嵌合多肽及其用途的制作方法

对相关申请的交叉引用

本申请要求2017年9月22日提交的美国临时申请号62/562,223的优先权，该申请通过引用以其整体并入本文。

序列表

本申请含有序列表，其已经以ascii格式电子提交，并且在此通过引用以其整体并入。2018年9月20日创建的所述ascii拷贝命名为kpi-005wo_st25.txt，并且大小为9,531字节。

本公开涉及新的肽和包含此类肽的多肽组合物(例如接头、嵌合多肽、抗原结合分子)以及使用和制备它们的方法。

背景技术：

抗原结合分子，包括抗体，被用于免疫疗法和基于固相的应用中，例如生物传感器，亲和色谱法和免疫测定法。这些抗体和抗原结合分子凭借其特异性结合其靶标的能力而获得其效用。

融合蛋白可以需要接头序列，当用于生物技术和生物治疗应用时其通常基于肽，该接头序列可以用于一系列与科学相关的应用。例如，可以将接头用作间隔物部分，以赋予较大的分子以期望的结构和/或功能特性。在另一个例子中，接头可以几乎不赋予或不赋予较大的分子以结构或功能特性，但是可以简单地用作区别特征(例如，“标记”或“生物标记”或“标签”)，唯一地识别较大的分子。在又一个例子中，接头可以用于赋予可识别的特征，其可以用作抗体针对包含肽序列的较大分子的结合位点。

发明概述

本发明尤其提供了新的肽序列，其允许融合蛋白的正确表达、折叠、鉴定和活性。本文所述的新肽可用于连接融合蛋白(例如scfv)内的结构域，促进各个肽结构域的柔性。scfv构成大多数car构建体的结合结构域。scfv包含igg可变轻链和重链以及连接这两个结构域的柔性肽(例如接头)。接头必须足够长以将结构域连接成单个蛋白质构建体。此外，期望接头或标签构建体不是免疫原性的潜在原因。

由于它们固有的柔性和侧链的简单性，通常使用的接头包括甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸(g4s)(seqidno：32)的重复序列，其在治疗应用中的免疫原性可能较低。whitlow等人在1993年首先描述了18残基的whitlow接头gstsgsgkpgsgegstkg(seqidno：1)。本文所述的肽也可以用作肽标签。在一些实施方案中，融合蛋白包含与本文所述的肽(例如接头)融合的多肽。

本文所述的包含共有序列bpxxxz的新的嵌合多肽组合了期望的属性(例如柔性和降低的免疫原性)，其适于整合到可用于治疗干预的融合蛋白中。

在一方面，本发明提供了包含6-20个氨基酸和共有序列bpxxxz的肽，其中x是甘氨酸(g)或丝氨酸(s)，b是带正电荷的氨基酸且z是甘氨酸(g)或带负电荷的氨基酸。在一个实施方案中，本发明提供肽，其中共有序列是kpgsge(seqidno:4)。在另一个实施方案中，共有序列是gkpgsge(seqidno:5)或gkpgsgg(seqidno:6)。

在一方面，本发明提供了包含6-20个氨基酸和共有序列bpxxxz的肽，其中x是甘氨酸(g)或丝氨酸(s)，b是带正电荷的氨基酸且z是甘氨酸(g)或带负电荷的氨基酸，且其中所述肽不是gstsgsgkpgsgegstkg(seqidno:1),gsgkpgsgeg(seqidno:13),gkpgsgeg(seqidno:14),或sgkpgsge(seqidno:15)。

在一方面，本发明提供了包含8-20个氨基酸和共有序列xbpxxxzx的肽，其中每个x独立地是甘氨酸(g)或丝氨酸(s)，b是带正电荷的氨基酸且z是甘氨酸(g)或带负电荷的氨基酸，和p是脯氨酸。

在一方面，本发明提供了包含8-20个氨基酸和共有序列xbpxxxzx的肽，其中每个x独立地是甘氨酸(g)或丝氨酸(s)，b是带正电荷的氨基酸且z是甘氨酸(g)或带负电荷的氨基酸，和p是脯氨酸，且其中所述肽不是gstsgsgkpgsgegstkg(seqidno:1),gsgkpgsgeg(seqidno:13),gkpgsgeg(seqidno:14),或sgkpgsge(seqidno:15)

在一些实施方案中，本发明提供了包含8-20个氨基酸和共有序列xbpxxxzx的肽，其中每个x独立地是甘氨酸(g)或丝氨酸(s)，b是赖氨酸(k)或精氨酸(r)且z是甘氨酸(g)或带负电荷的氨基酸，和p是脯氨酸。

在一些实施方案中，本发明提供了包含8-20个氨基酸和共有序列xbpxxxzx的肽，其中每个x独立地是甘氨酸(g)或丝氨酸(s)，b是赖氨酸(k)且z是甘氨酸(g)或带负电荷的氨基酸，和p是脯氨酸。

在一些实施方案中，本发明提供了了包含8-20个氨基酸和共有序列xbpxxxzx的肽，其中每个x独立地是甘氨酸(g)或丝氨酸(s)，b是带正电荷的氨基酸且z是甘氨酸(g)，和p是脯氨酸。

在一些实施方案中，z是选自谷氨酸(e)或天冬氨酸(d)的带负电荷的氨基酸。在一些实施方案中，z是谷氨酸(e)。

在一些实施方案中，本发明提供了肽，其中共有序列是gkpgsge(seqidno:5)或gkpgsgg(seqidno:6)。在一些实施方案中，共有序列是gkpgsge(seqidno:5)。在一些实施方案中，肽包含共有序列gsgkpgsgegg(seqidno:31)。

在一些实施方案中，肽包含共有序列的一个或多个重复。在一些实施方案中，重复是连续的。在一些实施方案中，肽重复被1-4个氨基酸分开。在一些实施方案中，肽是xxxgkpgsgexxxgkpgsgexxx(seqidno:3)，其中x是甘氨酸(g)或丝氨酸(s)。

在一些实施方案中，肽不是gstsgsgkpgsgegstkg(seqidno:1),gsgkpgsgeg(seqidno:13),gkpgsgeg(seqidno:14),或sgkpgsge(seqidno:15)。在某些实施方案中，肽不是gstsgsgkpgsgegstkg(seqidno:1)。在某些实施方案中，接头不是gsgkpgsgeg(seqidno:13)。在某些实施方案中，肽不是gkpgsgeg(seqidno:14)。在某些实施方案中，肽不是sgkpgsge(seqidno:15)。

在一些实施方案中，肽包含6-20个氨基酸。在一些实施方案中，肽包含10-20个氨基酸。在一些实施方案中，肽包含14-19个氨基酸。在一些实施方案中，肽包含15-17个氨基酸。在一些实施方案中，肽包含15-16个氨基酸。在一些实施方案中，肽包含16个氨基酸。

在一些实施方案中，肽包含gggsgkpgsgegggs(seqidno:7)的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽包含gggsgkpgsgeggggs(seqidno:8)的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽包含ggggsgkpgsggggs(seqidno:9)的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽包含ggggsgkpgsgeggs(seqidno:10)的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽包含ggggsgkpgsgegggs(seqidno:11)的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽包含ggggsgkpgsgeggggs(seqidno:12)的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽包含stsgsgkpgsgegst(seqidno:17)的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽包含ggggsggggsggggsg(seqidno:18)的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽包含gggggsggggsggggs(seqidno:19)的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽包含ggggsggggsgggggs(seqidno:20)的氨基酸序列。

在一方面，本发明提供了肽，其包含8-20个氨基酸和与gggsgkpgsgegggs(seqidno:7),gggsgkpgsgeggggs(seqidno:8),ggggsgkpgsggggs(seqidno:9),ggggsgkpgsgeggs(seqidno:10),ggggsgkpgsgegggs(seqidno:11),ggggsgkpgsgeggggs(seqidno:12),stsgsgkpgsgegst(seqidno:17),ggggsggggsggggsg(seqidno:18),gggggsggggsggggs(seqidno:19),或ggggsggggsgggggs(seqidno:20)中的任一项至少80％相同的氨基酸序列。

在一些实施方案中，肽包含与gggsgkpgsgegggs(seqidno:7),gggsgkpgsgeggggs(seqidno:8),ggggsgkpgsggggs(seqidno:9),ggggsgkpgsgeggs(seqidno:10),ggggsgkpgsgegggs(seqidno:11),ggggsgkpgsgeggggs(seqidno:12),stsgsgkpgsgegst(seqidno:17),ggggsggggsggggsg(seqidno:18),gggggsggggsggggs(seqidno:19),或ggggsggggsgggggs(seqidno:20)中的任一项至少90％相同的氨基酸序列。

在一方面，本发明提供了肽，其包含8-20个氨基酸和含有在gggsgkpgsgegggs(seqidno:7),gggsgkpgsgeggggs(seqidno:8),ggggsgkpgsggggs(seqidno:9),ggggsgkpgsgeggs(seqidno:10),ggggsgkpgsgegggs(seqidno:11),ggggsgkpgsgeggggs(seqidno:12),stsgsgkpgsgegst(seqidno:17),ggggsggggsggggsg(seqidno:18),gggggsggggsggggs(seqidno:19),或ggggsggggsgggggs(seqidno:20)的任一项中存在的十(10)个连续氨基酸中的至少六(6)个相同氨基酸的氨基酸序列。

