用于基因工程的核酸酶系统的制作方法

交叉引用本申请要求2017年9月7日提交的美国临时申请第62/555,564号和2018年4月3日提交的美国临时申请第62/652,047号的权益，所述申请通过引用以其整体并入本文。序列表本申请含有序列表，该序列表已以ascii格式以电子方式提交并在此通过引用以其整体并入。所述ascii副本创建于2018年9月7日，名为47533-727_601_sl.txt，并且大小为1,150,509字节。背景随着基因组科学的快速发展，有效的基因组工程在理解人类疾病的分子基础以及治疗在基因组中具有可鉴定改变的人类病症方面都具有广阔的前景。过去几年见证了rna-指导的crispr/cas9技术的快速发展。人们正致力于优化当前的crispr/cas9系统和/或鉴定更多具有较好效率和特异性的cas9样核酸酶。类似地，正在进行进行大量努力来鉴定可以以提高的特异性和效率用于基因组编辑的新系统。通过引用并入本文中的所有出版物、专利和专利申请都通过引用并入，其程度就如同每个单独的出版物、专利或专利申请均被明确地和单独地指示通过引用并入一样。在本文中的术语与并入的参考文献中的术语之间发生冲突的情况下，以本文中的术语为准。发明概述本文公开了多肽构建体，其包含：原核的含rna酶h样结构域(rhdc)的多肽序列和核酸解旋多肽序列。在一些情况下，rhdc多肽序列在中温温度下切割靶多核苷酸序列中的核酸。在一些情况下，靶多核苷酸序列被引导dna结合。在一些情况下，rhdc多肽序列与核酸解旋多肽序列融合。在一些情况下，rhdc多肽序列或所述核酸解旋多肽序列中的至少一种源自嗜中温有机体。在一些情况下，rhdc多肽序列在约30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃或39℃切割靶多核苷酸序列中的核酸。在一些情况下，rhdc多肽序列在约19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃切割所述靶多核苷酸序列中的核酸。在一些情况下，rhdc多肽序列在37℃切割所述靶多核苷酸序列中的核酸。在一些情况下，嗜中温有机体是原核有机体。在一些情况下，原核有机体来自选自以下的家族：拟杆菌门(bacteroidetes)、变形菌门(proteobacteria)、酸杆菌门(acidobacteria)、放线菌门(actinobacteria)、厚壁菌门(firmicutes)、蓝菌门(cyanobacteria)、螺旋体门(spirochaetes)、异常球菌(deinococcus)、疣微菌门(verrucomicrobia)、浮霉菌门(planctomycetes)、balneolaeota和绿弯菌门(chloroflexi)。在一些情况下，rhdc多肽序列源自被基因编码的多肽，所述基因位于以下中的至少一种的相邻操纵子中：p元件诱导的无用睾丸(piwi)基因、ruvc、cas、sir2、mrr、tir、pld、rease、限制性核酸内切酶、dexd/h、超家族ii解旋酶、rrxrr(seqidno:380)、duf460、duf3010、duf429、duf1092、cog5558、orfb_is605、肽酶_a17、核糖核酸酶h样结构域、3'-5'核酸外切酶结构域、3'-5'核糖核酸外切酶rv2179c样结构域、噬菌体mu、转座酶、dna指导的dna聚合酶、家族b、核酸外切酶结构域、核酸外切酶、rna酶t/dna聚合酶iii、yqgf基因、hepn、rna酶ls结构域、lsoa催化结构域、ken结构域、rna酶l、ire1、rna酶结构域、rloc或prrc。在一些情况下，rhdc多肽序列源自被基因编码的多肽，所述基因位于参与防御、应激响应、成簇规律间隔短回文重复序列(crispr)、argonaute或dna修复中的至少一种基因的相邻操纵子中。在一些情况下，rhdc多肽序列是argonaute结构域序列。在一些情况下，rhdc多肽序列包括核酸酶、切口酶、rna酶、重组酶、翻转酶、转座酶、或以上的组合。在一些情况下，多肽构建体还包含与rhdc多肽序列和核酸解旋多肽序列融合的另外的功能多肽序列。在一些情况下，核酸解旋多肽是原核或古细菌来源的。在一些情况下，核酸解旋多肽包含解旋酶、拓扑异构酶、cas、或以上的组合。在一些情况下，cas是催化失活的cas或部分失活的cas(切口酶)。在一些情况下，催化失活的cas选自以下的催化失活的衍生物：cas1、cas1b、cas2、cas3、cas4、cas5、cas6、cas7、cas8、cas9、cas10、csy1、csy2、csy3、cse1、cse2、csc1、csc2、csa5、csn2、csm2、csm3、csm4、csm5、csm6、cmr1、cmr3、cmr4、cmr5、cmr6、csb1、csb2、csb3、csx17、csx14、csx10、csx16、csax、csx3、csx1、csx1s、csf1、csf2、cso、csf4、cpf1、c2c1、c2c3、cas9hifi、xcas9、casx、casy和casrx。在一些情况下，多肽构建体还包含atp酶序列。在一些情况下，rhdc多肽序列和核酸解旋多肽序列通过接头序列融合。在一些情况下，接头是多肽接头，其包括：gsgsgs序列或多个拷贝的gsgsgs(seqidno:381)、不带电的氨基酸、α-螺旋结构域或具有配体诱导型构象变化的肽。在一些情况下，接头是多肽接头。在一些情况下，核酸解旋多肽序列和rhdc多肽序列在同一框中表达。在一些情况下，多肽构建体结合引导dna。在一些情况下，引导dna的长度是约1个碱基对至约30个碱基对。在一些情况下，引导dna与靶多核苷酸序列互补。在一些情况下，靶多核苷酸序列包含基因序列。在一些情况下，在被引入细胞中时，多肽构建体在基因序列中产生破坏。在一些情况下，破坏包括双链断裂或单链断裂。在一些情况下，rhdc多肽序列包含在37℃切割核酸的厚壁菌argonaute结构域或其功能片段或变体。在一些情况下，rhdc多肽序列包含在37℃切割核酸的梭菌(clostridium)argonaute结构域或其功能片段或变体。在一些情况下，梭菌argonaute结构域包括双孢梭菌(clostridiumdisporicum)argonaute结构域或其功能片段或变体。在一些情况下，rhdc多肽序列包含在37℃切割核酸的高温放线菌(thermoactinomyces)argonaute结构域或其功能片段或变体。在一些情况下，高温放线菌argonaute结构域包括高温放线菌(thermoactinomycessp)cdfargonaute结构域或其功能片段或变体。在一些情况下，rhdc多肽序列包含在37℃切割核酸的甲基杆菌(methylobacter)argonaute结构域或其功能片段或变体。在一些情况下，甲基杆菌argonaute结构域包括whittenburyi甲基杆菌(methylobacterwhittenburyi)argonaute结构域或其功能片段或变体。在一些情况下，rhdc多肽序列包含在37℃切割核酸的嗜热聚球藻(thermosynechococcus)argonaute结构域或其功能片段或变体。在一些情况下，嗜热聚球藻argonaute结构域包括细长嗜热聚球藻(thermosynechococcuselongates)argonaute结构域或其功能片段或变体。本文公开了包含argonaute多肽序列和核酸解旋多肽序列的合成融合体的多肽构建体。在一些情况下，argonaute多肽序列在嗜中温温度下切割靶核酸。在一些情况下，argonaute多肽序列或核酸解旋多肽序列中的至少一种源自嗜中温有机体。在一些情况下，argonaute多肽序列在约19℃至40℃切割靶核酸。在一些情况下，argonaute多肽序列在约30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃或39℃切割靶核酸。在一些情况下，argonaute多肽序列在37℃切割靶核酸。在一些情况下，argonaute多肽序列是古细菌argonaute多肽序列。在一些情况下，argonaute多肽序列包括核酸酶、切口酶、rna酶、重组酶、翻转酶、转座酶、或以上的组合。在一些情况下，argonaute多肽序列和核酸解旋多肽序列通过接头序列融合。本文提供了包含多肽构建体的离体细胞。本文提供了编码多肽构建体的核酸。本文提供了包含多肽构建体的组合物。本文提供了基因组编辑的方法，其包括使细胞与多肽构建体接触。本文提供了试剂盒，其包含：多肽构建体和所述试剂盒的使用说明书。在一些情况下，试剂盒还可以包含容器。本文提供了多肽构建体，其包含：含rna酶h样结构域(rhdc)的多肽序列、核酸解旋多肽序列和核酸插入多肽序列。在一些情况下，rhdc多肽序列在嗜中温温度下切割靶多核苷酸序列中的核酸以生成切割的核酸。在一些情况下，靶多核苷酸序列被引导dna结合。在一些情况下，rhdc多肽序列与核酸解旋多肽序列融合。在一些情况下，核酸插入多肽序列将核酸序列插入切割的核酸中。本文提供了多肽构建体，其包含：含rna酶h样结构域(rhdc)的多肽序列和调控结构域多肽(rdp)序列。在一些情况下，多肽构建体还包含核酸解旋结构域序列。在一些情况下，核酸解旋结构域序列包括催化失活的cas、解旋酶或拓扑异构酶。在一些情况下，rdp序列是rad51多肽、重组酶、表观遗传调节剂或参与生殖细胞修复的结构域。在一些情况下，rhdc多肽序列包含在37℃切割所述靶多核苷酸序列中的核酸的厚壁菌argonaute结构域或其功能片段或变体。在一些情况下，rhdc多肽序列包含在37℃切割所述靶多核苷酸序列中的核酸的梭菌argonaute结构域或其功能片段或变体。在一些情况下，梭菌argonaute结构域包括双孢梭菌argonaute结构域或其功能片段或变体。在一些情况下，rhdc多肽序列包含在37℃切割所述靶多核苷酸序列中的核酸的高温放线菌argonaute结构域或其功能片段或变体。在一些情况下，高温放线菌argonaute结构域包括高温放线菌cdfargonaute结构域或其功能片段或变体。在一些情况下，rhdc肽包含在37℃切割所述靶多核苷酸序列中的核酸的甲基杆菌argonaute结构域或其功能片段或变体。在一些情况下，甲基杆菌argonaute结构域包括whittenburyi甲基杆菌argonaute结构域或其功能片段或变体。在一些情况下，rhdc多肽包含在37℃切割所述靶多核苷酸序列中的核酸的嗜热聚球藻argonaute结构域或其功能片段或变体。在一些情况下，嗜热聚球藻argonaute结构域包括细长嗜热聚球藻argonaute结构域或其功能片段或变体。本文公开了多肽构建体，其包含：argonaute多肽序列、核酸解旋多肽序列和核酸插入多肽序列。在一些情况下，argonaute多肽序列在嗜中温温度下切割核酸并将核酸插入多肽序列插入切割的核酸中的核酸序列中。在一些情况下，argonaute多肽序列或核酸解旋多肽序列中的至少一种源自嗜中温有机体。在一些情况下，argonaute多肽序列从19℃至40℃切割核酸。在一些情况下，argonaute多肽序列在约30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃或39℃切割核酸。在一些情况下，argonaute多肽序列在37℃切割核酸。在一些情况下，argonaute多肽序列是古细菌argonaute多肽序列。在一些情况下，argonaute多肽序列包括核酸酶、切口酶、rna酶、重组酶、翻转酶、转座酶、或以上的组合。在一些情况下，argonaute多肽序列和核酸解旋多肽序列通过接头连接。本文提供了包含多肽构建体的离体细胞。本文提供了编码多肽构建体的核酸。本文提供了包含多肽构建体的组合物。本文提供了基因组编辑的方法，其包括使细胞与多肽构建体接触。本文提供了这样的方法，其包括：使细胞与核酸编辑系统接触，所述核酸编辑系统包含：(i)含rna酶h样结构域(rhdc)的多肽序列；(ii)核酸解旋剂序列；(iii)引导核酸；和(iv)调控结构域多肽(rdp)序列。在一些情况下，接触导致编辑细胞中的核酸。在一些情况下，rhdc序列、核酸解旋剂序列和rdp序列在蛋白质复合物中。在一些情况下，蛋白质复合物与引导核酸缔合以形成引导的编辑复合物。在一些情况下，引导核酸是引导dna。在一些情况下，引导核酸是引导rna。在一些情况下，rhdc结构域来自argonaute。在一些情况下，核酸解旋剂序列包括解旋酶、拓扑异构酶、cas或以上的组合。在一些情况下，cas是催化失活的或部分催化失活的cas。在一些情况下，rdp序列包括重组酶、表观遗传调节剂、生殖细胞修复结构域、dna修复蛋白、或以上的组合。在一些情况下，rdp序列全部或部分控制核酸编辑。在一些情况下，引导核酸与细胞中的核酸互补。在一些情况下，细胞中的核酸编码疾病相关抗原。在一些情况下，疾病是心脏病、糖尿病、癌症、神经病、精神病、遗传病、或以上的组合。在一些情况下，与不含rdp序列的相应核酸编辑方法相比，该方法具有较低的能量需求，并且其中能量需求通过计算atp用量差来确定，所述atp用量差通过向核酸编辑系统中提供预定量的atp，和在编辑后基于([atp]-[adp])/[修饰的dna]计算atp用量来确定。在一些情况下，与不含rdp序列的相当的核酸编辑系统相比，当使用包含rdp序列的核酸编辑系统时，能量水平降低约4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％或高达25％。在一些情况下，相比非同源末端连接，该方法有利于朝向同源定向修复的基因组编辑修复。在一些情况下，该方法还包括将转基因引入细胞的基因组中。在一些情况下，通过非病毒方式进行引入。在一些情况下，通过病毒进行引入。在一些情况下，细胞是原代细胞或重组细胞。在一些情况下，细胞是人细胞。在一些情况下，将核酸编辑系统电穿孔至细胞中。在一些情况下，该方法还包括将由该方法编辑的细胞引入有需要的对象中。在一些情况下，rhdc多肽序列包含在37℃切割核酸的厚壁菌argonaute结构域或其功能片段或变体。在一些情况下，rhdc多肽序列包含在37℃切割核酸的梭菌argonaute结构域或其功能片段或变体。在一些情况下，梭菌argonaute结构域包括双孢梭菌argonaute结构域或其功能片段或变体。在一些情况下，rhdc多肽序列包含在37℃切割核酸的高温放线菌argonaute结构域或其功能片段或变体。在一些情况下，高温放线菌argonaute结构域包括高温放线菌cdfargonaute结构域或其功能片段或变体。在一些情况下，rhdc多肽序列包含在37℃切割核酸的甲基杆菌argonaute结构域或其功能片段或变体。在一些情况下，甲基杆菌argonaute结构域包括whittenburyi甲基杆菌argonaute结构域或其功能片段或变体。在一些情况下，rhdc多肽序列包含在37℃切割核酸的嗜热聚球藻argonaute结构域或其功能片段或变体。在一些情况下，嗜热聚球藻argonaute结构域包括细长嗜热聚球藻argonaute结构域或其功能片段或变体。本文提供了包含分离的核酸序列，其包含与seqidno:161-252中的任一个至少60％同一性。在一些情况下，分离的核酸序列包含与seqidno:161-252中的任一个至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。本文提供了包含分离的核酸序列的细胞。本文提供了包含由分离的核酸序列编码的蛋白的细胞。在一些情况下，细胞还包含引导核酸。在一些情况下，细胞还包含调控结构域多肽(rdp)。本文提供了分离的多肽序列，其包含与seqidno:20-38中的任一个至少60％同一性。在一些情况下，分离的多肽序列还包含与seqidno:20-38中的任一个至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。本文提供了包含分离的多肽序列的细胞。在一些情况下，细胞还包含引导核酸。在一些情况下，细胞还包含调控结构域多肽(rdp)序列。本文提供了基因组编辑的方法，其包括：使细胞群体与多肽构建体接触，其中在接触之后，至少约5％的群体包含基因组破坏。在一些情况下，在接触之后，至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％或60％的群体包含基因组破坏。本文提供了基因组编辑的方法，其包括：使细胞群体与编码多肽构建体的分离的多核酸接触，其中在接触之后，至少约5％的群体包含基因组破坏。在一些情况下，在接触之后，至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％或60％的群体包含基因组破坏。本文提供了基因组编辑的方法，其包括：(a)使基因组序列与成簇规律间隔短回文重复序列(crispr)蛋白解旋，从而生成解旋的基因组序列；和(b)通过使解旋的基因组序列与嗜中温的含rna酶h样结构域(rhdc)的多肽接触，以在解旋基因组序列中引入基因组破坏，从而编辑基因组。在一些情况下，crispr蛋白是催化失活的cas或部分失活的cas(切口酶)。在一些情况下，催化失活的cas选自以下的催化失活的衍生物：cas1、cas1b、cas2、cas3、cas4、cas5、cas6、cas7、cas8、cas9、cas10、csy1、csy2、csy3、cse1、cse2、csc1、csc2、csa5、csn2、csm2、csm3、csm4、csm5、csm6、cmr1、cmr3、cmr4、cmr5、cmr6、csb1、csb2、csb3、csx17、csx14、csx10、csx16、csax、csx3、csx1、csx1s、csf1、csf2、cso、csf4、cpf1、c2c1、c2c3、cas9hifi、xcas9、casx、casy和casrx。在一些情况下，cas是dcas9。在一些情况下，rhdc多肽包括选自ruvc、hnh、rna酶h、piwi、或以上组合的多肽。在一些情况下，该方法还包括调控结构域多肽(rdp)。在一些情况下，rdp包括rad51、重组酶、表观遗传调节剂或参与生殖细胞修复的结构域。在一些情况下，基因组序列在原代细胞或重组细胞中。在一些情况下，基因组序列在人细胞中。本文提供了治疗有需要的对象中的疾病的方法，其包括施用由本文公开的方法编辑的细胞。在一些情况下，疾病是心脏病、糖尿病、癌症、神经病、免疫性疾病、精神病、遗传病、或以上的组合。在一些情况下，疾病的量度在施用之后减少约10％至约50％。本文提供了使有需要的对象中的疾病稳定的方法，其包括施用由本文公开的方法编辑的细胞。在一些情况下，稳定包括在施用之后对象中的疾病水平的小于5％的改变。本文提供了编码原核的含rna酶h样结构域(rhdc)的多肽序列和核酸解旋多肽序列的核酸构建体，其中rhdc多肽序列在嗜中温温度下切割靶多核苷酸序列中的核酸，其中靶多核苷酸序列被引导dna结合，并且其中rhdc多肽序列与由核酸构建体编码的多肽中的核酸解旋多肽序列融合。本文提供了编码含rna酶h样结构域(rhdc)的多肽序列、核酸解旋多肽序列和核酸插入多肽序列的核酸构建体，其中由所述rhdc多肽序列编码的蛋白在嗜中温温度下切割靶多核苷酸序列中的核酸，其中靶多核苷酸序列被引导dna结合，其中rhdc多肽序列与由核酸构建体编码的多肽中的核酸解旋多肽序列融合，并且其中核酸插入多肽序列将核酸序列插入切割的核酸中。本文提供了细胞，其包含多肽构建体，所述多肽构建体包含原核的含rna酶h样结构域(rhdc)的多肽和核酸解旋多肽，其中rhdc多肽序列在嗜中温温度下切割核酸，其中核酸切割活性被引导dna结合，并且其中rhdc多肽序列与核酸解旋多肽融合。本文提供了细胞，其包含多肽构建体，所述多肽构建体包含含rna酶h样结构域(rhdc)的多肽序列、核酸解旋多肽序列和核酸插入多肽序列，其中由rhdc多肽序列编码的多肽在嗜中温温度下切割靶多核苷酸序列中的核酸，其中靶多核苷酸序列被引导dna结合，其中rhdc多肽序列于核酸解旋多肽融合，并且其中核酸插入多肽序列将核酸序列插入切割的核酸中。本文提供了细胞，其包含核酸构建体，所述核酸构建体编码原核的含rna酶h样结构域(rhdc)的多肽序列和核酸解旋多肽序列，其中rhdc多肽序列在嗜中温温度下切割靶多核苷酸序列中的核酸，其中靶多核苷酸序列被引导dna结合，并且其中rhdc多肽序列与核酸解旋多肽序列融合。本文提供了细胞，其包含核酸构建体，所述核酸构建体编码含rna酶h样结构域(rhdc)的多肽序列、核酸解旋多肽序列和核酸插入多肽序列，其中rhdc多肽序列在嗜中温温度下切割靶多核苷酸序列中的核酸，其中靶多核苷酸序列被引导dna结合，其中rhdc多肽序列与核酸解旋多肽序列融合，并且其中核酸插入多肽序列将核酸序列插入切割的核酸中。本文公开了包含含rna酶h样结构域(rhdc)的多肽序列和核酸解旋多肽的原核多肽构建体。rhdc多肽在嗜中温温度下切割核酸。核酸切割活性由引导dna指导并且rhdc多肽与核酸解旋多肽融合。本文公开了包含含rna酶h样结构域(rhdc)的多肽和核酸解旋多肽的多肽构建体。rhdc多肽在嗜中温温度下切割核酸。核酸切割活性由引导dna指导并且rhdc多肽与核酸解旋多肽融合。本文公开了包含argonaute多肽和核酸解旋多肽的多肽构建体。argonaute多肽在嗜中温温度下切割核酸。在一些情况下，rhdc多肽或核酸解旋多肽中的至少一种源自嗜中温有机体。在一些情况下，argonaute多肽或核酸解旋多肽中的至少一种源自嗜中温有机体。rhdc多肽可从约30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃至约39℃切割核酸。在一些情况下，rhdc多肽从约19℃至约40℃切割核酸。在一些情况下，rhdc多肽在37℃切割核酸。在一些情况下，argonaute多肽在约30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃或39℃切割核酸。在一些情况下，argonaute多肽在37℃切割核酸。在一些情况下，嗜中温有机体是原核有机体。原核有机体可以来自选自以下的家族：拟杆菌门、变形菌门、酸杆菌门、放线菌门、厚壁菌门、蓝菌门、螺旋体门、异常球菌、疣微菌门、浮霉菌门、balneolaeota和绿弯菌门。rhdc多肽可以是古细菌argonaute多肽。argonaute多肽可以是古细菌argonaute多肽。rhdc多肽可以被基因编码，所述基因位于以下中至少一种的相邻操纵子中：p元件诱导的无用睾丸(piwi)基因、ruvc、cas、sir2、mrr、tir、pld、rease、限制性核酸内切酶、dexd/h、超家族ii解旋酶、rrxrrseqidno:380)、duf460、duf3010、duf429、duf1092、cog5558、orfb_is605、肽酶_a17、核糖核酸酶h样结构域、3'-5'核酸外切酶结构域、3'-5'核糖核酸外切酶rv2179c样结构域、噬菌体mu、转座酶、dna指导的dna聚合酶、家族b、核酸外切酶结构域、核酸外切酶、rna酶t/dna聚合酶iii、yqgf基因、hepn、rna酶ls结构域、lsoa催化结构域、ken结构域、rna酶l、ire1、rna酶结构域、rloc或prrc。在一些情况下，rhdc多肽被基因编码，所述基因位于参与防御、应激响应、成簇规律间隔短回文重复序列(crispr)、argonaute或dna修复中的至少一种基因的相邻操纵子中。在一些情况下，rhdc多肽是argonaute结构域。在一些情况下，rhdc多肽编码核酸酶、切口酶、rna酶、重组酶、翻转酶、转座酶、或以上的组合。在一些情况下，argonaute多肽编码核酸酶、切口酶、rna酶、重组酶、翻转酶、转座酶、或以上的组合。在一些情况下，rhdc多肽编码rna酶。核酸解旋多肽可以是原核或古细菌来源的。在一些情况下，核酸解旋多肽编码解旋酶、拓扑异构酶、cas、或以上的组合。cas可以是催化失活的cas或部分失活的cas(切口酶)。cas可以是部分催化失活的。cas可以是部分失活的。在一些情况下，催化失活的cas选自：cas1、cas1b、cas2、cas3、cas4、cas5、cas6、cas7、cas8、cas9、cas10、csy1、csy2、csy3、cse1、cse2、csc1、csc2、csa5、csn2、csm2、csm3、csm4、csm5、csm6、cmr1、cmr3、cmr4、cmr5、cmr6、csb1、csb2、csb3、csx17、csx14、csx10、csx16、csax、csx3、csx1、csx1s、csf1、csf2、cso、csf4、cpf1、c2c1、c2c3、cas9hifi、xcas9、casx、casy和casrx。在一些情况下，多肽构建体还包含atp酶编码序列。在一些情况下，rhdc多肽和核酸解旋多肽通过接头连接。接头可以是多肽接头，其包括：gsgsgs、不带电的氨基酸、α-螺旋结构域和具有配体诱导型构象变化的肽。在一些情况下，argonaute多肽和核酸解旋多肽通过接头连接。接头可以是多肽接头。在一些情况下，核酸解旋多肽和rhdc多肽在同一框中表达。在一些情况下，核酸解旋多肽和argonaute多肽在同一框中表达。在一些情况下，由多肽构建体编码的蛋白与引导dna结合。在一些情况下，多肽构建体可与引导核酸结合。在一些情况下，引导多核酸可以是引导dna(gdna)或引导rna(grna)。引导dna的长度可以是约1个碱基对至约30个碱基对。引导dna可与靶多核苷酸序列互补。在一些情况下，靶多核苷酸序列包含基因序列。在一些情况下，在被引入细胞中时，由多肽构建体编码的蛋白在基因序列中产生破坏。破坏可以包括双链断裂或单链断裂。本文公开了包含多肽构建体的离体细胞。本文公开了基因组编辑的方法，其包括使细胞与由多肽构建体编码的蛋白接触。本文公开了试剂盒，其包含多肽构建体和所述试剂盒的使用说明书。试剂盒还可以包含容器。本文公开了包含含rna酶h样结构域(rhdc)的多肽和核酸解旋多肽的多肽构建体。由rhdc多肽编码的蛋白在嗜中温温度下切割核酸。核酸切割活性可由引导dna指导。rhdc多肽可与核酸解旋多肽融合，并且由多肽构建体编码的蛋白还可显示出核酸插入活性。本文公开了包含argonaute多肽和核酸解旋多肽的多肽构建体，由argonaute多肽编码的蛋白在嗜中温温度下切割核酸，并且由多肽构建体编码的蛋白还显示出核酸插入活性。本文公开了包含含rna酶h样结构域(rhdc)的多肽和调控结构域多肽(rdp)的多肽构建体。多肽构建体还可包含核酸解旋结构域。核酸解旋结构域可以是催化失活的cas、解旋酶或拓扑异构酶。在一些情况下，rdp是rad51多肽、重组酶、表观遗传调节剂或参与生殖细胞修复的结构域。本文公开了包含多肽构建体的细胞。本文公开了包含多肽构建体的组合物。本文公开了这样的方法，其包括使细胞与核酸编辑系统接触，所述核酸编辑系统包含含rna酶h样结构域(rhdc)的多肽、核酸解旋剂、引导核酸和调控结构域多肽(rdp)。在一些情况下，rhdc、核酸解旋剂和rdp包含在蛋白质复合物中。蛋白质复合物与引导核酸缔合以形成引导的编辑复合物。在一些情况下，引导核酸是引导dna、引导rna、或以上的组合。rhdc结构域可以来自argonaute。核酸解旋剂包括解旋酶、拓扑异构酶、cas、或以上的组合。在一些情况下，cas可以是催化失活的cas。cas可以是部分催化失活的。rdp可以包括重组酶、表观遗传调节剂、生殖细胞修复结构域、dna修复蛋白、或以上的组合。在一些情况下，rdp允许调整核酸编辑。引导核酸可与细胞中包含基因的基因组序列互补。在一些情况下，基因编码参与疾病的蛋白。疾病可以是心脏病、糖尿病、癌症、神经病、免疫性疾病、精神病、遗传病、或以上的组合。在一些情况下，与不含rdp的相应核酸编辑系统相比，本文公开的方法具有较低的能量需求，并且其中能量需求通过计算atp用量差来确定，所述atp用量差通过向核酸编辑系统中提供预定量的atp，和在编辑后基于([atp]-[adp])/[修饰的dna]计算atp用量来来确定。在一些情况下，与不含rdp的所述相当的核酸编辑系统相比，当使用该核酸编辑系统时，能量水平可降低约4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％或高达25％。在一些情况下，相比非同源末端连接，该方法偏向朝向同源定向修复的基因组编辑修复。本文公开的可以是这样的方法，其还包括将转基因引入细胞的基因组中。在一些情况下，引入转基因通过非病毒方式或通过病毒进行。细胞可以是原代细胞或重组细胞。细胞可以是人或非人的。可将核酸编辑系统电穿孔至细胞中。该方法还可以包括将由核酸编辑系统编辑的细胞引入有需要的对象中。本文公开了分离的核酸序列，其包含与seqidno:161-252中的任一个至少60％同一性百分比。分离的核酸序列还可包含与本文公开的序列至少约65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或高达约100％同一性。本文公开了包含由分离的核酸序列编码的蛋白的细胞。细胞还可包含引导核酸。细胞还可包含由调控结构域多肽(rdp)编码的蛋白。本文公开了基因组编辑的方法，其包括使细胞群体与由多肽构建体编码的蛋白或多肽构建体接触，其中在接触之后，至少约5％的所述群体包含基因组破坏。在一些情况下，在接触之后，至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％或60％的所述细胞群体包含基因组破坏。本文公开了基因组编辑的方法，其包括使基因组序列与成簇规律间隔短回文重复序列(crispr)蛋白解旋，从而生成解旋的基因组序列；和通过与含rna酶h样结构域(rhdc)的多肽接触，以在所述解旋的基因组序列中引入基因组破坏，从而编辑基因组。crispr蛋白可以是催化失活的cas或部分失活的cas(切口酶)。cas可以是部分催化失活的。催化失活的cas可选自：cas1、cas1b、cas2、cas3、cas4、cas5、cas6、cas7、cas8、cas9、cas10、csy1、csy2、csy3、cse1、cse2、csc1、csc2、csa5、csn2、csm2、csm3、csm4、csm5、csm6、cmr1、cmr3、cmr4、cmr5、cmr6、csb1、csb2、csb3、csx17、csx14、csx10、csx16、csax、csx3、csx1、csx1s、csf1、csf2、cso、csf4、cpf1、c2c1、c2c3、cas9hifi、xcas9、casx、casy和casrx。cas可以是dcas9。rhdc包括选自ruvc、hnh、rna酶h、piwi或以上组合的蛋白。方法还可以包括调控结构域多肽(rdp)。在一些情况下，rdp可以是rad51、重组酶、表观遗传调节剂或参与生殖细胞修复的结构域。细胞可以是原代细胞或重组细胞。细胞可以是人或非人的。本文公开了治疗有需要的对象中的疾病的方法，其包括施用由该方法编辑的细胞。疾病可以是心脏病、糖尿病、癌症、神经病、免疫性疾病、精神病、遗传病、或以上的组合。在一些情况下，在所述施用之后，疾病水平减少约10％至约50％。本文公开了使有需要的对象中的疾病稳定的方法，其包括施用由该方法编辑的细胞。稳定疾病可以包括对象中的疾病水平的小于5％的改变。在一个实施方案中，本公开提供了包含含rna酶h样结构域(rhdc)的多肽和核酸解旋多肽的多肽构建体，其中rhdc多肽在嗜中温温度下切割核酸，其中核酸切割活性由引导dna指导，并且其中rhdc多肽核酸解旋多肽融合。在一些实施方案中，本公开提供了包含argonaute多肽和核酸解旋多肽的多肽构建体，其中argonaute多肽在嗜中温温度下切割核酸。在一些实施方案中，本公开提供了基因组编辑的方法，其包括将以下引入细胞中：(a)含rna酶h样结构域(rhdc)的多肽；(b)核酸解旋剂；和(c)引导dna，其中引导dna包含与细胞中的靶核酸序列的至少一部分互补的序列，其中核酸解旋剂将靶序列的至少一部分解旋，并且其中rhdc多肽在嗜中温温度下将基因组破坏引入靶序列中。在一些实施方案中，本公开提供了基因组编辑的方法，其包括将以下引入细胞中：(a)argonaute多肽；(b)核酸解旋剂；和(c)引导多核酸，其中引导多核酸包含与细胞中的靶核酸序列的至少一部分互补的序列，其中核酸解旋剂将靶序列的至少一部分解旋，并且其中argonaute多肽在嗜中温温度下将基因组破坏引入靶序列中。在一些实施方案中，该方法还包括将外源核酸序列引入细胞中。在一些实施方案中，将外源核酸序列引入基因组破坏中。在一些实施方案中，将外源核酸序列引入随机基因组位置中。在一些实施方案中，外源核酸序列经由非病毒引入或病毒引入来引入。在一些实施方案中，病毒引入包括逆转录病毒、慢病毒、腺病毒或腺相关病毒。在一些实施方案中，外源核酸序列的非病毒引入包括电穿孔、微注射、脂质体或缀合。在一些实施方案中，外源核酸序列是dna或rna。在一些实施方案中，外源核酸序列是单链dna或双链dna。在一些实施方案中，外源核酸序列包含双链dna，其包含质粒dna或微环dna。在一些实施方案中，外源核酸序列编码外源受体。在一些实施方案中，该方法包括在引入之前、同时或之后刺激细胞。在一些实施方案中，在引入之前刺激细胞。在一些实施方案中，将细胞在引入之前刺激约1小时至约48小时。在一些实施方案中，刺激包括使细胞与以下中的至少一种接触：抗cd3抗体、抗cd28抗体或白介素。在一些实施方案中，引入包括以下中的至少一种：电穿孔、微注射、脂质体或缀合。在一些实施方案中，引入包括电穿孔。在一些实施方案中，电穿孔包括在约1000v至约2000v的电压下引入argonaute多肽、核酸解旋剂、引导多核酸或以上的组合，持续约1ms至约30ms。在一些实施方案中，电压为约1400v持续约10ms。在一些实施方案中，电穿孔包括约1个脉冲至约5个脉冲。在一些实施方案中，电穿孔是3个脉冲在一些实施方案中，该方法还包括扩增细胞。在一些实施方案中，该方法还包括选择一种或多种细胞。在一些实施方案中，选择包括以下中的至少一种：磁性分离、流式细胞术分离和/或抗生素。在一些实施方案中，选择包括选择表达细胞标志物或外源受体的细胞群体。在一些实施方案中，细胞标志物包括以下中的至少一种：cd3、cd4、cd8、ccr7、cd45ra、cd62l+、cd27、cd28和il-7rα。在一些实施方案中，该方法在封闭系统中进行。在一些实施方案中，该方法还包括在细胞上重复该方法。在一些实施方案中，多肽包含至少一种rhdc多肽和核酸解旋多肽。在一些实施方案中，至少一种rhdc多肽和核酸解旋多肽源自嗜中温有机体。在一些实施方案中，多肽包含至少一种argonaute多肽和核酸解旋多肽。在一些实施方案中，至少一种argonaute多肽和核酸解旋多肽源自嗜中温有机体。在一个实施方案中，本公开提供了用于靶向预定基因的离体系统，所述系统包括含rna酶h样结构域(rhdc)的多肽、核酸解旋剂和引导dna(gdna)，其中gdna结合基因或所述基因相邻的核酸序列，并且其中rhdc多肽在嗜中温温度下切割核酸，其中核酸切割活性由引导dna指导。在一个实施方案中，本公开提供了用于靶向预定基因的离体系统，该系统包含argonaute多肽和核酸解旋剂，其中argonaute多肽在嗜中温温度下切割核酸。在一些实施方案中，离体系统还包含细胞。在一些实施方案中，用于靶向预定基因的离体系统包含至少一种rhdc多肽和核酸解旋多肽。在一些实施方案中，至少一种rhdc多肽和核酸解旋多肽源自嗜中温有机体。在一些实施方案中，用于靶向预定基因的离体系统包含至少一种argonaute多肽和核酸解旋多肽。在一些实施方案中，至少一种argonaute多肽和核酸解旋多肽源自嗜中温有机体。在一些实施方案中，rhdc多肽从约30℃至约39℃切割核酸。在一些实施方案中，rhdc多肽从约35℃至约39℃切割核酸。在一些实施方案中，rhdc多肽在37℃切割核酸。在一些实施方案中，rhdc多肽从5℃至40℃显示出核酸酶活性。在一些实施方案中，argonaute多肽从约30℃至约39℃切割核酸。在一些实施方案中，argonaute多肽从约35℃至约39℃切割核酸。在一些实施方案中，argonaute多肽在37℃切割核酸。在一些实施方案中，argonaute多肽从5℃至40℃显示出核酸酶活性。在一些实施方案中，嗜中温有机体是原核有机体。在一些实施方案中，嗜中温有机体来自选自以下的家族：拟杆菌门、变形菌门、放线菌门、厚壁菌门、蓝菌门、螺旋体门、异常球菌、疣微菌门、浮霉菌门、balneolaeota和绿弯菌门。在一些实施方案中，嗜中温有机体来自选自以下的家族：变形菌门、酸杆菌门、放线菌门和拟杆菌门。在一些实施方案中，rhdc多肽是古细菌argonaute多肽。在一些实施方案中，argonaute多肽是古细菌argonaute多肽。在一些实施方案中，rhdc多肽被基因编码，所述基因位于以下中的至少一种的相邻操纵子中：p元件诱导的无用睾丸(piwi)基因、ruvc、cas、sir2、mrr、tir、pld、rease、限制性核酸内切酶、dexd/h、超家族ii解旋酶、rrxrr、duf460、duf3010、duf429、duf1092、cog5558、orfb_is605、肽酶_a17、核糖核酸酶h样结构域、3'-5'核酸外切酶结构域、3'-5'核糖核酸外切酶rv2179c样结构域、噬菌体mu、转座酶、dna指导的dna聚合酶、家族b、核酸外切酶结构域、核酸外切酶、rna酶t/dna聚合酶iii、yqgf基因、hepn、rna酶ls结构域、lsoa催化结构域、ken结构域、rna酶l、ire1、rna酶结构域、rloc或prrc。