浮液中加入三乙胺(55.6g,0.549mol)、1-羟基苯并三唑一水合物(84.2g,0.549mol)、n-[(9h-芴-9-基甲氧基)羰基]甘氨酰基甘氨酰基-l-苯丙氨酰基-n-[(羧基甲氧基)甲基]甘氨酰胺(325g,0.503mol)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(114g,0.595mol)，并将所得混合物在室温搅拌2小时。向其中加入四氢呋喃(3.9l)、乙酸乙酯(2.6l)和11%碳酸氢钾水溶液(5.2l)，搅拌所得混合物并分离为有机层和水层。用19%柠檬酸水溶液(3.9l)、22%碳酸氢钾水溶液(2.6l)和18%盐水(0.78l)按此顺序洗涤所得有机层。向所得有机层中加入活性碳(52g)，并搅拌所得混合物30分钟。然后，向其中加入四氢呋喃(0.78l)和无水硫酸镁(0.78g)，并将所得混合物搅拌30分钟。通过过滤分离固体，并用四氢呋喃(0.78l)洗涤由此通过过滤分离的固体。将所得滤液和洗液在减压下浓缩直至液体量变为约200ml。向所得浓缩物中加入乙酸乙酯(1.3l)并将所得混合物在减压下浓缩直至液体量变为约200ml。向所得浓缩物中加入四氢呋喃(1.8l)。历经12分钟将所得溶液滴加至在另一容器中制备的乙酸乙酯(1.3l)和环戊基甲基醚(1.3l)的混合溶液中。向该悬浮液中加入环戊基甲基醚(2.6l)，并将所得混合物搅拌18小时，然后冷却至约5℃并进一步搅拌1小时。过滤沉淀的固体，并用四氢呋喃和环戊基甲基醚的1:3混合溶液(1.3l)洗涤通过过滤分离的固体。将所得固体在减压下在40℃下干燥以获得标题化合物(408g,收率:84%)。
(实施例20)
甘氨酰基甘氨酰基-l-苯丙氨酰基-n-[(2-{[(1s,9s)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1h,12h-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-1-基]氨基}-2-氧代乙氧基)甲基]甘氨酰胺
[化110]
在氮气流下分8份每5分钟向n-[(9h-芴-9-基甲氧基)羰基]甘氨酰基甘氨酰基-l-苯丙氨酰基-n-[(2-{[(1s,9s)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1h,12h-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-1-基]氨基}-2-氧代乙氧基)甲基]甘氨酰胺(400g,0.376mol)在脱水四氢呋喃(8l)中的悬浮液中加入1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(51.6g,0.339mol)，并将所得混合物搅拌2.5小时。在氮气流下过滤沉淀的固体，并用四氢呋喃(2.4l)洗涤通过过滤分离的固体。将所得固体在减压下在40℃下干燥以获得含有标题化合物的混合物(363g,收率:115%)。
(实施例21)
制备n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]甘氨酰基甘氨酰基-l-苯丙氨酰基-n-[(2-{[(1s,9s)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1h,12h-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-1-基]氨基}-2-氧代乙氧基)甲基]甘氨酰胺的晶种
[化111]
向甘氨酰基甘氨酰基-l-苯丙氨酰基-n-[(2-{[(1s,9s)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1h,12h-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-1-基]氨基}-2-氧代乙氧基)甲基]甘氨酰胺(200mg,0.24mmol)在吡啶(0.2ml)、四氢呋喃(2.0ml)和乙腈(0.6ml)中的悬浮液中加入吡啶鎓对甲苯磺酸盐(120mg,0.48mmol)、三乙胺(100μl,0.72mmol)和6-马来酰亚胺基己酸n-琥珀酰亚胺酯(73mg,0.24mmol)，并将所得混合物在室温搅拌3小时。通过硅胶快速柱色谱法(biotageab)[四氢呋喃:丙酮=3:7至7:3(v/v)]纯化反应溶液以获得为油状物的标题化合物。向19.5mg所得油状物中加入丙酮(0.4ml)和2-丁醇(0.2ml)，并将所得混合物温热至约60℃。将沉淀的固体在室温下过滤，并用2-丁醇(约0.2ml)洗涤通过过滤分离的固体以获得为无色粉末的标题化合物(14.3mg)。将所得粉末用作下一反应的晶种。
(实施例22)
n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]甘氨酰基甘氨酰基-l-苯丙氨酰基-n-[(2-{[(1s,9s)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1h,12h-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-1-基]氨基}-2-氧代乙氧基)甲基]甘氨酰胺
[化112]