在一些实施方案中，肽氨基酸序列含有在gggsgkpgsgegggs(seqidno:7),gggsgkpgsgeggggs(seqidno:8),ggggsgkpgsggggs(seqidno:9),ggggsgkpgsgeggs(seqidno:10),ggggsgkpgsgegggs(seqidno:11),ggggsgkpgsgeggggs(seqidno:12),stsgsgkpgsgegst(seqidno:17),ggggsggggsggggsg(seqidno:18),gggggsggggsggggs(seqidno:19),或ggggsggggsgggggs(seqidno:20)的任一项中存在的十(10)个连续氨基酸中的至少七(7)个、至少八(8)个或至少九(9)个相同氨基酸的氨基酸序列。

在一些实施方案中，肽包含ggggsggggsggggsg(seqidno:18),gggggsggggsggggs(seqidno:19),或ggggsggggsgggggs(seqidno:20)的氨基酸序列。

在一方面，本发明提供了融合蛋白，其包含第一多肽；第二多肽；和如本文所述的肽接头。在一些方面，融合蛋白是抗原结合分子。在一些实施方案中，抗原结合分子式scfv。在一些实施方案中，第一多肽是轻链可变域且第二多肽是重链可变域。在一些实施方案中，融合蛋白是嵌合抗原受体。

在一方面，本发明提供了编码如本文所述的肽(例如接头、标签)的多核苷酸。在一些实施方案中，本发明提供了编码如本文所述的融合蛋白的多核苷酸。

在一方面，本发明提供了表达载体，其包含编码如本文所述的肽(例如接头或融合蛋白)的多核苷酸。在一些实施方案中，本发明提供了重组细胞，其包含编码如本文所述的肽(例如接头或融合蛋白)的多核苷酸。在一些实施方案中，重组细胞包含表达载体，所述表达载体包含编码如本文所述的肽(例如接头或融合蛋白)的多核苷酸。

本文描述的任何方面或实施方案可以与如本文公开的任何其他方面或实施方案组合。尽管已经结合本发明的详细描述描述了本发明，但是前面的描述旨在说明而非限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书的范围限定。其他方面，优点和修改在所附权利要求书的范围内。

本文引用的专利和科学文献建立了本领域技术人员可获得的知识。本文引用的所有美国专利和已公布或未公布的美国专利申请均通过引用并入本文。本文引用的所有公布的外国专利和专利申请均通过引用并入本文。本文引用的所有其他公布的参考文献，词典，文献，手稿和科学文献均通过引用并入本文。

从附图，以下详细描述，包括实施例，和权利要求书中，本发明的其他特征和优点将变得显而易见。

附图简述

当结合附图考虑时，根据以下详细描述，将更清楚地理解上述以及其他特征。然而，附图仅出于说明的目的，而不是为了限制。

图1显示了示例性肽(例如接头)序列的氨基酸序列比对。

图2显示了分别包含seqidno1、21-25、1和26-30的肽的表位作图elisa实验结果的柱状图。

图3显示了分别包含seqidno32、9-11和17的多肽接头的抗体结合概况结果的柱状图。

图4是一系列图，其显示了使用呈现嵌合抗原受体(car)的细胞进行的流式细胞术实验的结果，所述嵌合抗原受体包含肽kl2(seqidno:10)、kl3(seqidno:11)、kl4(seqidno:7)、kl5(seqidno:12)、kl6(seqidno:8)和g4s2(seqidno:18)。

定义

为了使本发明更容易理解，下面首先定义某些术语。对于以下术语和其他术语的附加定义在整个说明书中得以阐述。

如在本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指示物，除非上下文另有明确规定。

除非在上下文中明确说明或显而易见，否则如本文所用，术语“或”应当理解为包含性的并且涵盖“或”和“和”两者。

本文使用的情况下，术语“和/或”视为具有或不具有另一个的两个指定特征或组件中的每一个的具体公开。因此，如在本文中的短语例如“a和/或b”中所使用的术语“和/或”旨在包括a和b；a或b；a(单独)；和b(单独)。同样地，如在短语例如“a、b和/或c”中所使用的术语“和/或”旨在涵盖以下方面的每一个：a、b和c；a、b或c；a或c；a或b；b或c；a和c；a和b；b和c；a(单独)；b(单独)；和c(单独)。

如本文所用，术语“例如”和“即”仅作为实例使用，而无意于限制，并且不应当诠释为仅涉及在说明书中明确列举的那些项目。

术语“或更多”、“至少”、“超过”等，例如“至少一种”应当理解为包括但不限于至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、1920、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149或150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000或超过所述值。还包括其间任何更大的数字或分数。

相反地，术语“不超过”包括小于所述值的每个值。例如，“不超过100个核苷酸”包括100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1和0个核苷酸。还包括其间任何更小的数字或分数。

术语“多个”、“至少两个”、“两个或更多个”、“至少第二个”等应当理解为包括但不限于至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、1920、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149或150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000或更多。还包括其间任何更大的数字或分数。

在整个说明书中，词语“包含”、“包括”将理解为暗指包括所述要素、整数或步骤，或要素、整数或步骤的组，但不排除任何其他要素、整数或步骤，或要素、整数或步骤的组。应当理解的是，在本文中无论何处用语言“包含”描述方面，还提供了以“由......组成”和/或“基本上由......组成”描述的其他类似方面。

除非明确说明或从上下文中显而易见，如本文所用，术语“约”是指如本领域普通技术人员测定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分取决于如何测量或测定值或组成，即测量系统的局限性。例如，“约”或“基本上包含”可以意指按本领域实践的1个或超过1个标准偏差内。“约”或“基本上包含”可以意指高达10％的范围(即±10％)。因此“约”可以理解为在比所叙述的值大或小10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、0.01％或0.001％内。例如，约5mg可以包括4.5mg和5.5mg之间的任何量。此外，特别是关于生物系统或过程，该术语可以意指高达一个数量级或高达5倍的值。当在本公开中提供特定值或组成时，除非另有说明，否则应当假定“约”或“基本上包含”的含义在该特定值或组成的可接受的误差范围内。

如本文所述，除非另有说明，否则任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应当理解为包括所叙述范围内的任何整数的值，并且在适当时包括其分数(例如整数的十分之一和百分之一)。

使用其国际单位制(si)接受的形式提供本文所使用的单位、前缀和符号。数字范围包括定义范围的数字。

除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本公开所涉及领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。例如，juo,“theconcisedictionaryofbiomedicineandmolecularbiology”,2nded.,(2001),crcpress；“thedictionaryofcell&molecularbiology”,5thed.,(2013),academicpress；和“theoxforddictionaryofbiochemistryandmolecularbiology”,cammacketal.编,2nded,(2006),oxforduniversitypress为本领域技术人员提供了本公开中使用的许多术语的通用词典。

“施用”是指使用本领域技术人员已知的任何各种方法和递送系统将药剂物理导入受试者。本文公开的制剂的示例性施用途径包括静脉内、肌肉内、皮下、腹膜内、脊柱或其他肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。如本文所用，短语“肠胃外施用”意指除肠内和局部施用外的施用方式，通常通过注射以及包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、淋巴管内、病灶内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注，以及体内电穿孔。在一些实施方案中，经由非肠胃外途径例如口服施用制剂。其他非肠胃外途径包括局部、表皮或粘膜施用途径，例如鼻内、阴道、直肠、舌下或局部。也可以例如，一次，多次，和/或在一个或多个延长时期内进行施用。

如本文所用，如果抗原与第一结合分子、抗体或其抗原结合分子之间的相互作用阻断、限制、抑制或以其它方式降低参考结合分子、参考抗体或其抗原结合分子与抗原相互作用的能力，则抗原结合分子、抗体或其抗原结合分子与参考抗体或其抗原结合分子“交叉竞争”。交叉竞争可以是完全的，例如结合分子与抗原的结合完全阻断了参考结合分子结合抗原的能力，或其可以是部分的，例如结合分子与抗原的结合降低了参考结合分子结合抗原的能力。在某些实施方案中，与参考抗原结合分子交叉竞争的抗原结合分子与参考抗原结合分子结合相同或重叠的表位。在其它实施方案中，与参考抗原结合分子交叉竞争的抗原结合分子与参考抗原结合分子结合不同的表位。多种类型的竞争性结合测定法可用于确定一种抗原结合分子是否与另一种竞争，例如：固相直接或间接放射免疫测定法(ria)；固相直接或间接酶免疫测定法(eia)；夹心竞争测定法(stahlietal.,1983,methodsinenzymology9:242-253)；固相直接生物素-亲合素eia(kirklandetal.,1986,j.immunol.137:3614-3619)；固相直接标记测定法，固相直接标记夹心测定法(harlowandlane,1988,antibodies,alaboratorymanual,coldspringharborpress)；使用1-125标记的固相直接标记ria(moreletal.,1988,molec.immunol.25:7-15)，固相直接生物素-亲合素eia(cheung,etal.,1990,virology176:546-552)，和直接标记的ria(moldenhaueretal.,1990,scand.j.immunol.32:77-82)。