在一些实施方案中，rhdc多肽被基因编码，所述基因位于参与防御、应激响应、crispr系统或dna修复中的至少一种基因的相邻操纵子中。在一些实施方案中，rhdc多肽包含argonaute结构域。在一些实施方案中，rhdc多肽具有核酸酶活性。在一些实施方案中，argonaute多肽具有核酸酶活性。在一些实施方案中，核酸酶活性是双链dna切割活性。在一些实施方案中，rhdc多肽具有切口酶活性。在一些实施方案中，argonaute多肽具有切口酶活性。在一些实施方案中，切口酶活性是单链dna切割活性。在一些实施方案中，rhdc多肽具有rna酶活性。在一些实施方案中，argonaute多肽具有rna酶活性。在一些实施方案中，rna酶活性是双链rna切割活性。在一些实施方案中，rna酶活性是rna切割活性。在一些实施方案中，rhdc多肽具有rna酶h活性。在一些实施方案中，argonaute多肽具有rna酶h活性。在一些实施方案中，rna酶h活性是rna切割活性。在一些实施方案中，rhdc多肽具有重组酶活性。在一些实施方案中，rhdc多肽具有dna碱基翻转活性。在一些实施方案中，rhdc多肽具有转座酶活性。在一些实施方案中，核酸解旋多肽是原核来源的。在一些实施方案中，核酸解旋多肽是古细菌来源的。在一些实施方案中，核酸解旋多肽包含解旋酶结构域。在一些实施方案中，核酸解旋多肽包含拓扑异构酶结构域。在一些实施方案中，核酸解旋多肽包含cas蛋白结构域。在一些实施方案中，cas蛋白结构域选自：cas1、cas1b、cas2、cas3、cas4、cas5、cas6、cas7、cas8、cas9、cas10、csy1、csy2、csy3、cse1、cse2、csc1、csc2、csa5、csn2、csm2、csm3、csm4、csm5、csm6、cmr1、cmr3、cmr4、cmr5、cmr6、csb1、csb2、csb3、csx17、csx14、csx10、csx16、csax、csx3、csx1、csx1s、csf1、csf2、cso、csf4、cpf1、c2c1、c2c3和cas9hifi。在一些实施方案中，核酸解旋多肽包含催化失活的核酸解旋结构域。在一些实施方案中，催化失活的核酸解旋结构域是dcas结构域。在一些实施方案中，催化失活的核酸解旋结构域是dcas9结构域。在一些实施方案中，核酸解旋多肽包含atp酶结构域。在一些实施方案中，核酸解旋多肽具有atp酶活性。在一些实施方案中，在一些实施方案中，多肽构建体包含具有atp酶活性的多肽。在一些实施方案中，离体系统包含功能性atp酶结构域。在一些实施方案中，rhdc多肽和核酸解旋多肽通过接头连接。在一些实施方案中，argonaute多肽和核酸解旋多肽通过接头连接。在一些实施方案中，接头是多肽接头。在一些实施方案中，核酸解旋多肽和rhdc多肽在同一框中表达。在一些实施方案中，核酸解旋多肽和argonaute多肽在同一框中表达。在一些实施方案中，多肽构建体与引导dna结合。在一些实施方案中，包含含rna酶h样结构域(rhdc)的多肽的多肽构建体和核酸解旋多肽构建体与引导dna结合。在一些实施方案中，rhdc多肽和核酸解旋剂中的至少一种结合引导dna。在一些实施方案中，多肽构建体与引导核酸结合。在一些实施方案中，包含argonaute多肽和核酸解旋多肽的多肽构建体与引导核酸结合。在一些实施方案中，引导多核酸是引导dna(gdna)。在一些实施方案中，引导dna是约1个碱基对至约30个碱基对。在一些实施方案中，引导dna形成二级结构。在一些实施方案中，引导dna与靶多核苷酸序列互补。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是基因序列。在一些实施方案中，基因序列是疾病相关基因的序列。在一些实施方案中，引导核酸是引导rna(grna)。在一些实施方案中，引导多核酸是约1个碱基对至约30个碱基对。在一些实施方案中，引导多核酸形成二级结构。在一些实施方案中，引导多核酸与靶多核苷酸序列互补。在一些实施方案中，靶多核苷酸序列是基因序列。在一些实施方案中，基因序列是疾病相关基因的序列。在一些实施方案中，在被引入细胞中时，多肽构建体产生破坏。在一些实施方案中，在被引入细胞中时，离体系统产生破坏。在一些实施方案中，破坏包括双链断裂或单链断裂。在一些实施方案中，细胞是原核细胞。在一些实施方案中，细胞是真核细胞。在一些实施方案中，真核细胞是植物细胞。在一些实施方案中，真核细胞是动物细胞。在一些实施方案中，动物细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，哺乳动物细胞是人细胞。在一些实施方案中，人细胞是干细胞。在一些实施方案中，人细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是淋巴样细胞。在一些实施方案中，淋巴样细胞是t细胞、b细胞、nk细胞、干细胞或til。在一些实施方案中，细胞是原代细胞。在一些实施方案中，多肽构建体是良好生产规范(gmp)相容的。在一些实施方案中，离体系统是良好生产规范(gmp)相容的。在一些实施方案中，本公开提供了包含本文公开的多肽构建体中的任一种的离体细胞。在一些实施方案中，本公开提供了包含多肽构建体的离体细胞，所述多肽构建体包含含rna酶h样结构域(rhdc)的多肽和核酸解旋多肽，其中rhdc多肽在嗜中温温度下切割核酸，其中核酸切割活性由引导dna指导，并且其中rhdc多肽与核酸解旋多肽融合。在一些实施方案中，本公开提供了包含含argonaute多肽和核酸解旋多肽的多肽构建体的离体细胞，其中argonaute多肽在嗜中温温度下切割核酸。在一些实施方案中，离体细胞是原代细胞。在一些实施方案中，离体细胞是重组细胞。在一些实施方案中，离体细胞是原核细胞。在一些实施方案中，离体细胞是真核细胞。在一些实施方案中，真核细胞是植物细胞。在一些实施方案中，真核细胞是动物细胞。在一些实施方案中，动物细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，哺乳动物细胞是人细胞。在一些实施方案中，人细胞是干细胞。在一些实施方案中，人细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是淋巴样细胞。在一些实施方案中，淋巴样细胞是t细胞、b细胞、nk细胞、干细胞或til。在一些实施方案中，细胞是原代细胞。在一些实施方案中，本公开提供了编码本文公开的多肽构建体中任一种的多核酸。在一些实施方案中，本公开提供了编码包含含rna酶h样结构域(rhdc)的多肽和核酸解旋多肽的多肽构建体的多核酸，其中rhdc多肽在嗜中温温度下切割核酸，其中核酸切割活性由引导dna指导，并且其中rhdc多肽与核酸解旋多肽融合。在一些实施方案中，本公开提供了编码包含argonaute多肽和核酸解旋多肽的多肽构建体的多核酸，其中argonaute多肽在嗜中温温度下切割核酸。在一些实施方案中，rhdc多肽和核酸解旋多肽在同一阅读框中。在一些实施方案中，多核酸还包含核定位信号。在一些实施方案中，本公开提供了药物组合物，其包含：(a)本文公开的多肽构建体中的任一种或本文公开的离体系统中的任一种；和(b)以下中的至少一种：赋形剂、稀释剂或载体。在一些实施方案中，药物组合物呈单位剂型。在一些实施方案中，药物组合物呈片剂、液体、糖浆剂、口服制剂、静脉内制剂、鼻内制剂、皮下制剂、可吸入呼吸制剂、栓剂以及以上的任何组合的形式。在一些实施方案中，本公开提供了试剂盒，其包含：(a)本文公开的多肽构建体中的任一种或本文公开的离体系统中的任一种；和(b)所述试剂盒的使用说明书。在一些实施方案中，试剂盒还包含容器。在一些实施方案中，本公开提供了治疗有需要的对象的方法，其包括施用用本文公开的方法中的任一种修饰的细胞群体。在一些实施方案中，该方法还包括施用以下中的至少一种：细胞因子、化疗剂、抗病毒剂、抗生素或粒细胞集落刺激因子(g-csf)类似物。在一些实施方案中，细胞因子是il-2。在一些实施方案中，在施用之后，在有需要的对象中减少癌症，如通过ct扫描所测量的。在一些实施方案中，本公开提供了离体系统，其包含含rna酶h样结构域(rhdc)的多肽、核酸解旋剂和引导核酸，其中引导核酸结合预定基因或所述预定基因相邻的核酸序列，rhdc多肽能够在所述预定基因中引入双链断裂，与用单独的rhdc多肽引入双链断裂相比，核酸解旋剂降低了引入双链断裂的能量需求，以及离体系统在19℃至40℃的温度范围引入双链断裂。在一些实施方案中，离体系统还包含调控结构域多肽(rdp)。在一些实施方案中，本文提供了包含含rna酶h样结构域(rhdc)的多肽、核酸解旋剂、引导核酸和调控结构域多肽(rdp)的离体系统，其中引导核酸结合预定基因或所述预定基因相邻的核酸序列，rhdc多肽能够在所述预定基因中引入双链断裂，与用单独的rhdc引入双链断裂相比，核酸解旋剂降低了引入双链断裂的能量需求，以及离体系统在19℃至40℃的温度范围引入双链断裂。在一些实施方案中，核酸解旋剂是多肽。在一些实施方案中，rhdc多肽、核酸解旋剂和rdp是多肽构建体。在一些情况下，rdp是rad51多肽或重组酶。在一些情况下，引导核酸是引导dna。在一些情况下，离体系统以比不含所述核酸解旋剂的相当的离体系统高25％、50％或75％的效率在预定的基因中引入双链断裂。在一些情况下，离体系统以25％、50％或75％的效率在预定的基因中引入第一d-环，并且以25％、50％或75％的效率在所述预定的核酸序列中引入第二d-环。在一些情况下，rhdc多肽是argonaute多肽。在一些情况下，argonaute选自：mjago、ttago、hlaago、dmcago、msago、tsago和pfago。在一些实施方案中，本文提供了包含离体系统的细胞。在一些实施方案中，本文提供了包含离体系统的组合物。在一些实施方案中，本文提供了包含含rna酶h样结构域(rhdc)的多肽和调控结构域多肽(rdp)的多肽构建体。在一些情况下，多肽构建体还包含核酸解旋结构域。在一些情况下，核酸解旋结构域是dcas9结构域。在一些情况下，多肽构建体还包含调控结构域多肽(rdp)。在一些情况下，rdp是rad51多肽或重组酶。本文提供了包含多肽构建体的细胞。本文提供了包含多肽构建体的组合物。本文提供了用于降低与核酸编辑系统相关的能量需求的方法，其包括使细胞与核酸编辑系统接触，其中核酸编辑系统包含含rna酶h样结构域(rhdc)的多肽、核酸解旋剂、引导核酸和调控结构域多肽(rdp)，其中用所述核酸编辑系统进行核酸编辑所需的能量小于不含rdp的相当的核酸编辑系统。本文提供了包含含rna酶h样结构域(rhdc)的多肽、核酸解旋多肽和任选的调控结构域多肽(rdp)的组装的遗传编辑分子(agem)，其中rhdc多肽在嗜中温温度下切割核酸，其中所述核酸切割活性由引导核酸指导，并且其中所述rhdc多肽与所述核酸解旋多肽融合。在一些情况下，rhdc多肽是argonaute多肽。在一些情况下，argonaute选自：mjago、ttago、hlaago、dmcago、msago、tsago和pfago。在一些情况下，rhdc多肽包含选自seqidno:59-160的序列。在一些情况下，rdp是rad51多肽或重组酶。在一些情况下，核酸解旋多肽包含dcas9结构域。附图简述本发明的新特征在所附的权利要求书中具体阐述。通过参考以下详述及其附图，可以更好地理解本发明的特征和优点，在所述详述中阐述了利用本发明原理的说明性实施方案：图1显示了argonaute蛋白的完整基因组中的piwi结构域的系统发育树。该树鉴定了有机体中可能的piwi结构域，其可以用于鉴定适合的核酸酶或解旋酶结构域。图2显示了基于piwi结构域鉴定的核酸酶鉴定的挖掘策略。图3显示了piwi超家族蛋白的特征，包括c末端可含有piwi结构域，并且在核酸酶之间是保守的。虚线表示位于相同预测的操纵子中的分开的基因。图4显示了系统发育树。右边是预测的结构比对之间的同源性。从左到右是蛋白质的第0位至末端。黑框是保守的结构域。图5显示了c末端结构比对。红色是匹配的α螺旋，蓝色是β折叠。图5按出现顺序分别公开了seqidno385-406。图6显示了附近有解旋酶的argonaute基因的系统发育树。蓝色指示argonaute基因来自嗜中温有机体；红色指示argonaute基因来自嗜热有机体。图7a-7d显示了argonaute蛋白的系统发育树。蓝色指示argonaute蛋白来自嗜中温有机体；红色指示argonaute蛋白来自嗜热有机体。图8a-8d显示了系统发育树。右边是预测的结构比对之间的同源性。从左到右是蛋白质的第0位至末端。黑框是保守的结构域。图9显示了功能获得(gain-of-function)基因编辑报告系统的示意图。图10描绘了整合至hek293t中以生成报告子细胞系hek293tqms(cmvs-cuoluc-p2a-gfp,ef1α-cymr)的慢病毒质粒的图谱。图11显示了spcas9和sgcymr表达质粒即px459-sgcymr-94的图谱。图12描绘了rdp同源定向修复增强的示意图。注意，人工基因组编辑器分子(agem)。图13a显示了argonaute(seqidno:190)的裂解条件1的考马斯亮蓝染色凝胶。图13b显示了argonaute(seqidno:190)的裂解条件2的考马斯亮蓝染色凝胶。图13c显示了argonaute(seqidno:190)的裂解条件3的考马斯亮蓝染色凝胶。图13d显示了argonaute(seqidno:190)的裂解条件4的考马斯亮蓝染色凝胶。图13e显示了argonaute(seqidno:190)的裂解条件5的考马斯亮蓝染色凝胶。图13f显示了argonaute(seqidno:190)的裂解条件6的考马斯亮蓝染色凝胶。图14a显示了在不同浓度的nacl下，利用argonaute(seqidno:190)结合sgdna(d1、d22或非靶向sgdna(nt))，表25进行的ssdna切割测定的sybrgold染色的ssdna凝胶。图14b显示了在不同浓度的nacl下，利用超声处理的argonaute(seqidno:190)结合sgdna(d1、d2或nt)，表25进行的ssdna切割测定的sybrgold染色的ssdna凝胶。图14c显示了在250mmnacl的浓度下，利用超声处理的argonaute(seqidno:190)结合sgdna(d1、d2、r1、r2或nt)，表25进行的ssdna切割测定的sybrgold染色的ssdna凝胶。图14d显示了在包括95℃的加热步骤的不同的处理条件下，利用超声处理的argonaute(seqidno:190)结合sgdna(d1、d2、r1、r2或nt)，表25进行的ssdna切割测定的sybrgold染色的ssdna凝胶。图15a显示了bsa的蛋白质定量标准曲线。图15b显示了argo#4、argo#7、argo#8、argo#9和argo#10的蛋白质定量。图15c显示了argo#16、argo#17、argo#19、argo#20和argo#21的蛋白质定量。图15d显示了argo#23、argo#25、argo#26、argo#27和argo#29的蛋白质定量。图15e显示了argo#29、argo#30、argo#41、argo#63和空对照的蛋白质定量。图16显示了利用argo#41、#17和#30进行的ssdna切割测定的结果。图17显示了dsdna/ssdna切割测定的示意图。图18显示了6808细胞测定的示意图。图19显示了用于dna切割/缺口测定的拆分荧光报告子(splitfluorescentreporter)的可能体系结构的实例。相对于体系结构，还包括引导dna的位置6819、6821、sg_02、sg_03、sg_01。图20显示了用于dna切割/缺口测定的拆分荧光报告子的可能体系结构(architecture)的实例。引导dna的位置还包括相对于该体系结构的6819、6821、sg_02、sg_03、sg_01。图21显示了用于dna切割/缺口测定的拆分荧光报告子的可能体系结构的实例。引导dna的位置还包括相对于该体系结构的6819、6821、sg_02、sg_03、sg_01。图22a显示了使用hek293t细胞进行的阴性对照实验。图22b显示了使用6808细胞进行的阴性对照实验。图22c显示了使用6808细胞和cas9进行的阴性对照实验。图22d显示了使用6808细胞、cas9和非靶向引导rna进行的阴性对照实验。图22e显示了使用6808细胞、cas9、非靶向引导rna和单链寡脱氧核苷酸供体进行的阴性对照实验。图22f显示了使用6808细胞、cas9、非靶向引导rna和另一种单链寡脱氧核苷酸供体进行的阴性对照实验。图22g显示了使用6808细胞、cas9n和非靶向引导rna进行的阴性对照实验。图22h显示了使用6808细胞、cas9、非靶向引导rna和单链寡脱氧核苷酸供体进行的阴性对照实验。图22i显示了使用6808细胞、ncas9、非靶向引导rna和单链寡脱氧核苷酸供体进行的阴性对照实验。图22j显示了使用6808细胞和单链寡脱氧核苷酸供体进行的阴性对照实验。图22k显示了使用6808细胞和单链寡脱氧核苷酸供体进行的阴性对照实验。图23显示了使用6808细胞、cas9和靶向94_接头的引导rna进行的阳性对照实验。图24显示了使用6808细胞、ncas9和靶向94_接头的引导rna进行的阳性对照实验。图25a显示了使用6808细胞、ncas9、靶向94_接头的引导rna和单链寡脱氧核苷酸供体进行的阳性对照实验。图25b显示了使用6808细胞、ncas9、靶向94_接头的引导rna和另一种单链寡脱氧核苷酸供体进行的阳性对照实验。图26a显示了利用表22的截短的引导多核酸进行ssdna切割测定的考马斯亮蓝染色凝胶。图26b显示了利用表22的截短的引导多核酸进行ssdna切割测定的sybrgold染色的ssdna凝胶，d1*表示d1不具有5’磷酸化。图27a显示了对未处理的6808细胞进行的测序反应的结果。图27b显示了对用cas9n、非靶向引导rna和ssodn_4供体处理的6808细胞进行的测序反应的结果。图28显示了对用ncas9和sgrna6821处理的6808细胞进行的测序反应的结果。图29显示了对用ncas9、sgrna6821和ssodn_4供体处理的6808细胞进行的测序反应的结果。图30显示了对用cas9和sgrna6825处理的6808细胞进行的测序反应的结果。图31显示了对用cas9、sgrna6825和ssodn_4供体处理的6808细胞进行的测序反应的结果。图32a和图32b分别显示了针对38种和44种不同的ago蛋白的拆分荧光6808细胞测定的结果。图33显示了遗传热力学的第一定律，并提供了本文提供的agem系统(放热)与另外的基因编辑系统(吸热)之间的比较。图34描绘了人工基因组编辑器分子(agem)的解剖结构的示例性示意图。agem含有含rna酶h样结构域的蛋白、核酸解旋剂和调控结构域剂。图35显示了用于dna切割/缺口测定的拆分荧光报告子的可能体系结构的实例。引导dna的位置还包括相对于该体系结构的6825。发明详述以下描述和实例详细说明了本发明的实施方案。应当理解，本发明不限于本文所述的特定实方案，并因此可以改变。本领域的技术人员将认识到，本发明有许多变化和修改，它们都包含在其范围内。定义如本文所用，与参考数值及其语法等同物相关的术语“约”及其语法等同物可以包括从该值加或减10％的数值范围。例如，量“约10”包括9至11的量。与参考数值相关的术语“约”还可以包括从该值加或减10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的数值范围。如本文所用，术语“激活”及其语法等同物可以指细胞从静止状态转变为活跃状态的过程。该过程可以包括对抗原的响应、迁移和/或表型或遗传改变为功能活性状态。例如，术语“激活”可以指t细胞激活的逐步过程。例如，t细胞可能需要至少两个信号才能完全激活。第一信号可以在抗原-mhc复合物与tcr接合后出现，而第二信号可以通过共刺激分子的接合出现。在体外，抗cd3可以模拟第一信号，并且抗cd28可以模拟第二信号。如本文所用，术语“相邻”及其语法等同物可以指紧接参考对象。例如，在核苷酸序列的上下文中，术语相邻可以意指其间没有任何核苷酸。例如，与多核苷酸b相邻的多核苷酸a可以意指在a和b之间没有任何核苷酸的ab。如本文所用，术语“argonuate”、“ago”及其语法等同物可以指天然存在的或工程化的结构域或蛋白质，其可以通过引导多核苷酸特异性识别靶核酸来引导，所述靶核酸包含引导多核酸的互补序列。一些ago结构域或蛋白质，在本文中也称为“argonaute核酸酶”，具有核酸内切酶活性，如能够切割靶核酸中的内部磷酸二酯键。某些ago蛋白可能不切割靶核酸。如本文所用，术语“自体的”及其语法等同物可以指源自同一存在(thesamebeing)。例如，样品(如细胞)可以在稍后的时间被取出、处理并送回至同一主体(如对象)。自体过程不同于同种异体过程，在同种异体过程中，供体和接受者是不同的对象。如本文所用，术语“癌症”及其语法等同物可以指细胞的过度增殖，其独特特征是失去正常控制，导致生长失控、缺乏分化、局部组织浸润和/或转移。就本发明方法而言，癌症可以是任何癌症，包括以下中的任一种：急性淋巴细胞癌、急性髓细胞性白血病、肺泡横纹肌肉瘤、膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、肛门癌、肛管癌、直肠癌、眼癌、肝内胆管癌、关节癌、颈癌、胆囊癌或胸膜癌、鼻癌、鼻腔癌或中耳癌、口腔癌、外阴癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性粒细胞癌、结肠癌、食道癌、宫颈癌、纤维肉瘤、胃肠道类癌瘤、霍奇金淋巴瘤、喉咽癌、肾癌(kidneycancer)、喉癌、白血病、液体肿瘤、肝癌、肺癌、淋巴瘤、恶性间皮瘤、肥大细胞瘤、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、腹膜癌、网膜癌和肠系膜癌、咽癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌(renalcancer)、皮肤癌、小肠癌、软组织癌、实体瘤、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、输尿管癌和/或膀胱癌。如本文所用，术语“肿瘤”是指如恶性类型或良性类型的细胞或组织的异常生长。如本文所用，术语“癌症新生抗原(cancerneo-antigen)”或“新生抗原”或“新生表位”及其语法等同物可以指在正常的非癌性宿主组织中不表达和/或未暴露于免疫监视的抗原。例如，“新生抗原”可能在正常的非突变宿主基因组中不编码。在一些情况下，“新生抗原”可以代表致癌病毒蛋白或由于体细胞突变而产生的异常蛋白。例如，新生抗原可以通过病毒蛋白的活性来破坏细胞机制而产生。另一个实例可以是致癌化合物的暴露，其在某些情况下可导致体细胞突变。这种体细胞突变可最终导致肿瘤/癌症的形成。如本说明书中所用，术语“细胞毒性”是指细胞正常状态的改变，以致细胞死亡。细胞的正常状态可以指在细胞暴露于细胞毒性组合物、试剂和/或条件之前已经显现或存在的状态。通常，处于正常状态的细胞是处于内稳态的细胞。细胞正常状态的意外或不期望的改变可以以例如细胞死亡(如程序性细胞死亡)、复制潜能降低、细胞完整性(诸如膜完整性)降低、代谢活性降低、发育能力降低或本申请中公开的任何细胞毒性作用的形式显现。细胞毒性例如在肿瘤细胞的细胞毒性的情况下可能是期望的，或者例如在健康细胞的细胞毒性的情况下可能是不期望的。短语“降低细胞毒性(reducingcytotoxicity)”或“降低细胞毒性(reducecytotoxicity)”是指在暴露于细胞毒性组合物、试剂和/或条件时细胞正常状态的意外或不期望的改变的程度或频率的降低。该短语可以指降低暴露于细胞毒性组合物、试剂和/或条件的单独细胞的细胞毒性程度，或者降低细胞群体暴露于细胞毒性组合物、试剂和/或条件时表现出细胞毒性的细胞群体的数量。如本文所用，术语“工程化的”及其语法等同物可以指核酸如有机体基因组内的核酸的一种或多种改变。术语“工程化的”可以指基因的改变、添加和/或缺失。工程化的细胞也可以指具有添加、缺失和/或改变的基因的细胞。如本文所用，术语“细胞”或“工程化细胞”及其语法等同物可以指人类或非人类动物来源的细胞。如本文所用，术语“检查点基因”及其语法等同物可以指参与起调控免疫应答幅度的作用的抑制过程(如，反馈环)，例如减轻了有害响应的不受控制的传播的免疫抑制反馈环的任何基因。这些响应可以包括形成分子屏蔽，以防止在对感染的免疫应答和/或维持外周自我耐受期间可能发生的附带组织损伤。检查点基因的非限制性实例可以包括受体的扩展cd28家族成员及其配体以及参与共抑制途径的基因(如ctla-4和pd-1)。术语“检查点基因”还可指代免疫检查点基因。“crispr”、“crispr系统”或“crispr核酸酶系统”及其语法等同物可以包括结合dna的rna分子(如，引导rna)和具有核酸酶功能(如两个核酸酶结构域)的cas蛋白(如，cas9)。参见，如sander,j.d.,等人,“crispr-cassystemsforediting,regulatingandtargetinggenomes,”naturebiotechnology,32:347–355(2014)；还可参见如hsu,p.d.,等人,“developmentandapplicationsofcrispr-cas9forgenomeengineering,”cell157(6):1262-1278(2014)。在一些实施方案中，crispr系统包括具有切口酶功能(如，一个催化失活的核酸酶结构域和一个催化活性核酸酶结构域)的cas蛋白。cas可以是部分催化失活的。如本文所用，术语“破坏”及其语法等同物可以指如通过缺失、插入、突变、重排或其任何组合来改变基因的过程。例如，基因可通过敲除而被破坏。破坏基因可以例如部分或完全阻抑基因的表达。破坏基因还可以引起不同基因，例如下游基因的激活。如本文所用，术语“工程化的”及其语法等同物可以指核酸如有机体基因组内的核酸的一种或多种改变。术语“工程化的”可以指基因的改变、添加和/或缺失。工程化细胞也可以指具有添加、缺失和/或改变的基因的细胞。如本文所用，术语“功能”及其语法等同物可以指操作、具有或用于预期目的的能力。功能可以包括从基线到100％的正常功能的任何百分比。例如，功能可以包括或包括约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、和/或100％的正常功能。在一些情况下，术语功能可意指超过或超过约100％的正常功能，例如125、150、175、200、250、300％和/或高于正常功能。如本文所用，术语“基因编辑”及其语法等同物可以指这样的基因工程，其中从基因组中插入、替换或去除一个或多个核苷酸。可以使用核酸酶(如，天然存在的核酸酶或人工工程化的核酸酶)进行基因编辑。如本文所用，术语“良好生产规范”(gmp)及其语法等同物可以指根据fda是安全、有效或纯的产品。gmp有时也可以称为“cgmp”。“c”代表“当前”。产品制造商可以使用最新的技术和系统以符合gmp产品的规定。gmp相容性产品通常在临床环境中使用，而不是在研究环境中使用。如本文所用，术语“突变”及其语法等同物可以包括多核苷酸中一个或多个核苷酸的取代、缺失和插入。例如，多核苷酸(cdna，基因)或多肽序列中多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、40、50或更多个核苷酸/氨基酸可以被取代、缺失和/或插入。突变可影响基因的编码序列或其调控序列。突变也可影响基因组序列的结构或编码的mrna的结构/稳定性。如本文所用，术语“非人类动物”及其语法等同物可以包括除人类以外的所有动物物种，包括非人类哺乳动物，其可以是天然动物或经遗传修饰的非人类动物。术语“核酸”、“多核苷酸”、“多核酸”和“寡核苷酸”及其语法等同物可以互换使用，并且可以指呈线性或环状构象以及呈单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物。为了本公开的目的，这些术语不应被解释为对长度的限制，除非上下文另外明确指出。该术语还可以涵盖天然核苷酸的类似物，以及在碱基、糖和/或磷酸部分(如硫代磷酸酯主链)中被修饰的核苷酸。该术语的修饰还可以涵盖去甲基化、cpg甲基化的添加、细菌甲基化的去除、和/或哺乳动物甲基化的添加。通常，特定核苷酸的类似物可以具有相同的碱基配对特异性，如，a的类似物可以与t进行碱基配对。术语“构建体”可以指人工或合成的构建体。例如，多肽构建体可以指人工的或合成的多肽，如包含一条或多条多肽序列。类似地，核酸构建体可以指人工或合成核酸，如包含一条或多条核酸序列。可以容易地确定全长的序列或其片段上的核酸或氨基酸序列的术语“同一性百分比(％)”。通常，当提及两个不同序列(如核苷酸或氨基酸序列)之间的“同一性”、“同源性”或“相似性”时，参考“比对”序列确定“同一性”、“同源性”或“相似性”。“比对”序列或“比对”是指这样的多个核酸序列或蛋白质(氨基酸)序列，与参考序列相比，其通常含有对缺失或另外的碱基或氨基酸的校正。如本文所用，术语“外周血淋巴细胞”(pbl)及其语法等同物可以指在血液(如外周血)中循环的淋巴细胞。外周血淋巴细胞可以指未定位于器官的淋巴细胞。外周血淋巴细胞可以包括t细胞、nk细胞、b细胞或其任何组合。如本文所用，术语“表型”及其语法等同物可以指有机体的可观察特征或特性的组合，诸如其形态、发育、生化或生理性质、物候、行为和/或行为产物。根据上下文，术语“表型”有时可以指群体的可观察特征或特性的组合。如本文所用，术语“前间隔子(protospacer)”及其语法等同物可以指能够与引导rna的一部分(诸如引导rna的间隔子序列或工程化的靶向部分)杂交的pam相邻核酸序列。前间隔子可以是由引导rna靶向的基因、基因组或染色体内的核苷酸序列。在天然状态下，前间隔子与pam(前间隔子相邻基序)相邻。rna引导的核酸酶的切割位点在前间隔子序列内。例如，当引导rna靶向特定的前间隔子时，cas蛋白将在前间隔子序列内生成双链断裂，从而切割前间隔子。切割后，可通过非同源末端连接(nhej)或同源定向修复(hdr)导致前间隔子的破坏。前间隔子的破坏可能会导致前间隔子缺失。另外地或可选地，前间隔子的破坏可以导致将外源核酸序列插入或替换前间隔子。如本文所用，术语“接受者”及其语法等同物可以指人类或非人类动物。接受者也可以是有需要的。如本文所用，术语“重组”及其语法等同物可以指两个多核酸之间交换遗传信息的过程。为了本公开的目的，“同源重组”或“hr”可以指此类遗传交换的特化形式，其可以例如在修复双链断裂期间发生。该过程可能需要核苷酸序列同源性，例如使用供体分子来对靶分子(如经历双链断裂的分子)进行模板修复，并且有时被称为非交叉基因转换(non-crossovergeneconversion)或短束基因转换(shorttractgeneconversion)。此类转移还可涉及在断裂的靶标和供体之间形成的异源双链dna的错配校正，和/或合成依赖性链退火(其中供体可以用于重新合成可以成为靶标一部分的遗传信息)和/或相关过程。此类特化的hr通常可以导致靶分子序列的改变，使得供体多核苷酸的一部分或全部序列可以被掺入靶多核苷酸中。在一些情况下，术语“重组臂”和“同源臂”可以互换使用。如本文所用，术语“含rna酶h样结构域(rhdc)的多肽及其语法等同物可以指具有共同的结构和/或功能特征的多肽。rhdc也可以称为含rna酶h样结构域的蛋白。在某些实施方案中，rhdc多肽具有类似于rna酶h的结构的结构特征，例如如下的β-链和α-螺旋的二级结构：β1-β2-β3-α1-β4-α2-β5-(α3)-α4，其中α3是任选的。在一些实施方案中，rhdc多肽在例如约19℃至40℃具有核酸切割活性，如通过rhdc多肽可源自嗜中温有机体的事实所证明的。在一些实施方案中，rhdc多肽在例如约19℃至40℃具有核酸切割活性。在一些实施方案中，“源自嗜中温有机体”可以指在嗜中温有机体中出现的特征。在一些情况下，可源自嗜中温有机体的特征可共有β1-β2-β3-α1-β4-α2-β5-(α3)-α4的结构域组织，其中α3是任选的，同时还与在嗜中温有机体中出现的rhdc多肽具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。在一些实施方案中，rhdc多肽具有核酸切割活性或有助于核酸切割活性。如本文所用，术语“转基因”及其语法等同物可以指转移到有机体中的基因或遗传物质。例如，转基因可以是含有被引入有机体中的基因的dna的链段或区段。当转基因被转移到有机体中时，则该有机体被称为转基因有机体。转基因可以保留其在转基因有机体中产生rna或多肽(如蛋白质)的能力。转基因可以由不同的核酸例如rna或dna组成。转基因可以编码工程化的t细胞受体，例如tcr转基因。转基因可以是tcr序列。转基因可以是受体。转基因可包含重组臂。转基因可以包含工程化位点。如果所治疗的病况发生变化，则可发生“治疗效应”。变化可以是正的或负的。例如，“正效应”可以对应于对象中激活的t细胞数量的增加。在另一个实例中，“负效应”可以对应于对象中肿瘤的数量或大小的减小。如果有至少10％的提高、优选至少25％、更优选至少50％、甚至更优选至少75％并且最优选100％，则所治疗的病况就会有“改变”。所述改变可以基于个体中所治疗病况的严重程度的改善，或者基于个体的群体中改善的病况的频率差异(在具有或没有与本发明的组合物组合施用的治疗性组合物进行治疗的情况下)。类似地，本公开的方法可以包括向对象施用“治疗有效”量的细胞。术语“治疗有效”应理解为具有对应于‘具有治疗效应’的定义。如本文所用，术语“序列”及其语法等同物可以指核苷酸序列，其可以是dna或rna；可以是线性的、环状的或分支的；并且可以是单链或双链的。序列可以是突变的。序列可以具有任何长度，例如长度为2至1,000,000个或更多个核苷酸(或其间或之上的任何整数值)，如约100至约10,000个核苷酸或者约200至约500个核苷酸。综述本公开提供了使用包含rhdc多肽和核酸解旋剂的系统修饰靶核酸的方法、系统、组合物和试剂盒。本文所述的系统可包含例如核酸酶、解旋酶和atp酶。这些系统克服了与rhdc蛋白质相关的技术挑战，包括例如，在有助于人细胞内基因编辑的温度下缺乏活性。本文所述的方法、系统、组合物和试剂盒允许通过提供与核酸解旋剂组合的rhdc多肽来进行这种生理相关的基因编辑。不希望受到理论的束缚，这种组合克服了rhdc蛋白质所面临的能量屏障，该屏障阻止了单独的rhdc蛋白质诱导单链或双链核酸断裂，因为核酸解旋剂暴露了核酸序列，使得rhdc多肽可以在暴露的区域中切割。在一些实施方案中，rhdc是例如来自嗜中温有机体的argonaute蛋白。在一些实施方案中，核酸解旋剂是解旋酶或拓扑异构酶。在一些实施方案中，rhdc多肽和核酸解旋剂作为融合蛋白提供。在一些实施方案中，提供rhdc多肽和核酸解旋剂，使得它们共定位在核酸上，而不作为融合蛋白存在。本公开还提供了生物信息学共定位，作为dna修复的生物能效率的代用品(proxy)。在一些情况下，生理修复是节能的并且是自然状态。在一些方面，双链断裂的病理性失效是能量效率低下和患病状态。用于基因工程的核酸酶系统细胞内基因组移植可以是遗传修饰细胞和核酸以用于治疗应用的方法。本文提供的可以是含有可互换部分的基因编辑系统。例如，基因编辑系统的一个模块可以被替换，而不会影响其他模块的功能。本文提供的模块基因编辑系统可以是可调的，以允许调高和调低基因编辑效率和/或偏向特定的基因组断裂修复方法。本文还提供了用于破坏对象(如哺乳动物、非哺乳动物或植物)中的基因组序列的组合物、构建体、系统和方法。本文还提供了治疗或抑制有需要的对象(如，哺乳动物或人类)或非人类对象(如，哺乳动物)中的目标基因组基因座内的靶序列缺陷引起的病况的组合物、构建体、系统和方法。在一些情况下，方法可以包括通过操纵靶序列来修饰对象或非人类对象，并且其中病况可以通过操纵靶序列而易于治疗或抑制。本文还公开了利用含rna酶h样结构域的蛋白对系统进行基因组编辑的方法，所述蛋白质以有利的热力学进行基因组改变。基因组改变可以是放热的。基因组改变可以是吸热的。在一些情况下，利用所公开的系统的基因组改变可能在能量上优于替代的基因编辑系统。含rna酶h样结构域的蛋白质的系统可能在热力学上更为有利，如通过生化系统所测量的，例如通过向反应中提供有限量的atp并在发生基因组改变之前、期间和之后测量基因编辑的量。在一些情况下，与不采用含rna酶h样结构域的蛋白的系统相比，所公开的利用含rna酶h样结构域的蛋白质的编辑系统可将能量需求降低约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、40％、50％或高达约60％。在一些情况下，与不采用所公开的含rna酶h样结构域的蛋白的系统相比，所公开的利用含rna酶h样结构域的蛋白质的编辑系统可以使对含rna酶h样结构域的蛋白质的免疫应答降低约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、40％、50％或高达约60％。在一些情况下，可以从人体中内源性存在的细菌中收获含rna酶h样结构域的蛋白质，以防止引发免疫应答。