在氮气气氛下，在吡啶(0.35l)、乙腈(1.1l)和四氢呋喃(3.5l)中溶解吡啶鎓对甲苯磺酸盐(209g,0.832mol)、6-马来酰亚胺基己酸n-琥珀酰亚胺酯(128g,0.415mol)和甘氨酰基甘氨酰基-l-苯丙氨酰基-n-[(2-{[(1s,9s)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1h,12h-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-1-基]氨基}-2-氧代乙氧基)甲基]甘氨酰胺(350g,0.416mol)。然后向溶液中加入三乙胺(63.2g,0.625mol)，并将所得混合物在室温搅拌3.5小时。向其中加入四氢呋喃(3.5l)、19%柠檬酸水溶液(3.5l)、乙酸乙酯(2.5l)和18%盐水(2.5l)，并将所得混合物搅拌，然后分离为有机层和水层。向所得有机层中加入19%柠檬酸水溶液(2.5l)和18%盐水(2.5l)，并将所得混合物搅拌，然后分离为有机层和水层。将所得有机层分离为有机层和水层并用22%碳酸氢钾水溶液(2.1l)和随后用18%盐水(1.8l)洗涤。将所得有机层滴加至在另一容器中制备的活性碳(35g)在乙腈(35l)中的悬浮液中，并将所得混合物搅拌30分钟。然后，通过过滤分离活性碳，并用乙腈(1.8l)洗涤由此通过过滤分离的活性碳。将所得滤液和洗液在减压下在约40℃的外部温度下浓缩直至不再蒸馏出溶剂。向所得浓缩残余物中按此顺序加入丙酮(1.8l)和1-丙醇(3.5l)，并通过温热至55℃溶解所得混合物。然后，将溶液冷却至室温。向其中加入实施例21中得到的粉末(0.2g)作为晶种，并将所得混合物搅拌86小时。然后，过滤沉淀的固体，并用丙酮(1.1l)洗涤通过过滤分离的固体。将所得固体在减压下在40℃下干燥以获得晶体形式的标题化合物(191g,收率:44%)。
(实施例23)
n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]甘氨酰基甘氨酰基-l-苯丙氨酰基-n-[(2-{[(1s,9s)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1h,12h-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-1-基]氨基}-2-氧代乙氧基)甲基]甘氨酰胺
[化113]
在20-30℃下向无水硫酸钠(1.8g)、氰基(羟基亚氨基)乙酸乙酯(0.16g,1.13mmol)和含有n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]甘氨酰基甘氨酰基-l-苯丙氨酰基-n-[(羧基甲氧基)甲基]甘氨酰胺(总量:5.76g,转化为12.40%1,2-二甲氧基乙烷后的内在含量:5.05g,8.18mmol)的纯水和四氢呋喃(24ml和18ml)的混合溶液中加入含有(1s,9s)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1h,12h-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-1-铵甲磺酸盐(3.0g,5.64mmol)的纯水和四氢呋喃(9ml和15ml)的混合悬浮液。向混合溶液中加入四氢呋喃(9ml)和含有n-甲基吗啉(0.63g,6.23mmol)的四氢呋喃溶液(7.5ml)，并在与上述相同的温度下搅拌所得混合物15分钟。然后，向其中加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(2.16g,11.27mmol)和纯水和四氢呋喃(1.5ml和1.5ml)的混合溶液。将混合溶液在20-30℃搅拌30分钟或更长时间。确认终止反应后，将反应混合物分离为有机层和水层并除去水层。将有机层的温度调节为15至25℃，然后向其中加入乙酸乙酯(36ml)、无水硫酸钠(1.26g)和含有n-甲基吗啉(0.14g,1.38mmol)的纯水(24ml)，搅拌所得混合物并分离为有机层和水层。除去水层。向有机层中加入纯水(9ml)，搅拌所得混合物并分离为有机层和水层。向其中进一步加入含有乙酸(0.45ml)的纯水(9ml)，搅拌所得混合物并分离为有机层和水层以获得有机层。向其中加入活性碳(0.30g,kyoryokushirasagi(由osakagaschemicalsco.,ltd.制造))，并将所得混合物在室温搅拌约15分钟。然后通过过滤分离活性碳，然后用四氢呋喃(9ml)洗涤活性碳，并将洗液与滤液合并。将所得混合物在减压下浓缩至30ml。向浓缩物中加入四氢呋喃(75ml)，并将所得混合物在减压下浓缩至30ml。向残余物中进一步加入四氢呋喃(45ml)，并将所得混合物在减压下浓缩至30ml。确认浓缩物的水含量为8.0%(v/v)或更少后，向其中加入丙酮和1-丙醇(30ml和71ml)的混合溶液。向其中加入n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]甘氨酰基甘氨酰基-l-苯丙氨酰基-n-[(2-{[(1s,9s)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1h,12h-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-1-基]氨基}-2-氧代乙氧基)甲基]甘氨酰胺(30mg)，并将所得混合物在20-30℃搅拌12小时或更长时间。将悬浮液冷却至0-5℃，然后进一步搅拌24小时或更长时间。过滤沉淀，并在0-5℃用丙酮和1-丙醇的1:1混合溶液(30ml)洗涤过滤分离的粉末。将所得晶体在减压下在35℃下干燥以获得n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]甘氨酰基甘氨酰基-l-苯丙氨酰基-n-[(2-{[(1s,9s)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1h,12h-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-1-基]氨基}-2-氧代乙氧基)甲基]甘氨酰胺的粗制晶体(5.23g,收率:89.6%)。