“抗原”是指引发免疫应答或能够被抗体或抗原结合分子结合的任何分子。免疫应答可以牵涉抗体产生或特异性免疫活性细胞的活化或这两者。本领域技术人员将容易理解任何大分子(包括几乎所有蛋白质或肽)均可以充当抗原。抗原可以内源性表达，即由基因组dna表达或可以重组表达。抗原可以对某些组织，例如癌细胞具有特异性或者其可以广泛地表达。此外，较大分子的片段可以起抗原作用。在一个实施方案中，抗原为肿瘤抗原。

术语“同种异体”是指源自一个个体然后被导入相同物种的另一个个体的任何物质，例如同种异体t细胞移植。

术语“转导”和“经转导的”是指一种过程，通过该过程将外源dna经由病毒载体导入到细胞中(参见jonesetal.,“genetics:principlesandanalysis,”boston:jones&bartlettpubl.(1998))。在一些实施方案中，载体为逆转录病毒载体、dna载体、rna载体、腺病毒载体、杆状病毒载体、埃巴病毒载体、乳多空病毒载体、痘苗病毒载体、单纯疱疹病毒载体、腺病毒相关载体、慢病毒载体或其任何组合。

“癌症”是指一大组各种疾病，其特征为体内异常细胞不受控制的生长。不受调节的细胞分裂和生长导致形成入侵相邻组织且可以通过淋巴系统或血流转移到身体远程部分的恶性肿瘤。“癌症”或“癌症组织”可以包括肿瘤。可以通过本发明的方法治疗的癌症的实例包括但不限于免疫系统的癌症，包括淋巴瘤、白血病、骨髓瘤及其他白细胞恶性肿瘤。在一些实施方案中，本发明的方法可以用于缩小源自例如下组的肿瘤的肿瘤尺寸：骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、多发性骨髓瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤(nhl)、原发性纵隔大b细胞淋巴瘤(pmbc)、弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、滤泡性淋巴瘤(fl)、转化滤泡性淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤(smzl)、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病、急性髓样白血病、慢性髓样白血病、急性淋巴母细胞白血病(all)(包括非t细胞all)、慢性淋巴细胞白血病(cll)、儿童实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(cns)赘生物、原发性cns淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊柱轴肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西氏肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、t细胞淋巴瘤、由环境诱发的癌症(包括由石棉诱发的那些)、其他b细胞恶性肿瘤以及所述癌症的组合。在一个特定的实施方案中，癌症为多发性骨髓瘤。特定癌症可以对化学疗法或放射疗法有响应或者癌症可以是难治性的。难治性癌症是指不易于通过外科手术干预的癌症，并且癌症或是最初对化学疗法或放射疗法无响应，或是癌症随时间变成无响应。

如本文所用，“抗肿瘤效应”是指可以呈现为肿瘤体积缩小、肿瘤细胞的数目减少、肿瘤细胞增殖减少、转移的数目减少、总体或无进展生存期增加、期望寿命增加或各种与肿瘤相关的生理症状改善的生物效应。抗肿瘤效应也可以指肿瘤发生的预防，例如疫苗。

如本文所用，“细胞因子”是指响应与特定抗原的接触由一个细胞释放的非抗体蛋白质，其中细胞因子与第二个细胞相互作用以介导在第二个细胞中的应答。细胞因子可以由细胞内源性表达或施用于受试者。细胞因子可以由免疫细胞(包括巨噬细胞、b细胞、t细胞和肥大细胞)释放以传播免疫应答。细胞因子可以诱导受体细胞中的各种应答。细胞因子可以包括稳态细胞因子、趋化因子、促炎细胞因子、效应物和急性期蛋白质。例如，稳态细胞因子(包括白细胞介素(il)7和il-15)促进免疫细胞存活和增殖，而促炎细胞因子可以促进炎症应答。稳态细胞因子的实例包括但不限于il-2、il-4、il-5、il-7、il-10、il-12p40、il-12p70、il-15及干扰素(ifn)gamma。促炎细胞因子的实例包括但不限于il-1a、il-1b、il-6、il-13、il-17a、肿瘤坏死因子(tnf)-alpha、tnf-beta、成纤维细胞生长因子(fgf)2、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、可溶性细胞间黏附分子1(sicam-1)、可溶性血管黏附分子1(svcam-1)、血管内皮生长因子(vegf)、vegf-c、vegf-d以及胎盘生长因子(plgf)。效应物的实例包括但不限于粒酶a、粒酶b、可溶性fas配体(sfasl)以及穿孔蛋白。急性期蛋白质的实例包括但不限于c反应蛋白(crp)及血清淀粉样蛋白a(saa)。

“趋化因子”是介导细胞趋化性或定向运动的一类细胞因子。趋化因子的实例包括但不限于il-8、il-16、嗜酸性粒细胞趋化因子、嗜酸性粒细胞趋化因子-3、巨噬细胞衍生的趋化因子(mdc或ccl22)、单核细胞趋化蛋白1(mcp-1或ccl2)、mcp-4、巨噬细胞炎性蛋白1α(mip-1α、mip-1a)、mip-1β(mip-1b)、gamma-诱导蛋白10(ip-10)以及胸腺和活化调节的趋化因子(tarc或ccl17)。

治疗剂(例如经工程化的cart细胞)的“治疗有效量”、“有效剂量”、“有效量”或“治疗有效剂量”是当单独使用或与另一治疗剂组合使用时保护受试者免于疾病发作或者促进疾病消退的任何量，所述疾病消退的证据为疾病症状的严重性降低、疾病无症状期的频率和持续期间增加或防止由于疾病折磨导致的损伤或残疾。可以使用熟练从业人员已知的各种方法评估治疗剂促进疾病消退的能力，例如在临床试验期间在人受试者中评估、在用于预测在人体中的效力的动物模型系统中评估或通过在体外测定法中测定试剂的活性评估。

如本文所用，术语“淋巴细胞”包括自然杀伤(nk)细胞、t细胞或b细胞。nk细胞是代表固有免疫系统的主要组分的一类细胞毒性(细胞毒)淋巴细胞。nk细胞排斥肿瘤以及病毒感染的细胞。其通过凋亡或程序性细胞死亡的过程发挥作用。由于其不需要活化来杀伤细胞，因而称为“自然杀伤”。t细胞在细胞介导的免疫(无抗体参与)中发挥主要作用。它的t细胞受体(tcr)将自身与其他淋巴细胞类型区分开来。胸腺(免疫系统的专门器官)主要负责t细胞的成熟。有六种类型的t细胞，即：辅助性t细胞(例如cd4+细胞)、细胞毒性t细胞(也称为tc、细胞毒性t淋巴细胞、ctl、t杀伤细胞、溶细胞性t细胞、cd8+t细胞或杀伤t细胞)、记忆t细胞((i)干细胞样记忆tscm细胞(如初始细胞)为cd45ro-、ccr7+、cd45ra+、cd62l+(l选择素)、cd27+、cd28+以及il-7rα+，但它们也表达大量的cd95、il-2rβ、cxcr3以及lfa-1，并且显示许多记忆细胞独特的功能属性；(ii)中央记忆tcm细胞表达l-选择素和ccr7，它们分泌il-2，但不分泌ifnγ或il-4，以及(iii)效应记忆tem细胞，然而，不表达l-选择素或ccr7，但产生效应细胞因子，如ifnγ和il-4)、调节性t细胞(treg、抑制性t细胞或cd4+cd25+调节性t细胞)、自然杀伤t细胞(nkt)以及gammadeltat细胞。另一方面，b细胞在体液免疫(有抗体参与)中发挥主要作用。其生成抗体和抗原并执行抗原呈递细胞(apc)的作用，并且在通过抗原相互作用的活化后转变成记忆b细胞。在哺乳动物中，未成熟的b细胞在骨髓中形成。

术语“经基因工程化改造的”、“经工程化改造的”或“经修饰的”是指修饰细胞的方法，包括但不限于通过删除编码或非编码区或其部分或通过反义技术在基因中创建缺陷，或引入编码区或其部分增加蛋白的表达。在一些实施方案中，修饰的细胞为干细胞(例如造血干细胞(hsc)、胚胎干细胞(es)、诱导多能干(ips)细胞)，淋巴细胞(例如t细胞)，其可以从患者或供体获得。细胞可以经修饰以表达外源构建体，例如前tcrα蛋白，嵌合抗原受体(car)或t细胞受体(tcr)，其可以整合到细胞的基因组中。

“免疫应答”是指免疫系统的细胞(例如t淋巴细胞、b淋巴细胞、自然杀伤(nk)细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、树突状细胞以及中性粒细胞)和由这些细胞的任一种或肝脏产生的可溶性大分子(包括ab、细胞因子和补体)的作用，其导致选择性靶向、结合、损害、破坏和/或从脊椎动物体内排除入侵病原体、被病原体感染的细胞或组织、癌细胞或其他异常细胞，或者在自身免疫或病理性炎症的情况下，正常的人细胞或组织。