在一些情况下，可以被破坏或修饰的基因组可以来自有机体或对象，其可以是真核生物(包括哺乳动物，所述哺乳动物包括人类)或非人类真核生物或非人类动物或非人类哺乳动物。在一些情况下，有机体或对象可以是非人类动物，并且可以是节肢动物，例如昆虫，或可以是线虫。在一些情况下，有机体或对象可以是植物。在一些情况下，有机体或对象可以是哺乳动物或非人类哺乳动物。非人类哺乳动物可以是例如啮齿动物(优选小鼠或大鼠)、有蹄类动物或灵长类动物。在本发明的一些方法中，有机体或对象是藻类，包括微藻，或者是真菌。在一些情况下，对象可以是人类。人类对象可以是成人或儿童对象。儿童对象可以未满18岁。成人对象可以为约18岁或18岁以上。具有核酸切割活性的蛋白质(如，核酸酶)可以是将核酸中的核苷酸链切割成较小单位的酶。具有核酸切割活性的蛋白质可以来自真核生物或原核生物。具有核酸切割活性的蛋白质可以来自真核生物。具有核酸切割活性的蛋白质可以来自原核生物。在一些情况下，具有核酸切割活性的蛋白质可以来自古细菌。在一些情况下，具有核酸切割活性的蛋白质可以是含rna酶h样结构域的蛋白。在一些情况下，核酸酶可以是具有与rna酶h或含rna酶h样结构域的蛋白质类似的二级结构的蛋白质。rna酶h可以属于核苷酰转移酶超家族，其可以包括转座酶、逆转录病毒整合酶、霍利迪连结体游离酶(hollidayjunctionresolvase)和risc核酸酶argonaute。在一些情况下，rna酶h或含rna酶h样结构域的蛋白质可以利用双金属离子催化作为一般特征。在核酸酶中，两个金属离子可以不对称配位，并且在激活亲核试剂和稳定过渡态中具有独特的作用。在一些情况下，rna酶h或含rna酶h样结构域的蛋白可以具有在催化中心中含有羧酸酯/盐(carboxylate)三联体的α/β折叠。在一些情况下，核酸酶中可以存在两个空间保守的asp。例如，asp残基可以在大多数argonaute序列中是保守的。asp残基可以与rna酶h样催化位点的催化asp残基在空间上对齐。在一些情况下，核酸酶可以是rna酶h、逆转录酶、整合酶、tn5、argonaute、ruvc、cas、或以上的组合。在一些情况下，核酸酶可以是可与rna酶h、逆转录酶、整合酶、tn5、argonaute、ruvc或cas中的任一种共有rna酶h结构域的酶。在其他情况下，核酸酶可以在结构上与rna酶h、逆转录酶、整合酶、tn5、argonaute、ruvc或cas中的任一种基本类似。基本上类似的结构可以含有β-折叠，该β-折叠含有在两侧均被α-螺旋围绕的中央五链混合β-折叠。在一些情况下，rna酶h结构还可以具有插入在两个α-转角-β单元之间的另外的螺旋和环，这可以形成底物结合表面的一部分。在一些情况下，基本上类似的结构含有活性位点。rna酶h或rna酶h样蛋白质的活性位点可以含有一组三个高度保守的羧化物(carboxylate)。在一些情况下，结构域可以是ruvc。在一些情况下，结构域是piwi结构域。在一些情况下，系统发育树鉴定有机体中的可能piwi结构域，其可以用于鉴定适合的核酸酶或解旋酶结构域，图1。在一些情况下，酶促多肽可以是rna依赖性dna酶编辑器、rna依赖性rna酶编辑器、dna依赖性dna酶编辑器或dna依赖性rna酶编辑器。rna依赖性dna酶编辑器的实例可以为例如cas9和cpf1。rna依赖性rna酶编辑器的实例是cas13。酶促蛋白可含有多个结构域。例如，酶促多肽可含有能结合dna-rna、dna-dna或rna-rna的双链体的结构域。例如，ruvc能结合cas9和cpf1；hnh能结合cas9、rna酶h能结合核糖核酸酶和piwi能结合ago。在一些情况下，rhdc多肽可由位于与以下中的至少一种的操纵子相邻的基因表达：p元件诱导的无用睾丸(piwi)基因、ruvc、cas、sir2、mrr、tir、pld、rease、限制性核酸内切酶、dexd/h、超家族ii解旋酶、rrxrr(seqidno:380)、duf460、duf3010、duf429、duf1092、cog5558、orfb_is605、肽酶a17、核糖核酸酶h样结构域、3'-5'核酸外切酶结构域、3'-5'核糖核酸外切酶rv2179c样结构域、噬菌体mu、转座酶、dna指导的dna聚合酶、家族b、核酸外切酶结构域、核酸外切酶、rna酶t/dna聚合酶iii、yqgf基因、hepn、rna酶ls结构域、lsoa催化结构域、ken结构域、rna酶l、ire1、rna酶结构域、rloc、prrc、或以上的修饰形式。本文公开的rhdc多肽可以是可互换的。例如，rhdc多肽结构域可以是任何核酸酶结构域，其可以选自包括以下的列表：crispr、argonaute、兆核酸酶、锌指核酸酶(zfn)、talen或限制酶。在一些情况下，当rhdc结构域互换时，互换可不影响基因编辑系统其余模块(核酸解旋剂或rdp)的功能。在一些情况下，可以调高或调低基因编辑系统。调高可以通过将诸如rhdc多肽的结构域交换为更强表现的rhdc多肽来进行。与相当的基因编辑系统相比，调高可以使双链断裂修复提高约5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或高达约100％。调低可以通过将诸如rhdc多肽的结构域交换为更弱表现的rhdc多肽来进行，从而对双链断裂进行改善的同源定向修复(hdr)。在一些情况下，交换基因编辑系统的模块可以允许双链断裂的hdr。使用本文公开的基因编辑系统可以允许双链断裂的优先hdr超过相当或替代的基因编辑系统。在一些情况下，hdr修复可以优先发生在％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或高达约100％的细胞群体中，超出相当的基因编辑系统中发生的细胞群体。在一些情况下，rhdc或其功能片段可选自细菌门，所述细菌门选自：绿弯菌门、变形菌门、拟杆菌门、浮霉菌门、厚壁菌门、蓝菌门、拟杆菌门、balneolaeota、拟杆菌门、广古菌门(euryarchaeota)、泉古菌门(crenarchaeota)、厚壁菌门、广古菌门、放线菌门、热袍菌门(thermotogae)、异常球菌、螺旋体门、酸杆菌门、以上的修饰形式、或以上的任何组合。在一些情况下，rhdc或其功能片段可选自细菌纲，所述细菌纲选自：绿弯菌门(纲：thermoflexi、脱卤球菌纲(dehalococcoidia)、厌氧绳菌纲(anaerolinaea)、ardenticatenia、暖绳菌纲(caldilineae)、纤线杆菌纲(ktedonobacteria)、热微菌纲(thermomicrobia)、绿弯菌纲(chloroflexia))、变形菌门(纲：α-变形菌纲(alphaproteobacteria)、β-变形菌纲(betaproteobacteria)、亲氢菌纲(hydrogenophilalia)、γ-变形菌纲(gammaproteobacteria)、硫杆菌纲(acidithiobacillia)、δ-变形菌纲(deltaproteobacteria)、ε-变形菌纲(epsilonproteobacteria)、oligoflexia)、拟杆菌门(纲：rhodothermia、balneolia、噬纤维菌纲(cytophagia)、鞘脂杆菌纲(sphingobacteria)、chitinophagia、拟杆菌纲(bacteroidia)、黄杆菌纲(flavobacteriia))、浮霉菌门(纲：phycisphaerae、浮霉菌纲(plantomycetacia))、厚壁菌门(纲：芽孢杆菌纲(bacillales)、梭菌纲(clostridia)、热石杆菌纲(thermolithobacteria))、蓝菌门(纲：色球藻目(chroococcales)、chroococcidiopsidales、gleobacterales、念珠藻目(nostocales)、颤藻目(oscillatoriales)、宽球藻目(pleurocapsales)、螺旋藻目(spirulinales)、聚球藻目(synechococcales)、地位未定(incertaesedis))、拟杆菌门(纲：rhodothermia、balneolia、噬纤维菌纲(cytophagia)、鞘脂杆菌纲(sphingobacteria)、chitinophagia、拟杆菌纲(bacteroidia)、黄杆菌纲(flavobacteriia))、balneolaeota(纲：balneolia)、广古菌门(纲：aciduliprofundum、古丸菌纲(archaeoglobi)、盐杆菌纲(halobacteria)、甲烷杆菌纲(methanobacteria)、甲烷球菌纲(methanococci)、甲烷微菌纲(methanomicrobia)、甲烷火菌纲(methanopyri)、纳米嗜盐古菌纲(nanohaloarchaea)、热球菌纲(thermococci)、热原体纲(thermoplasmata))、泉古菌门(纲：eocyta、泉古菌纲(eocytes)、crenarchaeotgarrity和holt)、放线菌门(纲：红杆菌纲(rubrobacteria)、嗜热油菌纲(thermoleophilia)、红椿杆菌纲(coriobacteriia)、酸微菌纲(acidimicrobiia)、nitrilliruptoia、放线菌纲(actinobacteria))、热袍菌门(纲：热袍菌纲(thermotogae))、异常球菌(纲：异常球菌纲(deinococci)、螺旋体门(纲：螺旋体纲(spirochaetia))、酸杆菌门(纲：酸杆菌纲(acidobacteria)、芽球菌纲(blastocatellia)、全噬菌纲(holophagae))、以上的修饰形式、或以上的任何组合。在一些情况下，rhdc或其功能片段可选自物种，所述物种选自：产乙烯脱卤拟球菌dcmb5(dehalococcoidesmccartyidcmb5)、耐金属贪铜菌h1130(cupriavidusmetalliduransh1130)、威尼斯不动杆菌(acinetobactervenetianus)、whittenburyi甲基杆菌、脆弱拟杆菌菌株i1345(bacteroidesfragilisstr.i1345)、candidatusbrocadiasinicajpn1、煎盘梭菌aau1(clostridiumsartagoformeaau1)、眉藻pcc7103(calothrixsp.pcc7103)、铜绿微囊藻pcc9701(microcystisaeruginosapcc9701)、脑膜炎败血伊丽莎白菌(elizabethkingiameningoseptica)、嗜盐红色盐杆菌(rhodohalobacterhalophilus)、格氏副拟杆菌cl02t12c30(parabacteroidesgoldsteiniicl02t12c30)、氯酚鞘氨醇杆菌l-1(sphingobiumchlorophenolicuml-1)、methanotorrisformicicusmc-s-70、耐低温薄层菌dsm18569(hymenobacterpsychrotoleransdsm18569)、岩化热古菌768-28(vulcanisaetamoutnovskia768-28)、flavobacteriumseoulense、按蚊伊丽莎白金菌(elizabethkingiaanophelis)、沼泽红假单胞菌dx-1(rhodopseudomonaspalustrisdx-1)、毛螺科菌ve202-12(lachnospiraceaebacteriumve202-12)、嗜压热球菌(thermococcusbarophilus)、居水根瘤菌ors992＝atcc700741(rhizobiumundicolaors992＝atcc700741)、anoxybacillusgonensis、多形拟杆菌(bacteroidesthetaiotaomicron)、约氏黄杆菌(flavobacteriumjohnsoniae)、铜绿微囊藻kw(microcystisaeruginosakw)、伯克氏菌h160(burkholderiasp.h160)、温泉拟甲色球藻pcc7203(chroococcidiopsisthermalispcc7203)、fischerellamajornies-592、海环杆菌dsm745(cyclobacteriummarinumdsm745)、黄杆菌root186(flavobacteriumsp.root186)、酒红诺卡氏菌nbrc100364(nocardiasienatanbrc100364)、高温放线菌cdf、嗜中温甲基杆菌sr1.6/6(methylobacteriummesophilicumsr1.6/6)、nonlabensulvanivorans、聚球藻pcc7003(synechococcussp.pcc7003)、psychroserpensdamuponensis、土壤黄杆菌dsm19725(flavobacteriumsolidsm19725)、院内不动杆菌(acinetobacternosocomialis)、沸热甲烷暖球菌ag86(methanocaldococcusfervensag86)、产乙烯脱卤拟球菌cbdb1、耐氮海水袍菌dsm16785(marinitogahydrogenitoleransdsm16785)、布氏栖热菌(thermusbrockianus)、水管致黑栖热菌sa-01(thermusscotoductussa-01)、rhodopirellulamaioricasm1、氢噬菌pbc(hydrogenophagasp.pbc)、异常球菌yim77859(deinococcussp.yim77859)、马赛库特氏菌(kurthiamassiliensis)、thermococcusonnurineusna1、中间普氏菌zt(prevotellaintermediazt)、生丝单胞菌t16b2(hyphomonassp.t16b2)、halopigerdjelfimassiliensis、牙龈卟啉单胞菌(porphyromonasgingivalis)、亚洲嗜盐碱杆菌dsm12278(natrialbaasiaticadsm12278)、微囊藻t1-4(microcystissp.t1-4)、铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)、沉积小杆菌c3(sediminibacteriumsp.c3)、塔夫河栖河菌dsm16823(fluviicolataffensisdsm16823)、嗜盐古菌bab2207(haloferaxsp.bab2207)、cecembialonarensislw9、leptolineatardivitalis、长嗜热聚球藻bp-1(thermosynechococcuselongatusbp-1)、中慢生根瘤菌l2c066b000(mesorhizobiumsp.l2c066b000)、溶解噬纤维菌dsm7489(cellulophagalyticadsm7489)、考氏盐红菌jcm14978(halorubrumkocuriijcm14978)、北方类芽孢杆菌(paenibacillusborealis)、金黄杆菌jm1(chryseobacteriumsp.jm1)、争论产碱菌b4(variovoraxparadoxusb4)、methylibiumsp.yr605、紫单胞菌科细菌cot-184oh4590(porphyromonadaceaebacteriumcot-184oh4590)、生丝单胞菌t16b2(hyphomonassp.t16b2)、野口氏钩端螺旋体(leptospiranoguchii)、梭菌目细菌nk3b98(clostridialesbacteriumnk3b98)、地芽孢杆菌fw23(geobacillussp.fw23)、奇特龙梭菌wal-19142([clostridium]citroniaewal-19142)、双孢梭菌、越南伯克氏菌(burkholderiavietnamiensis)、脆弱拟杆菌菌株3397t14(bacteroidesfragilisstr.3397t14)、细鞘丝藻'hensonii'(leptolyngbyasp.'hensonii')、衣壳酸杆菌atcc51196(acidobacteriumcapsulatumatcc51196)、产气荚膜梭状芽胞杆菌wal-14572(clostridiumperfringenswal-14572)、嗜热地芽孢杆菌gblys(geobacilluskaustophilusgblys)、clostridiumsaudiense、methylomicrobiumburyatense5g、神户肠杆菌(enterobacterkobei)、异常球菌rl(deinococcussp.rl)。在一些情况下，rhdc或其功能片段可选自以下中的至少一种：岩化热古菌、乌宗热变形菌(thermoproteusuzoniensis)、热棒菌(pyrobaculum)、海洋适中杆菌(modestobactermarinus)、燕麦嗜酸菌(acidovoraxavenae)、粪黄假单胞菌(pseudomonassynxantha)、野油菜黄单胞菌(xanthomonascampestris)、西格尼斯柄细菌(caulobactersegnis)、恶臭假单胞菌(pseudomonasputida)、辣椒疮痂病菌(xanthomonasvesicatoria)、施氏假单胞菌(pseudomonasstutzeri)、泛菌(pantoea)、贪铜菌(cupriavidus)、硫还原地杆菌(geobactersulfurreducens)、褐杆状绿菌(chlorobiumphaeobacteroides)、支气管炎博德特氏菌(bordetellabronchiseptica)、海栖木洞菌(woodsholeamaritima)、食五环芳烃新鞘氨醇菌(novosphingobiumpentaromativorans)、菜豆根瘤菌(rhizobiumphaseoli)、polymorphumgilvum、埃氏慢生根瘤菌(bradyrhizobiumelkanii)、慢生根瘤菌(bradyrhizobium)、bradyrhizobiumoligotrophicum、铀还原地杆菌(geobacteruraniireducens)、喜湖浮霉状菌(planctomyceslimnophilus)、百慕大短小盒菌(parvularculabermudensis)、α-变形菌(alphaproteobacterium)、不动杆菌(acinetobacter)、邬氏不动杆菌(acinetobacterursingii)、别氏不动杆菌(acinetobacterbereziniae)、氧化亚铁深海菌(mariprofundusferrooxydans)、伯克氏菌-h160(burkholderiasp-h160)、氧化硫氰酸热硫碱弧菌(thioalkalivibriothiocyanoxidans)、争论产碱菌、burkholderiagraminis、burkholderiaxenovoranslb400、脆弱拟杆菌638r(bacteroidesfragilis638r)、甲苯脱硫橄榄样菌tol2(desulfobaculatoluolicatol2)、白蚁梭菌(clostridiumtermitidis)、梭菌-cag-264(clostridiumsp-cag-264)、鲍氏梭菌(clostridiumbolteae)、厚壁菌门细菌cag-65、拟杆菌(bacteroides)、卵形拟杆菌(bacteroidesovatus)、塔夫河栖河菌dsm16823、海苏特氏菌(joostellamarina)、马赛拟杆菌(bacteroidesmassiliensis)、格氏副拟杆菌(parabacteroidesgoldsteinii)、短稳杆菌(empedobacterbrevis)、埃氏拟杆菌(bacteroideseggerthii)、bacteroidesfluxus、腐烂别样杆菌(alistipesputredinis)、粪副拟杆菌(parabacteroidesmerdae)、文氏密螺旋体(treponemavincentii)、毛螺菌科细菌3157faact1(lachnospiraceaebacterium3157faact1)、短螺旋体菌-cag-484(brachyspirasp-cag-484)、梭菌目细菌nk3b98(clostridialesbacteriumnk3b98)、厚壁菌门细菌cag-137、脱硫弧菌-6146afaa(desulfovibriosp-6146afaa)、嗜麦芽窄食单胞菌r551-3(stenotrophomonasmaltophiliar551-3)、香港维克斯氏菌dsm(owenweeksiahongkongensisdsm)、海环杆菌dsm745、嗜粪拟杆菌(bacteroidescoprophilus)、肠道拟杆菌cag-564(bacteroidesintestinaliscag-564)、舞蹈土地杆菌dsm12145(pedobactersaltansdsm12145)、脱氮生丝微菌1nes1(hyphomicrobiumdenitrificans1nes1)、鞘氨醇单胞菌-s17(sphingomonassp-s17)、沼泽红假单胞菌bisb5、农杆菌-h13-3(agrobacteriumsp-h13-3)、嗜温埃里奥特氏菌(elioraeatepidiphila)、rhodanobacterdenitrificans、菜豆根瘤菌ciat652(rhizobiumetliciat652)、pelagibacteriumhalotoleransb2、运动替斯崔纳菌ka081020-065(tistrellamobiliska081020-065)、维氏鞘氨醇单胞菌rw1(sphingomonaswittichiirw1)、衣壳酸杆菌atcc51196、葡萄糖醋杆菌pal5(gluconacetobacterdiazotrophicuspal5)、中慢生根瘤菌stm4661、费氏中华根瘤菌ngr234(sinorhizobiumfrediingr234)、苜蓿中华根瘤菌wsm419(sinorhizobiummedicaewsm419)、耐重金属中慢生根瘤菌(mesorhizobiummetallidurans)、乙酸甲烷八叠球菌c2a(methanosarcinaacetivoransc2a)、嗜盐古菌dl31、死海盐盒菌atcc43049(haloarculamarismortuiatcc43049)、嗜冷嗜盐菌atcc49239(halorubrumlacusprofundiatcc49239)、苍白盐八叠球菌(halosarcinapallida)、特班齐赫盐红菌(halorubrumtebenquichense)、羽扇豆根瘤菌(rhizobiumlupine)、granulicellatundricolamp5actx9、白甲基微菌(methylomicrobiumalbum)、新鞘氨醇菌-pp1y(novosphingobiumsp-pp1y)、rhodopirellulamaiorica、印度黄杆菌gptsa100-9(flavobacteriumindicumgptsa100-9)、海洋浮霉状菌(planctomycesmaris)、细鞘丝藻-pcc7375(leptolyngbyasp-pcc7375)、多形拟杆菌、拟杆菌-3119(bacteroidessp-3119)、副杆状菌(parabacteroides)、食神醇鞘氨醇杆菌(sphingobacteriumspiritivorum)、fibrellaaestuarinabuz2、anaerophagathermohalophila、塔氏弧菌(vibriotubiashii)、中华黄海菌(gilvimarinuschinensis)、希瓦氏菌-ana-3(shewanellasp-ana-3)、雷氏普罗威登斯菌(providenciarettgeri)、土壤异希瓦氏菌(alishewanellaagri)、香鱼假单胞菌(pseudomonasplecoglossicida)、产碱假单胞菌(pseudomonasalcaligenes)、铜绿假单胞菌、食五环芳烃新鞘氨醇菌、嗜中温甲基杆菌、无乳固氮螺菌(azospirillumamazonense)、喜石甲基养菌pm1(methylibiumpetroleiphilumpm1)、克里米亚甲基盐菌(methylohalobiuscrimeensis)、百慕大短小盒菌htcc2503、丰佑菌科细菌tav5(opitutaceaebacteriumtav5)、pedosphaeraparvula、酸杆菌科细菌taa166(acidobacteriaceaebacteriumtaa166)、耐金属贪铜菌ch34、台湾贪铜菌(cupriavidustaiwanensis)、分枝杆菌-kms(mycobacteriumsp-kms)、海洋适中杆菌(modestobactermarinus)、菜豆根瘤菌、鞘氨醇单胞菌-kc8、慢生根瘤菌-yr681、甲基杆菌-88a、食五环芳烃新鞘氨醇菌、嗜碱海棍状菌(maritimibacteralkaliphilus)、矢野口鞘氨醇杆菌(sphingobiumyanoikuyae)、印度拜叶林克氏菌印度亚种atcc9039(beijerinckiaindicasubsp-indicaatcc9039)、brucellainopinata、百脉根中慢生根瘤菌maff303099(mesorhizobiumlotimaff303099)、afipiabroomeae、双鞘不粘柄菌(asticcacaulisbiprosthecium)、查朴图鞘氨醇盒菌(sphingopyxisbaekryungensis)、沉积物矿场弧菌(fodinicurvatasediminis)、亚硫酸杆菌-nas-14-1(sulfitobactersp-nas-14-1)、小红卵菌-ph10(rhodovulumsp-ph10)、自养黄色杆菌py2(xanthobacterautotrophicuspy2)、冰岛硫化叶菌m-16-27(sulfolobusislandicusm-16-27)、地下热厌氧菌(caldanaerobactersubterraneus)、哈氏噬纤维菌atcc33406(cytophagahutchinsoniiatcc33406)、solitaleacanadensisdsm3403、拟杆菌-cag-189(bacteroidessp-cag-189)、winogradskyellapsychrotolerans、cecembialonarensis、黄杆菌wg21(flavobacteriumsp-wg21)、氯酚鞘氨醇杆菌l-1、天蓝色链霉菌a3-2(streptomycescoelicolora3-2)、嗜中温甲基杆菌、百慕大短小盒菌htcc2503、沼泽红假单胞菌dx-1、热丙酸盐暗色厌氧香肠状菌si(pelotomaculumthermopropionicumsi)、氧化延胡奈酸互营杆菌mpob(syntrophobacterfumaroxidansmpob)、鲍曼不动杆菌(acinetobacterbaumannii)、院内不动杆菌、氢噬菌、肠道沙门氏菌(salmonellaenterica)、隐球出芽菌(gemmataobscuriglobus)、zavarzinellaformosa、acidovoraxebreustpsy、rhodopirellulamaiorica、蓝丝菌-pcc8801(cyanothecesp-pcc8801)、类球红细菌atcc17025(rhodobactersphaeroidesatcc17025)、衣壳酸杆菌atcc51196、发光古球菌dsm4304(archaeoglobusfulgidusdsm4304)、硝酸盐还原热土弧菌dsm19672(calditerrivibrionitroreducensdsm19672)、marinimicrobiabacteriumjgi0000039-d08、溶解噬纤维菌dsm7489(cellulophagalyticadsm7489)、belliellabalticadsm15883、海环杆菌dsm745、鲍曼不动杆菌(acinetobacterbaumanniil)、院内不动杆菌、中间密螺旋体(treponemamedium)、斯氏小梨形菌dsm6068(pirellulastaleyidsm6068)、肾脏螺旋菌(leptospirainterrogans)、肝素土地杆菌dsm2366(pedobacterheparinusdsm2366)、舌螺状菌dsm74(spirosomalingualedsm74)、圣地罗西钩端螺旋体(leptospirasantarosai)、厌氧芽孢杆菌-dt3-1(anoxybacillussp-dt3-1)、热泉甲基栖热菌(methylovulummiyakonense)、床田硫化叶菌(sulfolobustokodaii)str-7、candidatusnitrososphaeragargensisga9-2、伪枝藻(scytonemahofmanni)、蓝丝菌-pcc8802(cyanothecesp-pcc8802)、眉藻-pcc7103、水稻日本组(oryzasativajaponicagroup)、格氏嗜盐碱杆菌sp2(natronobacteriumgregoryisp2)、嗜盐杆菌-dl1(halobacteriumsp-dl1)、荷兰原绿丝蓝细菌(prochlorothrixhollandica)、halopigerxanaduensissh-6、延长富盐菌(haloferaxelongans)、反硝化富盐菌(haloferaxdenitrificans)、西藏嗜盐碱红菌(natronorubrumtibetense)、隐红碱线菌dsm15624(natrinemapellirubrumdsm15624)、藤黄紫假交替单胞菌(pseudoalteromonasluteoviolacea)、aromatoleumaromaticumebn1、聚球藻-pcc7002(synechococcussp-pcc7002)、长聚球藻pcc7942、聚球藻-ja-3-3ab、蓝丝菌-pcc7822(cyanothecesp-pcc7822)、青色球形斯塔尼尔氏菌pcc7437(stanieriacyanosphaerapcc7437)、水管致黑栖热菌sa-01、栖热菌-ccbus3uf1(thermussp-ccbus3uf1)、嗜冷嗜盐菌atcc49239、团聚火球形古菌dsm17230(ignisphaeraaggregansdsm17230)、超耐热菌vf5(aquifexaeolicusvf5)、强壮硬毛藻pcc6605(chamaesiphonminutuspcc6605)、尖细颤藻pcc6304(oscillatoriaacuminatapcc6304)、鞘丝藻-pcc8106(lyngbyasp-pcc8106)、温泉拟甲色球藻pcc7203、胶须藻-pcc7116(rivulariasp-pcc7116)、铜绿微囊藻nies-843(microcystisaeruginosanies-843)、crinaliumepipsammumpcc9333、柱孢鱼腥藻pcc7122(anabaenacylindricalpcc7122)、费氏藻-jsc-11(fischerellasp-jsc-11)、眉藻-pcc7507、双向伯克氏菌(burkholderiaambifaria)和/或氧化硫氰酸热硫碱弧菌。在一些情况下，多肽构建体可包含双孢梭菌argonaute结构域或其功能片段或变体。在一些情况下，多肽构建体可包含rhdc多肽，其包含可以在37℃显示核酸切割活性的高温放线菌argonaute结构域或其功能片段或变体。在一些情况下，多肽构建体包含来自高温放线菌cdfargonaute结构域的结构域或其功能片段或变体。在一些情况下，多肽构建体可包含rhdc多肽，所述rhdc多肽包含在37℃切割核酸的甲基杆菌argonaute结构域或其功能片段或变体。在一些情况下，多肽构建体包含甲基杆菌argonaute结构域(其包括whittenburyi甲基杆菌argonaute结构域)或其功能片段或变体。在一些情况下，多肽构建体包含rhdc多肽，其包含在37℃切割核酸的嗜热聚球藻argonaute结构域或其功能片段或变体。在一些情况下，多肽构建体包含高温放线菌argonaute结构域(其包含细长嗜热聚球藻argonaute结构域)或其功能片段或变体。在一些情况下，如本文所述的核酸构建体可编码原核的含rna酶h样结构域(rhdc)的多肽和核酸解旋多肽。在一些情况下，rhdc多肽在嗜中温温度下切割核酸。核酸切割活性可由引导dna指导。在一些情况下，rhdc多肽可与核酸解旋多肽融合。在一些情况下，如本文所述的核酸构建体可编码含rna酶h样结构域(rhdc)的多肽和核酸解旋多肽。在一些情况下，由rhdc多肽编码的蛋白在嗜中温温度下切割核酸。在一些情况下，核酸切割活性可由引导dna指导。在一些情况下，rhdc多肽可与核酸解旋多肽融合。在一些情况下，由多肽构建体编码的蛋白还显示核酸插入活性。在一些情况下，插入可以是外源转基因的。外源转基因可以是细胞受体，在一些情况下，如嵌合抗原受体或t细胞受体。在一些情况下，可以基于与基因组中第二基因(secondarygene)的接近性来选择rhdc多肽。例如，rhdc多肽可以基于其与诸如ssdna解旋酶sf1的解旋酶基因相邻的位置来选择。在一些情况下，可以基于与dna修复相关基因的接近性来选择rhdc多肽。在一些情况下，可以基于预测的比对(如结构分析)或系统发育分析来选择rhdc多肽，图4-8d。例如，就第二基因的基因序列而言，rhdc多肽可以具有同源性或是保守的。在一些情况下，就rna酶h而言，rhdc多肽可以高度保守。保守性可以指序列或结构。结构保守性可以指存在或不存在结构特征。结构特征可以是二级结构特征，如α螺旋或β折叠片，图5。可以基于二级结构来筛选或选择rhdc多肽。rhdc多肽可以是rna酶-hi、rna酶-hii、rve/trasp、argonaute、prp8、ruvc、ruvx、rna酶t或dnapoliii。rhdc多肽可共有与以下中的至少一种类似的二级结构：rna酶-hi、rna酶-hii、rve/trasp、argonaute、prp8、ruvc、ruvx、rna酶t或dnapoliii。在一些情况下，基于结构中rhdc多肽折叠的存在来选择核酸酶。在一些情况下，基于在n末端或c末端中的保守性来选择rhdc多肽。例如，c末端可以含有piwi结构域，并且在适合的核酸酶中是保守的，图3。在一些情况下，可通过是否存在rna酶h折叠来鉴定核酸酶。rna酶h折叠可以是进化最古老的蛋白质折叠之一，其可以在不同的核酸酶之间共有。在一些情况下，在趋异进化过程中，核酸酶成员的序列积累了许多取代、插入、缺失并经历了与各种结构域的融合。由于这种差异，rnhl蛋白的不同家族之间的序列类似性可能很低。在一些情况下，序列类似性可能是不可检测的。由于在催化核心中存在大量插入，因此不同蛋白质中rna酶h样结构域的长度可能会发生显著变化。在一些情况下，可以进行测序分析以鉴定共有结构域(如rna酶h或rna酶h-样)的核酸酶。在一些情况下，rhdc多肽可与至少一个另外的元件，例如解旋酶融合。在一些情况下，核酸酶可与atp酶融合。在一些情况下，rhdc多肽可与另一个rhdc多肽融合。在一些情况下，rhdc多肽可与靶向多核酸或靶向蛋白融合。在一些情况下，rhdc多肽可以是rhdc多肽和核酸解旋多肽的融合构建体。在一些情况下，融合蛋白包含源自嗜中温有机体的多肽。嗜中温有机体可以来自选自以下的家族：拟杆菌门、变形菌门、放线菌门、厚壁菌门、蓝菌门、螺旋体门、异常球菌、疣微菌门、浮霉菌门、balneolaeota和绿弯菌门。嗜中温有机体可以来自选自以下的家族：变形菌门、酸杆菌门、放线菌门和拟杆菌门。在一些情况下，rhdc多肽可以是可具有核酸酶活性的多肽。核酸酶活性可以是双链多核酸切割活性，如dna或rna。在一些情况下，核酸酶活性可以是单链多核酸切割活性。在一些情况下，rhdc多肽可具有切口酶活性。切口酶活性可以是单链dna或rna切割活性。在一些情况下，rhdc多肽可具有rna酶活性。在一些情况下，rna酶活性可以是双链rna切割活性。在一些情况下，rna酶活性可以是rna切割活性。在一些情况下，rhdc蛋白或多肽可具有rna酶h活性。在一些情况下，rna酶h活性可以是rna切割活性。在一些情况下，rhdc多肽可具有重组酶活性。rhdc多肽还可具有dna翻转活性。在一些情况下，rhdc多肽可具有转座酶活性。融合蛋白可以使用已知技术合成，例如重组dna技术，其中融合蛋白各个部分的编码序列可以在核酸水平上连接在一起。随后可以使用宿主细胞产生融合蛋白。在一些实施方案中，融合蛋白在该蛋白的不同部分或结构域之间(如，在核酸解旋结构域和rhdc多肽之间)包含可切割或不可切割的接头。例如，接头可以是多肽接头，如长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或更多个氨基酸的接头。