向n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]甘氨酰基甘氨酰基-l-苯丙氨酰基-n-[(2-{[(1s,9s)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1h,12h-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-1-基]氨基}-2-氧代乙氧基)甲基]甘氨酰胺(4.50g,4.35mmol)的粗制晶体中加入含有乙酸(15μl)的丙酮和纯水(10.6mland2.9ml)的混合溶液，将所得混合物在34-38℃搅拌1小时或更长时间。确认溶解后，将溶液冷却至20-25℃。向其中加入丙酮和1-丙醇(31.5ml和64.8ml)的混合溶液，然后加入n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]甘氨酰基甘氨酰基-l-苯丙氨酰基-n-[(2-{[(1s,9s)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1h,12h-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-1-基]氨基}-2-氧代乙氧基)甲基]甘氨酰胺(27mg)，并将所得混合物在20-25℃搅拌24小时或更长时间。将悬浮液冷却至0-5℃，然后进一步搅拌12小时或更长时间。过滤沉淀，并在0-5℃用丙酮和1-丙醇的1:1混合溶液(27ml)洗涤通过过滤分离的粉末。将所得晶体在减压下在35℃下干燥以获得n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]甘氨酰基甘氨酰基-l-苯丙氨酰基-n-[(2-{[(1s,9s)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1h,12h-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-1-基]氨基}-2-氧代乙氧基)甲基]甘氨酰胺(4.37g,收率:93.0%)的纯晶体。
仪器数据类似于实施例14中描述的化合物的仪器数据。
(实施例24)
n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]甘氨酰基甘氨酰基-l-苯丙氨酰基-n-[(2-{[(1s,9s)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1h,12h-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-1-基]氨基}-2-氧代乙氧基)甲基]甘氨酰胺
[化114]
在20-30℃下向无水硫酸钠(1.8g)、氰基(羟基亚氨基)乙酸乙酯(0.16g,1.13mmol)和含有n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]甘氨酰基甘氨酰基-l-苯丙氨酰基-n-[(羧基甲氧基)甲基]甘氨酰胺(总量:5.76g,转化为12.40%1,2-二甲氧基乙烷后的内在含量:5.05g,8.18mmol)的纯水和四氢呋喃(24ml和18ml)的混合溶液中加入含有(1s,9s)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1h,12h-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-1-铵甲磺酸盐(3.0g,5.64mmol)的纯水和四氢呋喃(9ml和15ml)的混合悬浮液。向混合溶液中加入四氢呋喃(9ml)和含有n-甲基吗啉(0.63g,6.23mmol)的四氢呋喃溶液(7.5ml)，并在与上述相同的温度下搅拌所得混合物15分钟。然后，向其中加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(2.16g,11.27mmol)和纯水和四氢呋喃(1.5ml和1.5ml)的混合溶液。将混合溶液在20-30℃搅拌30分钟或更长时间。确认终止反应后，将反应混合物分离为有机层和水层，并除去水层。将有机层的温度调节至15-25℃，然后向其中加入乙酸乙酯(36ml)、无水硫酸钠(1.26g)和含有n-甲基吗啉(0.14g,1.38mmol)的纯水(24ml)，搅拌所得混合物并分离为有机层和水层。除去水层。向有机层中加入纯水(9ml)，搅拌所得混合物并分离为有机层和水层。向其中进一步加入含有乙酸(0.45ml)的纯水(9ml)，搅拌所得混合物并分离为有机层和水层以获得有机层。向其中加入活性碳(0.30g,kyoryokushirasagi(由osakagaschemicalsco.,ltd.制造))，并将所得混合物在室温搅拌约15分钟或更长时间。然后，通过过滤分离活性碳，然后用四氢呋喃(9ml)洗涤活性碳，并将洗液与滤液合并。将所得混合物在减压下浓缩至30ml。向浓缩物中加入四氢呋喃(75ml)，并将所得混合物在减压下浓缩至30ml。向残余物中进一步加入四氢呋喃(45ml)，并将所得混合物在减压下浓缩至30ml。确认浓缩物的水含量为8.0%(v/v)或更少后，向其中加入丙酮和1-丙醇(30ml和71ml)的混合溶液，并将所得混合物在20-30℃搅拌22小时。将悬浮液冷却至0-5℃，然后进一步搅拌24小时或更长时间。过滤沉淀，并在0-5℃用丙酮和1-丙醇的1:1混合溶液(30ml)洗涤过滤分离的粉末。将所得晶体在减压下在35℃下干燥以获得n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]甘氨酰基甘氨酰基-l-苯丙氨酰基-n-[(2-{[(1s,9s)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,10,13,15-六氢-1h,12h-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-1-基]氨基}-2-氧代乙氧基)甲基]甘氨酰胺的晶体(5.08g,收率:87.0%)。
仪器数据与实施例14中描述的化合物的仪器数据类似。
序列表的自由文本
seqidno:1-抗-her2抗体重链的氨基酸序列
seqidno:2-抗-her2抗体轻链的氨基酸序列
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