术语“免疫疗法”是指患有疾病或处于感染疾病或遭受疾病复发的风险的受试者的治疗，该治疗通过包括诱导、增强、抑制或以其他方式修饰免疫应答的方法进行。免疫疗法的实例包括但不限于t细胞疗法。t细胞疗法可以包括过继性t细胞疗法、肿瘤浸润淋巴细胞(til)免疫疗法、自体细胞疗法、工程化自体细胞疗法(eact^tm)以及同种异体t细胞移植。然而，本领域技术人员将认为本文公开的调理方法将增强任何移植的t细胞疗法的有效性。t细胞疗法的实例描述于美国专利公开号2014/0154228和2002/0006409、美国专利号5,728,388以及国际公开号wo2008/081035中。

免疫疗法的t细胞可以来自本领域已知的任何来源。例如，t细胞可以在体外从造血干细胞群体、诱导多能干细胞(ips)，胚胎干细胞(es)分化，或者t细胞可以从受试者获得。t细胞可以从例如外周血单个核细胞(pbmc)、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织以及肿瘤获得。此外，t细胞可以源自本领域中可获得的一个或多个t细胞系。t细胞也可以使用本领域技术人员已知的任何数目的技术(如ficoll^tm分离和/或单采血液成分术(apheresis))从受试者收集的单位血液获得。分离用于t细胞疗法的t细胞的另外的方法公开于美国专利公开号2013/0287748，其通过引用整体并入本文。

术语“工程化自体细胞疗法”(其可以缩写为“eact^tm”，也称为过继细胞转移)是收集患者自身的t细胞，随后将其经遗传改变以识别并靶向一种或多种在一种或多种特定的肿瘤细胞或恶性肿瘤的细胞表面上表达的抗原的过程。如本文所用，“患者”包括任何患有癌症(例如淋巴瘤或白血病)的人。本文中，术语“受试者”和“患者”可互换使用。

如本文所用，术语“体外细胞”是指离体培养的任何细胞。特别地，体外细胞可以包括t细胞。

术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用并且是指包含通过肽键共价连接的氨基酸残基的化合物。蛋白质或肽含有至少两个氨基酸并且可以包含蛋白质或肽的序列的氨基酸的最大数量没有限制。如本文所用，本发明的肽可以作为接头发挥功能(例如连接两个肽或多肽)。如本文所用，本发明的肽可以作为生物标记或标签发挥功能。术语肽、标签或接头可以互换使用。多肽包括任何包含两个或更多个通过肽键彼此连接的氨基酸的肽或蛋白质。如本文所用，该术语是指短链(其在本领域中也通常称为例如肽、寡肽和寡聚体)和较长的链(其在本领域中通常称为蛋白质，其具有许多类型)两者。“多肽”包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同源二聚体、异源二聚体、多肽的变体、经修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然的肽、重组的肽、合成的肽或其组合。

如本文所用，“刺激”是指由刺激分子与其同源配体的结合所诱导的初级应答，其中结合介导信号转导事件。“刺激分子”是t细胞上的分子，例如与存在于抗原呈递细胞上的同源刺激配体特异性结合的t细胞受体(tcr)/cd3复合物。“刺激配体”是当存在于抗原呈递细胞(例如apc、树突状细胞、b细胞等)上时可以与t细胞上的刺激分子特异性结合，从而介导t细胞的初级应答(包括但不限于活化、启动免疫应答、增殖等)的配体。刺激配体包括但不限于抗cd3抗体、装载有肽的mhci类分子、超激动性抗cd2抗体以及超激动性抗cd28抗体。

如本文所用，“共刺激信号”是指与初级信号(例如tcr/cd3连接)组合时导致t细胞应答的信号，例如但不限于增殖和/或关键分子的上调或下调。

如本文所用，“共刺激配体”包括与t细胞上的同源共刺激分子特异性结合的抗原呈递细胞上的分子。共刺激配体的结合提供介导t细胞应答(包括但不限于增殖、活化、分化等)的信号。共刺激配体诱导除了由刺激分子提供的初级信号(例如由t细胞受体(tcr)/cd3复合物与装载有肽的主要组织相容性复合物(mhc)分子的结合提供)外的信号。共刺激配体可以包括但不限于，3/tr6、4-1bb配体、结合toll配体受体的激动剂或抗体、b7-1(cd80)、b7-2(cd86)、cd30配体、cd40、cd7、cd70、cd83、疱疹病毒进入介体(hvem),人白细胞抗原g(hla-g)、ilt4、免疫球蛋白样转录物(ilt)3、诱导性共刺激配体(icos-l)、细胞内黏附分子(icam)、特异性结合b7-h3的配体、淋巴毒素beta受体、mhci类链相关蛋白a(mica)、mhci类链相关蛋白b(micb)、ox40配体、pd-l2或程序性死亡(pd)l1。共刺激配体包括但不限于，与存在于t细胞上的共刺激分子特异性结合的抗体，该存在于t细胞上的共刺激分子例如但不限于4-1bb、b7-h3、cd2、cd27、cd28、cd30、cd40、cd7、icos、与cd83特异性结合的配体、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1)、自然杀伤细胞受体c(nkg2c)、ox40、pd-1或肿瘤坏死因子超家族成员14(tnfsf14或light)。

“共刺激分子”是在t细胞上特异性结合共刺激配体，从而介导t细胞的共刺激反应(例如但不限于增殖)的同源结合配偶体。共刺激分子包括但不限于，“共刺激分子”是在t细胞上特异性结合共刺激配体，从而介导t细胞的共刺激反应(例如但不限于增殖)的同源结合配偶体。共刺激分子包括但不限于4-1bb/cd137、b7-h3、baffr、blame(slamf8)、btla、cd33、cd45、cd100(sema4d)、cd103、cd134、cd137、cd154、cd16、cd160(by55)、cd18、cd19、cd19a、cd2、cd22、cd247、cd27、cd276(b7-h3)、cd28、cd29、cd3(alpha；beta；delta；epsilon；gamma；zeta)、cd30、cd37、cd4、cd4、cd40、cd49a、cd49d、cd49f、cd5、cd64、cd69、cd7、cd80、cd83配体、cd84、cd86、cd8alpha、cd8beta、cd9、cd96(tactile)、cdl-la、cdl-lb、cdl-lc、cdl-ld、cds、ceacam1、crtam、dap-10、dnam1(cd226)、fcgamma受体、gads、gitr、hvem(lightr)、ia4、icam-1、icam-1、icos、igalpha(cd79a)、il2rbeta、il2rgamma、il7ralpha、整合素、itga4、itga4、itga6、itgad、itgae、itgal、itgam、itgax、itgb2、itgb7、itgbl、kirds2、lat、lfa-1、lfa-1、light、light(肿瘤坏死因子超家族成员14；tnfsf14)、ltbr、ly9(cd229)、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1(cdlla/cd18)、mhci类分子、nkg2c、nkg2d、nkp30、nkp44、nkp46、nkp80(klrf1)、ox40、pag/cbp、pd-1、psgl1、selplg(cd162)、信号传导淋巴细胞活化分子,slam(slamf1；cd150；ipo-3)、slamf4(cd244；2b4)、slamf6(ntb-a；lyl08)、slamf7、slp-76、tnf、tnfr、tnfr2、toll配体受体、trance/rankl、vla1或vla-6，或其片段、截短或组合。

本文中，术语“减少”和“降低”可互换使用并且表示小于原来的任何变化。“减少”和“降低”是相对的术语，需要在测量前和测量后间进行比较。“减少”和“降低”包括完全消耗。

受试者的“治疗”或“处理”是指在受试者上进行任何类型的干预或过程，或对该受试者施用活性剂，以达到逆转、减轻、改善、抑制、减缓或预防症状、并发症或状况或与疾病相关的生化指标的发作、进展、发展、严重或复发的目的。在一个实施方案中，“治疗”或“处理”包括部分缓解。在另一个实施方案中，“治疗”或“处理”包括完全缓解。

为了计算同一性百分比，通常以产生序列之间最大匹配的方式比对被比较的序列。可以用来确定同一性百分比的计算机程序的一个实例是gcg程序包，其包括gap(devereuxetal.,1984,nucl.acidres.12:387；geneticscomputergroup,universityofwisconsin,madison,wis.)。计算机算法gap用于比对要确定其序列同一性百分比的两个多肽或多核苷酸。对序列进行比对以使其相应的氨基酸或核苷酸最佳匹配(由算法确定的“匹配的跨度”)。在某些实施方案中，算法也使用使用标准比较矩阵(对于pam250比较矩阵参见dayhoffetal.,1978,atlasofproteinsequenceandstructure5:345-352；对于blosum62比较矩阵，参见henikoffetal.,1992,proc.natl.acad.sci.u.s.a.89:10915-10919)。

在以下小节中将更详细地描述本发明的各个方面。

发明详述

本文描述的组合物提供了制备(例如设计，工程化)嵌合或融合多肽的手段。如本文所述的肽(例如接头)序列允许融合蛋白的正确表达，折叠和活性。本发明尤其提供了新的多肽(例如接头)和包含它们的融合蛋白。在一些实施方案中，本发明提供了编码本文所述的肽(例如接头、标签)或融合蛋白的多核苷酸组合物。在一些实施方案中，本发明提供了表达载体，其包含编码肽(例如接头、标签)或融合蛋白的多核苷酸。在其他实施方案中，本发明提供了细胞，其包含编码肽(例如接头、标签)或融合蛋白的多核苷酸和/或表达载体。本文描述了包含肽接头的新的组合物，包含通过肽接头连接的多肽的多肽组合物，以及相关的多核苷酸、载体、细胞和药物组合物。在一些实施方案中，肽(例如接头、标签)与一种或多种多肽融合。描述的接头序列可操作地连接两个感兴趣的肽/多肽，使得通过接头连接的多肽的表达和活性(例如抗原结合)是持久的和最优的。肽接头或标签可以在多肽的c端，n端或任何地方融合以实现期望的功能。