如本文所述，“融合”的两个多肽序列不需要彼此直接相邻。融合的多肽序列可以通过接头融合，或通过融合至多肽序列的另外功能性肽序列融合。接头可以是gsgsgs接头(seqidno:381)。在一些情况下，基因组编辑构建体上可以有1、2、3、4、5、6、7、8、9或多达10个接头。例如，可以有1至10个gsgsgs接头。接头可以包含不带电的氨基酸或带电的氨基酸。接头可以包含α-螺旋结构域。接头可以包含化学交叉接头。在一些情况下，接头可以具有不同的长度，以调节融合结构域的功能及其物理接近度。在一些情况下，接头可以包含具有配体诱导型构象变化的肽。在一些实施方案中，核酸酶可以是argonaute蛋白或多肽或者其功能结构域或变体。argonaute蛋白可以是约800至约1200个氨基酸的相对大的蛋白。argonaute蛋白或多肽或者其功能结构域或变体可以是真核生物来源的。argonaute蛋白或多肽或者其功能结构域或变体可以是原核生物来源的。真核argonaute蛋白可以包括小鼠argonaute蛋白，如ag02。argonaute蛋白可源自古细菌或细菌有机体。argonaute蛋白可源自嗜中温有机体。嗜中温有机体可以是在约19℃至40℃的温度下具有活性的有机体。在一些实施方案中，嗜中温有机体可从约17℃、约18℃、19℃、约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃、约30℃、约31℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃或高达40℃的温度具有活性。在一些实施方案中，嗜中温有机体可以在约17℃至40℃的温度下具有活性。在一些实施方案中，嗜中温有机体可在至少约17℃的温度下具有活性。在一些实施方案中，嗜中温有机体可在不超过40℃的温度下具有活性。在一些实施方案中，嗜中温有机体可以在约17℃至约19℃、约17℃至约21℃、约17℃至约23℃、约17℃至约25℃、约17℃至约27℃、约17℃至约29℃、约17℃至约31℃、约17℃至约33℃、约17℃至约35℃、约17℃至约37℃、约17℃至40℃、约19℃至约21℃、约19℃至约23℃、约19℃至约25℃、约19℃至约27℃、约19℃至约29℃、约19℃至约31℃、约19℃至约33℃、约19℃至约35℃、约19℃至约37℃、约19℃至40℃、约21℃至约23℃、约21℃至约25℃、约21℃至约27℃、约21℃至约29℃、约21℃至约31℃、约21℃至约33℃、约21℃至约35℃、约21℃至约37℃、约21℃至40℃、约23℃至约25℃、约23℃至约27℃、约23℃至约29℃、约23℃至约31℃、约23℃至约33℃、约23℃至约35℃、约23℃至约37℃、约23℃至40℃、约25℃至约27℃、约25℃至约29℃、约25℃至约31℃、约25℃至约33℃、约25℃至约35℃、约25℃至约37℃、约25℃至40℃、约27℃至约29℃、约27℃至约31℃、约27℃至约33℃、约27℃至约35℃、约27℃至约37℃、约27℃至40℃、约29℃至约31℃、约29℃至约33℃、约29℃至约35℃、约29℃至约37℃、约29℃至40℃、约31℃至约33℃、约31℃至约35℃、约31℃至约37℃、约31℃至40℃、约33℃至约35℃、约33℃至约37℃、约33℃至40℃、约35℃至约37℃、约35℃至40℃或约37℃至40℃的温度下具有活性。在本文所述的某些实施方案中，argonaute多肽可包含来自本文所述的argonaute蛋白的功能结构域或其变体。在一些情况下，rhdc多肽可在包括约19℃至约41℃的温度范围内显示核酸切割活性。在一些情况下，核酸酶或rhdc多肽可以来自嗜中温有机体。rhdc多肽可以是argonaute蛋白、多肽或其功能部分。在一些实施方案中，rhdc多肽在约17℃、约18℃、19℃、约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃、约30℃、约31℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃或高达40℃的温度下具有核酸切割活性。在一些实施方案中，rhdc多肽在约17℃至40℃的温度下具有核酸切割活性。在一些实施方案中，嗜中温有机体可以在至少约17℃的温度下具有活性。在一些实施方案中，嗜中温有机体可以在不超过40℃的温度下具有活性。在一些实施方案中，嗜中温有机体可在约17℃至约19℃、约17℃至约21℃、约17℃至约23℃、约17℃至约25℃、约17℃至约27℃、约17℃至约29℃、约17℃至约31℃、约17℃至约33℃、约17℃至约35℃、约17℃至约37℃、约17℃至40℃、约19℃至约21℃、约19℃至约23℃、约19℃至约25℃、约19℃至约27℃、约19℃至约29℃、约19℃至约31℃、约19℃至约33℃、约19℃至约35℃、约19℃至约37℃、约19℃至40℃、约21℃至约23℃、约21℃至约25℃、约21℃至约27℃、约21℃至约29℃、约21℃至约31℃、约21℃至约33℃、约21℃至约35℃、约21℃至约37℃、约21℃至40℃、约23℃至约25℃、约23℃至约27℃、约23℃至约29℃、约23℃至约31℃、约23℃至约33℃、约23℃至约35℃、约23℃至约37℃、约23℃至40℃、约25℃至约27℃、约25℃至约29℃、约25℃至约31℃、约25℃至约33℃、约25℃至约35℃、约25℃至约37℃、约25℃至40℃、约27℃至约29℃、约27℃至约31℃、约27℃至约33℃、约27℃至约35℃、约27℃至约37℃、约27℃至40℃、约29℃至约31℃、约29℃至约33℃、约29℃至约35℃、约29℃至约37℃、约29℃至40℃、约31℃至约33℃、约31℃至约35℃、约31℃至约37℃、约31℃至40℃、约33℃至约35℃、约33℃至约37℃、约33℃至40℃、约35℃至约37℃、约35℃至40℃或约37℃至40℃的温度下具有活性。argonaute多肽可以来自智人(homosapiens)、拟南芥(arabidopsisthaliana)、日本水稻(oryzasativajaponica)、迪斯帕内阿米巴(entamoebadispar)、第四双小核草履虫(parameciumtetraurelia)、黑腹果蝇(drosophilamelanogaster)、秀丽隐杆线虫(caenorhabditiselegans)。argonaute多肽可以是智人ago2、拟南芥ago、日本水稻ago、迪斯帕内阿米巴saw760ago、第四双小核草履虫菌株d4-2ago、黑腹果蝇ago、秀丽隐杆线虫ago或智人ago。在一些情况下，rhdc多肽可包含argonaute蛋白或功能结构域。在一些情况下，argonaute多肽或其部分可以是天然存在的argonaute多肽(如，天然存在于细菌和/或古细菌细胞中)。在其他情况下，argonaute多肽可以不是天然存在的多肽(如，argonaute多肽可以是变体、嵌合或融合的)。在一些情况下，argonaute多肽可具有核酸酶活性。在一些情况下，argonaute多肽可不具有核酸酶活性。在一些情况下，argonaute多肽可以是i型原核argonaute。在一些情况下，i型原核argonaute可携带dna核酸靶向核酸。在一些情况下，dna核酸靶向核酸靶向双链dna(dsdna)的一条链以产生dsdna的缺口或断裂。缺口或断裂可触发宿主dna修复。在一些情况下，宿主dna修复可以是非同源末端连接(nhej)或同源定向重组(hdr)。在一些情况下，dsdna可选自基因组、染色体和质粒。i型原核argonaute可以是长i型原核argonaute，其可具有n-paz-mid-piwi结构域体系结构。在一些情况下，长i型原核argonaute具有催化活性piwi结构域。长i型原核argonaute可具有由天冬氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸/组氨酸(dedx)编码的催化四分体。催化四分体可以结合一个或多个镁离子或锰离子。在一些情况下，i型原核argonaute锚定dna引导的5'磷酸端。在一些情况下，dna引导可以在其5'端具有脱氧胞嘧啶。在一些实施方案中，原核argonaute是ii型ago。ii型原核argonaute可携带rna核酸靶向核酸。rna核酸靶向核酸可靶向双链dna(dsdna)的一条链以产生dsdna的缺口或断裂，其可触发宿主dna修复；宿主dna修复可以是非同源末端连接(nhej)或同源定向重组(hdr)。在一些情况下，dsdna可选自基因组、染色体和质粒。ii型原核argonaute可以是长ii型原核argonaute或短ii型原核argonaute。长ii型原核argonaute可具有n-paz-mid-piwi结构域体系结构。短ii型原核argonaute可具有mid和prwi结构域，但可不具有paz结构域。在一些情况下，短ii型ago可具有paz结构域的类似物。在一些情况下，ii型ago可不具有催化活性piwi结构域。ii型ago可缺乏由天冬氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸/组氨酸(dedx)编码的催化四分体。在一些情况下，编码ii型原核argonaute的基因与编码核酸酶、解旋酶或其组合的一种或多种基因成簇。核酸酶可以是天然的、经设计的或其结构域。在一些情况下，核酸酶选自sir2、re1和tir。ii型ago可锚定rna引导的5'磷酸端。在一些情况下，rna引导在其5'端具有尿嘧啶。在一些情况下，ii型原核argonaute是类球红细菌argonaute。在一些情况下，可能需要使用已失去切割核酸能力的argonaute核酸酶，如在其中argonaute:引导分子复合物用作探针的应用中。在一些情况下，失活argonaute系统可利用次级核酸酶进行基因组破坏。在这种情况下，催化结构域中的一个或多个氨基酸残基可以被取代或缺失，从而可以消除或减少催化活性。在其他情况下，可能需要使用切割温度诱导型argonaute来控制切割的时间，或者是否应在非诱导温度下抑制切割。在一些情况下，argonaute多肽可具有至少一个活性结构域。例如，argonaute的活性结构域可以是piwi结构域。除催化piwi结构域外，argonaute还可以含有非催化结构域，如(piwi-argonaute-zwille)、mid(中间)和n结构域，以及两个结构域接头l1和l2。mid结构域可以用于结合引导多核酸的5′-端，并可存在于ago蛋白中。paz结构域可以含有ob折叠核。ob折叠核可参与稳定3’端的引导多核酸。n结构域可有助于加载的双链基因组的第二条信使链解离，并有助于靶切割。在一些情况下，argonaute家族可含有piwi和mid结构域。在一些情况下，argonaute家族可含有或可不含有paz和n结构域。在一些情况下，argonaute多肽可以是或可包含天然存在的多肽(如，天然存在于细菌细胞和/或古细菌细胞中)，如核酸酶。在其他情况下，argonaute多肽可以是或可包含非天然存在的多肽，如核酸酶。可将天然存在的多肽工程化。工程化的argonaute多肽可以是嵌合核酸酶，其突变的、缀合的或以其他方式修饰的形式。在一些情况下，argonaute多肽可包含由seqidno:1至seqidno:19中的任一个编码的序列。在一些情况下，argonaute多肽的多肽序列可以包含由seqidno:20至seqidno:38中的任一个编码的序列。在一些情况下，多肽可包含由seqidno:39至seqidno:57中的任一个编码的序列。在一些情况下，构建体可包含由表16(seqidno:59-seqidno:67)中的任一序列编码的序列、其修饰的形式、其衍生物或其截短物。在一些情况下，构建体可包含由表17(seqidno:68-seqidno:160)中的任一序列编码的序列、其修饰的形式、其衍生物或其截短物。在一些情况下，构建体可包含由表18(seqidno:161-seqidno:252)中的任一序列编码的序列、其修饰的形式、其衍生物或其截短物。在一些情况下，构建体可包含由表19(seqidno:253-seqidno:344)中的任一序列编码的序列、其修饰的形式、其衍生物或其截短物。在一些情况下，argonaute核酸或其部分可包含与seqidno:1至seqidno:19或seqidno:39至seqidno:57中的任一个至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、高达至少约100％的同一性百分比。在一些情况下，argonaute多肽或其部分可包含与seqidno:20至seqidno:38中的任一个至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、高达至少约100％的同一性百分比。在一些情况下，多肽或其部分可以来自包含这样的序列，其与seqidno:59至seqidno:344中的任一个至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、高达至少约100％的同一性百分比。表1：通过piwi结构域鉴定的细菌argonaute功能结构域核酸序列表2：与通过piwi结构域鉴定的表1中公开的那些对应的argonaute结构域多肽酸序列表3：如表1中公开的那些的通过piwi结构域鉴定的对应的argonaute全基因组核酸序列。在一些情况下，核酸酶可以来自一种或多种crispr系统，或其变体或衍生物。来自crispr系统的核酸酶可以是cas蛋白。在化脓性链球菌(streptococcuspyogenes)中，cas9可以经由蛋白质中的以下两个催化结构域介导的过程，在前间隔子相邻基序(protospacer-adjacentmotif，pam)上游约1bp至约10bp处生成平末端双链断裂：切割dna的互补链的hnh结构域和切割非互补链的ruvc样结构域。在一些情况下，双链断裂位于pam上游约3bp处。参见jinke等人,science337,816-821(2012)，其在此通过引用以其整体并入。已知cas9蛋白存在于许多ii型crispr系统中，包括makarova等人,naturereviews,microbiology,第9卷，2011年6月，第467-477页的补充信息中所鉴定的以下内容：海沼甲烷球菌c7(methanococcusmaripaludisc7)；白喉棒状杆菌(corynebacteriumdiphtheriae)；有效棒状杆菌ys-314(corynebacteriumefficiensys-314)；谷氨酸棒状杆菌atcc13032kitasato(corynebacteriumglutamicumatcc13032kitasato)；谷氨酸棒状杆菌atcc13032bielefeld(corynebacteriumglutamicumatcc13032bielefeld)；谷氨酸棒状杆r(corynebacteriumglutamicumr)；克罗彭施泰特棒状杆菌dsm44385(corynebacteriumkroppenstedtiidsm44385)；脓肿分枝杆菌atcc19977(mycobacteriumabscessusatcc19977)；法氏诺卡氏菌ifm10152(nocardiafarcinicaifm10152)；红串红球菌pr4(rhodococcuserythropolispr4)；约什特氏红球菌rha1(rhodococcusjostiirha1)；不透明红球菌b4uid36573(rhodococcusopacusb4uid36573)；解纤维热酸菌11b(acidothermuscellulolyticus11b)；氯酚节杆菌a6(arthrobacterchlorophenolicusa6)；黄色韩国生工菌dsm17836uid43465(kribbellaflavidadsm17836uid43465)；弯曲高温单孢菌dsm43183(thermomonosporacurvatadsm43183)；齿双歧杆菌bd1(bifidobacteriumdentiumbd1)；长双歧杆菌djo10a(bifidobacteriumlongumdjo10a)；还原天芥茉碱斯奈克氏菌dsm20476(slackiaheliotrinireducensdsm20476)；海珀尔女神菌exh1(persephonellamarinaexh1)；脆弱拟杆菌nctc9434(bacteroidesfragilisnctc9434)；黄褐二氧化碳噬纤维菌dsm7271(capnocytophagaochraceadsm7271)；嗜冷黄杆菌jip0286(flavobacteriumpsychrophilumjip0286)；嗜粘蛋白艾克曼菌atccbaa835(akkermansiamuciniphilaatccbaa835)；卡氏红弯曲菌dsm13941(roseiflexuscastenholziidsm13941)；玫瑰弯菌rs1(roseiflexusrs1)；集胞藻pcc6803(synechocystispcc6803)；小迷踪菌pei191(elusimicrobiumminutumpei191)；未培养的termite组1细菌种系型rsd17(unculturedtermitegroup1bacteriumphylotypersd17)；产琥珀酸丝状杆菌s85(fibrobactersuccinogeness85)；蜡样芽孢杆菌atcc10987(bacilluscereusatcc10987)；无害李斯特菌(listeriainnocua)；干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)；鼠李糖乳杆菌gg(lactobacillusrhamnosusgg)；唾液乳杆菌ucc118(lactobacillussalivariusucc118)；无乳链球菌a909(streptococcusagalactiaea909)；无乳链球菌nem316(streptococcusagalactiaenem316)；无乳链球菌2603(streptococcusagalactiae2603)；似马停乳链球菌ggs124(streptococcusdysgalactiaeequisimilisggs124)；兽瘟马链球菌mgcs10565(streptococcusequizooepidemicusmgcs10565)；解没食子酸链球菌ucn34uid46061(streptococcusgallolyticusucn34uid46061)；格氏链球菌challis亚株ch1(streptococcusgordoniichallissubstch1)；变异链球菌nn2025uid46353(streptococcusmutansnn2025uid46353)；变异链球菌(streptococcusmutans)；化脓性链球菌m1gas；化脓性链球菌mgas5005；化脓性链球菌mgas2096；化脓性链球菌mgas9429；化脓性链球菌mgas10270；化脓性链球菌mgas6180；化脓性链球菌mgas315；化脓性链球菌ssi-1；化脓性链球菌mgas10750；化脓性链球菌nz131；嗜热链球菌cnrz1066(streptococcusthermophilescnrz1066)；嗜热链球菌lmd-9(streptococcusthermophileslmd-9)；嗜热链球菌lmg18311(streptococcusthermophileslmg18311)；肉毒梭状芽胞杆菌a3lochmaree(clostridiumbotulinuma3lochmaree)；肉毒梭状芽胞杆菌beklund17b(clostridiumbotulinumbeklund17b)；肉毒梭状芽胞杆菌ba4657(clostridiumbotulinumba4657)；肉毒梭状芽胞杆菌flangeland(clostridiumbotulinumflangeland)；解纤维梭状芽胞杆菌h10(clostridiumcellulolyticumh10)；大芬戈尔德菌atcc29328(finegoldiamagnaatcc29328)；直肠真杆菌atcc33656(eubacteriumrectaleatcc33656)；鸡败血支原体(mycoplasmagallisepticum)；运动支原体163k(mycoplasmamobile163k)；穿通支原体(mycoplasmapenetrans)；滑液支原体53(mycoplasmasynoviae53)；念珠状链杆菌dsm12112(streptobacillusmoniliformisdsm12112)；慢生根瘤菌btai1；汉氏硝化细菌x14(nitrobacterhamburgensisx14)；沼泽红假单胞菌bisb18；沼泽红假单胞菌bisb5；食清洁剂细小棒菌ds-1(parvibaculumlavamentivoransds-1)；dinoroseobactershibaedfl12；葡萄糖醋杆菌pal5faperj；葡萄糖醋杆菌pal5jgi；固氮螺菌b510uid46085(azospirillumb510uid46085)；深红红螺菌atcc11170(rhodospirillumrubrumatcc11170)；diaphorobactertpsyuid29975；蚯蚓虫肾杆菌ef01-2(verminephrobactereiseniaeef01-2)；脑膜炎奈瑟菌053442(neisseriameningitides053442)；脑膜炎奈瑟菌α14(neisseriameningitidesalpha14)；脑膜炎奈瑟菌z2491(neisseriameningitidesz2491)；需盐脱硫弧菌dsm2638(desulfovibriosalexigensdsm2638)；德莱空肠弯曲杆菌26997(campylobacterjejunidoylei26997)；空肠弯曲杆菌81116(campylobacterjejuni81116)；空肠弯曲杆菌(campylobacterjejuni)；红嘴鸥弯曲杆菌rm2100(campylobacterlarirm2100)；肝螺杆菌(helicobacterhepaticus)；产琥珀酸沃林氏菌(wolinellasuccinogenes)；奥湖甲苯单胞菌dsm9187(tolumonasauensisdsm9187)；大西洋假交替单胞菌t6c(pseudoalteromonasatlanticat6c)；乌贼希瓦氏菌atcc700345(shewanellapealeanaatcc700345)；嗜肺军团菌paris(legionellapneumophilaparis)；产琥珀酸放线杆菌130z(actinobacillussuccinogenes130z)；多杀巴斯德菌(pasteurellamultocida)；新凶手土拉弗朗西斯菌u112(francisellatularensisnovicidau112)；欧亚土拉弗朗西斯菌(francisellatularensisholarctica)；土拉弗朗西斯菌fsc198(francisellatularensisfsc198)；土拉土拉弗朗西斯菌(francisellatularensistularensis)；土拉弗朗西斯菌wy96-3418；和齿垢密螺旋体atcc35405(treponemadenticolaatcc35405)。因此，本公开的方面涉及在ii型crispr系统中存在的cas9蛋白，其与所公开的基因编辑系统组合使用。在一些情况下，cas可以用作含rna酶h样结构域的肽复合物中的模块。cas蛋白的非限制性实例可以包括cas1、cas1b、cas2、cas3、cas4、cas5、cas6、cas7、cas8、cas9(也称为csn1或csx12)、cas10、csy1、csy2、csy3、cse1、cse2、csc1、csc2、csa5、csn2、csm2、csm3、csm4、csm5、csm6、cmr1、cmr3、cmr4、cmr5、cmr6、csb1、csb2、csb3、csx17、csx14、csx10、csx16、csax、csx3、csx1、csx1s、csf1、csf2、cso、csf4、cpf1、c2c1、c2c3、cas9hifi、xcas9、casx、casy、casrx，其同源物或其修饰形式。在一些情况下，可以利用cas的替代物。例如，在一些情况下，可以使用cpf1核酸内切酶。cpf1可以在系统发育上接近细菌和古细菌argonauts。例如，在cpf1的c末端，它可以与argonaute对齐。cpf1的c末端可以包含piwi结构域。在一些情况下，也可以使用催化失活的cas蛋白(如，dcas9)。cas可以是部分催化失活的。cas蛋白可以具有dna或rna切割活性。crispr酶可指导靶序列(如基因序列内和/或基因序列的互补物内)中的一条或两条链的切割。例如，crispr酶可以指导从前间隔子相邻基序(pam)序列的第一个核苷酸或最后一个核苷酸开始在或在约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、200、500或更多个碱基对内的一条或两条链的切割。在一些情况下，cas蛋白可以是高保真cas蛋白，如cas9hifi。在一些情况下，cas可以是部分失活的cas，如切口酶。表4：化脓性链球菌cas9(spcas9)在一些情况下，可以利用cas9。cas9可以指与野生型示例性cas9多肽(如，来自化脓性链球菌的cas9)具有至少或至少约50％、60％、70％、80％、90％、100％序列同一性和/或序列类似性的多肽。cas9可以指与野生型示例性cas9多肽(如，来自化脓性链球菌的cas9)具有不超过或不超过约50％、60％、70％、80％、90％、100％序列同一性和/或序列类似性的多肽。cas9可以指野生型或修饰形式的cas9蛋白，所述修饰形式的cas9蛋白可以包含氨基酸变化，如缺失、插入、取代、变体、突变、融合、嵌合体或以上的任何组合。cas9可以指与seqidno:58具有至少或至少约50％、60％、70％、80％、90％、100％序列同一性和/或序列类似性的多肽。虽然表4中的化脓性链球菌cas9(spcas9)可以用作用于基因组工程的crispr核酸内切酶，但在一些情况下，它并不是针对每个靶标切除位点的最优核酸内切酶。例如，spcas9的pam序列(5′ngg3′)在整个人类基因组中是丰富的，但是ngg序列可能无法正确定位以靶向所需的修饰基因。在一些情况下，不同的核酸内切酶可以用于靶向某些基因组靶标。在一些情况下，可以使用具有非nggpam序列的合成spcas9来源的变体。另外，已经鉴定了来自各种物种的其他cas9直向同源物，并且这些“非spcas9”结合多种pam序列，其也可以用于本发明中。例如，spcas9的相对大尺寸(大约4kb编码序列)意味着携带spcas9cdna的质粒不能在细胞中有效表达。相反，金黄色葡萄球菌cas9(staphylococcusaureuscas9，sacas9)的编码序列比spcas9短约1千个碱基，这可能允许其在细胞中有效表达。与spcas9相似，sacas9核酸内切酶能够修饰体外哺乳动物细胞和体内小鼠细胞中的靶基因。化脓性链球菌cas9的替代物可以包括来自cpf1家族的rna引导的核酸内切酶，其在哺乳动物细胞中展现出切割活性。与cas9核酸酶不同，cpf1介导的dna切割的结果是带有短的3'突出部分的双链断裂。cpf1的交错切割模式可以打开定向基因转移的可能性(类似于传统的限制酶克隆)，这可以提高基因编辑的效率。与上述的cas9变体和直向同源物一样，cpf1还可以将crispr可靶向的位点数扩展至缺乏spcas9偏爱的nggpam位点的富at区或富at基因组。在一些情况下，核酸酶可包含多核酸解旋剂，如解旋酶。在其他情况下，核酸酶可不含有dna解旋剂。可解旋多核酸的核酸酶可以是cas或cpf1。在一些情况下，核酸酶可以在转座子/转座酶系统中起作用。可转座的元件可以是能够介导稳定的基因组整合和/或破坏的天然、非病毒基因递送媒介物。转座子/转座酶可以是piggybac。piggybac可以由转座子盒和转座酶两者组成。piggybac系统转座子可以在‘ttaa’位点处修饰基因组。可以对核酸酶进行密码子优化，以在特定细胞如真核细胞中表达。编码核酸内切酶(如，argonaute)的多核苷酸可以经密码子优化以在特定细胞如真核细胞中表达。这种类型的优化可需要外部来源的(如重组)核酸的突变，以在编码同一蛋白质的同时模拟预期的宿主有机体或细胞的密码子偏好。转座酶可以通过乒乓机制对称地协调并交换作用，以交替激活水和3'-oh，从而进行连续的链切割和转移。在一些实施方案中，rna酶h特异性识别a型rna链和b型dna链。核酸酶可以结合和/或修饰(如切割、甲基化、去甲基化等)靶核酸和/或与靶核酸缔合的多肽。如下文进一步详细描述的，在一些情况下，主题核酸酶可具有修饰靶核酸的酶促活性。酶促活性可以指核酸酶活性、甲基转移酶活性、去甲基化酶活性、dna修复活性、dna损伤活性、脱氨活性、歧化酶活性、烷基化活性、脱嘌呤活性、氧化活性、嘧啶二聚体形成活性、整合酶活性、转座酶活性、重组酶活性、聚合酶活性、连接酶活性、解旋酶活性、光解酶活性或糖基化酶活性。在其他情况下，主题核酸酶可具有修饰与靶核酸缔合的多肽的酶促活性。在一些实施方案中，除了核酸切割活性之外或作为代替核酸切割活性，本文所述的组合物、多肽、方法和系统还可具有“粘贴”功能。因此，除了或代替切割靶核酸，所述组合物、多肽、方法和系统还可以用于将核酸插入靶序列中。此类示例性核酸插入活性包括但不限于整合酶、翻转酶、转座酶和重组酶活性。因此，具有此类功能的示例性多肽(核酸插入多肽)包括整合酶、重组酶和翻转酶。这些核酸插入多肽可以例如在已被本公开的多肽切割的位点处插入核酸序列。在一些情况下，argonaute核酸酶、crispr核酸酶或rna酶h样核酸酶可含有核定位序列(nls)。核定位序列可以来自sv40。nls可以来自以下中的至少一种：sv40、核质蛋白(nucleoplasmin)、输入蛋白α、c-myc、egl-13、tus、borg、hnrnpa1、mata2或py-nls。nls可以在核酸酶多肽或核酸的c端或n端。在一些情况下，核酸酶可含有约1至约10个nls序列。核酸酶可以含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或高达10个nls序列。核酸酶可含有sv40和nucloplasminnls序列。在一些情况下，nls可以来自猿猴空泡病毒40。解旋剂在一些情况下，可利用核酸解旋剂。核酸解旋剂可以是解旋核酸的多核酸、蛋白、药物或系统。核酸解旋剂可以是能量。核酸解旋剂可以提供能量或热。解旋可以指双螺旋(如dna)的解旋，以及双链核酸的解旋以将其转化为单链核酸或从组蛋白解旋dna。在一些实施方案中，解旋剂是解旋酶。在一些实施方案中，解旋酶是结合核酸或核酸蛋白复合物的酶。在一些实施方案中，解旋酶是dna解旋酶。在一些实施方案中，解旋酶是rna解旋酶。在一些实施方案中，解旋酶在任何位置处解旋多核酸。在一些情况下，发现解旋位置在免疫检查点基因内。在一些情况下，核酸的解旋位置编码参与疾病的基因。在一些实施方案中，解旋剂是atp酶、解旋酶、合成相关的解旋酶或拓扑异构酶。在一些实施方案中，核酸解旋剂通过断裂双链dna或rna中的核苷酸碱基对之间的氢键起作用。在一些情况下，解旋核酸(如，通过断裂氢键)需要能量。为了断裂氢键，核酸解旋剂可以使用atp中储存的能量。在一些实施方案中，核酸解旋剂包括atp酶。例如，具有核酸解旋活性的多肽可以包含atp酶或与之融合。在一些实施方案中，将atp酶添加至细胞系统中。在一些实施方案中，核酸解旋剂是多肽，例如，核酸解旋肽可以是原核生物来源、古细菌来源或真核生物来源的。在一些实施方案中，核酸解旋多肽包含解旋酶结构域、拓扑异构酶结构域、cas蛋白结构域，如选自以下的cas蛋白结构域：cas1、cas1b、cas2、cas3、cas4、cas5、cas6、cas7、cas8、cas9、cas10、csy1、csy2、csy3、cse1、cse2、csc1、csc2、csa5、csn2、csm2、csm3、csm4、csm5、csm6、cmr1、cmr3、cmr4、cmr5、cmr6、csb1、csb2、csb3、csx17、csx14、csx10、csx16、csax、csx3、csx1、csx1s、csf1、csf2、cso、csf4、cpf1、c2c1、c2c3、cas9hifi、xcas9、casx、casy、casrx或催化失活的核酸解旋结构域如dcas结构域(如dcas9结构域)。在一些实施方案中，核酸解旋剂是小分子。例如，小分子核酸解旋剂可以通过嵌入、沟结合或共价结合至核酸或以上的组合来对核酸解旋。示例性小分子核酸解旋剂包括但不限于9-氨基吖啶、喹吖因、氯喹、吖啶黄、安吖啶、(z)-3-(吖啶-9-基氨基)-2-(5-氯-1,3-苯并噁唑-2-基)丙-2-烯醛、可稳定四链体结构的小分子、喹氟拉辛(quarfloxin)、喹叨啉、基于喹啉的三嗪化合物、braco-19、吖啶、pyridostatin(吡啶并他汀)以及它们的衍生物。在一些实施方案中，多核酸以物理方式解旋。物理方式可以包括例如添加热或剪接。在一些情况下，可使多核酸如dna或rna暴露于热以进行核酸解旋。dna或rna可在约50℃至约150℃的温度变性。dna或rna从约50℃至60℃、从约60℃至约70℃、从约70℃至约80℃、从约80℃至约90℃、从约90℃至约100℃、从约100℃至约110℃、从约110℃至约120℃、从约120℃至约130℃、从约130℃至约140℃、从约140℃至约150℃变性。在一些情况下，可以经由ph变化而使多核酸变性。例如，氢氧化钠(naoh)可以用于通过增加ph至约25至约29来使多核酸变性。在一些情况下，可以经由添加盐使多核酸变性。在一些情况下，与不采用所公开的解旋剂的系统相比，所公开的利用解旋剂的编辑系统可以使热力学能量需求降低约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、40％、50％或高达约60％。在一些情况下，与不采用所公开的解旋剂的系统相比，所公开的利用解旋剂的编辑系统可以使对解旋剂的免疫应答降低约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、40％、50％或高达约60％。在一些情况下，可以从人体内源性存在的细菌中收获解旋剂，以防止引发免疫应答。调控结构域多肽(rdp)在一些情况下，调控结构域多肽可以是核酸编辑系统的一部分。rdp可调控核酸编辑系统的活性水平，如编辑。rdp的非限制性实例可以包括重组酶、表观遗传调节剂、生殖细胞修复结构域或dna修复蛋白。在一些情况下，可通过在包含含rna酶h样结构域的多肽的区域中筛选共定位的dna修复蛋白来挖掘rdp。可以用作rdp的示例性重组酶包括cre、hin、tre或flp重组酶。在一些情况下，可以利用参与同源重组的重组酶。例如，rdp可以是rada、rad51、reca、dmc1或uvsx。表观遗传调节剂可以是可以直接通过dna甲基化、染色质的翻译后修饰或通过改变染色质结构来修饰表观基因组的蛋白质。示例性生殖细胞修复结构域可以例如包括atm、atr或dna-pk。生殖细胞修复结构域可以通过多种机制修复dna损伤，如核苷酸切除修复(ner)、碱基切除修复(ber)、错配修复(mmr)、dna双链断裂修复(dsbr)和复制后修复(prr)。rdp可以是核酸编辑系统的可调组件。例如，可以在编辑系统中调换rdp以实现特定的结果。在一些情况下，可以基于待靶向的细胞、要寻求的编辑效率水平或为了减少核酸编辑系统的脱靶效应来选择rdp。与相当的基因编辑系统相比，调高或调整可将基因组断裂修复的参数(效率、安全性、速度或准确性)提高约5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或高达约100％。调低或调整可以通过交换结构域(如rdp)来进行，以在基因组修饰期间实现不同的效果。例如，不同的效果可以是偏向特定的基因组断裂修复、重组、表观遗传调节或高保真修复。在一些情况下，rdp可以用于增强转基因插入基因组断裂中。在一些情况下，与nhej或mmej相反，交换基因编辑系统的模块可以允许双链断裂的hdr。使用本文公开的基因编辑系统可以允许双链断裂的优先hdr超过相当或替代的基因编辑系统。在一些情况下，hdr修复可以优先发生在约5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或高达约100％的细胞群体中，超过不含所述rdp的相当的基因编辑系统中发生的细胞群体。在一些情况下，与不采用所公开的rdp的系统相比，所公开的利用rdp的编辑系统可以将热力学能量需求降低约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、40％、50％或高达约60％。