肽接头

本文所述的包含共有序列xypxxxzx的新的嵌合多肽组合了期望的属性，其适于整合到可用于治疗干预的融合蛋白中。在一方面，本发明提供了包含8-20个氨基酸和共有序列xypxxxzx的接头，其中x是甘氨酸(g)或丝氨酸(s)，b是带正电荷的氨基酸且z是甘氨酸(g)或带负电荷的氨基酸。本发明人已经发现，除了接头序列的抗体识别外，共有序列中氨基酸残基的间隔和电荷都有助于接头的功能。

在一方面，本发明提供了包含6-20个氨基酸序列和共有序列bpxxxz的接头，其中x是甘氨酸(g)或丝氨酸(s)，b是赖氨酸(k)或精氨酸(r)且z是甘氨酸(g)或带负电荷的氨基酸，和p是脯氨酸。

在一些实施方案中，本发明提供了包含8-20个氨基酸和共有序列xbpxxxzx的接头，其中x是甘氨酸(g)或丝氨酸(s)，b是赖氨酸(k)或精氨酸(r)且z是甘氨酸(g)或带负电荷的氨基酸，和p是脯氨酸。

在一些实施方案中，本发明提供了包含8-20个氨基酸和共有序列xbpxxxzx的接头，其中x是甘氨酸(g)或丝氨酸(s)，b是赖氨酸(k)且z是甘氨酸(g)或带负电荷的氨基酸，和p是脯氨酸。

在一些实施方案中，本发明提供了包含8-20个氨基酸和共有序列xbpxxxzx的接头，其中x是甘氨酸(g)或丝氨酸(s)，b是带正电荷的氨基酸且z是甘氨酸(g)，和p是脯氨酸。

在一些实施方案中，z是选自谷氨酸(e)或天冬氨酸(d)的带负电荷的氨基酸。在一些实施方案中，z是谷氨酸(e)。

在一些实施方案中，本发明提供了接头，其中共有序列是gkpgsge(seqidno:5)或gkpgsgg(seqidno:6)。在一些实施方案中，共有序列是gkpgsge(seqidno:5)。

在一些实施方案中，肽包含ggggsggggsggggsg(seqidno:18)的氨基酸序列。

接头肽序列可以具有任何合适的长度以连接一种或多种感兴趣的蛋白质，并且优选地被设计为足够柔性以允许其连接的肽之一或两者的适当折叠和/或功能和/或活性。因此，接头肽可以具有不超过10个，不超过11个，不超过12个，不超过13个，不超过14个，不超过15个，不超过16个，不超过17个，不超过18个，不超过19个或不超过20个氨基酸的长度。在一些实施方案中，接头肽可以具有至少3个，至少4个，至少5个，至少6个，至少7个，至少8个，至少9个，至少10个，至少11个，至少12个，至少13个，至少14个，至少15个，至少16个，至少17个，至少18个，至少19个或至少20个氨基酸的长度。在一些实施方案中，接头包含至少7个且不超过20个氨基酸，至少7个且不超过19个氨基酸，至少7个且不超过18个氨基酸，至少7个且不超过17个氨基酸，至少7个且不超过16个氨基酸，至少7个且不超过15个氨基酸，至少7个且不超过14个氨基酸，至少7个且不超过13个氨基酸，至少7个且不超过少于12个氨基酸或至少7个且不超过11个氨基酸。在某些实施方案中，接头包含15-17个氨基酸，并且在特定实施方案中，包含16个氨基酸。在一些实施方案中，接头包含10-20个氨基酸。在一些实施方案中，接头包含14-19个氨基酸。在一些实施方案中，接头包含15-17个氨基酸。在一些实施方案中，接头包含15-16个氨基酸。在一些实施方案中，接头包含16个氨基酸。在一些实施方案中，接头包含10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。

如本文所用，“保守氨基酸取代”是指氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代的氨基酸取代。本领域已经定义了具有侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有以下侧链的氨基酸：碱性或带正电荷侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，酸性或带负电荷侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)，不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，beta分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。在某些实施方案中，可以用具有相似侧链的氨基酸残基取代本文提供的多肽接头、融合蛋白、抗体或抗原结合分子(或其片段)的cdr或框架区内的一个或多个氨基酸残基。

本公开内容涵盖的保守氨基酸取代可以涵盖非天然存在的氨基酸残基，其通常通过化学肽合成而不是通过在生物系统中的合成而并入。这些包括模拟肽和其它反向或倒向形式的氨基酸部分。天然存在的残基可以根据常见的侧链特性分为以下类别：

疏水性：正亮氨酸，met，ala，val，leu，ile；

中性亲水性：cys，ser，thr，asn，gln；

酸性(带负电荷)：asp，glu；

碱性(带负电荷)：his，lys，arg；

影响链取向的残基：gly，pro；和

芳香族：trp，tyr，phe。

非保守取代可以涉及将这些类别之一的成员交换为来自另一类别的成员。此类取代的残基可被引入例如与非人抗体同源的人抗体区域中，或分子的非同源区域中。示例性的保守氨基酸取代在下表a中列出。

表a

在一些实施方案中，接头包含gggsgkpgsgegggs(seqidno:7)的氨基酸序列。在一些实施方案中，接头包含gggsgkpgsgeggggs(seqidno:8)的氨基酸序列。在一些实施方案中，接头包含ggggsgkpgsggggs(seqidno:9)的氨基酸序列。在一些实施方案中，接头包含ggggsgkpgsgeggs(seqidno:10)的氨基酸序列。在一些实施方案中，接头包含ggggsgkpgsgegggs(seqidno:11)的氨基酸序列。在一些实施方案中，接头包含ggggsgkpgsgeggggs(seqidno:12)的氨基酸序列。在一些实施方案中，接头包含stsgsgkpgsgegst(seqidno:17)的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽包含ggggsggggsggggsg(seqidno:18)的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽包含gggggsggggsggggs(seqidno:19)的氨基酸序列。在一些实施方案中，肽包含ggggsggggsgggggs(seqidno:20)的氨基酸序列。

在一方面，本发明提供了接头，其包含6-20个氨基酸和与gggsgkpgsgegggs(seqidno:7),gggsgkpgsgeggggs(seqidno:8),ggggsgkpgsggggs(seqidno:9),ggggsgkpgsgeggs(seqidno:10),ggggsgkpgsgegggs(seqidno:11),ggggsgkpgsgeggggs(seqidno:12),stsgsgkpgsgegst(seqidno:17),ggggsggggsggggsg(seqidno:18),gggggsggggsggggs(seqidno:19),或ggggsggggsgggggs(seqidno:20)中的任一项至少80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％相同的氨基酸序列。

在一些实施方案中，接头氨基酸序列含有在gggsgkpgsgegggs(seqidno:7),gggsgkpgsgeggggs(seqidno:8),ggggsgkpgsggggs(seqidno:9),ggggsgkpgsgeggs(seqidno:10),ggggsgkpgsgegggs(seqidno:11),ggggsgkpgsgeggggs(seqidno:12),stsgsgkpgsgegst(seqidno:17),ggggsggggsggggsg(seqidno:18),gggggsggggsggggs(seqidno:19),或ggggsggggsgggggs(seqidno:20)的任一项中存在的10个连续氨基酸中的至少五(5)个、六(6)个、七(7)个、八(8)个或至少九(9)个相同氨基酸。

在一方面，本发明提供了接头，其包含8-20个氨基酸和含有在gggsgkpgsgegggs(seqidno:7),gggsgkpgsgeggggs(seqidno:8),ggggsgkpgsggggs(seqidno:9),ggggsgkpgsgeggs(seqidno:10),ggggsgkpgsgegggs(seqidno:11),ggggsgkpgsgeggggs(seqidno:12),stsgsgkpgsgegst(seqidno:17),ggggsggggsggggsg(seqidno:18),gggggsggggsggggs(seqidno:19),或ggggsggggsgggggs(seqidno:20)的任一项中存在的10个连续氨基酸中的至少六(6)个相同氨基酸的氨基酸序列。

在一些实施方案中，接头氨基酸序列含有在gggsgkpgsgegggs(seqidno:7),gggsgkpgsgeggggs(seqidno:8),ggggsgkpgsggggs(seqidno:9),ggggsgkpgsgeggs(seqidno:10),ggggsgkpgsgegggs(seqidno:11),ggggsgkpgsgeggggs(seqidno:12),stsgsgkpgsgegst(seqidno:17),ggggsggggsggggsg(seqidno:18),gggggsggggsggggs(seqidno:19),或ggggsggggsgggggs(seqidno:20)的任一项中存在的10个连续氨基酸中的至少七(7)个、至少八(8)个或至少九(9)个相同氨基酸。

融合蛋白

在一方面，本发明提供了融合蛋白，其包含第一多肽；第二多肽；和本文所述的接头。本文描述了多肽组合物和编码多肽组合物的多核苷酸，其中多肽组合物包含通过本文所公开的接头序列连接的第一和第二肽/多肽。本发明人令人惊讶地发现，根据本发明的接头提供了第一和第二肽的最优的柔性和长度以避免空间位阻并允许正确折叠。

以这种方式产生的多肽组合物通常称为融合或嵌合蛋白/多肽，并通常通过在适合的系统中编码多肽组合物的核酸序列的表达(例如转录、翻译)来制备。制备融合和/或嵌合多肽的手段是本领域公知的(参见例如sambrooketal.,molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringsharborlaboratory,1992,newyork，其通过引用以其整体并入本文)。

在本文所述的多肽组合物中，两个多肽(例如第一多肽和第二多肽)可以通过以上描述的任何接头多肽重组连接，其中所述接头置于两个多肽之间。例如，在一些实施方案中，多肽或组合物包含通过接头重组连接的第一和第二多肽，所述接头包含gggsgkpgsgegggs(seqidno:7),gggsgkpgsgeggggs(seqidno:8),ggggsgkpgsggggs(seqidno:9),ggggsgkpgsgeggs(seqidno:10),ggggsgkpgsgegggs(seqidno:11),ggggsgkpgsgeggggs(seqidno:12),stsgsgkpgsgegst(seqidno:17),ggggsggggsggggsg(seqidno:18),gggggsggggsggggs(seqidno:19),或ggggsggggsgggggs(seqidno:20)。该两个多肽可以是任何氨基酸序列，其包括两个不同蛋白或相同蛋白的全长蛋白、蛋白片段或部分，功能性蛋白片段或部分，功能性蛋白结构域等。

如本文所用，术语“多肽”或“肽”是指通常仅通过肽键连接的氨基酸残基的聚合物，其可以天然产生(例如分离的，基本上纯化的或纯化的)或合成(例如通过化学合成)产生。通过表达非宿主dna分子产生的多肽是“异源”肽或多肽。包含多肽的“氨基酸残基”可以是通过肽键和/或不同于肽键的键连接的天然或非天然氨基酸残基。氨基酸残基可以是d-构型或l-构型。在一些方面，本文所指的多肽是通过重组核酸的表达产生的蛋白质、肽或其片段。在一些实施方案中，本文所述的多肽组合物包含通过接头序列连接的两个多肽。

如本文所用，“功能性片段”或“部分”意指少于完整的成熟或天然蛋白质，其足以保留成熟或天然蛋白质的一种或多种期望的生物学活性(例如，足以保留就待治疗疾病而言的治疗或改善生物学活性)。因此，氨基酸序列或多肽可以被修饰，例如其中已经以如下的方式插入、缺失和/或取代氨基酸，使得修饰基本上不干扰多肽编码功能性剂的能力的多肽序列。

本文所述的接头或多肽接头是指设计为连接(例如接合、连结)两个蛋白质序列的肽序列，其中所述接头肽序列通常不天然位于所述两个蛋白质序列之间。在本发明的上下文中，短语“连结的”或“接合的”或“连接的”通常是指两个连续或相邻的氨基酸序列之间的功能性连接，以产生通常在自然界中不存在的多肽。在某些实施方案中，连接可用于指例如第一多肽和第二多肽的氨基酸序列(例如抗体重链和轻链)的共价连接。通常，连接的蛋白质连续或彼此相邻，并且在连接时保留其各自的可操作性和功能。包含本文公开的嵌合多肽的肽通过插入的包含一个或多个氨基酸的肽接头连接。此类接头可以提供期望的柔性以允许嵌合多肽的期望的表达，活性和/或构象定位。通常将典型的氨基酸接头设计成具有柔性或在两个蛋白质部分之间插入结构例如α-螺旋。接头可以与多肽的n端或c端融合，或在内部插入。

在包含接头的多肽组合物中，接头肽序列(例如氨基酸序列)的5'端(例如末端)与一个蛋白质序列(第一肽)(例如全长蛋白质或蛋白质结构域，片段或变体)的3’端相邻并共价连接，且进一步接头氨基酸序列的3'端与另一蛋白质序列(第二肽)的5'端相邻并共价连接。

抗原结合分子

在一些方面，融合蛋白是抗原结合分子。在一些实施方案中，第一多肽是轻链可变域，且第二多肽是重链可变域。在一些实施方案中，如本文所述的接头用于连接抗体重链和轻链可变区，提供了允许最优柔性和长度以避免空间位阻并允许抗原结合结构域的正确折叠的益处。第一和第二肽的正确构型对于抗原识别和结合至关重要。

如本文所用，术语“可变区”或“可变结构域”可互换使用，并指抗体的一部分，通常是轻链或重链的一部分，通常是抗体的氨基末端，并且包含重链中的100-130个氨基酸和轻链中的约90-115个氨基酸，其在抗体之间的序列差异很大并用于特定抗体对特定抗原的结合和特异性。序列的变异性集中在那些称为互补决定区(cdr)的区域中，而可变域中保守性较高的区域称为框架区(fr)。轻链和重链的cdr主要负责抗体与抗原的相互作用和特异性。

在某些实施方案中，抗原结合分子的可变区是人可变区。在其它实施方案中，可变区包含啮齿动物，人或鼠的cdr和人框架区(fr)。在其它实施方案中，可变区是灵长类(例如非人灵长类)可变区。在其它实施方案中，可变区是兔可变区。在其它实施方案中，可变区包含人cdr和非人(例如兔、鼠、大鼠或非人灵长类)框架区(fr)。在其它实施方案中，可变区包含非人(例如兔、鼠、大鼠或非人灵长类)cdr和人框架区(fr)。

术语“vh”，“vh结构域”和“vh链”可互换使用，是指抗原结合分子，抗体或其抗原结合片段的重链可变区。如本文所用，术语“重链”在提及抗体使用时根据恒定结构域的氨基酸序列可以指任何不同的类型，例如alpha(α)、delta(δ)、epsilon(ε)、gamma(γ)和mu(μ)，其分别产生iga、igd、ige、igg和igm类抗体，包括igg的亚类，例如igg1、igg2、igg3和igg4。

术语“vl”，“vl结构域”和“vl链”可互换使用，是指抗原结合分子，抗体或其抗原结合片段的轻链可变区。如本文所用，术语“轻链”在提及抗体使用时根据恒定结构域的氨基酸序列可以指任何不同的类型，例如kappa(κ)或lambda(λ)。轻链氨基酸序列是本领域公知的。在特定的实施方案中，轻链是人轻链。

“抗原结合分子”、“抗原结合部分”或“抗体片段”是指包含从该分子所源于的抗体的抗原结合部分(例如，cdr)的任何分子。抗原结合分子可以包括抗原互补决定区(cdr)。抗体片段的实例包括但不限于，从抗原结合分子形成的fab、fab’、f(ab’)2和fv片段、dab、线性抗体、scfv抗体和多特异性抗体。肽体(peptibody)(即，包含肽结合结构域的fc融合分子)是合适的抗原结合分子的另一个实例。在一些实施方案中，抗原结合分子结合肿瘤细胞上的抗原。在一些实施方案中，抗原结合分子结合参与过度增殖性疾病的细胞上的抗原或结合病毒或细菌抗原。在其它实施方案中，抗原结合分子是抗体或其片段，包括其一个或多个互补决定区(cdr)。在其它实施方案中，抗原结合分子是单链可变片段(scfv)。

如本文所用，术语“单链抗体”和“单链可变片段(scfv)”可互换使用，并且是指其中vl和vh区通过接头连接以形成连续蛋白链的抗原结合分子，其中接头足够长以允许蛋白链自身折叠并形成单价抗原结合位点(参见例如birdetal.,(1988)science242：423-26andhustonetal.,(1988)proc.natl.acad.sci.u.s.a.85：5879-83(1988)。fmc63(nicholsonetal.,(1997)mol.immunol.34:(16-17)1157-65)是scfv的一个具体例子，并且对cd19特异。

在一些实施方案中，抗原结合分子是scfv。

在一些实施方案中，本发明提供了抗原结合分子，包括scfv，其包括共有序列bpxxxz、xbpxxxzx或如本文所述的示例性接头序列(例如kpgsge(seqidno:4),gkpgsge(seqidno:5),gkpgsgg(seqidno:6),gggsgkpgsgegggs(seqidno:7),gggsgkpgsgeggggs(seqidno:8),ggggsgkpgsggggs(seqidno:9),ggggsgkpgsgeggs(seqidno:10),ggggsgkpgsgegggs(seqidno:11),ggggsgkpgsgeggggs(seqidno:12),stsgsgkpgsgegst(seqidno:17),ggggsggggsggggsg(seqidno:18),gggggsggggsggggs(seqidno:19)或ggggsggggsgggggs(seqidno:20)。在一些实施方案中，还提供了包含这些序列的分子和呈递此类分子的细胞，编码抗原结合分子的多核苷酸，并形成本公开的方面。