在一些情况下，与不采用所公开的rdp的系统相比，所公开的利用rdp的编辑系统可以将对rdp的免疫应答降低约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、40％、50％或高达约60％。在一些情况下，可以从人体内源性存在的细菌中收获rdp，以防止引发免疫应答。引导多核酸引导多核酸可以将包含rhdc多肽编码的蛋白的基因编辑系统引导至基因组位置。在一些情况下，引导多核酸可以是dna。在其他情况下，引导多核酸可以是rna。引导多核酸可以是dna和rna的组合。引导多核酸可以是单链、双链或其组合。引导多核酸的长度可以是至少或至少约5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30或更多个核苷酸。引导多核苷酸的长度可以不超过或不超过约5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30或更多个核苷酸。引导多核苷酸的长度可以是约5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30或更多个核苷酸。在一些情况下，引导多核酸可被截短，如在表22中。可以利用截短的引导多核酸以确定最小结合长度。引导多核酸可以是引导rna(即“grna”)，其可以与rhdc多肽缔合并借由与靶核酸的靶位点杂交将rhdc多肽引导至靶核酸内的特定靶序列。类似地，引导多核酸可以是引导rna(即“gdna”)，其可以与rhdc多肽缔合并借由与靶核酸的靶位点杂交将rhdc多肽引导至靶核酸内的特定靶序列。在一些情况下，引导多核酸可在引导多核酸和靶核酸之间具有错配的情况下进行杂交。当与靶核酸杂交时，引导多核酸可包含至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、19、20、25、30、35或高达40个错配。在一些情况下，引导多核酸可以容忍募集结构域中的错配，例如在g6、g7和g8处。在一些情况下，引导多核酸可以在稳定结构域中含有错配。稳定结构域可以与引导分子的3'端相邻。例如，位置g6-g16，如g6、g7、g8、g9、g10、g11、g12、g13、g14、g15和g16或其任何组合可在16个核苷酸长的引导分子中错配。募集结构域中的错配可以优选在位置g6、g7和/或g8中具有错配。本文公开的方法还可以包括将至少一种引导rna或核酸如编码至少一种引导rna的dna引入细胞或胚胎。引导rna可以与rna引导的核酸内切酶相互作用以将核酸内切酶引导至特定的靶位点，在该位点处引导rna的5'端与染色体序列中的特定前间隔子序列进行碱基配对。引导rna可以包括两种rna，如crisprrna(crrna)和反式激活crrna(tracrrna)。引导rna有时可包含通过crrna的一部分(如功能部分)和tracrrna融合形成的单引导rna(sgrna)。引导rna也可以是包含crrna和tracrrna的双重rna。引导rna可包含crrna且缺乏tracrrna。此外，crrna可以与靶dna或前间隔子序列杂交。如上所论述的，引导rna可以是表达产物。例如，编码引导rna的dna可以是包含编码引导rna的序列的载体。引导rna可以通过用分离的引导rna或包含编码引导rna的序列和启动子的质粒dna转染细胞或有机体而转移到细胞或有机体中。引导rna还可以以其他方式，如使用病毒介导的基因传递转移到细胞或有机体中。可以分离引导多核酸。例如，引导rna可以以分离的rna的形式转染到细胞或有机体中。可以使用任何体外转录系统通过体外转录来制备引导rna。引导rna可以以分离的rna形式而不是包含编码引导rna的序列的质粒形式转移到细胞中。引导rna可以包含dna靶向区段和蛋白质结合区段。dna靶向区段(或dna靶向序列或间隔子序列)包含可与靶dna内的特定序列(如前间隔子)互补的核苷酸序列。蛋白质结合区段(或蛋白质结合序列)可以与定点修饰多肽(如rna引导的核酸内切酶，如cas蛋白)相互作用。“区段”意指分子的区段/部分/区，如rna中核苷酸的连续链段。区段也可以意指复合物的区域/部分，使得区段可以包含一个以上分子的区域。例如，在一些情况下，dna靶向rna的蛋白质结合区段是一个rna分子，并因此该蛋白质结合区段包含此rna分子的区域。在其他情况下，dna靶向rna的蛋白质结合区段包含沿着互补区域杂交的两个单独的分子。引导多核酸可以包含两个单独的多核酸分子或单个多核酸分子。示例性单分子引导多核酸(如，引导rna)包含dna靶向区段和蛋白质结合区段。在一些情况下，rhdc多肽或其部分可以与引导多核酸形成复合物。引导多核酸可以通过包含可与靶核酸序列互补的核苷酸序列来提供对复合物的靶特异性。在一些情况下，靶核酸可包含基因的至少一部分。在一些情况下，靶核酸可以在基因的外显子内。在其他情况下，靶核酸可以在基因的内含子内。引导多核酸可与rhdc多肽复合以提供rhdc多肽位点特异性活性。换句话说，rhdc多肽可以借由其与引导多核酸的缔合被引导至单链靶核酸序列内的靶位点，如双链核酸、染色体序列或染色体外序列的单链区域，如游离序列(episomalsequence)、小环序列、线粒体序列、叶绿体序列、ssrna、ssdna等。在一些情况下，引导多核酸可以包含一个或多个修饰(如，碱基修饰、主链修饰)，以为核酸提供新的或增强的特征(如，改进的稳定性)。引导多核酸可以包含核酸亲和标签。核苷可以是碱基-糖组合。核苷的碱基部分可以是杂环碱基。此类杂环碱的两个最常见的类别可以是嘌呤和嘧啶。核苷酸可以是核苷，其还包括与核苷的糖部分共价连接的磷酸基团。对于包括戊呋喃糖基(pentofuranosyl)糖的那些核苷，磷酸基团可以连接至糖的2'、3'或5'羟基部分。在形成引导多核酸时，磷酸基团可以将相邻的核苷彼此共价连接，以形成线性聚合化合物。此外，线性化合物可以具有内部核苷酸碱基互补性，并因此可以以产生完全或部分双链化合物的方式折叠。在引导多核酸中，磷酸基团通常可被称为形成引导多核酸的核苷间主链。引导多核酸的连键或主链可以是3'至5'磷酸二酯连键。在一些情况下，引导多核酸可以包含核苷类似物，其可以是天然存在的dna和rna核苷的脱氧胞苷、脱氧尿苷、脱氧腺苷、脱氧鸟苷和胸苷的氧基-或脱氧-类似物。引导多核酸还可包含通用碱基，如脱氧肌苷或5-硝基吲哚。引导多核酸可包含修饰的主链和/或修饰的核苷间连键。修饰的主链可以包括可以在主链中保留磷原子的那些和在主链中不具有磷原子的那些。其中含有磷原子的适合的修饰的引导多核酸主链可以包括例如硫代磷酸酯，手性硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，磷酸三酯，氨基烷基磷酸三酯，膦酸甲酯和其他膦酸烷基酯如3'-亚烷基膦酸酯、5'-亚烷基膦酸酯、手性膦酸酯，次膦酸酯，氨基磷酸酯，其包括3'-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯，二氨基磷酸酯，硫代氨基磷酸酯，硫代烷基膦酸酯，硫代烷基磷酸三酯，硒代磷酸酯和硼烷磷酸酯(具有正常的3'-5'连键)，2'-5'连接的类似物及具有相反极性的那些，其中一个或多个核苷酸间连键是3'至3'、5'至5'或2'至2'连键。具有相反极性的适合的引导多核酸可以在最3'-核苷酸间连键处包含单个3'至3'连键(即，其中核碱基缺失或具有羟基基团替代其的单个反向核苷残基)。在一些情况下，引导多核酸(如，引导rna)还可以在5’或3'端处包含尾区，所述尾区可以是基本上单链的。例如，尾区有时与目标细胞中的任何染色体序列都不互补，并且有时可能与引导多核酸的其余部分不互补。此外，尾区的长度可以变化。尾区的长度可以大于或大于约4个核苷酸。例如，尾区的长度的范围可以为约5至或至约60个核苷酸的长度。在一些情况下，引导多核酸可结合基因组的与前间隔子相邻基序(pam)相邻的区域。引导核酸可例如，在5’端或3’端处或附近包含核苷酸序列(如，间隔子)，其可与靶核酸中的序列(如，前间隔子)杂交。引导核酸的间隔子可以以序列特异性方式经由杂交(即，碱基配对)与靶核酸相互作用。间隔子序列可以与位于前间隔子相邻基序(pam)的5’或3’的靶核酸杂交。间隔子序列的长度可以是至少或至少约5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30或更多个核苷酸。间隔子序列的长度可以是不超过或不超过约5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30或更多个核苷酸。在一些情况下，引导多核酸可结合与pam相邻的约1至约20个碱基对的区域。在其他情况下，引导多核酸可远离pam约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80或高达85个碱基对结合。通常，引导多核酸结合区可经设计以与一个或多个靶核酸序列互补或基本上互补。在一些情况下，引导多核酸的结合区可掺入摆动或简并碱基以结合多个序列。在一些情况下，可以改变结合区以增加稳定性。例如，可掺入非天然核苷酸以增加rna对降解的抗性。在一些情况下，可以改变或设计结合区以避免或减少结合区中的二级结构形成。在一些情况下，可以设计结合区以优化g-c含量。在一些情况下，g-c含量优选为约40％至约60％(如40％、45％、50％、55％和60％)。在一些情况下，结合区可含有修饰的核苷酸，如但不限于甲基化或磷酸化的核苷酸。在一些情况下，引导多核酸还可包含可形成二级结构的双链双链体区。例如，由引导多核酸形成的二级结构可以包含茎(或发夹)和环。环和茎的长度可以变化。例如，环的长度范围可以是约3至约10个核苷酸，并且茎的长度范围可以是约6至约20个碱基对。茎可以包含1至约10个核苷酸的一个或多个凸起。第二区的总长度范围可以是约16至约60个核苷酸长。例如，环的长度可以是或可以是约4个核苷酸，并且茎可以是或可以是约12个碱基对。在一些情况下，5'茎环区的长度可以是约15至约50个核苷酸(如长度为约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或约50个核苷酸)。在一些情况下，5'茎环区的长度是约30-45个核苷酸(如长度为约31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45个核苷酸)。在一些情况下，5'茎环区的长度是至少约为31个核苷酸(如长度为至少约31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45个核苷酸)。在一些情况下，5'茎环结构含有一个或多个环或凸起，每个环或凸起有约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。在一些情况下，5'茎环结构含有约10至30个互补碱基对(如11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个互补碱基对)的茎。在一些情况下，5'茎环结构可以含有蛋白质结合或小分子结合结构。在一些情况下，结合5'茎环的蛋白质结合结构的药物、生长因子、小分子配体或蛋白质可以有条件地激活5'茎环功能(如与引导多核酸-引导的核酸酶相互作用或组装)。在一些情况下，5'茎环结构可以含有非天然核苷酸。例如，可以掺入非天然核苷酸以增强蛋白质-rna相互作用、蛋白质dna相互作用，或增加引导多核酸的热稳定性或抗降解性。在一些情况下，引导多核酸可在5'和3'茎环结构之间具有插入序列，其长度可以是约10至约50个核苷酸(如长度为约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或约50个核苷酸)。在一些情况下，插入序列被设计为线性、非结构化、基本线性或基本非结构化的。在一些实施方案中，插入序列可以含有非天然核苷酸。例如，可以掺入非天然核苷酸以增强蛋白质-rna相互作用或增加grna：核酸酶复合物的活性。作为另一个实例，可以掺入天然核苷酸以增强grna的热稳定性或抗降解性。在一些情况下，3'茎环结构可含有约3、4、5、6、7或8个核苷酸环和约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸或更长的茎。在一些情况下，3'茎环可含有蛋白质-结合、小分子-结合、激素-结合或代谢物-结合结构，其可以有条件地稳定grna的二级和/或三级结构。在一些实施方案中，3'茎环可含有非天然核苷酸。例如，可以掺入非天然核苷酸以增强蛋白质-引导的核酸相互作用或增加引导多核酸：核酸酶复合物的活性。作为另一个实例，可以掺入天然核苷酸以增强grna或gdna的热稳定性或抗降解性。在一些情况下，引导多核酸可在其3'端处包含终止结构。在一些情况下，引导多核酸可以如在终止结构之前包含另外的3'发夹结构，所述结构可以与蛋白质、小分子、激素等相互作用以具有稳定或另外功能，如引导多核酸：核酸酶组装或活性的有条件的稳定或有条件的调控。在一些情况下，可以优化引导多核酸以增强稳定性、组装和/或表达。在一些情况下，可以优化引导多核酸以相较于对照或相当的引导多核酸：核酸酶结构(grna、crisprrnp、未修饰的grna或未修饰的引导多核酸)，增强引导多核酸：核酸酶复合物的活性。在一些情况下，可以通过取代、缺失或添加一个或多个核苷酸来优化引导多核酸进行表达。在一些情况下，提供从编码模板核酸进行无效转录的核苷酸序列可被缺失或取代。例如，在一些情况下，可以从与rna聚合酶iii启动子可操作地连接的核酸转录引导多核酸。在一些情况下，可以修饰引导多核酸以增加稳定性。可以通过优化引导多核酸：核酸酶相互作用的稳定性、优化引导多核酸：核酸酶复合物的组装、去除或改变rna或dna去稳定序列元件或添加rna或dna稳定序列元件来增强稳定性。在一些实施方案中，引导多核酸可含有与引导多核酸-引导的核酸酶相互作用的结合区靠近或相邻的5'茎环结构。5'茎环结构的优化可以提供引导多核酸：核酸酶复合物的增强的稳定性或组装。在一些情况下，通过增加茎环结构中的茎部分的长度来优化5'茎环结构。例如，可以将5'茎环优化与突变组合以增加转录，从而提供优化的引导多核酸。例如，可以将a-u翻转和细长的茎环组合以提供优化的引导多核酸。双链引导多核酸双链体区可包含蛋白质结合区段，所述蛋白质结合区段可与rna或dna-结合蛋白质(如argonaute蛋白、多肽或其功能部分)形成复合物。在一些情况下，引导多核酸可以包含修饰。修饰可以是化学修饰。修饰可选自5’腺苷酸、5’鸟苷-三磷酸帽、5’n7-甲基鸟苷-三磷酸帽、5’三磷酸帽、3’磷酸、3’硫代磷酸、5’磷酸、5’硫代磷酸、cis-syn胸苷二聚体、三聚体、c12间隔子、c3间隔子、c6间隔子、dspacer、pc间隔子、rspacer、spacer18、spacer9,3’-3’修饰、5’-5’修饰、脱碱基、吖啶、偶氮苯、生物素、生物素bb、生物素teg、胆固醇基teg、脱硫生物素teg、dnpteg、dnp-x、dota、dt-生物素、双重生物素、pc生物素、补骨脂素c2、补骨脂素c6、tina、3’dabcyl、黑洞猝灭剂1、黑洞猝灭剂2、dabcylse、dt-dabcyl、irdyeqc-1、qsy-21、qsy-35、qsy-7、qsy-9、羧基接头、硫醇接头、2’脱氧核糖核苷类似物嘌呤、2’脱氧核糖类似物嘧啶、核糖核苷类似物、2’-o-甲基核糖核苷类似物、糖修饰的类似物、摆动/通用碱基、荧光染料标记物、2’氟rna、2’o-甲基rna、膦酸甲酯、磷酸二酯dna、磷酸二酯rna、硫代磷酸酯dna、硫代磷酸酯rna、una、假尿苷-5’-三磷酸、5-甲基胞苷-5’-三磷酸、2-o-甲基3硫代磷酸酯或以上的任何组合。修饰可以是假尿苷修饰。在一些情况下，修饰不会影响存活力。在一些情况下，修饰是2-o-甲基3硫代磷酸酯添加。2-o-甲基3硫代磷酸酯添加可从1个碱基至150个碱基进行。2-o-甲基3硫代磷酸酯添加可从1个碱基至4个碱基进行。2-o-甲基3硫代磷酸酯添加可对2个碱基进行。2-o-甲基3硫代磷酸酯添加可对4个碱基进行。修饰还可以是截短。截短可以是5个碱基截短。引导多核酸可以通过本领域已知的方法进行修饰。在一些情况下，修饰可以包括但不限于添加以下序列元件中的一个或多个：5'帽(如7-甲基鸟苷酸帽)；3'聚腺苷酸化尾；核糖开关序列；稳定性控制序列；发夹；亚细胞定位序列；检测序列或标记物；或一种或多种蛋白质的结合位点。修饰还可以包括引入非天然核苷酸，包括但不限于以下中的一种或多种：荧光核苷酸和甲基化核苷酸。在一些实施方案中，引导多核酸可含有5'至3'的：(i)约10至约50个核苷酸的结合区；(ii)含有少于四个连续尿嘧啶核苷酸或长度为至少31个核苷酸(如，约31至约41个核苷酸)的5'发夹区；(iii)3'发夹区；和(iv)转录终止序列，其中小引导rna被配置为与引导多核酸-引导的核酸酶形成复合物，相对于未修饰的复合物，所述复合物具有增加的稳定性或活性。引导rna或引导dna可以靶向20个核苷酸或约20个核苷酸的核酸序列。靶核酸可以小于或小于约20个核苷酸。靶核酸可以是至少或至少约5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30个或更多个核苷酸。靶核酸可以是不超过或不超过约5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30个或更多个核苷酸。靶核酸序列可以是或可以是约紧接pam的第一个核苷酸的5’的20个碱基。引导rna或引导dna可以靶向包含基因或其部分的核酸序列。引导rna或引导dna可靶向包含基因的基因组序列。可以被靶向的基因可参与疾病。疾病可以是癌症、心血管病况、生殖病况、神经病、免疫性疾病、器官病况、变性、眼病况、糖尿病、血管病况或胃肠病况。可以被破坏的基因可以是基因家族的成员。例如，可以被破坏的基因可以提高癌症免疫疗法的治疗潜力。可以被破坏的基因可以改善与人类遗传病相关的一种或多种症状或并发症。可以被破坏的基因可以参与减弱tcr信号传导、功能亲合力或对癌症的免疫力。在一些情况下，当刺激tcr时，待破坏的基因上调。基因可以参与抑制细胞扩增、功能亲合力或细胞因子多功能性。基因可以参与负调控细胞因子产生。例如，基因可以参与抑制效应细胞因子，例如ifn-γ和/或tnf的产生。基因还可以参与tcr刺激后抑制支持性细胞因子(如il-2)的表达。疾病可以是瘤形成。与瘤形成相关的基因可以是：pten；atm；atr；egfr；erbb2；erbb3；erbb4；notch1；notch2；notch3；notch4；akt；akt2；akt3；hif；hif1a；hif3a；met；hrg；bcl2；pparα；pparγ；wt1(维尔姆斯瘤)；fgf受体家族成员(5个成员：1、2、3、4、5)；cdkn2a；apc；rb(视网膜母细胞瘤)；men1；vhl；brca1；brca2；ar(雄激素受体)；tsg101；igf；igf受体；igf1(4种变体)；igf2(3种变体)；igf1受体；igf2受体；bax；bcl2；半胱天冬酶家族(9个成员：1、2、3、4、6、7、8、9、12)；kras；apc。疾病可以是年龄相关的黄斑变性。与黄斑变性相关的基因可以是：abcr；ccl2；cc2；cp(血浆铜蓝蛋白)；timp3；组织蛋白酶d；vldlr；ccr2。疾病可以是精神分裂症。与精神分裂症相关的基因可以是：神经调节蛋白1(nrg1)；erb4(神经调节蛋白的受体)；复合素1(cplx1)；tph1色氨酸羟化酶；tph2(色氨酸羟化酶2)；轴突蛋白1；gsk3；gsk3a；gsk3b。病症可以与诸如以下的基因相关：5-htt(slc6a4)；comt；drd(drd1a)；slc6a3；daoa；dtnbp1；dao(dao1)。疾病可以是三核苷酸重复序列病症。三核苷酸重复序列病症可以与诸如以下的基因相关：htt(亨廷顿氏dx(huntington'sdx))；sbma/smax1/ar(肯尼迪氏dx(kennedy'sdx))；fxn/x25(弗里德利希共济失调(friedrich'sataxia))；atx3(马查多-约瑟夫氏dx(machado-joseph'sdx))；atxn1和atxn2(脊髓小脑共济失调)；dmpk(强直性肌营养不良)；atrophin-1和atn1(drpladx)；cbp(creb-bp-整体不稳定性)；vldlr(阿尔茨海默氏)；atxn7；atxn10。疾病可以是脆性x综合征。与脆性x综合征相关的基因可以是：fmr2；fxr1；fxr2；mglur5。疾病可以是与选自以下的相关基因相关的分泌酶：aph-1(α和β)；早老素(psen1)；呆蛋白、(ncstn)；pen-2；nos1；parp1；nat1；nat2。疾病可以是朊病毒相关病症，其中相关基因选自prp。疾病可以是als，其中相关基因是：sod1；als2；stex；fus；tardbp；vegf(vegf-a；vegf-b；vegf-c)。疾病可以是药物成瘾，其中相关基因是：prkce(醇)；drd2；drd4；abat(醇)；gria2；grm5；grin1；htr1b；grin2a；drd3；pdyn；gria1(醇)。疾病可以是自闭症，其中相关基因选自：mecp2；bzrap1；mdga2；sema5a；轴突蛋白1；脆性x(fmr2(aff2)；fxr1；fxr2；mglur5)。疾病可以是阿尔茨海默氏病，其中相关基因选自：e1；chip；uch；ubb；tau；lrp；picalm；丛生蛋白；ps1；sorl1；cr1；vldlr；uba1；uba3；chip28(aqp1,水通道蛋白1)；uchl1；uchl3；app。疾病可以是炎症，其中相关基因选自：il-10；il-1(il-1a；il-1b)；il-13；il-17(il-17a(ctla8)；il-17b；il-17c；il-17d；il-17f)；ii-23；cx3cr1；ptpn22；tnfa；nod2/card15(针对ibd)；il-6；il-12(il-12a；il-12b)；ctla4；cx3cl1。疾病可以是帕金森氏病(parkinson’sdisease)，其中相关基因选自：x-突触核蛋白；dj-1；lrrk2；parkin；pink1。疾病可以是血液和凝血病症：贫血症(cdan1、cda1、rps19、dba、pklr、pk1、nt5c3、umph1、psn1、rhag、rh50a、nramp2、sptb、alas2、anh1、asb、abcb7、abc7、asat)；裸淋巴细胞综合征(tapbp、tpsn、tap2、abcb3、psf2、ring11、mhc2ta、c2ta、rfx5、rfxap、rfx5)、出血病症(tbxa2r、p2rx1、p2x1)；因子h和因子h样1(hf1、cfh、hus)；因子v和因子viii(mcfd2)；因子vii缺陷症(f7)；因子x缺陷症(f10)；因子xi缺陷症(f11)；因子xii缺陷症(f12、haf)；因子xiiia缺陷症(f13a1、f13a)；因子xiiib缺陷症(f13b)；范科尼贫血(fanconianemia)(fanca、faca、fa1、fa、faa、faap95、faap90、flj34064、fancb、fancc、facc、brca2、fancd1、fancd2、fancd、facd、fad、fance、face、fancf、xrcc9、fancg、brip1、bach1、fancj、phf9、fancl、fancm、kiaa1596)；噬血细胞性淋巴组织细胞增生症病症(prf1、hplh2、unc13d、munc13-4、hplh3、hlh3、fhl3)；血友病a(f8、f8c、hema)；血友病b(f9、hemb)、出血性病症(pi、att、f5)；白细胞缺陷和病症(itgb2、cd18、lcamb、lad、eif2b1、eif2ba、eif2b2、eif2b3、eif2b5、lvwm、cach、cle、eif2b4)；镰状细胞性贫血(hbb)；地中海贫血(hba2、hbb、hbd、lcrb、hba1)。细胞失调和肿瘤疾病和病症：b细胞非霍奇金淋巴瘤(b-cellnon-hodgkinlymphoma)(bcl7a、bcl7)；白血病(tal1tcl5、scl、tal2、flt3、nbs1、nbs、znfn1a1、ik1、lyf1、hoxd4、hox4b、bcr、cml、phl、all、arnt、kras2、rask2、gmps、af10、arhgef12、larg、kiaa0382、calm、clth、cebpa、cebp、chic2、btl、flt3、kit、pbt、lpp、npm1、nup214、d9s46e、can、cain、runx1、cbfa2、aml1、whsc1l1、nsd3、flt3、af1q、npm1、numa1、znf145、plzf、pml、myl、stat5b、af10、calm、clth、arl11、arlts1、p2rx7、p2x7、bcr、cml、phl、all、graf、nf1、vrnf、wss、nfns、ptpn11、ptp2c、shp2、ns1、bcl2、ccnd1、prad1、bcl1、tcra、gata1、gf1、eryf1、nfe1、abl1、nqo1、dia4、nmor1、nup214、d9s46e、can、cain)。疾病可以是炎症和/或免疫相关的疾病和病症：aids(kir3dl1、nkat3、nkb1、amb11、kir3ds1、ifng、cxcl12、sdf1)；自身免疫性淋巴细胞增生综合征(tnfrsf6、apt1、fas、cd95、alps1a)；联合免疫缺陷、(il2rg、scidx1、scidx、imd4)；hiv-1(ccl5、scya5、d17s136e、tcp228)、hiv易感性或感染(il10、csif、cmkbr2、ccr2、cmkbr5、ccckr5(ccr5))；免疫缺陷(cd3e、cd3g、aicda、aid、higm2、tnfrsf5、cd40、ung、dgu、higm4、tnfsf5、cd40lg、higm1、igm、foxp3、ipex、aiid、xpid、pidx、tnfrsf14b、taci)；炎症(il-10、il-1(il-1a、il-1b)、il-13、il-17(il-17a(ctla8)、il-17b、il-17c、il-17d、il-17f)、ii-23、cx3cr1、ptpn22、tnfa、nod2/card15(针对ibd)、il-6、il-12(il-12a、il-12b)、ctla4、cx3cl1)；严重联合免疫缺陷(scid)(jak3、jakl、dclre1c、artemis、scida、rag1、rag2、ada、ptprc、cd45、lca、il7r、cd3d、t3d、il2rg、scidx1、scidx、imd4)。疾病可以是代谢、肝脏、肾脏和蛋白质疾病和病症：淀粉样变神经病(ttr、palb)；淀粉样变性(apoa1、app、aaa、cvap、ad1、gsn、fga、lyz、ttr、palb)；硬化(krt18、krt8、cirh1a、naic、tex292、kiaa1988)；囊性纤维化(cftr、abcc7、cf、mrp7)；糖原贮积病(slc2a2、glut2、g6pc、g6pt、g6pt1、gaa、lamp2、lampb、agl、gde、gbe1、gys2、pygl、pfkm)；肝腺瘤、142330(tcf1、hnf1a、mody3)、早发性肝衰竭和神经病症(scod1、sco1)、肝脂肪酶缺陷(lipc)、肝母细胞瘤、癌症和癌(ctnnb1、pdgfrl、pdgrl、prlts、axin1、axin、ctnnb1、tp53、p53、lfs1、igf2r、mpri、met、casp8、mch5；髓质囊性肾病(umod、hnfj、fjhn、mckd2、admckd2)；苯丙酮尿症(pah、pku1、qdpr、dhpr、pts)；多囊性肾和肝病(fcyt、pkhd1、arpkd、pkd1、pkd2、pkd4、pkdts、prkcsh、g19p1、pcld、sec63)。疾病可以是肌肉/骨骼疾病和病症：贝克肌营养不良(beckermusculardystrophy)(dmd、bmd、myf6)、杜兴氏肌营养不良(duchennemusculardystrophy)(dmd、bmd)；emery-dreifuss肌营养不良(lmna、lmn1、emd2、fpld、cmd1a、hgps、lgmd1b、lmna、lmn1、emd2、fpld、cmd1a)；面肩胛肱型肌营养不良(fshmd1a、fshd1a)；肌营养不良(fkrp、mdc1c、lgmd2i、lama2、lamm、large、kiaa0609、mdc1d、fcmd、ttid、myot、capn3、canp3、dysf、lgmd2b、sgcg、lgmd2c、dmda1、scg3、sgca、adl、dag2、lgmd2d、dmda2、sgcb、lgmd2e、sgcd、sgd、lgmd2f、cmd1l、tcap、lgmd2g、cmd1n、trim32、ht2a、lgmd2h、fkrp、mdc1c、lgmd2i、ttn、cmd1g、tmd、lgmd2j、pomt1、cav3、lgmd1c、sepn1、seln、rsmd1、plec1、pltn、ebs1)；骨硬化症(lrp5、bmnd1、lrp7、lr3、oppg、vbch2、clcn7、clc7、opta2、ostm1、gl、tcirg1、tirc7、oc116、optb1)；肌肉萎缩(vapb、vapc、als8、smn1、sma1、sma2、sma3、sma4、bscl2、spg17、gars、smad1、cmt2d、hexb、ighmbp2、smubp2、catf1、smard1)。疾病可以是神经和神经元疾病和病症：als(sod1、als2、stex、fus、tardbp、vegf(vegf-a、vegf-b、vegf-c)；阿尔茨海默氏病(app、aaa、cvap、ad1、apoe、ad2、psen2、ad4、stm2、apbb2、fe65l1、nos3、plau、urk、ace、dcp1、ace1、mpo、pacip1、paxip1l、ptip、a2m、blmh、bmh、psen1、ad3)；自闭症(mecp2、bzrap1、mdga2、sema5a、轴突蛋白1、glo1、mecp2、rtt、ppmx、mrx16、mrx79、nlgn3、nlgn4、kiaa1260、autsx2)；脆性x综合征(fmr2、fxr1、fxr2、mglur5)；亨廷顿氏病和疾病样病症(hd、it15、prnp、prip、jph3、jp3、hdl2、tbp、sca17)；帕金森氏病(nr4a2、nurr1、not、tinur、sncaip、tbp、sca17、snca、nacp、park1、park4、dj1、park7、lrrk2、park8、pink1、park6、uchl1、park5、snca、nacp、park1、park4、prkn、park2、pdj、dbh、ndufv2)；瑞特综合征(rettsyndrome)(mecp2、rtt、ppmx、mrx16、mrx79、cdkl5、stk9、mecp2、rtt、ppmx、mrx16、mrx79、x-突触核蛋白、dj-1)；精神分裂症(神经调节蛋白1(nrg1)、erb4(神经调节蛋白的受体)、复合素1(cplx1)、tph1色氨酸羟化酶、tph2(色氨酸羟化酶2)、轴突蛋白1、gsk3、gsk3a、gsk3b、5-htt(slc6a4)、comt、drd(drd1a)、slc6a3、daoa、dtnbp1、dao(dao1))；分泌酶相关病症(aph-1(α和β)、早老素(psen1)、呆蛋白、(ncstn)、pen-2、nos1、parp1、nat1、nat2)；三核苷酸重复序列病症(htt(亨廷顿氏dx)、sbma/smax1/ar(肯尼迪氏dx)、fxn/x25(弗里德利希共济失调)、atx3(马查多-约瑟夫氏dx)、atxn1和atxn2(脊髓小脑共济失调)、dmpk(强直性肌营养不良)、atrophin-1和atn1(drpladx)、cbp(creb-bp-整体不稳定性)、vldlr(阿尔茨海默氏)、atxn7、atxn10)。疾病可以是眼部疾病和/或病症：年龄相关的黄斑变性(abcr、ccl2、cc2、cp(血浆铜蓝蛋白)、timp3、组织蛋白酶d、vldlr、ccr2)；cataract(cryaa、crya1、crybb2、cryb2、pitx3、bfsp2、cp49、cp47、cryaa、crya1、pax6、an2、mgda、cryba1、cryb1、crygc、cryg3、ccl、lim2、mp19、crygd、cryg4、bfsp2、cp49、cp47、hsf4、ctm、hsf4、ctm、mip、aqp0、cryab、crya2、ctpp2、crybb1、crygd、cryg4、crybb2、cryb2、crygc、cryg3、ccl、cryaa、crya1、gja8、cx50、cae1、gja3、cx46、czp3、cae3、ccm1、cam、krit1)；角膜混浊和营养不良(apoa1、tgfbi、csd2、cdgg1、csd、bigh3、cdg2、tacstd2、trop2、m1s1、vsx1、rinx、ppcd、ppd、ktcn、col8a2、fecd、ppcd2、pip5k3、cfd)；先天性扁平角膜(kera、cna2)；青光眼(myoc、tigr、glc1a、joag、gpoa、optn、glc1e、fip2、hypl、nrp、cyp1b1、glc3a、opa1、ntg、npg、cyp1b1、glc3a)；莱伯氏先天性黑蒙(lebercongenitalamaurosis)(crb1、rp12、crx、cord2、crd、rpgrip1、lca6、cord9、rpe65、rp20、aipl1、lca4、gucy2d、guc2d、lca1、cord6、rdh12、lca3)；黄斑营养不良(elovl4、admd、stgd2、stgd3、rds、rp7、prph2、prph、avmd、aofmd、vmd2)。在一些情况下，可以用公开的编辑系统治疗的疾病可以与细胞状况有关。例如，可以用所公开的编辑系统破坏与细胞性能相关的基因：pi3k/akt信号传导；prkce；itgam；itga5；irak1；prkaa2；eif2ak2；pten；eif4e；prkcz；grk6；mapk1；tsc1；plk1；akt2；ikbkb；pik3ca；cdk8；cdkn1b；nfkb2；bcl2；pik3cb；ppp2r1a；mapk8；bcl2l1；mapk3；tsc2；itga1；kras；eif4ebp1；rela；prkcd；nos3；prkaa1；mapk9；cdk2；ppp2ca；pim1；itgb7；ywhaz；ilk；tp53；raf1；ikbkg；relb；dyrk1a；cdkn1a；itgb1；map2k2；jak1；akt1；jak2；pik3r1；chuk；pdpk1；ppp2r5c；ctnnb1；map2k1；nfkb1；pak3；itgb3；ccnd1；gsk3a；frap1；sfn；itga2；ttk；csnk1a1；braf；gsk3b；akt3；foxo1；sgk；hsp90aa1；rps6kb1。例如，erk/mapk信号传导：prkce；itgam；itga5；hspb1；irak1；prkaa2；eif2ak2；rac1；rap1a；tln1；eif4e；elk1；grk6；mapk1；rac2；plk1；akt2；pik3ca；cdk8；creb1；prkci；ptk2；fos；rps6ka4；pik3cb；ppp2r1a；pik3c3；mapk8；mapk3；itga1；ets1；kras；mycn；eif4ebp1；pparg；prkcd；prkaa1；mapk9；src；cdk2；ppp2ca；pim1；pik3c2a；itgb7；ywhaz；ppp1cc；ksr1；pxn；raf1；fyn；dyrk1a；itgb1；map2k2；pak4；pik3r1；stat3；ppp2r5c；map2k1；pak3；itgb3；esr1；itga2；myc；ttk；csnk1a1；crkl；braf；atf4；prkca；srf；stat1；sgk。糖皮质激素受体信号传导：rac1；taf4b；ep300；smad2；traf6；pcaf；elk1；mapk1；smad3；akt2；ikbkb；ncor2；ube2i；pik3ca；creb1；fos；hspa5；nfkb2；bcl2；map3k14；stat5b；pik3cb；pik3c3；mapk8；bcl2l1；mapk3；tsc22d3；mapk10；nrip1；kras；mapk13；rela；stat5a；mapk9；nos2a；pbx1；nr3c1；pik3c2a；cdkn1c；traf2；serpine1；ncoa3；mapk14；tnf；raf1；ikbkg；map3k7；crebbp；cdkn1a；map2k2；jak1；il8；ncoa2；akt1；jak2；pik3r1；chuk；stat3；map2k1；nfkb1；tgfbr1；esr1；smad4；cebpb；jun；ar；akt3；ccl2；mmp1；stat1；il6；hsp90aa1。轴突引导信号传导：prkce；itgam；rock1；itga5；cxcr4；adam12；igf1；rac1；rap1a；e1f4e；prkcz；nrp1；ntrk2；arhgef7；smo；rock2；mapk1；pgf；rac2；ptpn11；gnas；akt2；pik3ca；erbb2；prkci；ptk2；cfl1；gnaq；pik3cb；cxcl12；pik3c3；wnt11；prkd1；gnb2l1；abl1；mapk3；itga1；kras；rhoa；prkcd；pik3c2a；itgb7；gli2；pxn；vasp；raf1；fyn；itgb1；map2k2；pak4；adam17；akt1；pik3r1；gli1；wnt5a；adam10；map2k1；pak3；itgb3；cdc42；vegfa；itga2；epha8；crkl；rnd1；gsk3b；akt3；prkca。肝配蛋白受体信号传导：prkce；itgam；rock1；itga5；cxcr4；irak1；prkaa2；eif2ak2；rac1；rap1a；grk6；rock2；mapk1；pgf；rac2；ptpn11；gnas；plk1；akt2；dok1；cdk8；creb1；ptk2；cfl1；gnaq；map3k14；cxcl12；mapk8；gnb2l1；abl1；mapk3；itga1；kras；rhoa；prkcd；prkaa1；mapk9；src；cdk2；pim1；itgb7；pxn；raf1；fyn；dyrk1a；itgb1；map2k2；pak4、akt1；jak2；stat3；adam10；map2k1；pak3；itgb3；cdc42；vegfa；itga2；epha8；ttk；csnk1a1；crkl；braf；ptpn13；atf4；akt3；sgk。肌动蛋白细胞骨架信号传导：actn4；prkce；itgam；rock1；itga5；irak1；prkaa2；eif2ak2；rac1；ins；arhgef7；grk6；rock2；mapk1；rac2；plk1；akt2；pik3ca；cdk8；ptk2；cfl1；pik3cb；myh9；diaph1；pik3c3；mapk8；f2r；mapk3；slc9a1；itga1；kras；rhoa；prkcd；prkaa1；mapk9；cdk2；pim1；pik3c2a；itgb7；ppp1cc；pxn；vil2；raf1；gsn；dyrk1a；itgb1；map2k2；pak4；pip5k1a；pik3r1；map2k1；pak3；itgb3；cdc42；apc；itga2；ttk；csnk1a1；crkl；braf；vav3；sgk。亨廷顿氏病信号传导：prkce；igf1；ep300；rcor1；prkcz；hdac4；tgm2；mapk1；capns1；akt2；egfr；ncor2；sp1；capn2；pik3ca；hdac5；creb1；prkc1；hspa5；rest；gnaq；pik3cb；pik3c3；mapk8；igf1r；prkd1；gnb2l1；bcl2l1；capn1；mapk3；casp8；hdac2；hdac7a；prkcd；hdac11；mapk9；hdac9；pik3c2a；hdac3；tp53；casp9；crebbp；akt1；pik3r1；pdpk1；casp1；apaf1；frap1；casp2；jun；bax；atf4；akt3；prkca；cltc；sgk；hdac6；casp3。凋亡信号传导：prkce；rock1；bid；irak1；prkaa2；eif2ak2；bak1；birc4；grk6；mapk1；capns1；plk1；akt2；ikbkb；capn2；cdk8；fas；nfkb2；bcl2；map3k14；mapk8；bcl2l1；capn1；mapk3；casp8；kras；rela；prkcd；prkaa1；mapk9；cdk2；pim1；tp53；tnf；raf1；ikbkg；relb；casp9；dyrk1a；map2k2；chuk；apaf1；map2k1；nfkb1；pak3；lmna；casp2；birc2；ttk；csnk1a1；braf；bax；prkca；sgk；casp3；birc3；parp1。b细胞受体信号传导：rac1；pten；lyn；elk1；mapk1；rac2；ptpn11；akt2；ikbkb；pik3ca；creb1；syk；nfkb2；camk2a；map3k14；pik3cb；pik3c3；mapk8；bcl2l1；abl1；mapk3；ets1；kras；mapk13；rela；ptpn6；mapk9；egr1；pik3c2a；btk；mapk14；raf1；ikbkg；relb；map3k7；map2k2；akt1；pik3r1；chuk；map2k1；nfkb1；cdc42；gsk3a；frap1；bcl6；bcl10；jun；gsk3b；atf4；akt3；vav3；rps6kb1。白细胞血管渗出信号传导：actn4；cd44；prkce；itgam；rock1；cxcr4；cyba；rac1；rap1a；prkcz；rock2；rac2；ptpn11；mmp14；pik3ca；prkci；ptk2；pik3cb；cxcl12；pik3c3；mapk8；prkd1；abl1；mapk10；cybb；mapk13；rhoa；prkcd；mapk9；src；pik3c2a；btk；mapk14；nox1；pxn；vil2；vasp；itgb1；map2k2；ctnnd1；pik3r1；ctnnb1；cldn1；cdc42；f11r；itk；crkl；vav3；cttn；prkca；mmp1；mmp9。整合素信号传导：actn4；itgam；rock1；itga5；rac1；pten；rap1a；tln1；arhgef7；mapk1；rac2；capns1；akt2；capn2；pik3ca；ptk2；pik3cb；pik3c3；mapk8；cav1；capn1；abl1；mapk3；itga1；kras；rhoa；src；pik3c2a；itgb7；ppp1cc；ilk；pxn；vasp；raf1；fyn；itgb1；map2k2；pak4；akt1；pik3r1；tnk2；map2k1；pak3；itgb3；cdc42；rnd3；itga2；crkl；braf；gsk3b；akt3。急性期反应信号传导：irak1；sod2；myd88；traf6；elk1；mapk1；ptpn11；akt2；ikbkb；pik3ca；fos；nfkb2；map3k14；pik3cb；mapk8；ripk1；mapk3；il6st；kras；mapk13；il6r；rela；socs1；mapk9；ftl；nr3c1；traf2；serpine1；mapk14；tnf；raf1；pdk1；ikbkg；relb；map3k7；map2k2；akt1；jak2；pik3r1；chuk；stat3；map2k1；nfkb1；frap1；cebpb；jun；akt3；il1r1；il6。pten信号传导：itgam；itga5；rac1；pten；prkcz；bcl2l11；mapk1；rac2；akt2；egfr；ikbkb；cbl；pik3ca；cdkn1b；ptk2；nfkb2；bcl2；pik3cb；bcl2l1；mapk3；itga1；kras；itgb7；ilk；pdgfrb；insr；raf1；ikbkg；casp9；cdkn1a；itgb1；map2k2；akt1；pik3r1；chuk；pdgfra；pdpk1；map2k1；nfkb1；itgb3；cdc42；ccnd1；gsk3a；itga2；gsk3b；akt3；foxo1；casp3；rps6kb1。p53信号传导：pten；ep300；bbc3；pcaf；fasn；brca1；gadd45a；birc5；akt2；pik3ca；chek1；tp53inp1；bcl2；pik3cb；pik3c3；mapk8；thbs1；atr；bcl2l1；e2f1；pmaip1；chek2；tnfrsf10b；tp73；rb1；hdac9；cdk2；pik3c2a；mapk14；tp53；lrdd；cdkn1a；hipk2；akt1；pik3r1；rrm2b；apaf1；ctnnb1；sirt1；ccnd1；prkdc；atm；sfn；cdkn2a；jun；snai2；gsk3b；bax；akt3。芳烃受体信号传导：hspb1；ep300；fasn；tgm2；rxra；mapk1；nqo1；ncor2；sp1；arnt；cdkn1b；fos；chek1；smarca4；nfkb2；mapk8；aldh1a1；atr；e2f1；mapk3；nrip1；chek2；rela；tp73；gstp1；rb1；src；cdk2；ahr；nfe2l2；ncoa3；tp53；tnf；cdkn1a；ncoa2；apaf1；nfkb1；ccnd1；atm；esr1；cdkn2a；myc；jun；esr2；bax；il6；cyp1b1；hsp90aa1。异生物质代谢信号传导：prkce；ep300；prkcz；rxra；mapk1；nqo1；ncor2；pik3ca；arnt；prkci；nfkb2；camk2a；pik3cb；ppp2r1a；pik3c3；mapk8；prkd1；aldh1a1；mapk3；nrip1；kras；mapk13；prkcd；gstp1；mapk9；nos2a；abcb1；ahr；ppp2ca；ftl；nfe2l2；pik3c2a；ppargc1a；mapk14；tnf；raf1；crebbp；map2k2；pik3r1；ppp2r5c；map2k1；nfkb1；keap1；prkca；eif2ak3；il6；cyp1b1；hsp90aa1。sapk/jnk信号传导：prkce；irak1；prkaa2；eif2ak2；rac1；elk1；grk6；mapk1；gadd45a；rac2；plk1；akt2；pik3ca；fadd；cdk8；pik3cb；pik3c3；mapk8；ripk1；gnb2l1；irs1；mapk3；mapk10；daxx；kras；prkcd；prkaa1；mapk9；cdk2；pim1；pik3c2a；traf2；tp53；lck；map3k7；dyrk1a；map2k2；pik3r1；map2k1；pak3；cdc42；jun；ttk；csnk1a1；crkl；braf；sgk。ppar/rxr信号传导：prkaa2；ep300；ins；smad2；traf6；ppara；fasn；rxra；mapk1；smad3；gnas；ikbkb；ncor2；abca1；gnaq；nfkb2；map3k14；stat5b；mapk8；irs1；mapk3；kras；rela；prkaa1；ppargc1a；ncoa3；mapk14；insr；raf1；ikbkg；relb；map3k7；crebbp；map2k2；jak2；chuk；map2k1；nfkb1；tgfbr1；smad4；jun；il1r1；prkca；il6；hsp90aa1；adipoq。nf-kb信号传导：irak1；eif2ak2；ep300；ins；myd88；prkcz：traf6；tbk1；akt2；egfr；ikbkb；pik3ca；btrc；nfkb2；map3k14；pik3cb；pik3c3；mapk8；ripk1；hdac2；kras；rela；pik3c2a；traf2；tlr4:pdgfrb；tnf；insr；lck；ikbkg；relb；map3k7；crebbp；akt1；pik3r1；chuk；pdgfra；nfkb1；tlr2；bcl10；gsk3b；akt3；tnfaip3；il1r1。神经调节蛋白信号传导：erbb4；prkce；itgam；itga5：pten；prkcz；elk1；mapk1；ptpn11；akt2；egfr；erbb2；prkci；cdkn1b；stat5b；prkd1；mapk3；itga1；kras；prkcd；stat5a；src；itgb7；raf1；itgb1；map2k2；adam17；akt1；pik3r1；pdpk1；map2k1；itgb3；ereg；frap1；psen1；itga2；myc；nrg1；crkl；akt3；prkca；hsp90aa1；rps6kb1。wnt&beta连环蛋白信号传导：cd44；ep300；lrp6；dvl3；csnk1e；gja1；smo；akt2；pin1；cdh1；btrc；gnaq；mark2；ppp2r1a；wnt11；src；dkk1；ppp2ca；sox6；sfrp2：ilk；lef1；sox9；tp53；map3k7；crebbp；tcf7l2；akt1；ppp2r5c；wnt5a；lrp5；ctnnb1；tgfbr1；ccnd1；gsk3a；dvl1；apc；cdkn2a；myc；csnk1a1；gsk3b；akt3；sox2。胰岛素受体信号传导：pten；ins；eif4e；ptpn1；prkcz；mapk1；tsc1；ptpn11；akt2；cbl；pik3ca；prkci；pik3cb；pik3c3；mapk8；irs1；mapk3；tsc2；kras；eif4ebp1；slc2a4；pik3c2a；ppp1cc；insr；raf1；fyn；map2k2；jak1；akt1；jak2；pik3r1；pdpk1；map2k1；gsk3a；frap1；crkl；gsk3b；akt3；foxo1；sgk；rps6kb1。il-6信号传导：hspb1；traf6；mapkapk2；elk1；mapk1；ptpn11；ikbkb；fos；nfkb2：map3k14；mapk8；mapk3；mapk10；il6st；kras；mapk13；il6r；rela；socs1；mapk9；abcb1；traf2；mapk14；tnf；raf1；ikbkg；relb；map3k7；map2k2；il8；jak2；chuk；stat3；map2k1；nfkb1；cebpb；jun；il1r1；srf；il6。肝脏胆汁淤积：prkce；irak1；ins；myd88；prkcz；traf6；ppara；rxra；ikbkb；prkci；nfkb2；map3k14；mapk8；prkd1；mapk10；rela；prkcd；mapk9；abcb1；traf2；tlr4；tnf；insr；ikbkg；relb；map3k7；il8；chuk；nr1h2；tjp2；nfkb1；esr1；srebf1；fgfr4；jun；il1r1；prkca；il6。igf-1信号传导：igf1；prkcz；elk1；mapk1；ptpn11；nedd4；akt2；pik3ca；prkci；ptk2；fos；pik3cb；pik3c3；mapk8；igf1r；irs1；mapk3；igfbp7；kras；pik3c2a；ywhaz；pxn；raf1；casp9；map2k2；akt1；pik3r1；pdpk1；map2k1；igfbp2；sfn；jun；cyr61；akt3；foxo1；srf；ctgf；rps6kb1。nrf2-介导的氧化应激反应：prkce；ep300；sod2；prkcz；mapk1；sqstm1；nqo1；pik3ca；prkci；fos；pik3cb；pik3c3；mapk8；prkd1；mapk3；kras；prkcd；gstp1；mapk9；ftl；nfe2l2；pik3c2a；mapk14；raf1；map3k7；crebbp；map2k2；akt1；pik3r1；map2k1；ppib；jun；keap1；gsk3b；atf4；prkca；eif2ak3；hsp90aa1。肝纤维化/肝星状细胞激活：edn1；igf1；kdr；flt1；smad2；fgfr1；met；pgf；smad3；egfr；fas；csf1；nfkb2；bcl2；myh9；igf1r；il6r；rela；tlr4；pdgfrb；tnf；relb；il8；pdgfra；nfkb1；tgfbr1；smad4；vegfa；bax；il1r1；ccl2；hgf；mmp1；stat1；il6；ctgf；mmp9。ppar信号传导：ep300；ins；traf6；ppara；rxra；mapk1；ikbkb；ncor2；fos；nfkb2；map3k14；stat5b；mapk3；nrip1；kras；pparg；rela；stat5a；traf2；ppargc1a；pdgfrb；tnf；insr；raf1；ikbkg；relb；map3k7；crebbp；map2k2；chuk；pdgfra；map2k1；nfkb1；jun；il1r1；hsp90aa1。fcεri信号传导：prkce；rac1；prkcz；lyn；mapk1；rac2；ptpn11；akt2；pik3ca；syk；prkci；pik3cb；pik3c3；mapk8；prkd1；mapk3；mapk10；kras；mapk13；prkcd；mapk9；pik3c2a；btk；mapk14；tnf；raf1；fyn；map2k2；akt1；pik3r1；pdpk1；map2k1；akt3；vav3；prkca。g-蛋白偶联受体信号传导：prkce；rap1a；rgs16；mapk1；gnas；akt2；ikbkb；pik3ca；creb1；gnaq；nfkb2；camk2a；pik3cb；pik3c3；mapk3；kras；rela；src；pik3c2a；raf1；ikbkg；relb；fyn；map2k2；akt1；pik3r1；chuk；pdpk1；stat3；map2k1；nfkb1；braf；atf4；akt3；prkca，磷酸肌醇代谢：prkce；irak1；prkaa2；eif2ak2；pten；grk6；mapk1；plk1；akt2；pik3ca；cdk8；pik3cb；pik3c3；mapk8；mapk3；prkcd；prkaa1；mapk9；cdk2；pim1；pik3c2a；dyrk1a；map2k2；pip5k1a；pik3r1；map2k1；pak3；atm；ttk；csnk1a1；braf；sgk。pdgf信号传导：eif2ak2；elk1；abl2；mapk1；pik3ca；fos；pik3cb；pik3c3；mapk8；cav1；abl1；mapk3；kras；src；pik3c2a；pdgfrb；raf1；map2k2；jak1；jak2；pik3r1；pdgfra；stat3；sphk1；map2k1；myc；jun；crkl；prkca；srf；stat1；sphk2。vegf信号传导：actn4；rock1；kdr；flt1；rock2；mapk1；pgf；akt2；pik3ca；arnt；ptk2；bcl2；pik3cb；pik3c3；bcl2l1；mapk3；kras；hif1a；nos3；pik3c2a；pxn；raf1；map2k2；elavl1；akt1；pik3r1；map2k1；sfn；vegfa；akt3；foxo1；prkca。天然杀伤细胞信号传导：prkce；rac1；prkcz；mapk1；rac2；ptpn11；kir2dl3；akt2；pik3ca；syk；prkci；pik3cb；pik3c3；prkd1；mapk3；kras；prkcd；ptpn6；pik3c2a；lck；raf1；fyn；map2k2；pak4；akt1；pik3r1；map2k1；pak3；akt3；vav3；prkca。细胞周期：g1/s检查点调控：hdac4；smad3；suv39h1；hdac5；cdkn1b；btrc；atr；abl1；e2f1；hdac2；hdac7a；rb1；hdac11；hdac9；cdk2；e2f2；hdac3；tp53；cdkn1a；ccnd1；e2f4；atm；rbl2；smad4；cdkn2a；myc；nrg1；gsk3b；rbl1；hdac6。t细胞受体信号传导：rac1；elk1；mapk1；ikbkb；cbl；pik3ca；fos；nfkb2；pik3cb；pik3c3；mapk8；mapk3；kras；rela、pik3c2a；btk；lck；raf1；ikbkg；relb、fyn；map2k2；pik3r1；chuk；map2k1；nfkb1；itk；bcl10；jun；vav3。死亡受体信号传导：cradd；hspb1；bid；birc4；tbk1；ikbkb；fadd；fas；nfkb2；bcl2；map3k14；mapk8；ripk1；casp8；daxx；tnfrsf10b；rela；traf2；tnf；ikbkg；relb；casp9；chuk；apaf1；nfkb1；casp2；birc2；casp3；birc3。fgf信号传导：rac1；fgfr1；met；mapkapk2；mapk1；ptpn11；akt2；pik3ca；creb1；pik3cb；pik3c3；mapk8；mapk3；mapk13；ptpn6；pik3c2a；mapk14；raf1；akt1；pik3r1；stat3；map2k1；fgfr4；crkl；atf4；akt3；prkca；hgf。gm-csf信号传导：lyn；elk1；mapk1；ptpn11；akt2；pik3ca；camk2a；stat5b；pik3cb；pik3c3；gnb2l1；bcl2l1；mapk3；ets1；kras；runx1；pim1；pik3c2a；raf1；map2k2；akt1；jak2；pik3r1；stat3；map2k1；ccnd1；akt3；stat1。肌萎缩性脊髓侧索硬化症信号传导：bid；igf1；rac1；birc4；pgf；capns1；capn2；pik3ca；bcl2；pik3cb；pik3c3；bcl2l1；capn1；pik3c2a；tp53；casp9；pik3r1；rab5a；casp1；apaf1；vegfa；birc2；bax；akt3；casp3；birc3。jak/stat信号传导：ptpn1；mapk1；ptpn11；akt2；pik3ca；stat5b；pik3cb；pik3c3；mapk3；kras；socs1；stat5a；ptpn6；pik3c2a；raf1；cdkn1a；map2k2；jak1；akt1；jak2；pik3r1；stat3；map2k1；frap1；akt3；stat1。烟酸和烟酰胺代谢：prkce；irak1；prkaa2；eif2ak2；grk6；mapk1；plk1；akt2；cdk8；mapk8；mapk3；prkcd；prkaa1；pbef1；mapk9；cdk2；pim1；dyrk1a；map2k2；map2k1；pak3；nt5e；ttk；csnk1a1；braf；sgk。趋化因子信号传导：cxcr4；rock2；mapk1；ptk2；fos；cfl1；gnaq；camk2a；cxcl12；mapk8；mapk3；kras；mapk13；rhoa；ccr3；src；ppp1cc；mapk14；nox1；raf1；map2k2；map2k1；jun；ccl2；prkca。il-2信号传导：elk1；mapk1；ptpn11；akt2；pik3ca；syk；fos；stat5b；pik3cb；pik3c3；mapk8；mapk3；kras；socs1；stat5a；pik3c2a；lck；raf1；map2k2；jak1；akt1；pik3r1；map2k1；jun；akt3。突触长期抑郁：prkce；igf1；prkcz；prdx6；lyn；mapk1；gnas；prkci；gnaq；ppp2r1a；igf1r；prkd1；mapk3；kras；grn；prkcd；nos3；nos2a；ppp2ca；ywhaz；raf1；map2k2；ppp2r5c；map2k1；prkca。雌激素受体信号传导：taf4b；ep300；carm1；pcaf；mapk1；ncor2；smarca4；mapk3；nrip1；kras；src；nr3c1；hdac3；ppargc1a；rbm9；ncoa3；raf1；crebbp；map2k2；ncoa2；map2k1；prkdc；esr1；esr2。蛋白质泛素化途径：traf6；smurf1；birc4；brca1；uchl1；nedd4；cbl；ube2i；btrc；hspa5；usp7；usp10；fbxw7；usp9x；stub1；usp22；b2m；birc2；park2；usp8；usp1；vhl；hsp90aa1；birc3。il-10信号传导：traf6；ccr1；elk1；ikbkb；sp1；fos；nfkb2；map3k14；mapk8；mapk13；rela；mapk14；tnf；ikbkg；relb；map3k7；jak1；chuk；stat3；nfkb1；jun；il1r1；il6。vdr/rxr激活：prkce；ep300；prkcz；rxra；gadd45a；hes1；ncor2；sp1；prkci；cdkn1b；prkd1；prkcd；runx2；klf4；yy1；ncoa3；cdkn1a；ncoa2；spp1；lrp5；cebpb；foxo1；prkca。tgf-β信号传导：ep300；smad2；smurf1；mapk1；smad3；smad1；fos；mapk8；mapk3；kras；mapk9；runx2；serpine1；raf1；map3k7；crebbp；map2k2；map2k1；tgfbr1；smad4；jun；smad5。toll样受体信号传导：irak1；eif2ak2；myd88；traf6；ppara；elk1；ikbkb；fos；nfkb2；map3k14；mapk8；mapk13；rela；tlr4；mapk14；ikbkg；relb；map3k7；chuk；nfkb1；tlr2；jun。p38mapk信号传导：hspb1；irak1；traf6；mapkapk2；elk1；fadd；fas；creb1；ddit3；rps6ka4；daxx；mapk13；traf2；mapk14；tnf；map3k7；tgfbr1；myc；atf4；il1r1；srf；stat1。神经营养因子/trk信号传导：ntrk2；mapk1；ptpn11；pik3ca；creb1；fos；pik3cb；pik3c3；mapk8；mapk3；kras；pik3c2a；raf1；map2k2；akt1；pik3r1；pdpk1；map2k1；cdc42；jun；atf4。fxr/rxr激活：ins；ppara；fasn；rxra；akt2；sdc1；mapk8；apob；mapk10；pparg；mttp；mapk9；ppargc1a；tnf；crebbp；akt1；srebf1；fgfr4；akt3；foxo1。突触长期增强：prkce；rap1a；ep300；prkcz；mapk1；creb1；prkci；gnaq；camk2a；prkd1；mapk3；kras；prkcd；ppp1cc；raf1；crebbp；map2k2；map2k1；atf4；prkca。钙信号传导：rap1a；ep300；hdac4；mapk1；hdac5；creb1；camk2a；myh9；mapk3；hdac2；hdac7a；hdac11；hdac9；hdac3；crebbp；calr；camkk2；atf4；hdac6。egf信号传导：elk1；mapk1；egfr；pik3ca；fos；pik3cb；pik3c3；mapk8；mapk3；pik3c2a；raf1；jak1；pik3r1；stat3；map2k1；jun；prkca；srf；stat1。心血管系统中缺氧信号传导：edn1；pten；ep300；nqo1；ube2i；creb1；arnt；hif1a；slc2a4；nos3；tp53；ldha；akt1；atm；vegfa；jun；atf4；vhl；hsp90aa1。lps/il-1介导的rxr功能lxr/rxr激活的抑制：irak1；myd88；traf6；ppara；rxra；abca1、mapk8；aldh1a1；gstp1；mapk9；abcb1；traf2；tlr4；tnf；map3k7；nr1h2；srebf1；jun；il1r1fasn；rxra；ncor2；abca1；nfkb2；irf3；rela；nos2a；tlr4；tnf；relb；ldlr；nr1h2；nfkb1；srebf1；il1r1；ccl2；il6；mmp9。淀粉样蛋白加工：prkce；csnk1e；mapk1；capns1；akt2；capn2；capn1；mapk3；mapk13；mapt；mapk14；akt1；psen1；csnk1a1；gsk3b；akt3；app。il-4信号传导：akt2；pik3ca；pik3cb；pik3c3；irs1；kras；socs1；ptpn6；nr3c1；pik3c2a；jak1；akt1；jak2；pik3r1；frap1；akt3；rps6kb1。细胞周期：g2/mdna损伤检查点调控：ep300；pcaf；brca1；gadd45a；plk1；btrc；chek1；atr；chek2；ywhaz；tp53；cdkn1a；prkdc；atm；sfn；cdkn2a。心血管系统中的一氧化氮信号传导：kdr；flt1；pgf；akt2；pik3ca；pik3cb；pik3c3；cav1；prkcd；nos3；pik3c2a；akt1；pik3r1；vegfa；akt3；hsp90aa1。嘌呤代谢：nme2；smarca4；myh9；rrm2；adar；eif2ak4；pkm2；entpd1；rad51；rrm2b；tjp2；rad51c；nt5e；pold1；nme1。camp介导的信号传导：rap1a；mapk1；gnas；creb1；camk2a；mapk3；src；raf1；map2k2；stat3；map2k1；braf；atf4。线粒体功能障碍notch信号传导：sod2；mapk8；casp8；mapk10；mapk9；casp9；park7；psen1；park2；app；casp3hes1；jag1；numb；notch4；adam17；notch2；psen1；notch3；notch1；dll4。内质网应激途径：hspa5；mapk8；xbp1；traf2；atf6；casp9；atf4；eif2ak3；casp3。嘧啶代谢：nme2；aicda；rrm2；eif2ak4；entpd1；rrm2b；nt5e；pold1；nme1。帕金森氏信号传导：uchl1；mapk8；mapk13；mapk14；casp9；park7；park2；casp3。心脏和β肾上腺素能信号传导：gnas；gnaq；ppp2r1a；gnb2l1；ppp2ca；ppp1cc；ppp2r5c。醣酵解/糖异生：hk2；gck；gpi；aldh1a1；pkm2；ldha；hk1。干扰素信号传导：irf1；socs1；jak1；jak2；ifitm1；stat1；ifit3。音猬因子信号传导：arrb2；smo；gli2；dyrk1a；gli1；gsk3b；dyrkib。甘油磷脂代谢：pld1；grn；gpam；ywhaz；sphk1；sphk2。磷脂降解：prdx6；pld1；grn；ywhaz；sphk1；sphk2。色氨酸代谢：siah2；prmt5；nedd4；aldh1a1；cyp1b1；siah1。赖氨酸降解：suv39h1；ehmt2；nsd1；setd7；ppp2r5c。核苷酸切除修复途径：ercc5；ercc4；xpa；xpc；ercc1。淀粉和蔗糖代谢：uchl1；hk2；gck；gpi；hk1。氨基糖代谢：nqo1；hk2；gck；hk1。花生四烯酸代谢：prdx6；grn；ywhaz；cyp1b1。昼夜节律信号传导：csnk1e；creb1；atf4；nr1d1。凝血系统：bdkrb1；f2r；serpine1；f3。多巴胺受体信号传导：ppp2r1a；ppp2ca；ppp1cc；ppp2r5c。谷胱甘肽代谢：idh2；gstp1；anpep；idh1。甘油脂代谢：aldh1a1；gpam；sphk1；sphk2。亚油酸代谢：prdx6；grn；ywhaz；cyp1b1。蛋氨酸代谢：dnmt1；dnmt3b；ahcy；dnmt3a。丙酮酸代谢：glo1；aldh1a1；pkm2；ldha。精氨酸和脯氨酸代谢：aldh1a1；nos3；nos2a。类二十烷酸信号传导：prdx6；grn；ywhaz。果糖和甘露糖代谢：hk2；gck；hk1。半乳糖代谢：hk2；gck；hk1。芪、香豆素和木质素生物合成：prdx6；prdx1；tyr。抗原呈递途径：calr；b2m。类固醇的生物合成：nqo1；dhcr7。丁酸代谢：aldh1a1；nlgn1。柠檬酸循环：idh2；idh1。脂肪酸代谢：aldh1a1；cyp1b1。甘油磷脂代谢：prdx6；chka。组氨酸代谢：prmt5；aldh1a1。肌醇代谢：ero1l；apex1。细胞色素p450对异生物质的代谢：gstp1；cyp1b1。甲烷代谢：prdx6；prdx1。苯丙氨酸代谢：prdx6；prdx1。丙酸代谢：aldh1a1；ldha。硒基氨基酸代谢：prmt5；ahcy。鞘脂代谢：sphk1；sphk2。氨基膦酸代谢：prmt5。雄激素和雌激素代谢：prmt5。抗坏血酸和醛糖二酸(aldarate)代谢：aldh1a1。胆汁酸生物合成：aldh1a1。半胱氨酸代谢：ldha。脂肪酸生物合成：fasn。谷氨酸受体信号传导：gnb2l1。nrf2介导的氧化应激反应：prdx1。磷酸戊糖途径：gpi。戊糖和葡糖醛酸的相互转化：uchl1。视黄醇代谢：aldh1a1。核黄素代谢：tyr。酪氨酸代谢：prmt5、tyr。泛醌生物合成：prmt5。缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解：aldh1a1。甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢：chka。赖氨酸降解：aldh1a1。疼痛/味觉：trpm5；trpa1。疼痛：trpm7；trpc5；trpc6；trpc1；cnr1；cnr2；grk2；trpa1；pomc；cgrp；crf；pka；era；nr2b；trpm5；prkaca；prkacb；prkar1a；prkar2a。线粒体功能：aif；cytc；smac(diablo)；aifm-1；aifm-2。发展性神经病(developmentalneurology)：bmp-4；腱蛋白(chrd)；头蛋白(nog)；wnt(wnt2；wnt2b；wnt3a；wnt4；wnt5a；wnt6；wnt7b；wnt8b；wnt9a；wnt9b；wnt10a；wnt10b；wnt16)；β-连环蛋白；dkk-1；卷曲相关蛋白；otx-2；gbx2；fgf-8；reelin；dab1；unc-86(pou4fl或brn3a)；numb；reln。在一些情况下，编辑系统可以用于提高免疫细胞性能。参与癌症或肿瘤阻抑的基因的实例可以包括例如atm(共济失调毛细血管扩张突变)、atr(共济失调毛细血管扩张和rad3相关性)、egfr(表皮生长因子受体)、erbb2(v-erb-b2成红细胞白血病病毒癌基因同源物2)、erbb3(v-erb-b2成红细胞白血病病毒癌基因同源物3)、erbb4(v-erb-b2成红细胞白血病病毒癌基因同源物4)、notch1、notch2、notch3或notch4。与分泌酶病症相关的基因和蛋白还可被破坏或引入并且可以包括psenen(早老素增强子2同源物(秀丽隐杆线虫))、ctsb(组织蛋白酶b)、psen1(早老素1)、app(淀粉样蛋白β(a4)前体蛋白)。aph1b(前咽缺陷1同源物b(秀丽隐杆线虫))、psen2(早老素2(阿尔茨海默病4))或bace1(β-位点app-切割酶1)。预期覆盖了在该应用内的基因的遗传同源物(如，基因的任何哺乳动物形式)。例如，可以被靶向的基因还可以包括cd27、cd40、cd122、ox40、gitr、cd137、cd28、icos、a2ar、b7-h3、b7-h4、btla、ctla-4、ido、kir、lag3、pd-1、tim-3、vista、hprt、ccr5、aavssite(如aavs1、aavs2、etc.)、ppp1r12c、trac、tcrb或cish。因此，预期可破坏表现出或表现出约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性(在核酸或蛋白质水平)的上述基因中的任一种。还预期可破坏表现出或表现出约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性(在核酸或蛋白质水平)的前述基因中的任一种。一些遗传同源物是本领域已知的，然而，在一些情况下，同源物是未知的。然而，哺乳动物之间的同源基因可以通过使用公开获得的数据库(如ncbiblast)比较核酸(dna或rna)序列或蛋白序列来发现。本文还公开了上述基因中任一种的非人类基因等同物。可以用本文公开的基因编辑系统破坏上述基因中任一种的非人类等同物。可以将引导rna作为rna分子引入细胞或胚胎中。例如，rna分子可以在体外转录和/或可以化学合成。