如本文所用，术语“结合亲和力”是指分子(例如，抗原结合分子如抗体)的单个结合位点与其结合伴侣(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，如本文所用的“结合亲和力”是指内在结合亲和力，其反映结合对的成员(例如抗体和抗原)之间的1：1相互作用。分子x与其伴侣y的亲和力通常可以用解离常数(kd)表示。亲和力可以以本领域中已知的多种方式测量和/或表示，包括但不限于平衡解离常数(kd)和平衡缔合常数(ka)。kd是根据koff/kon的商计算的，而ka是根据kon/koff的商计算的。kon是指例如抗体与抗原的缔合速率常数，而koff是指例如抗体与抗原的解离。kon和koff可以通过本领域普通技术人员已知的标准技术来确测定，例如或kinexa或表面等离振子共振。

在某些实施方案中，抗原结合分子包含单链，其中重链可变区和轻链可变区通过如本文所述的接头连接以形成scfv(例如本公开的抗原结合分子)。在一些实施方案中，vh位于接头的n端而vl位于接头的c端。在其他实施方案中，vl位于接头的n端而vh位于接头的c端。在一些实施方案中，接头包含至少约5个，至少约8个，至少约9个，至少约10个，至少约11个，至少约12个，至少约13个，至少约14个，至少约15个，至少约16个，至少约17个，至少约18个，至少约19个，至少约20个，至少约25个，至少约30个，至少约35个，至少约40个，至少约45个，至少约50个，至少约60个，至少约70个，至少约80个，至少约90个或至少约100个氨基酸。在一些实施方案中，接头包含约8个氨基酸至约18个氨基酸(例如16个氨基酸)。

嵌合抗原受体

抗原结合分子可以形成car或tcr的组分，并且可以用于引导car或tcr识别感兴趣的靶标。如本文所用，在car或tcr的情况下，抗原结合分子是指将car或tcr引导至期望的靶标并与该靶标结合的car或tcr的任何组分。在特定的实施方案中，car或tcr的抗原结合分子组分包含scfv，其包含通过本文所述的接头连接的重链和轻链可变区。重链和轻链可变区可以衍生自相同抗体或两种不同抗体。car或tcr中使用的抗原结合分子可以衍生自已知或怀疑与感兴趣的靶标结合的抗体。

可以工程化改造t细胞以表达例如嵌合抗原受体(car)或t细胞受体(tcr)。car阳性(car+)t细胞工程化改造为表达car。car可以包含例如对特定肿瘤抗原具有特异性的细胞外单链可变片段(scfv)，其直接或间接连接至包含至少一个共刺激结构域的细胞内信号传导部分，该共刺激结构域直接或间接连接至至少一个活化域；组分可以以任何顺序排列。共刺激结构域可以衍生自例如cd28或4-1bb，而活化结构域可以衍生自例如任何形式的cd3-zeta。在某些实施方案中，car被设计为具有两个、三个、四个或更多个共刺激结构域。carscfv可以设计为靶向cd19，其是b细胞谱系中的细胞表达的跨膜蛋白，包括所有正常b细胞和b细胞恶性肿瘤(例如nhl，cll和非t细胞all)。在一些实施方案中，工程化改造car使得共刺激域表达为单独的多肽链。cart细胞疗法和构建体的实例在美国专利公开号2013/0287748、2014/0227237、2014/0099309和2014/0050708中描述，其通过引用以其整体并入用于任何目的。

本公开的抗原结合分子也可以是完全人单克隆抗体，可以从其产生scfv，其然后可以形成本文提供的car或tcr的组分。可以通过本领域普通技术人员熟悉的许多技术来产生完全人单克隆抗体。此类方法包括但不限于人外周血细胞(例如含有b淋巴细胞)的埃巴病毒(ebv)转化，人b细胞的体外免疫，来自免疫的携带插入的人免疫球蛋白基因的转基因小鼠的脾细胞融合，从人免疫球蛋白v区噬菌体文库中分离或其他本领域已知的和基于本文公开内容的程序。

已经开发了在非人动物中产生人单克隆抗体的程序。例如，已经制备了其中一种或多种内源性免疫球蛋白基因已通过各种方式失活的小鼠。人免疫球蛋白基因已经引入小鼠中以替代失活的小鼠基因。在这种技术中，将人重链和轻链基因座的元件引入衍生自胚胎干细胞系的小鼠品系中，其含有内源性重链和轻链基因座的靶向破坏(也参见bruggemannetal.,(1997)curr.opin.biotechnol.8:455-58)。

还将理解的是，在需要的情况下本文所述的各种结构域和区域可以与抗原结合分子(例如scfv)和活化结构域在单独的链中表达，以所谓的“反式”构造表达。因此，在一个实施方案中，活化结构域可以在一条链上表达，而抗原结合分子和/或胞外结构域和/或跨膜结构域和/或共刺激结构域(根据car或tcr的期望结构)可以在分开的链上表达。

另外，本公开内容的car的组分的n至c端或细胞外至细胞内的顺序可以根据需要变化。抗原结合分子(scfv)将在细胞外以便与靶抗原结合，并且可以在最远离细胞膜的scfv的n端包括前导肽或信号肽。

多核苷酸

在一方面，本发明提供了编码如本文所述的接头的多核苷酸。在一些实施方案中，本发明提供了编码如本文所述的融合蛋白的多核苷酸。本公开还涉及编码抗体和抗原结合分子例如scfv(其包含如本文所述的接头)的多核苷酸，包含该序列的分子和呈现此类分子的细胞。

表达载体

在一方面，本发明提供了表达载体，其包含编码如本文所述的接头或融合蛋白的多核苷酸。在某些方面，本文提供了包含本公开的多核苷酸的载体。在一些实施方案中，本发明涉及包含编码本文所述的接头或融合蛋白的多核苷酸的载体或载体组。在其它实施方案中，本公开涉及包含编码如本文公开的抗体或其抗原结合分子的多核苷酸的载体或载体组。

本领域已知的任何载体均可适用于本公开。在一些实施方案中，载体是病毒载体。在一些实施方案中，载体是逆转录病毒载体、dna载体、鼠白血病病毒载体、sfg载体、质粒、rna载体、腺病毒载体、杆状病毒载体、epsteinbarr病毒载体，乳多空病毒载体，牛痘病毒载体，单纯疱疹病毒载体，腺病毒相关载体(aav)，慢病毒载体或其任何组合。在本公开的一些实施方案中，可以采用一种，两种或更多种载体。

重组细胞

在一些实施方案中，本发明提供了重组细胞，其包含编码如本文所述的接头或融合蛋白的多核苷酸。在一些实施方案中，重组细胞包含表达载体，该表达载体包含编码如本文所述的接头或融合蛋白的多核苷酸。在一些方面，本文提供了包含本公开的多核苷酸或载体的细胞。在一些实施方案中，本发明涉及宿主细胞，例如体外细胞，其包含编码如本文所述的接头或融合蛋白的多核苷酸。在一些实施方案中，本发明涉及宿主细胞，例如体外细胞，其包含编码本文所公开的抗体或其抗原结合分子的多核苷酸。

适合的宿主细胞可衍生自各种生物，包括但不限于哺乳动物、植物、鸟类(例如禽类系统)、昆虫、酵母和细菌。在一些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞。任何易受细胞培养和多肽表达的哺乳动物细胞可以依照本发明作为宿主细胞利用。可以依照本发明使用的哺乳动物细胞的非限制性实例包括人胚胎肾293细胞(hek293)、hela细胞；balb/c小鼠骨髓瘤细胞系(nso/l,ecaccno:85110503)；人成视网膜细胞(per.c6(crucell,leiden,thenetherlands))；sv40转化的猴肾cv1系(cos-7,atcccrl1651)；人纤维肉瘤细胞系(例如ht-1080)；人胚胎肾细胞系(293细胞或用于在悬浮培养物中生长而亚克隆的293细胞，grahametal.,j.genvirol.,36:59(1977))；幼仓鼠肾细胞(bhk,atccccl10)；中国仓鼠卵巢细胞+/-dhfr(cho,urlaubandchasin,proc.natl.acad.sci.usa,77:4216(1980))；小鼠睾丸支持细胞(sertolicell)(tm4,mather,biol.reprod.,23:243-251(1980))；猴肾细胞(cv1atccccl70)；非洲绿猴肾细胞(vero-76,atcccrl-1587)；人宫颈癌细胞(hela,atccccl2)；犬肾细胞(mdck,atccccl34)；水牛鼠(buffalorat)肝细胞(brl3a,atcccrl1442)；人肺细胞(w138,atccccl75)；人肝细胞(hepg2,hb8065)；小鼠乳腺肿瘤(mmt060562,atccccl51)；tri细胞(matheretal.,annalsn.y.acad.sci.,383:44-68(1982))；mrc5细胞；fs4细胞；人肝癌细胞系(hepg2)，人细胞系cap和age1.hn，和glycotope组。

适用于本发明的宿主细胞的非限制性实例包括衍生自以下的细胞或细胞系：对于酵母为巴斯德毕赤酵母，甲醇毕赤酵母，安格斯毕赤酵母，粟酒裂殖酵母，酿酒酵母和解脂耶氏酵母；对于昆虫为草地贪夜蛾(sodopterafrugiperda)，粉蚊夜蛾(trichoplusisni)，黑腹果蝇(drosophilamelangoster)和烟草天蛾(manducasexta)；和对于细菌为大肠杆菌，鼠伤寒沙门氏菌，枯草芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，脆弱拟杆菌，产气荚膜梭菌，艰难梭菌；以及对于两栖动物为光滑爪蟾(xenopuslaevis)。