然后可以将引导rna作为rna分子引入细胞或胚胎中。引导rna也可以以非rna核酸分子如dna分子的形式引入细胞或胚胎中。例如，可以将编码引导rna的dna与启动子控制序列可操作地连接，以在目标细胞或胚胎中表达引导rna。rna编码序列可以与rna聚合酶iii(poliii)识别的启动子序列可操作地连接。编码引导rna或引导dna的核酸可以是线性的。编码引导rna或引导dna的核酸也可以是环状的。编码引导多核酸的核酸也可以是载体的一部分。载体的一些实例可以包括质粒载体、噬菌粒、粘粒、人工/微型染色体、转座子和病毒载体。例如，编码rna引导的核酸内切酶的dna在质粒载体中存在。适合的质粒载体的其他非限制性实例包括puc、pbr322、pet、pbluescript及其变体。此外，载体可以包含另外的表达控制序列(如，增强子序列、kozak序列、聚腺苷酸化序列、转录终止序列等)、选择标志物序列(如，抗生素抗性基因)、复制起点等。用于引入引导多核酸、蛋白质或引导多核酸：核酸酶复合物的适合方法是本领域已知的，并且包括例如电穿孔；磷酸钙沉淀；或pei、peg、deae、纳米颗粒或脂质体介导的转化。其他适合的转染方法包括直接显微注射。在一些情况下，分别引入引导多核酸和核酸酶，并在细胞中形成引导多核酸：核酸酶复合物。在其他情况下，可以形成引导多核酸：核酸酶复合物，然后将其引入细胞中。在一些情况下，形成了多种差异标记的引导多核酸：核酸酶复合物(每种针对不同的基因组靶标)，然后将其引入细胞中。当将核酸引导的核酸酶和引导多核酸都引入细胞时，它们各自可以是单独分子的一部分(如，一个载体含有融合蛋白编码序列并且第二载体含有引导多核酸编码序列)，或者两者可以是同一分子的一部分(如，一个载体含有融合蛋白和引导多核酸两者的编码(和调控)序列)。在一些情况下，可以将核酸酶与引导多核酸预复合。复合物可以是核糖核蛋白(rnp)复合物。在一些情况下，可以进行guide-seq分析，以确定工程化的引导多核苷酸的特异性。tsai,s.等人,“guide-seqenablesgenome-wideprofilingofoff-targetcleavagebycrisprsystemnucleases,”nature,33:187-197(2015)中讨论了通过crispr系统核酸酶进行脱靶切割的guide-seq谱分析(profiling)的一般机制和方案。可以以任何功能浓度引入引导多核酸。例如，可以将引导多核酸以10微克引入细胞。在其他情况下，可以引入0.5微克至100微克的引导多核酸。可以引入0.5、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100微克的grna。引导多核苷酸的序列不必与其待特异性可杂交或可杂交的靶核酸的序列100％互补。此外，引导多核酸可在一个或多个区段上杂交，使得插入或或相邻区段(如，环结构或发夹结构)不参与杂交事件。例如，多核苷酸可以包含其将杂交的靶核酸序列内的靶区域的60％或更多、65％或更多、70％或更多、75％或更多、80％或更多、85％或更多、90％或更多、95％或更多、98％或更多、99％或更多、99.5％或100％的序列互补性。例如，反义核酸将代表90％的互补性，在所述反义核酸中，反义化合物的20个核苷酸中的18个与靶区域互补并且因此将特异性杂交。在该实例中，剩余的非互补核苷酸可以与互补核苷酸成簇或散布，并且不需要彼此相邻或与互补核苷酸相邻。可以使用任何方便的方法确定核酸内特定核酸序列链段之间的互补性百分比。示例性方法包括blast程序(基本局部比对搜索工具)和powerblast程序(altschul等人,j.mol.biol.,1990,215,403-410；zhang和madden,genomeres.,1997,7,649-656)或通过使用gap程序(威斯康星序列分析包(wisconsinsequenceanalysispackage),用于unix的版本8,geneticscomputergroup,universityresearchpark,madisonwis.)，使用默认设置，所述gap程序使用smith和waterman算法(adv.appl.math.,1981,2,482-489)。引导多核酸可以靶向基因或其部分。在一些情况下，修饰的细胞可以包含一个或多个阻抑的、破坏的或敲除的基因以及一个或多个转基因，如受体。本文所述的方法和组合物可以用于靶向来自哺乳动物的基因。可以被靶向的基因可以来自任何器官或组织。可以被靶向的基因可以来自例如皮肤、眼睛、心脏、肝脏、肺、肾脏、生殖道、脑。可以被靶向的基因也可以来自多种病况和疾病在一些情况下，破坏可导致经破坏的基因或其部分的基因组转录物的拷贝数减少。例如，与未破坏的细胞中的相同靶基因相比，可以被破坏的靶基因可以具有减少的转录物量。破坏可以导致破坏结果小于145个拷贝/μl、140个拷贝/μl、135个拷贝/μl、130个拷贝/μl、125个拷贝/μl、120个拷贝/μl、115个拷贝/μl、110个拷贝/μl、105个拷贝/μl、100个拷贝/μl、95个拷贝/μl、190个拷贝/μl、185个拷贝/μl、80个拷贝/μl、75个拷贝/μl、70个拷贝/μl、65个拷贝/μl、60个拷贝/μl、55个拷贝/μl、50个拷贝/μl、45个拷贝/μl、40个拷贝/μl、35个拷贝/μl、30个拷贝/μl、25个拷贝/μl、20个拷贝/μl、15个拷贝/μl、10个拷贝/μl、5个拷贝/μl、1个拷贝/μl或0.05个拷贝/μl。在一些情况下，破坏可以导致小于100个拷贝/μl。可使用任何方法敲除或破坏细胞中的一个或多个基因。例如，敲除一个或多个基因可以包括从细胞的基因组中缺失一个或多个基因。敲除还可以包括从细胞中去除全部或部分的基因序列。还预期敲除可以包括用一个或多个核苷酸替换细胞基因组中的全部或部分基因。敲除一个或多个基因还可以包括在一个或多个基因中插入序列，从而破坏一个或多个基因的表达。例如，插入序列可以在一个或多个基因的中间生成终止密码子。插入序列也可以移动一个或多个基因的开放阅读框。动物或细胞可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个编码与疾病相关的蛋白质的破坏的基因组序列，和0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个编码与疾病相关的蛋白质的基因组整合序列。递送至细胞中可通过任何适合的手段将本文所述的rhdc和核酸解旋剂、编码其的多核苷酸和/或任何转基因多核苷酸和包含所述多肽和/或多核苷酸的组合物递送至靶细胞。适合的细胞可以包括但不限于真核和原核细胞和/或细胞系。适合的细胞可以是人原代细胞。原代细胞可以直接取自活组织(即活检材料)并建立用于体外生长，与连续的致瘤或人工永生化细胞系相比，其经历了极少的群体倍增并因此更能代表它们所来源的组织的主要功能组分和特征。原代细胞可获自多种来源，如器官、脉管系统、血沉棕黄层(buffycoat)、全血、单采(apheresis)、血浆、骨髓、肿瘤、细胞库、冷冻保存库或血液样品。原代细胞可以是干细胞。可以用包含ranseh样结构域的基因组编辑系统编辑的适合细胞可以是上皮细胞、成纤维细胞、神经细胞、角质形成细胞、造血细胞、黑色素细胞、软骨细胞、淋巴细胞(b、nk和t)、巨噬细胞、单核细胞、单个核细胞、心肌细胞、其他肌肉细胞、颗粒细胞、卵丘细胞、表皮细胞、内皮细胞、胰岛细胞、血液细胞、血液前体细胞、骨细胞、骨前体细胞、神经元干细胞、始基干细胞、肝细胞、角质形成细胞、脐静脉内皮细胞、主动脉内皮细胞、微血管内皮细胞、成纤维细胞、肝星状细胞、主动脉平滑肌细胞、心肌细胞、神经元、库普弗细胞(kupffercells)、平滑肌细胞、施万恩细胞(schwanncells)和上皮细胞、红细胞、血小板、嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、脂肪细胞、软骨细胞、胰岛细胞、甲状腺细胞、甲状旁腺细胞、腮腺细胞、肿瘤细胞、胶质细胞、星形细胞、红细胞、白细胞、巨噬细胞、上皮细胞、体细胞、垂体细胞、肾上腺细胞、毛细胞、膀胱细胞、肾细胞、视网膜细胞、杆状细胞、圆锥细胞、心脏细胞、起搏细胞、脾细胞、抗原呈递细胞、记忆细胞、t细胞、b细胞、浆细胞、肌肉细胞、卵巢细胞、子宫细胞、前列腺细胞、阴道上皮细胞、精细胞、睾丸细胞、生殖细胞、卵细胞、莱迪希细胞(leydigcells)、管周细胞、塞尔托利细胞、黄体细胞、宫颈细胞、子宫内膜细胞、乳腺细胞、卵泡细胞、粘液细胞、纤毛细胞、非角化上皮细胞、角化上皮细胞、肺细胞、杯状细胞、柱状上皮细胞、多巴能细胞、鳞状上皮细胞、骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、多巴胺能细胞、胚胎干细胞、成纤维细胞和胎儿成纤维细胞。此外，一个或多个细胞可以是胰岛细胞和/或细胞簇等，包括但不限于胰腺α细胞、胰腺β细胞、胰腺δ细胞、胰腺f细胞(如pp细胞)或胰腺ε细胞。在一种情况下，一个或多个细胞可以是胰腺α细胞。在另一种情况下，一个或多个细胞可以是胰腺β细胞。人原代细胞可以是免疫细胞。免疫细胞可以是t细胞、b细胞、nk细胞和/或til。此类细胞或由此类细胞生成的细胞系的非限制性实例包括cos、cho(如cho-s、cho-k1、cho-dg44、cho-duxb11、cho-dukx、chok1sv)、vero、mdck、wi38、v79、b14af28-g3、bhk、hak、nso、sp2/0-ag14、hela、hek293(如hek293-f、hek293-h、hek293-t)和perc6细胞以及昆虫细胞如草地贪夜蛾(spodopterafugiperda，sf)，或真菌细胞如酵母(saccharomyces)、毕赤酵母(pichia)和裂殖酵母(schizosaccharomyces)。在一些情况下，细胞系可以是cho-k1、mdck或hek293细胞系。在一些情况下，适合的原代细胞包括外周血单核细胞(pbmc)、外周血淋巴细胞(pbl)和其他血细胞亚群，如但不限于t细胞、自然杀伤细胞、单核细胞、自然杀伤t细胞、单核细胞-前体细胞、造血干细胞或非多能干细胞。在一些情况下，细胞可以是任何免疫细胞，包括任何t细胞如肿瘤浸润细胞(til)，如cd3+t细胞、cd4+t细胞、cd8+t细胞或任何其他类型的t细胞。t细胞还可以包括记忆t细胞、记忆干t细胞或效应t细胞。t细胞也可以选自大量群体，例如，选择来自全血的t细胞。t细胞也可以从大量群体中扩增。t细胞也可以偏向特定群体和表型。例如，t细胞可以从表型上偏向包括cd45ro(-)、ccr7(+)、cd45ra(+)、cd62l(+)、cd27(+)、cd28(+)和/或il-7rα(+)。可以选择适合的细胞，其包含选自包括以下列表的一种或多种标志物：cd45ro(-)、ccr7(+)、cd45ra(+)、cd62l(+)、cd27(+)、cd28(+)和/或il-7rα(+)。适合的细胞还包括干细胞，诸如例如胚胎干细胞、诱导的多能干细胞、造血干细胞、神经元干细胞和间充质干细胞。适合的细胞可以包含任何数量的原代细胞，如人细胞、非人细胞和/或小鼠细胞。适合的细胞可以是祖细胞。适合的细胞可以源自待治疗的对象(如，对象)。适合的细胞可以源自人供体。适合的细胞可以是包含cd45ro(-)、ccr7(+)、cd45ra(+)、cd62l+(l-选择素)、cd27+、cd28+和il-7rα+的记忆性干细胞样tscm细胞，记忆性干细胞(stemmemorycells)还可表达cd95、il-2rβ、cxcr3和lfa-1，并且显示出记忆性干细胞特有的多种功能特性。适合的细胞可以是包含l-选择素和ccr7的中央记忆tcm细胞，中央记忆细胞可以分泌例如il-2，但不分泌ifnγ或il-4。适合的细胞也可以是包含l-选择素或ccr7的效应记忆tem细胞，并产生例如效应细胞因子，如ifnγ和il-4。在一些情况下，修饰的细胞可以是包含cd45ro(-)、ccr7(+)、cd45ra(+)、cd62l+(l-选择素)、cd27+、cd28+和il-7rα+的记忆性干细胞样tscm细胞，记忆性干细胞还可表达cd95、il-2rβ、cxcr3和lfa-1，并且显示出记忆性干细胞特有的多种功能特性。工程化的细胞，如rhdc多肽修饰的细胞，也可以是包含l-选择素和ccr7的中央记忆tcm细胞，其中中央记忆细胞可以分泌例如il-2，但不分泌ifnγ或il-4。工程化的细胞也可以是包含l-选择素或ccr7的效应记忆tem细胞，并产生例如效应细胞因子，如ifnγ和il-4。在一些情况下，可以将细胞群体引入对象。例如，细胞群体可以是t细胞和nk细胞的组合。在其他情况下，群体可以是初始细胞和效应细胞的组合。获得适合细胞如人原代细胞的方法可以包括选择细胞。在一些情况下，细胞可以包含可以选择该细胞的标志物。例如，此类标志物可以包括gfp、抗性基因、细胞表面标志物、内源性标签。可以使用任何内源性标志物选择细胞。可以使用任何技术选择适合的细胞。此类技术可以包括流式细胞术和/或磁柱。然后可以将选择的细胞输注至对象中。也可将选择的细胞扩增至大的数量。可以在输注之前扩增选择的细胞。在一些情况下，适合的细胞可以是重组细胞。重组细胞可以是永生化细胞系。细胞系可以是：cho-k1细胞；hek293细胞；caco2细胞；u2-os细胞；nih3t3细胞；nso细胞；sp2细胞；cho-s细胞；dg44细胞；k-562细胞、u-937细胞；mrc5细胞；imr90细胞；jurkat细胞；hepg2细胞；hela细胞；ht-1080细胞；hct-116细胞；hu-h7细胞；huvec细胞；molt4细胞。所有这些细胞系都可以通过本文所述的方法进行修饰，以提供细胞系模型以产生、表达、定量、检测、研究目标基因或蛋白质；这些模型也可以用于筛选研究和生产及诸如化学、生物燃料、治疗学和农学作为非限制实例的各种领域中的目标生物活性分子。如本文所述的基因组编辑系统可以使用载体递送，所述载体例如含有编码一种或多种蛋白质的序列。在一些情况下，如本文所述的系统可以在没有病毒载体的情况下被递送。在一些情况下，如本文所述的系统可以在没有病毒载体的情况下被递送，例如当该系统大于一千碱基时，而不会影响细胞存活力。可以类似地递送编码多核苷酸的转基因。可以使用任何载体系统，包括但不限于质粒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、痘病毒载体；疱疹病毒载体和腺相关病毒载体等。此外，这些载体中的任一种可以包含一种或多种转录因子、核酸酶和/或转基因。因此，当将一种或多种crispr、talen、基于转座子的(transposon-based)、zfn、兆核酸酶或mega-tal分子和/或转基因引入细胞中时，crispr、talen、转座子-基、zfn、兆核酸酶或mega-tal分子和/或转基因可被携带在同一载体上或不同载体上。当使用多种载体时，每种载体可包含编码一种或多种crispr、talen、基于转座子的、zfn、兆核酸酶或mega-tal分子和/或转基因的序列。常规的基于病毒和非病毒的基因转移方法可以用于在细胞(如，哺乳动物细胞)和靶组织中引入编码工程化的crispr、talen、基于转座子的、zfn、兆核酸酶或mega-tal分子和/或转基因的核酸。此类方法也可以用于将编码crispr、talen、基于转座子的、zfn、兆核酸酶或mega-tal分子和/或转基因的核酸体外施用至细胞中。在一些实例中，可以施用编码crispr、talen、基于转座子的、zfn、兆核酸酶或mega-tal分子和/或转基因的核酸以用于体内或离体免疫治疗用途。非病毒载体递送系统可以包括dna质粒、裸核酸和与递送媒介物如脂质体或泊洛沙姆复合的核酸。病毒载体递送系统可以包括dna和rna病毒，其在递送至细胞后具有游离的或整合的基因组。核酸的非病毒递送方法包括电穿孔、脂质转染、核转染、金纳米颗粒递送、微注射、生物弹药、病毒体、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质：核酸缀合物、裸dna、mrna、人工病毒体和试剂增强的dna摄取。使用如sonitron2000系统(rich-mar)的声孔效应也可以用于递送核酸。另外的示例性核酸递送系统包括由biosystems(cologne,germany)、lifetechnologies(frederick,md.)、maxcyte,inc.(rockville,md.)、btxmoleculardeliverysystems(holliston,mass.)和copernicustherapeuticsinc.(参见例如美国专利第6,008,336号)提供的那些。脂质转染试剂在市场上有售(如和)。可以递送至细胞(离体施用)或靶组织(体内施用)。另外的递送方法包括包装待递送至engeneic递送媒介物(edv)中的核酸的使用。使用双特异性抗体将这些edv特异性递送至靶组织，其中抗体的一个臂对靶组织具有特异性，而另一臂对edv具有特异性。抗体将edv带到靶细胞表面，然后通过内吞将edv带入细胞。也可以将载体(包括含有编码工程化的crispr、talen、基于转座子的、zfn、兆核酸酶或mega-tal分子、转座子和/或转基因的核酸的病毒和非病毒载体)直接施用于有机体以用于体内细胞转导。可选地，可以施用裸dna或mrna。施用可以通过通常用于引入分子与血液或组织细胞最终接触的任何途径进行，包括但不限于注射、输注、局部应用和电穿孔。可以使用一种以上的途径来施用特定的组合物。药学上可接受的载体部分地通过所施用的特定组合物以及用于施用该组合物的特定方法来确定。在一些情况下，可以将编码外源转基因的载体穿梭到细胞核酸酶中。例如，载体可以含有核定位序列(nls)。nls可以来自猿猴空泡病毒40。载体也可以通过蛋白质或蛋白质复合物穿梭。在一些情况下，cas9可以用作穿梭微环载体的手段。cas可以包含一种或多种nls。在一些情况下，可以在电穿孔之前将载体与cas蛋白预复合。可以用于穿梭的cas蛋白可以是核酸酶缺陷型cas9(dcas9)蛋白。可以用于穿梭的cas蛋白可以是核酸酶有效的(nuclease-competent)cas9。在一些情况下，cas蛋白可以与引导rna和编码外源转基因的载体或质粒预混合。如下所述，可以通过施用至个体对象，通常通过全身施用(如，静脉内、腹膜内、肌内、皮下或颅内输注)或的局部应用在体内递送载体。可选地，可以将载体递送至离体细胞，如从个体对象移植的细胞(如，淋巴细胞、t细胞、骨髓穿刺物、组织活检物)，然后通常在选择已经掺入载体的细胞后将细胞再植入对象中。在选择之前或之后，可以扩增细胞。可以用编码外源转基因的突变或嵌合的腺相关病毒载体和包含含rna酶h样结构域的蛋白的编辑系统转染细胞。aav载体浓度可以为0.5纳克至50微克。在一些情况下，可以改变可通过电穿孔引入细胞中的核酸(如ssdna、dsdna、rna)的量，以优化转染效率和/或细胞存活力。在一些情况下，可将小于约100皮克的核酸添加至每个细胞样品(如，经电穿孔的一个或多个细胞)中。在一些情况下，可将至少约100皮克、至少约200皮克、至少约300皮克、至少约400皮克、至少约500皮克、至少约600皮克、至少约700皮克、至少约800皮克、至少约900皮克、至少约1微克、至少约1.5微克、至少约2微克、至少约2.5微克、至少约3微克、至少约3.5微克、至少约4微克、至少约4.5微克、至少约5微克、至少约5.5微克、至少约6微克、至少约6.5微克、至少约7微克、至少约7.5微克、至少约8微克、至少约8.5微克、至少约9微克、至少约9.5微克、至少约10微克、至少约11微克、至少约12微克、至少约13微克、至少约14微克、至少约15微克、至少约20微克、至少约25微克、至少约30微克、至少约35微克、至少约40微克、至少约45微克或至少约50微克的核酸添加至每个细胞样品(如，经电穿孔的一个或多个细胞)中。例如，对于电穿孔，可以将1微克dsdna添加至每个细胞样品中。在一些情况下，最优转染效率和/或细胞存活力所需的核酸(如dsdna)的量可以对细胞类型具有特异性。在一些情况下，用于每种样品的核酸(如，dsdna)的量可以直接对应于转染效率和/或细胞存活力。用本文所述的任何核酸递送平台，例如核转染或电穿孔，转染细胞的效率可以为或可以为约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％或大于99.9％。本文所述的载体、质粒和基因组编辑系统可以通过任何适合的方法来递送，包括转染、电穿孔、脂质体递送、膜融合技术、高速dna包被的沉淀(highvelocitydna-coatedpellets)、病毒感染和原生质体融合。用于构建本发明任何实施方案的方法对于具有核酸操纵技术的人员是已知的，并且包括遗传工程、重组工程和合成技术。参见，如sambrook等人,molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharborpress,coldspringharbor,ny。使用例如transfectionsystem(thermofisherscientific)或nucleofector(biosystems)的电穿孔也可以用于将核酸递送到细胞中。可以调节电穿孔参数以优化转染效率和/或细胞存活力。电穿孔装置可以具有多种电波形脉冲设置，如指数衰减、时间常数和方波。每种细胞类型具有独特的最优场强(e)，这取决于所施加的脉冲参数(如电压、电容和电阻)。最优场强的应用会通过诱导跨膜电压引起电通透，其允许核酸穿过细胞膜。在一些情况下，可以调整电穿孔脉冲电压、电穿孔脉冲宽度、脉冲数、细胞密度和尖端类型以优化转染效率和/或细胞存活力。在一些情况下，可以改变电穿孔脉冲电压以优化转染效率和/或细胞存活力。在一些情况下，电穿孔电压可以小于约500伏特。在一些情况下，电穿孔电压可以为至少约500伏特、至少约600伏特、至少约700伏特、至少约800伏特、至少约900伏特、至少约1000伏特、至少约1100伏特、至少约1200伏特、至少约1300伏特、至少约1400伏特、至少约1500伏特、至少约1600伏特、至少约1700伏特、至少约1800伏特、至少约1900伏特、至少约2000伏特、至少约2100伏特、至少约2200伏特、至少约2300伏特、至少约2400伏特、至少约2500伏特、至少约2600伏特、至少约2700伏特、至少约2800伏特、至少约2900伏特或至少约3000伏特。在一些情况下，最优转染效率和/或细胞存活力所需的电穿孔脉冲电压可以对细胞类型具有特异性。例如，对于巨噬细胞，1900伏特的电穿孔电压可以是最优的(如，提供最高存活力和/或转染效率)。在另一个实例中，对于jurkat细胞或原代人细胞如t细胞，约1350伏特的电穿孔电压可以是最优的(如，提供最高存活力和/或转染效率)。在一些情况下，对于给定细胞类型，电穿孔电压的范围可以是最优的。例如，对于人578t细胞，约1000伏特至约1300伏特的电穿孔电压可以是最优的(如，提供最高存活力和/或转染效率)。在一些情况下，可以改变电穿孔脉冲宽度以优化转染效率和/或细胞存活力。在一些情况下，电穿孔脉冲宽度可以小于约5毫秒。在一些情况下，电穿孔宽度可以为至少约5毫秒、至少约6毫秒、至少约7毫秒、至少约8毫秒、至少约9毫秒、至少约10毫秒、至少约11毫秒、至少约12毫秒、至少约13毫秒、至少约14毫秒、至少约15毫秒、至少约16毫秒、至少约17毫秒、至少约18毫秒、至少约19毫秒、至少约20毫秒、至少约21毫秒、至少约22毫秒、至少约23毫秒、至少约24毫秒、至少约25毫秒、至少约26毫秒、至少约27毫秒、至少约28毫秒、至少约29毫秒、至少约30毫秒、至少约31毫秒、至少约32毫秒、至少约33毫秒、至少约34毫秒、至少约35毫秒、至少约36毫秒、至少约37毫秒、至少约38毫秒、至少约39毫秒、至少约40毫秒、至少约41毫秒、至少约42毫秒、至少约43毫秒、至少约44毫秒、至少约45毫秒、至少约46毫秒、至少约47毫秒、至少约48毫秒、至少约49毫秒或至少约50毫秒。在一些情况下，最优转染效率和/或细胞存活力所需的电穿孔脉冲宽度可以对细胞类型具有特异性。例如，对于巨噬细胞，30毫秒的电穿孔脉冲宽度可以是最优的(如，提供最高的存活力和/或转染效率)。在另一个实例中，对于jurkat细胞，约10毫秒的电穿孔宽度可以是最优的(如，提供最高存活力和/或转染效率)。在一些情况下，对于给定的细胞类型，电穿孔宽度的范围可以是最优的。例如，对于人578t细胞，约20毫秒至约30毫秒的电穿孔宽度可以是最优的(如，提供最高存活力和/或转染效率)。在一些情况下，可以改变电穿孔脉冲的数目以优化转染效率和/或细胞存活力。在一些情况下，电穿孔可以包括单个脉冲。在一些情况下，电穿孔可以包括超过一个脉冲。在一些情况下，电穿孔可以包括2个脉冲、3个脉冲、4个脉冲、5个脉冲、6个脉冲、7个脉冲、8个脉冲、9个脉冲或者10个或更多个脉冲。在一些情况下，最优转染效率和/或细胞存活力所需的电穿孔脉冲数目可以对细胞类型具有特异性。例如，对于巨噬细胞，具有单个脉冲的电穿孔可以是最优的(如，提供最高存活力和/或转染效率)。在另一个实例中，对于原代细胞，具有3个脉冲的电穿孔可以是最优的(如，提供最高存活力和/或转染效率)。在一些情况下，对于给定的细胞类型，电穿孔宽度的范围可以是最优的。例如，对于人细胞，具有约1个至约3个脉冲的电穿孔可以是最优的(如，提供最高存活力和/或转染效率)。在一些情况下，可以改变用于电穿孔的起始细胞密度以优化转染效率和/或细胞存活力。在一些情况下，用于电穿孔的起始细胞密度可以小于约1x105个细胞。在一些情况下，用于电穿孔的起始细胞密度可以为至少约1x105个细胞、至少约2x105个细胞、至少约3x105个细胞、至少约4x105个细胞、至少约5x105个细胞、至少约6x105个细胞、至少约7x105个细胞、至少约8x105个细胞、至少约9x105个细胞、至少约1x106个细胞、至少约1.5x106个细胞、至少约2x106个细胞、至少约2.5x106个细胞、至少约3x106个细胞、至少约3.5x106个细胞、至少约4x106个细胞、至少约4.5x106个细胞、至少约5x106个细胞、至少约5.5x106个细胞、至少约6x106个细胞、至少约6.5x106个细胞、至少约7x106个细胞、至少约7.5x106个细胞、至少约8x106个细胞、至少约8.5x106个细胞、至少约9x106个细胞、至少约9.5x106个细胞、至少约1x107个细胞、至少约1.2x107个细胞、至少约1.4x107个细胞、至少约1.6x107个细胞、至少约1.8x107个细胞、至少约2x107个细胞、至少约2.2x107个细胞、至少约2.4x107个细胞、至少约2.6x107个细胞、至少约2.8x107个细胞、至少约3x107个细胞、至少约3.2x107个细胞、至少约3.4x107个细胞、至少约3.6x107个细胞、至少约3.8x107个细胞、至少约4x107个细胞、至少约4.2x107个细胞、至少约4.4x107个细胞、至少约4.6x107个细胞、至少约4.8x107个细胞或至少约5x107个细胞。在一些情况下，最优转染效率和/或细胞存活力所需的电穿孔的起始细胞密度可以对细胞类型具有特异性。例如，对于巨噬细胞，1.5x106个细胞的电穿孔的起始细胞密度可以是最优的(如，提供最高存活力和/或转染效率)。在另一个实例中，对于人细胞，5x106个细胞的电穿孔的起始细胞密度可以是最优的(如，提供最高存活力和/或转染效率)。在一些情况下，对于给定细胞类型，用于电穿孔的起始细胞密度的范围可以是最优的。例如，对于诸如t细胞的人细胞，5.6x106-5x107个细胞的电穿孔的起始细胞密度可以是最优的(如，提供最高存活力和/或转染效率)。在一些情况下，引导多核酸和核酸酶可以作为复合物引入细胞中。复合物可以是核糖核蛋白复合物(rnp)。可以定时引入rnp复合物。在一些情况下，在引入引导多核酸和核酸酶之前，细胞可以在细胞周期的g1、s和/或m期与其他细胞同步。在一些情况下，可以在细胞期递送rnp复合物，使得可以增强hdr、mmej或nhej。在一些情况下，rnp复合物可以促进同源定向修复。非同源末端连接(nhej)和同源定向修复(hdr)可以使用多种方法进行定量。在一些情况下，nhej、hdr或两者的组合的百分比可以通过将基因编辑分子(例如引导多核苷酸和含rna酶h样结构域的多肽)与编码无启动子的gfp的供体dna模板共递送至细胞中来确定。约72小时后，可以进行流式细胞术以定量总细胞数(n总计)、gfp阳性细胞数(ngfp+)和gfp-阴性细胞数(ngfp-)。在gfp阴性细胞中，可以进行下一代测序来鉴定无突变(ngfp-0)和有突变(ngfp-1)的细胞。hdr效率可以计算为ngfp+/n总计x100％，并且nhej效率将计算为ngfp-1/n总计x100％。在一些情况下，可以使用表达报告蛋白或含有报告基因的细胞来测定dna编辑系统的活性。例如，可以对报告蛋白进行工程化以含有阻碍物，如终止密码子、移码突变、间隔子、接头或转录终止子；然后可以使用dna编辑系统去除阻碍物并可以检测到所得的功能性报告蛋白。在一些情况下，可以设计阻碍物，使得需要特定序列修饰来恢复报告蛋白的功能。在其他情况下，可以设计阻碍物，使得导致一个或两个碱基的移码的任何插入或缺失可以足以恢复报告蛋白的功能。报告蛋白的实例包括比色酶、代谢酶、荧光蛋白、与抗生素抗性相关的酶和转运蛋白以及发光酶。此类报告蛋白的实例包括β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、荧光素酶和海肾。不同的检测方法可以用于不同的报告蛋白。例如，报告蛋白可以影响细胞存活力、细胞生长、荧光、发光或可检测产物的表达。在一些情况下，可以使用比色测定检测报告蛋白。在一些情况下，报告蛋白可以是荧光蛋白，并且可以通过测量处理的细胞中的荧光程度或具有至少一个荧光阈值水平的处理的细胞数来测定dna编辑。在一些情况下，可以评估报告基因的转录物水平。在其他情况下，可以通过测序评估报告基因。在一些情况下，用于测量dna编辑的测定可以使用断裂荧光蛋白系统，如自互补的断裂gfp1-10/11系统，其中可以通过自身缔合以形成功能性gfp信号的gfp蛋白的两个片段(g1-10和g11)使用移码接头来连接。移码接头内的插入或缺失可以恢复g11片段的框，从而允许两个片段形成功能性gfp信号。此类测定的实例显示于实施例12及图18-25和图27-32中。如图32a和图32b所示，ago51和ago89均导致约1.2％的细胞显示出gfp荧光，比无ago对照条件(0.6％)中观察到的水平高2倍，表明在基线时观察到的两倍水平的成功dna编辑。在一些情况下，如本文所述的ago蛋白可导致至少约1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2％、2.5％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％或99％的细胞表现出报告蛋白的恢复活性。在一些情况下，如本文所述的ago蛋白可导致至少约1％至99％、1％至10％、1％至5％、1％至2％、5％至50％、10％至80％、10％至50％、30％至70％或50％至80％的细胞表现出报告蛋白的恢复活性。在一些情况下，与基线相比，如本文所述的ago蛋白可导致具有恢复的报告子活性的细胞百分比增加至少约1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍。在一些情况下，与基线相比，如本文所述的ago蛋白质可导致具有恢复的报告子活性的细胞百分比增加至少约1.2倍至10倍、1.5倍至10倍、2倍至10倍、2倍至5倍、2倍至20倍、3倍至5倍、4倍至10倍、5倍至20倍、10倍至100倍、10倍至50倍或1.2倍至100倍。相对于nhej或mmej，利用hdr进行的基因组断裂修复的发生百分比可以为或可以为约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％或大于99.9％的细胞，其与包含rna酶h样结构域的基因组编辑系统接触。相对于hdr或mmej，利用nhej进行的基因组断裂修复的发生百分比可以为或可以为约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％或大于99.9％的细胞，其与包含rna酶h样结构域的基因组编辑系统接触。相对于hdr或nhej，利用mmej进行的基因组断裂修复的发生百分比可以为或可以为约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％或大于99.9％的细胞，其与包含rna酶h样结构域的基因组编辑系统接触。可以使用任何技术来测量诸如tcr的外源性多核酸的整合。例如，可以通过流式细胞术、surveyor核酸酶测定、通过分解追踪插入缺失(trackingofindelsbydecomposition，tide)、连接pcr或以上的任何组合来测量整合。在其他情况下，转基因整合可以通过pcr进行测量。也可以对工程化的细胞进行tide分析。离体细胞转染还可以用于诊断、研究或基因治疗(如，经由将转染的细胞重新输注至宿主有机体中)。在一些情况下，将细胞从对象有机体中分离，用核酸(如，基因或cdna)转染，并重新输注回至对象有机体(如，对象)中。在对象中对治疗有效可能必需的含rhdc多肽的修饰的细胞的量可以根据细胞的存活力和细胞被遗传修饰的效率(如转基因已经整合至一个或多个细胞中的效率)而变化。在一些情况下，遗传修饰后细胞存活力和转基因整合效率的乘积(如，相乘)可以相当于可以用于施用至对象的细胞的治疗性试样(aliquot)。在一些情况下，遗传修饰后细胞存活力的增加可对应于在对象中进行治疗有效施用所必需的细胞数减少。在一些情况下，转基因已经整合至一个或多个细胞中的效率的增加可以对应于在对象中进行治疗有效施用所必需的细胞数减少。在一些情况下，确定治疗有效所必需的细胞量可以包括确定与细胞存活力随时间的变化相对应的函数。在一些情况下，确定治疗有效所必需的细胞量可以包括确定与可将转基因整合至一个或多个细胞中的效率就时间依赖性变量(如，细胞培养时间、电穿孔时间、细胞刺激时间)进行的变化相对应的函数。如本文所述，病毒颗粒如aav可以用于将包含目标基因或转基因的病毒载体如外源性tcr递送至离体或体内细胞中。在一些实施方案中，可以将如本文公开的突变或嵌合的腺相关病毒载体测量为pfu(噬斑形成单位)。在一些情况下，本公开的组合物和方法的重组病毒或者突变或嵌合的腺相关病毒载体的pfu可以为约108至约5×1010pfu。在一些情况下，本公开的重组病毒是至少约1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010和5×1010pfu。在一些情况下，本公开的重组病毒是不超过约1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010和5×1010pfu。在一些方面，本公开的突变或嵌合的腺相关病毒载体可以被测量为载体基因组。在一些情况下，本公开的重组病毒是1×1010至3×1012个载体基因组、或1×109至3×1013个载体基因组、或1×108至3×1014个载体基因组、或至少约1×101、1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1017和1×1018个载体基因组，或是1×108至3×1014个载体基因组，或是不超过约1×101、1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1017和1×1018个载体基因组。在一些情况下，可以使用感染复数(moi)来测量本公开的突变或嵌合的腺相关病毒载体。在一些情况下，moi可以指载体或病毒基因组与可将核酸递送至的细胞的比率或倍数。在一些情况下，moi可以是1×106gc/ml。在一些情况下，moi可以是1×105gc/ml至1×107gc/ml。在一些情况下，moi可以是1×104gc/ml至1×108gc/ml。在一些情况下，本公开的重组病毒是至少约1×101gc/ml、1×102gc/ml、1×103gc/ml、1×104gc/ml、1×105gc/ml、1×106gc/ml、1×107gc/ml、1×108gc/ml、1×109gc/ml、1×1010gc/ml、1×1011gc/ml、1×1012gc/ml、1×1013gc/ml、1×1014gc/ml、1×1015gc/ml、1×1016gc/ml、1×1017gc/ml和1×1018gc/mlmoi。在一些情况下，本公开的突变或嵌合的腺相关病毒是约1×108gc/ml至约3×1014gc/mlmoi，或是不超过约1×101gc/ml、1×102gc/ml、1×103gc/ml、1×104gc/ml、1×105gc/ml、1×106gc/ml、1×107gc/ml、1×108gc/ml、1×109gc/ml、1×1010gc/ml、1×1011gc/ml、1×1012gc/ml、1×1013gc/ml、1×1014gc/ml、1×1015gc/ml、1×1016gc/ml、1×1017gc/ml和1×1018gc/mlmoi。在一些方面，可以不使用突变或嵌合的腺相关病毒载体而递送非病毒载体或核酸，并且可以根据核酸的量进行测量。通常，任何合适量的核酸可以与本公开的组合物和方法一起使用。