另外，可以依照本发明利用任何数量的可用杂交瘤细胞系。本领域技术人员将理解杂交瘤细胞系可以具有不同的营养要求和/或可以要求不同的培养条件以实现最优生长和多肽或蛋白质表达，并且将能够根据需要修改条件。

实施例

尽管已经依据某些实施方案特异性地描述了本发明的某些化合物，组合物和方法，但以下实施例仅用于说明本发明的化合物，而不意图限制本发明。

实施例1：表位作图以鉴定接头共有序列

针对包含gstsgsgkpgsgegstkg(seqidno：1)的接头序列的car产生的抗体克隆8和16的特异性结合用于全长seqidno:1和变体的表位作图elisa实验，所述变体在n端或c端截短，并在n端上含有生物素部分或在c端上含有具有生物素部分的赖氨酸残基(seqidno:21-30)。

使用预先用蛋白g(pierce)包被的板以96孔板形式捕获抗体。将板在pbst缓冲液中洗涤6次，然后与靶标肽温育。用pbst进行另外的6次洗涤，并将抗体与链霉亲合素-hrp进一步温育。在pbst中进行最终6次洗涤后，通过增强的化学发光试剂盒(ecl，购自gehealthcare)和varioskanflash读板仪(thermofisher)检测并定量信号。图2中所示的表位作图elisa实验结果表明，尽管两种抗体均结合全长18聚体(seqidno：1)，但克隆8特异性结合7聚体亚序列gkpgsge(seqidno:5)而克隆16特异性结合5聚体亚序列kpgsg(seqidno:16)。综上所述，这些数据用于基于克隆8和16的最小结合表位生成共有序列。

实施例2：示例性接头序列的抗体结合概况

针对car产生的一组抗体的特异性结合用于分别从kip-1、kip-4和kip-3抗体确定示例性接头序列的抗体结合概况，所述car包含接头序列gstsgsgkpgsgegstkg(seqidno:1)，接头序列ggggsggggsggggs(seqidno:2)或抗cd19scfv克隆fmc63，如本文所述。该测定法中还包括包含图1中描述的接头序列kl1(seqidno:9)，kl2(seqidno:10)，kl3(seqidno:11)，和截短的whitlow接头(seqidno:17)的肽。使用预包被有蛋白g(pierce)的板以96孔板形式捕获抗体。将板在pbst缓冲液中洗涤6次，然后与靶标肽温育。用pbst进行另外的6次洗涤，并将抗体与链霉亲合素-hrp进一步温育。在pbst中进行最终6次洗涤后，通过增强的化学发光试剂盒(ecl，购自gehealthcare)和varioskanflash读板仪(thermofisher)检测并定量信号。图3中所示的抗体概况elisa实验的结果证明了根据本发明的接头的抗体结合的广度。

实施例3：包含嵌合接头的表达car的细胞的流式细胞术结果

使用蛋白l作为对照，通过流式细胞术测定cart细胞，以确认包含接头序列seqidno:1(fmc63wt)或seqidno:2(fmc63g4s)的每种car构建体的表达。这些结果证实了car构建体在t细胞表面上的表达。如图4所示，在scfvfmc63和24c1scfv的背景下产生了cart细胞。kl2(seqidno:10)、kl3(seqidno:11)、kl4(seqidno:7)、kl5(seqidno:12)、kl6(seqidno:8)和g4s2(seqidno:18)接头用于连接scfv的vl和vh结构域。

序列和seqidno

本公开内容包含一些核酸和多肽序列。为了方便起见，下表b将每个序列与其适合的seqidno相关联。

表b

等同实施方案

本领域技术人员将认识到或仅通过常规实验能够确定本文所述的本发明的特定实施方案的许多等同实施方案。本发明的范围不旨在限于以上描述，而是如所附的权利要求书中所述。

在权利要求书中使用序数术语例如“第一”，“第二”，“第三”等来修饰权利要求要素本身不意味着一个权利要求要素相对于另一个的优先、在先或顺序，或实施方法的行为的时间顺序，而仅用作标签以区分具有某个名称的一个权利要求要素与具有相同名称(除了序数术语的使用外)的另一个要素以区分权利要求要素。

除非明确指出相反，否则在说明书和权利要求书中使用的冠词“一个”和“一种”应理解为包括复数对象。对于在一个或多个组成员之间包括“或”的权利要求或描述，除非有相反说明或从上下文可以明显看出，如果一个，多于一个或所有的组成员在给定的产品或过程中存在，采用或在其它情况下与之相关，则认为是满足的。本发明包括其中正好一个组成员在给定产品或过程中存在，采用或在其它情况下与之相关的实施方案。本发明也包括其中多于一个，或全部组成员在给定产品或过程中存在，采用或在其它情况下与之相关的实施方案。此外，应理解本发明涵盖所有变型，组合和排列，除非另外指出或除非对于本领域的普通技术人员显而易见的是会出现矛盾或不一致，将来自一个或多个所列权利要求的一个或多个限定，要素，从句，描述性术语等引入从属于相同基础权利要求的另一权利要求(或相关的任何其它权利要求)。在要素以列表的形式呈现的情况下(例如，以马库什组或相似形式)，应当理解还公开了要素的每个亚组，并且可以从该组中移除任何一个或多个要素。应当理解，一般而言当本发明或本发明的方面称为包括具体要素，特征等时，本发明或本发明的方面的某些实施方案由此类要素、特征等组成或基本上由其组成。为了简单的目的，在任何情况下都没有在本文中用过多的词具体地阐述那些实施方案。还应当理解，可以在权利要求中明确地排除本发明的任何实施方案或方面，而不论说明书中是否列举了具体的排除。本文引用的描述本发明的背景和提供其实践的附加细节的出版物、网站和其它参考材料通过引用并入本文。

序列表

<110>凯德药业股份有限公司

<120>嵌合多肽及其用途

<130>kpi-005wo

<140>

<141>

<150>62/562,223

<151>2017-09-22

<160>32

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>18

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<221>来源

<223>/注释="人工序列的描述：合成

肽"

<400>1

glyserthrserglyserglylysproglyserglygluglyserthr

151015

lysgly

<210>2

<211>15

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<221>来源

<223>/注释="人工序列的描述：合成

肽"

<400>2

glyglyglyglyserglyglyglyglyserglyglyglyglyser

151015

<210>3

<211>23

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<221>来源

<223>/注释="人工序列的描述：合成

肽"

<220>

<221>变异

<222>(1)..(3)

<223>/替换="ser"

<220>

<221>变异

<222>(11)..(13)

<223>/替换="ser"

<220>

<221>变异

<222>(21)..(23)

<223>/替换="ser"

<220>

<221>位点

<222>(1)..(23)

<223>/注释="序列中给出的变异残基相对于注释中的变异位置

没有偏好"

<400>3

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151015

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<210>4

<211>6

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<213>人工序列

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<221>来源

<223>/注释="人工序列的描述：合成

肽"

<400>4

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15

<210>5

<211>7

<212>prt

<213>人工序列

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<221>来源

<223>/注释="人工序列的描述：合成

肽"

<400>5

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15

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<213>人工序列

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<221>来源

<223>/注释="人工序列的描述：合成

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<400>6

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15

<210>7

<211>15

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<213>人工序列

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<221>来源

<223>/注释="人工序列的描述：合成

肽"

<400>7

glyglyglyserglylysproglyserglygluglyglyglyser

151015

<210>8

<211>16

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<221>来源

<223>/注释="人工序列的描述：合成

肽"

<400>8

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151015

<210>9

<211>15

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<221>来源

<223>/注释="人工序列的描述：合成

肽"

<400>9

glyglyglyglyserglylysproglyserglyglyglyglyser

151015

<210>10

<211>15

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<221>来源

<223>/注释="人工序列的描述：合成

肽"

<400>10

glyglyglyglyserglylysproglyserglygluglyglyser

151015

<210>11

<211>16

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<221>来源

<223>/注释="人工序列的描述：合成

肽"

<400>11

glyglyglyglyserglylysproglyserglygluglyglyglyser

151015

<210>12

<211>17

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<221>来源

<223>/注释="人工序列的描述：合成

肽"

<400>12

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151015

ser

<210>13

<211>10

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<213>人工序列

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<221>来源

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肽"

<400>13

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<210>14

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<213>人工序列

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<400>14

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15

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<213>人工序列

<220>

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<400>15

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15

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<213>人工序列

<220>

<221>来源

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<400>16

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15

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<400>17

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<400>18

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<400>20

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<213>人工序列

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肽"

<400>21

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<213>人工序列

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<400>23

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1510

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<213>人工序列

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<400>24

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<213>人工序列

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1510

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<213>人工序列

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肽"

<400>26

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1510

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1510

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<213>人工序列

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肽"

<400>28

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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肽"

<400>31

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<210>32

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<213>人工序列

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肽"

<400>32

glyglyglyglyser

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