在一些情况下，核酸可以是至少约1pg、10pg、100pg、1pg、10pg、100pg、200pg、300pg、400pg、500pg、600pg、700pg、800pg、900pg、1μg、10μg、100μg、200μg、300μg、400μg、500μg、600μg、700μg、800μg、900μg、1ng、10ng、100ng、200ng、300ng、400ng、500ng、600ng、700ng、800ng、900ng、1mg、10mg、100mg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg、1g、2g、3g、4g或5g。在一些情况下，核酸可以是不超过约1pg、10pg、100pg、1pg、10pg、100pg、200pg、300pg、400pg、500pg、600pg、700pg、800pg、900pg、1μg、10μg、100μg、200μg、300μg、400μg、500μg、600μg、700μg、800μg、900μg、1ng、10ng、100ng、200ng、300ng、400ng、500ng、600ng、700ng、800ng、900ng、1mg、10mg、100mg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg、1g、2g、3g、4g或5g。在移植之前、之后和/或期间，细胞(如工程化的细胞或工程化的原代细胞)可以是有功能的。例如，移植的细胞可以在移植后至少或至少约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、6天、27天、28天、29天、30天、40天、50天、60天、70天、80天、90或100天是有功能的。移植的细胞可以在移植后至少或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月是有功能的。移植的细胞可以在移植后至少或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30年是有功能的。在一些情况下，移植的细胞可以在接受者的长达一生的期间是有功能的。此外，移植的细胞可以其正常预期操作的100％时起作用。移植的细胞也可以在其正常预期操作的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％时起作用。移植的细胞也可以其正常预期操作的100％以上起作用。例如，移植的细胞可以在正常预期操作的110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000或更大％时起作用。可以将一种或多种细胞因子与本发明的细胞一起引入。细胞因子可以用于增强细胞毒性t淋巴细胞(包括过继转移的肿瘤特异性细胞毒性t淋巴细胞)以在肿瘤微环境中扩增。在一些情况下，il-2可以用于促进本文所述的细胞的扩增。也可以采用诸如il-15的细胞因子。也可以利用免疫疗法领域中的其他相关细胞因子，如il-2、il-7、il-12、il-15、il-21或其任何组合。在一些情况下，il-2可以在细胞输注的24小时内开始施用，并持续长达约4天(最多12剂)。在一些情况下，可以在初始施用之后将il-2施用长达约5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、32天、33天、34天、35天、36天、37天、38天、39天、40天。可以每八小时施用il-2的剂量。在一些情况下，可以在初始施用之后约每1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时施用il-2。在一些情况下，如果检测到毒性，则可以停止il-2给药。在一些情况下，如果对象达到由于阿地白介素导致的3级或4级毒性(除了阿地白介素常见的可逆3级毒性，如腹泻、恶心、呕吐、低血压、皮肤变化、厌食症、粘膜炎、吞咽困难或全身症状(constitutionalsymptoms)和实验室变化之外)，则可延迟或停止剂量。在一些情况下，如果通过支持措施可以在24小时内容易地逆转这些毒性，则可以给予另外的剂量。另外，可以根据治疗医师的判断来保持或停止给药。药物组合物和制剂全文中描述的组合物可以配制成药用药物，并用于治疗患有疾病如癌症的有需要的人或哺乳动物。这些药物可以与一种或多种t细胞(如，工程化的t细胞)连同一种或多种化疗剂或化疗化合物一起共施用至人或哺乳动物。本申请还提供了包含修饰的多核苷酸的材料和方法，以及使用此类多核苷酸减轻与人类遗传病相关的一种或多种症状或并发症的方法。化疗剂可以是可以用于治疗癌症的化学化合物。可以与公开的t细胞组合使用的化疗癌症剂包括但不限于有丝分裂抑制剂(长春花生物碱)。这些包括长春新碱、长春碱、长春地辛和navelbinetm(长春瑞滨，5’-noranhydroblastine)。在其他情况下，化疗癌症剂包括拓扑异构酶i抑制剂，如喜树碱化合物。如本文所用，“喜树碱化合物”包括camptosartm(伊立替康hcl)、hycamtintm(拓扑替康hcl)和源自喜树碱及其类似物的其他化合物。可以用于本文公开的方法和组合物中的另一类化疗癌症剂可以是鬼臼毒素衍生物，如依托泊苷、替尼泊苷和米托鬼臼肼。本公开还涵盖被称为烷基化剂的其他化疗癌症剂，其将肿瘤细胞中的遗传物质烷基化。这些包括但不限于顺铂、环磷酰胺、氮芥、三亚甲基硫代磷酰胺、卡莫司汀、白消安、苯丁酸氮芥、贝司汀(belustine)、乌拉莫司汀、chlomaphazin和达卡巴嗪。本公开涵盖了抗代谢物作为化疗剂。这些类型的试剂的实例包括胞嘧啶阿拉伯糖苷、氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、巯基嘌呤、azathioprime和丙卡巴肼。可以用于本文公开的方法和组合物中的另一类化疗癌症剂包括抗生素。实例包括但不限于多柔比星、博来霉素、更生霉素、柔红霉素、光辉霉素、丝裂霉素、自力霉素c(mytomycinc)和道诺霉素。对于这些化合物有许多可商购获得的脂质体制剂。本公开还涵盖了其他化疗癌症剂，包括但不限于抗肿瘤抗体、达卡巴嗪、氮杂胞苷、安吖啶、美法仑、异环磷酰胺和米托蒽醌。可以向患者输注可以为他们生成的尽可能多的细胞。在一些情况下，输注至患者中的细胞并非全部工程化的。在一些情况下，对象可接受可引入的总细胞群体中一定百分比的工程化的细胞。例如，可以工程化至少90％的可以引入患者中的细胞。在其他情况下，可以工程化至少40％的引入患者中的细胞。例如，患者可接受任何数量的工程化的细胞，总引入的群体的10％、15％、20％、25％、30％,35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。本文公开的细胞可以与其他抗肿瘤剂(包括细胞毒性剂/抗肿瘤剂和抗血管生成剂)组合施用。细胞毒性剂/抗肿瘤剂可以被定义为攻击和杀伤癌细胞的药剂。也可以使用抗血管生成剂。用于所公开的方法和组合物中的适合的抗血管生成剂包括抗vegf抗体(包括人源化和嵌合抗体)、抗vegf适配子和反义寡核苷酸。其他血管生成抑制剂包括血管抑素、内皮抑素、干扰素、白介素1(包括α和β)、白介素12、视黄酸以及金属蛋白酶-1和-2的组织抑制剂(timp-1和-2)。也可以使用小分子，包括拓扑异构酶，如雷佐生，即一种具有抗血管生成活性的拓扑异构酶ii抑制剂。在一些情况下，例如，在组合物、制剂和治疗方法中，所施用的组合物或制剂的单位剂量可以是5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100mg。在一些情况下，所施用的组合物或制剂的总量可以是0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90或100g。在一些情况下，本发明提供了药物组合物，其包含可以单独或者与药学上可接受的载体或赋形剂一起通过任何途径施用的细胞，并且此类施用可以以单剂量和多剂量进行。更特别地，药物组合物可以以片剂、胶囊剂、锭剂、糖锭剂、手糖果、粉剂、喷雾剂、水性悬浮剂、可注射溶液、酏剂、糖浆剂等形式与各种药学上可接受的惰性载体组合。此类载体包括固体稀释剂或填充剂、无菌水性介质和各种无毒有机溶剂等。此外，此类口服药物制剂可以通过通常用于此类目的的各种类型的药剂适当地增甜和/或调味。在一些情况下，载体可以是水、盐水、乙醇、甘油、乳糖、蔗糖、磷酸钙、明胶、右旋糖酐、琼脂、果胶、花生油、芝麻油等、稀释剂、药学上可接受的载体(如磷酸盐缓冲盐水)、药学上可接受的赋形剂、增强抗原性的佐剂、免疫刺激性化合物或分子和/或本领域已知的其他化合物。本文的佐剂可以含有其上吸附有抗原的矿物质(明矾、氢氧化铝、磷酸铝)悬浮液；或是其中抗原溶液在油中乳化的油包水乳液(mf-59，弗氏不完全佐剂)，有时包含杀灭的分枝杆菌(弗氏完全佐剂)以进一步增强抗原性(抑制抗原降解和/或导致巨噬细胞流入)。佐剂还包括免疫刺激分子，如细胞因子，共刺激分子，以及例如免疫刺激dna或rna分子，如cpg寡核苷酸。此类剂量制剂是本领域技术人员容易确定的。剂量还可以含有一种或多种药学上可接受的盐，诸如例如无机酸盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；以及有机酸盐，如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。另外，辅助物质，如润湿剂或乳化剂、ph缓冲物质、凝胶或胶凝材料、调味剂、着色剂、微球、聚合物、助悬剂等在本文中也可以存在。此外，一种或多种其他常规药物成分，如防腐剂、保湿剂、助悬剂、表面活性剂、抗氧化剂、抗凝剂、填充剂、螯合剂、包衣剂、化学稳定剂等也可以存在，尤其是如果剂型是可复水的形式。适合的示例性成分包括微晶纤维素、羧甲基纤维素钠、聚山梨酯80、苯乙醇、氯丁醇、山梨酸钾、山梨酸、二氧化硫、没食子酸丙酯、对羟基苯甲酸酯、乙基香兰素、甘油、苯酚、对氯苯酚、明胶、白蛋白及以上的组合。在remington'spharmaceuticalsciences(mackpub.co.,n.j.1991，其通过引用并入本文)中可获得对药学上可接受的赋形剂的详尽论述。如本文所述，可以从人中提取细胞。可以对细胞进行离体遗传改变并相应地使用。这些细胞可以用于基于细胞的疗法。这些细胞可以用于治疗接受者(如人)中的疾病。例如，这些细胞可以用于治疗癌症。本文描述了治疗接受者中的疾病(如，癌症)的方法，该方法包括将包含工程化的细胞的一个或多个细胞(包括器官和/或组织)移植至接受者中。通过细胞内基因组移植制备的细胞可以用于治疗癌症。本文描述了治疗接受者中的疾病(如，癌症)的方法，该方法包括将一个或多个argonaute修饰的细胞(包括器官和/或组织)移植至接受者中。通常，本文所述的修饰的细胞可以通过与表面接触而扩增，所述表面上附着有可刺激cd3tcr复合物相关信号的试剂和可刺激t细胞表面上的共刺激分子的配体。具体而言，可以诸如通过与固定在表面上的抗cd3抗体或其抗原结合片段或者抗cd2抗体接触，或者通过与有时同钙离子载体结合的蛋白激酶c激活剂(如，苔藓抑素)接触，在体外刺激细胞群体。为了共刺激在修饰的细胞表面上的辅助分子，可以使用结合辅助分子的配体。例如，可以在可刺激t细胞增殖的条件下，使细胞群体与抗cd3抗体和抗cd28抗体接触。在一些情况下，4-1bb可以用于刺激细胞。例如，可以用4-1bb和il-21或另一种细胞因子刺激细胞。在一些情况下，将向对象施用5x1010个细胞。在其他情况下，将向对象施用5x1011个细胞。在一些实施方案中，将约5x1010个细胞施用至对象。在一些实施方案中，约5x1010个细胞表示施用至对象的细胞的中值量。在一些实施方案中，约5x1010个细胞是在对象中实现治疗响应所必需的。在一些实施方案中，至少约1x107个细胞、至少约2x107个细胞、至少约3x107个细胞、至少约4x107个细胞、至少约5x107个细胞、至少约6x107个细胞、至少约6x107个细胞、至少约8x107个细胞、至少约9x107个细胞、至少约1x108个细胞、至少约2x108个细胞、至少约3x108个细胞、至少约4x108个细胞、至少约5x108个细胞、至少约6x108个细胞、至少约6x108个细胞、至少约8x108个细胞、至少约9x108个细胞、至少约1x109个细胞、至少约2x109个细胞、至少约3x109个细胞、至少约4x109个细胞、至少约5x109个细胞、至少约6x109个细胞、至少约6x109个细胞、至少约8x109个细胞、至少约9x109个细胞、至少约1x1010个细胞、至少约2x1010个细胞、至少约3x1010个细胞、至少约4x1010个细胞、至少约5x1010个细胞、至少约6x1010个细胞、至少约6x1010个细胞、至少约8x1010个细胞、至少约9x1010个细胞、至少约1x1011个细胞、至少约2x1011个细胞、至少约3x1011个细胞、至少约4x1011个细胞、至少约5x1011个细胞、至少约6x1011个细胞、至少约6x1011个细胞、至少约8x1011个细胞、至少约9x1011个细胞或至少约1x1012个细胞。例如，可以将约5x1010个细胞施用至对象。在另一个实例中，以3x106个细胞开始，可以将细胞扩增至约5x1010个细胞并施用至对象。在一些情况下，将细胞扩增至用于治疗的足够数量。例如，5x107个细胞可以进行快速扩增以生成用于治疗用途的足够数量。在一些情况下，用于治疗用途的足够数量可以是5x1010。可以输注任何数量的细胞用于治疗用途。例如，可以向对象输注1x106至5x1012(包含端值)的许多细胞。可以向对象输注可以为其生成的尽可能多的细胞。在一些情况下，被输注至对象中的细胞并非全部工程化的。例如，可以工程化输注至对象中的至少90％的细胞。在其他情况下，可以工程化输注至对象中的至少40％的细胞。在一些实施方案中，本公开的方法包括计算和/或向对象施用影响对象中的治疗响应所必需的修饰的细胞的量。在一些实施方案中，计算影响治疗响应所必需的工程化细胞的量包括细胞的存活力和/或将转基因整合至细胞基因组中的效率。在一些实施方案中，为了在对象中实现治疗响应，可以向对象施用的修饰的细胞可以是活的。在一些实施方案中，为了在对象中实现治疗响应，至少约95％、至少约90％、至少约85％、至少约80％、至少约75％、至少约70％、至少约65％、至少约60％、至少约55％、至少约50％、至少约45％、至少约40％、至少约35％、至少约30％、至少约25％、至少约20％、至少约15％、至少约10％的细胞是活细胞。在一些实施方案中，为了在对象中实现治疗响应，施用至对象的rhdc多肽修饰的细胞可以是具有成功整合至细胞基因组中的一个或多个转基因的细胞。在一些实施方案中，为了在对象中实现治疗响应，至少约95％、至少约90％、至少约85％、至少约80％、至少约75％、至少约70％、至少约65％、至少约60％、至少约55％、至少约50％、至少约45％、至少约40％、至少约35％、至少约30％、至少约25％、至少约20％、至少约15％、至少约10％的细胞具有成功整合至细胞基因组中的一个或多个转基因的细胞。通过向有需要的对象施用含rna酶h样结构域的肽修饰的细胞，本文公开的方法可以用于治疗或预防疾病，包括但不限于癌症、心血管疾病、肺病、肝病、皮肤病或神经病。移植可以通过任何类型的移植进行。位点可以包括但不限于肝囊下间隙、脾囊下间隙、肾囊下间隙、网膜、胃或肠粘膜下层、小肠的血管段、静脉囊、睾丸、脑、脾或角膜。例如，移植可以是囊下移植。移植也可以是肌内移植。移植可以是门内(intraportal)移植。移植可以是来自人类的一个或多个细胞。例如，一个或多个细胞可以来自器官，其可以是脑、心脏、肺、眼睛、胃、胰腺、肾脏、肝脏、肠、子宫、膀胱、皮肤、头发、指甲、耳朵、腺体、鼻、嘴、嘴唇、脾脏、牙龈、牙齿、舌、唾液腺、扁桃体、咽、食道、大肠、小肠、直肠、肛门、甲状腺、胸腺、骨头、软骨、腱、韧带、肾上腺、骨骼肌、平滑肌、血管、血液、脊髓、气管、输尿管、尿道、下丘脑、垂体、幽门、肾上腺、卵巢、输卵管、子宫、阴道、乳腺、睾丸、精囊、阴茎、淋巴、淋巴结或淋巴管。一个或多个细胞也可以来自脑、心脏、肝脏、皮肤、肠、肺、肾脏、眼睛、小肠或胰腺。一个或多个细胞可以来自胰腺、肾、眼睛、肝脏、小肠、肺或心脏。一个或多个细胞可以来自胰腺。一个或多个细胞可以是胰岛细胞，例如胰岛β细胞。一个或多个细胞可以是任何血细胞，如外周血单核细胞(pbmc)、淋巴细胞、单核细胞或巨噬细胞。一个或多个细胞可以是任何免疫细胞，如淋巴细胞、b细胞或t细胞。本文公开的方法还可以包括移植一个或多个细胞(如自体细胞或同种异体细胞)，其中一个或多个细胞可以是任何类型的细胞。例如，一个或多个细胞可以是上皮细胞、成纤维细胞、神经细胞、角质形成细胞、造血细胞、黑色素细胞、软骨细胞、淋巴细胞(b和t)、巨噬细胞、单核细胞、单个核细胞、心肌细胞、其他肌肉细胞、颗粒细胞、卵丘细胞、表皮细胞、内皮细胞、胰岛细胞、血液细胞、血液前体细胞、骨细胞、骨前体细胞、神经元干细胞、始基干细胞、肝细胞、角质形成细胞、脐静脉内皮细胞、主动脉内皮细胞、微血管内皮细胞、成纤维细胞、肝星状细胞、主动脉平滑肌细胞、心肌细胞、神经元、库普弗细胞、平滑肌细胞、施万恩细胞和上皮细胞、红细胞、血小板、嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、脂肪细胞、软骨细胞、胰岛细胞、甲状腺细胞、甲状旁腺细胞、腮腺细胞、肿瘤细胞、胶质细胞、星形细胞、红细胞、白细胞、巨噬细胞、上皮细胞、体细胞、垂体细胞、肾上腺细胞、毛细胞、膀胱细胞、肾细胞、视网膜细胞、杆状细胞、圆锥细胞、心脏细胞、起搏细胞、脾细胞、抗原呈递细胞、记忆细胞、t细胞、b细胞、浆细胞、肌肉细胞、卵巢细胞、子宫细胞、前列腺细胞、阴道上皮细胞、精细胞、睾丸细胞、生殖细胞、卵细胞、莱迪希细胞、管周细胞、塞尔托利细胞、黄体细胞、宫颈细胞、子宫内膜细胞、乳腺细胞、卵泡细胞、粘液细胞、纤毛细胞、非角化上皮细胞、角化上皮细胞、肺细胞、杯状细胞、柱状上皮细胞、多巴能细胞、鳞状上皮细胞、骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、多巴胺能细胞、胚胎干细胞、成纤维细胞和胎儿成纤维细胞。此外，一个或多个细胞可以是胰岛细胞和/或细胞簇等，包括但不限于胰腺α细胞、胰腺β细胞、胰腺δ细胞、胰腺f细胞(如pp细胞)或胰腺ε细胞。在一种情况下，一个或多个细胞可以是胰腺α细胞。在另一种情况下，一个或多个可以是胰腺β细胞。供体可以处于任何发育阶段，包括但不限于胎儿、新生儿、青年和成年。例如，可以从成年人中分离出供体t细胞。供体人t细胞的年龄可以在10岁、9岁、8岁、7岁、6岁、5岁、4岁、3岁、2或1岁以下。例如，可以从6岁以下的人分离出t细胞。也可以从3岁以下的人中分离出t细胞。供体可以超过10岁。试剂盒本文公开的可以是包含组合物的试剂盒。本文公开的还可以是用于治疗或预防癌症、病原体感染、免疫病症或同种异体移植的试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒可以包含治疗或预防性组合物，其在单位剂型中含有有效量的核酸酶修饰细胞的组合物。在一些实施方案中，试剂盒包含无菌容器，该容器可以容纳工程化的t细胞的治疗组合物；此类容器可以是盒子、安瓿瓶、瓶、小瓶、管、袋子、小袋、泡罩包装或本领域已知的其他适合的容器形式。此类容器可以由塑料、玻璃、层压纸、金属箔或其他适用于容纳药物的材料制成。在一些情况下，可以提供rhdc多肽修饰的细胞，以及将细胞施用于患有癌症、病原体感染、免疫病症或同种异体移植或者处于发展癌症、病原体感染、免疫病症或同种异体移植的风险的对象的说明书。说明书通常可以包括有关该组合物用于治疗或预防癌症、病原体感染、免疫病症或同种异体移植的信息。在一些情况下，试剂盒可以包含约1x104个细胞至约1x1012个细胞。在一些情况下，试剂盒可以包含至少约1x105个细胞、至少约1x106个细胞、至少约1x107个细胞、至少约4x107个细胞、至少约5x107个细胞、至少约6x107个细胞、至少约6x107个细胞、至少约8x107个细胞、至少约9x107个细胞、至少约1x108个细胞、至少约2x108个细胞、至少约3x108个细胞、至少约4x108个细胞、至少约5x108个细胞、至少约6x108个细胞、至少约6x108个细胞、至少约8x108个细胞、至少约9x108个细胞、至少约1x109个细胞、至少约2x109个细胞、至少约3x109个细胞、至少约4x109个细胞、至少约5x109个细胞、至少约6x109个细胞、至少约6x109个细胞、至少约8x109个细胞、至少约9x109个细胞、至少约1x1010个细胞、至少约2x1010个细胞、至少约3x1010个细胞、至少约4x1010个细胞、至少约5x1010个细胞、至少约6x1010个细胞、至少约6x1010个细胞、至少约8x1010个细胞、至少约9x1010个细胞、至少约1x1011个细胞、至少约2x1011个细胞、至少约3x1011个细胞、至少约4x1011个细胞、至少约5x1011个细胞、至少约6x1011个细胞、至少约6x1011个细胞、至少约8x1011个细胞、至少约9x1011个细胞或至少约1x1012个细胞。例如，可以在试剂盒中包含约5x1010个细胞。在另一实例中，试剂盒可以包含3x106个细胞；可以将细胞扩增至约5x1010个细胞并施用至对象。在一些情况下，试剂盒可以包含同种异体细胞。在一些情况下，试剂盒可以包含可包含基因组修饰的细胞。在一些情况下，试剂盒可以包含“现成的(off-the-shelf)”细胞。在一些情况下，试剂盒可以包含可经扩增以用于临床用途的细胞。在一些情况下，试剂盒可含有用于研究目的的内容物。在一些情况下，说明书包括以下中至少一种：治疗剂的描述；用于治疗或预防瘤形成、病原体感染、免疫病症或同种异体移植或其症状的剂量时间表和施用；注意事项；警告信息；适应症；禁忌症；过剂量信息；不良反应；动物药理学；临床研究；和/或参考文献。说明书可以直接打印在容器上(如果有的话)，或者打印为适用于容器的标签，或者作为在容器中或与容器一起提供的单独的纸页、小册子、卡片或资料夹。在一些情况下，说明书提供了用于在施用化疗剂之后至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或长达2天、3天、4天、5天、6天或7天施用核酸酶修饰的细胞的程序。在一些情况下，说明书提供了用于在施用化疗剂之后至少24小时施用工程化的细胞的程序。可以配制核酸酶修饰的细胞用于静脉内注射。可以配制核酸酶修饰的细胞用于输注。在一些情况下，试剂盒可以含有儿科剂量的产品。本文所述的方法、组合物或试剂盒的另外用途可以包括以下中的一种或多种：基因组编辑、转录或表观遗传调控、基因组成像、拷贝数分析、活细胞分析、高度重复的基因组序列或结构的检测、复杂基因组序列或结构的检测、基因重复或重排的检测、增强的fish标记、靶核酸的解旋、与基因组缺失、重复和重排有关的疾病和遗传病症的大规模诊断、具有多种独特grna或gdna的rna寡核苷酸(oligo)芯片用于高通量成像和/或诊断、靶序列的多色差异检测、未知原因或起源的疾病的鉴定或诊断以及细胞(如活细胞)、组织或有机体的4维(如延时)或5维(例如多色延时)成像。实施例实施例1：核酸酶挖掘管线1使用tblastn，使用ncbirefseq数据库搜索各种piwi序列的wipi位置。所分析的序列具有wipi1命中+/-10kb。使用genemars预测了相关命中的氨基酸序列。将相关命中分为蛋白质家族、二级结构和相邻区域的功能富集。针对cdd数据库分析了蛋白质家族命中。分析了二级结构。功能富集分析检查了相邻区域中参与防御、应激反应、cas系统、dna修复或毒素防御的结构域，图2管线2使用tblastn，使用ncbirefseq数据库搜索各种piwi序列的wipi位置。所分析的序列具有wipi1命中+/-10kb。使用genemars预测了相关命中的氨基酸序列。使用针对cdd数据的rps-blast，使用orf中的氨基酸，分析了相关命中。鉴定了候选argonaute序列。结果分布在五个真核超群的至少四个中的约65％的测序的真核基因组编码argonaute。相比之下，使用代表性piwi结构域序列作为查询进行的refseq数据库(2013年11月)的位置特异性迭代基本局部比对搜索工具(psi-blast)搜索显示，分别在～32％和～9％的可获得的古细菌和细菌基因组中编码ago蛋白，并且在37个原核门中的17个中编码ago蛋白。与大多数原核防御基因42类似，pago显示了斑片状(patchy)分布，其中不超过70％的代表在任何细菌或古细菌门中。表10：核酸酶来源概述物种数命中数细菌(45,031中的)13001363古细菌(1,012中的)8387真核生物13926693表11：分类分布表12：分类分布分类计数α变形菌门244β变形菌门95δ变形菌门8γ变形菌门151ζ变形菌门2实施例2：鉴定适合的核酸酶通过与来自宏基因组的单独基因组序列或基因组装体的rna酶h蛋白进行二级结构比对来鉴定适合的核酸酶。将rna酶-h1、rna酶-hii、rve/transp、argonaute、prp8、ruvc、ruvc、ruvx、rna酶t和dnapoiii进行比对，并且比对结果显示这些蛋白质共有二级结构同源性。结构比对证实了核酸酶结构域的存在。实施例3：含rna酶h样结构域(rhdc)的多肽构建体利用pcr技术、分子克隆或重组dna技术，将含rna酶h样结构域(rhdc)的多肽(如，argonaute蛋白)经由设计或筛选的肽接头序列与核酸解旋多肽(如，解旋酶结构域)融合。分离并纯化所得的融合多肽。实施例4：合成解旋酶-argonaute融合构建体将催化失活的cas9(如dcas9)通过单链引导rna(sgrna)引导至靶序列。为了实现基因组破坏，dcas9可以单独使用(由此其通过空间位阻阻遏转录)或用作解旋酶。当与rhdc多肽或其功能部分融合时，dcas9允许进行两步基因组编辑系统，由此将dcas9首先引导至靶序列，在那其将在靶序列内的靶向位点处的双链螺旋解旋，并且在第二步，rhdc在解旋的靶序列处执行基因组断裂。实施例5：使用含rna酶h样结构域(rhdc)的多肽构建体的基因组工程t细胞的neon转染使用neon转染系统(10ul试剂盒，invitrogen,lifetechnologies)电穿孔未刺激或刺激的t细胞。对细胞计数，并将其以2x105个细胞的密度重悬于10ult缓冲液中。将1ugargonaute-解旋酶构建体或mrna和1ug靶向靶基因(如，免疫检查点基因)质粒或mrna的grna添加至细胞混合物中。在1400v，10ms，3个脉冲下对细胞进行电穿孔。转染后，将细胞涂铺在48孔板中的200ul培养基中。流式细胞术转染后24-48小时通过流式细胞术分析电穿孔的t细胞对破坏的靶基因的表达。通过用含有0.5％fbs的冷却1xpbs洗涤来准备好细胞，并用apc抗人cd3ε(ebiosciences,sandiego)和fixableviabilitydyeeflour780(ebiosciences,sandiego)染色。以下mab和试剂与指定的特异性和适当的同种型对照一起使用。来自bdbiosciences：apc-缀合的抗cd3(555335)、fitc-抗cd8(555366)、pe-抗cd8(555635)、pe-抗cd28(561793)、pe-抗cd107a(555801)和pe-抗β-2微球蛋白(551337)、fitc-抗hla-i(555552)、apc-抗cd137(550890)。来自biolegend：apc-抗pd1(114102)、apc-抗pdl1(329702)、fitc-抗cd45ro(304204)、apc-抗cd62l(304814)。来自beckmancoulter：pe-抗vb13.1(im2021u)。使用cellquest版本3.3(bdbiosciences)在facsaccuri(bdbiosciences)上获取数据，并通过fcsexpress版本3.00(denovosoftware)或flowjo版本7.6.1(treestar,inc.)对其进行分析。使用t7e1测定、tide和pcr片段测序来测量等位基因修饰频率通过t7e1核酸酶测定(neb)确定t细胞中靶基因的基因组破坏水平。靶标破坏百分比通过光密度法定量。将pcr产物连接至topo克隆载体(invitrogen)，然后在大肠杆菌中转化。挑选单个克隆并对其进行测序计算以计算插入缺失和插入。通过sanger测序确认pd1破坏。用于扩增靶基因座的pcr引物如下：pd1正向，5′-gtaataaaatgctcagcacagaata-3′(seqidno:382)；pd1反向，5′gagaaaaatatcaccagctcatct-3′(seqidno:383)。为了使用tide(通过分解追踪插入缺失)分析等位基因修饰频率，使用两个pcr引物对纯化的pcr产物进行sanger测序，并使用在线tide软件分析每个序列的色谱图。使用来自cas9模拟转染样品的参考序列进行分析。将参数设置为10个核苷酸的默认的最大插入缺失大小，并且分解窗口覆盖具有高质量痕迹的最大可能窗口。将低于1.5％的检测灵敏度的所有tide分析均设置为0％。elisa测定将靶细胞洗涤并以1×106个细胞/ml悬浮在r10培养基中。然后，将100μl的每种靶细胞类型一式三份添加至96孔圆底板(corning)中。将效应t细胞洗涤并以1×106个细胞/ml重悬于r10培养基中，然后在指定的孔中将100μlt细胞与靶细胞合并。将板在37℃孵育18至24小时。孵育后，收获上清液并进行elisa(ebioscience)。ifnγelispot将含rna酶h样结构域(rhdc)的融合构建体编辑的t细胞以每孔2×104个细胞的浓度与经辐照的同种异体pbmc一起涂铺在elispot板(r&dsystems)中。另一项实验是通过将同种异体pbmc与经辐照的编辑t细胞共培养而进行的。将细胞以1:1的刺激物与响应物比率孵育18小时。根据制造商的说明进行实验。使用用于扫描和分析的elispot读板仪对斑点进行自动定量。实施例6：在蛋白质水平上检测基因组破坏为了测定在遗传水平上观察到的敲除频率是否与蛋白质损失相关，评估了敲除之后靶蛋白的表达。在电穿孔后第14天，将外周血(pb)t细胞和til使用板结合的抗cd3和可溶性抗cd28抗体重新刺激，并通过考马斯亮蓝染色的凝胶评估靶基因的损失。实施例7：rhdc基因切割测定基因编辑报告系统：rhdc基因切割测定是高度灵敏的功能获得哺乳动物基因编辑报告系统，图9。将瞬时质粒dna，图10，转染至24孔板的各孔中的hek293tqms细胞中。使用无内毒素的dna制备试剂盒从大肠杆菌星状细胞制备所有质粒。总之，将5×104个细胞涂铺在6孔板中的每孔内0.5ml完全dmem生长培养基中。转染前，将细胞培养物在37℃孵育约24-36小时。转染前细胞为约60-70％汇合度(confluent)。a：转染前立即制备transit-lt1试剂：dna复合物(表13)。表13：transit-lt1试剂：dna复合物配方试剂：dna复合物通过以下生成：将transit-lt1试剂升温至室温，并在使用前轻轻涡旋。将50μlofopti-memireduced-serum培养基置于无菌的1.5ml管中。加入1μg质粒dna，然后吸打以完全混合。将1.5μltransit-lt1试剂添加至dna混合物，并轻轻吸打。最后进行30分钟的孵育。b：将复合物分配到完全生长培养基内的细胞transit-lt1试剂：将dna复合物逐滴添加至孔的不同区域。来回和左右轻轻地摇动板，以使transit-lt1试剂：dna复合物均匀分布。将混合物在37℃孵育。根据需要传代细胞。c：转染细胞的流式细胞术分析使用0.25％胰蛋白酶使转染的细胞胰蛋白酶化。将细胞以500g离心5分钟，重悬于含5％fbs和0.5medta的dpbs中，并通过5mlfacs管的顶部过滤器。在第3天、第6天和第10天使用beckmancytoflex流式细胞仪分析细胞。hek293t中的rhdc基因编辑将瞬时质粒dna，图10，转染到24孔板的各孔中的hek293tqms细胞中。使用无内毒素的dna制备试剂盒从大肠杆菌星状细胞制备所有质粒。总之，将5×104个细胞涂铺在6孔板中的每孔0.5ml完全dmem生长培养基中。转染前，将细胞培养物在37℃孵育约24-36小时。转染前细胞为约60-70％汇合度。a：转染前立即生成基因切割混合物表14：用于在hek293t测定中进行argonaute基因编辑的配方b：将复合物分配至完全生长培养基中的细胞将混合物逐滴添加至孔的不同区域。来回和左右轻轻地摇动板，以均匀分布混合物。将混合物在37℃孵育。根据需要传代细胞。c：转染细胞的流式细胞术分析使用0.25％胰蛋白酶使转染的细胞胰蛋白酶化。将细胞以500g离心5分钟，重悬于含5％fbs和0.5medta的dpbs中，并通过5mlfacs管的顶部过滤器。在第3天、第6天和第10天使用beckmancytoflex流式细胞仪分析细胞。表15：基因切割测定比较实施例8：组装的遗传编辑分子的基因组热力学计算组装的遗传编辑分子(agem)的基因组编辑系统的能量的测量可以通过考虑atp、adp的量和修饰的dna的百分比来计算。agem是一种模块化系统，其包括含rna酶h样结构域(rhdc)的多肽、核酸解旋多肽和任选的调控结构域多肽(rdp)，图34。通过向反应中提供有限量的atp，可以在生化系统中测量遗传热力学反应的能量成本。在反应结束时，可以通过计算([atp]-[adp])/[修饰的dna]来分析适当修饰的dna量以及反应中剩余的atp和adp的量的定量，图33。该公式可以估计每个编辑反应消耗了多少能量。由于可以互换编辑系统的模块，因此每个编辑事件的确切能量成本将有所不同。例如，rhdc可以互换为任何核酸酶结构域(来自crispr系统、argonaute系统、兆核酸酶、锌指核酸酶(zfn)、talen或任何限制酶系统)，而不影响核酸解旋剂或rdp功能。基因组编辑分子的基因组热力学反应的测量可以通过将长度为100bp的dsdna纳入反应中来确定，该dsdna含有用于引导多核酸(gdna或grna)的完全匹配序列。添加1um基因编辑分子，并添加1um引导dna或引导rna，使得比率为：基因编辑器:靶dna＝1:1。将10:1(10um)atp补充到反应中。反应将进行1小时。在反应结束时，将终止缓冲液添加至反应(如，mops)。通过基于甘油磷酸化的标准atp测定测量剩余atp的量，以生成易于通过比色(od＝570nm)或荧光(ex/em＝535/587nm)测定定量的产物。修饰的靶dna的量通过识别并切割非完全匹配的dna(编辑的dna)的t7核酸内切酶i测定，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳来进行定量。基因编辑分子消耗的总能量由([atp]-[atp]剩余)/[编辑的dna]计算。实施例9：与argonauts共定位的解旋酶及其优化的核酸序列优化表16中描述的序列以去除任何已知的限制酶识别位点、隐秘基因表达调控位点、被预测为隔离转录或翻译的序列、大于10bp的重复序列。该优化不会改变蛋白质肽序列，并仅基于使用不同核苷酸三联体编码相同氨基酸的密码子使用冗余。表16：优化的ago解旋酶的核苷酸序列表17：含有来自猿猴空泡病毒40的2x核定位序列(nls)的argonaute核苷酸序列在一些情况下，如本文所述的多肽构建体可以包含一种或多种结构域。多肽构建体的结构域可以以任何顺序排列。在一些情况下，多肽构建体的结构域组织呈以下构型：(argon)；(argol1)；paz；argol2；argomid；piwi。在一些情况下，多肽构建体的结构域组织呈以下构型：sir2；(argon)；(argol1)；argol2；argomid；piwi。在一些情况下，多肽构建体的结构域组织呈以下构型：(argon)；(argol1)；(argol2)；argomid；piwi。在一些情况下，多肽构建体含有dedx结构域。在一些情况下，多肽构建体不存在dedx结构域。在一些情况下，多肽构建体在自然环境下与解旋酶相邻。在一些情况下，多肽构建体包含seqidno:190的序列、其修饰的形式、其部分或其功能片段。在一些情况下，多肽构建体包含与表18(seqidno:161-seqidno:252)中的那些在遗传上类似、系统发生上类似或功能上类似的argonaute或解旋酶序列。在一些情况下，多肽构建体包含与seqidno:190、seqidno:211、seqidno:215或seqidno:249约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或高达100％相同的序列。表18：argonaute和解旋酶dna序列表19：含有2个核定位序列和克隆序列的argonaute核酸序列实施例10：rhdc表达和纯化将编码argo#的合成密码子优化的基因克隆至petm-30表达载体中。根据制造商的说明书，将亚克隆的argo质粒转化至大肠杆菌bl21(de3)(newenglandbiolabs)中。在37℃和150rpm下在细菌振荡孵育箱中，在含有50μg/ml卡那霉素(carlroth)的lb培养基(carlroth)中培养菌株。过夜孵育后，将预培养物用于接种表达培养物(150ml)，起始od600nm为0.05。将培养物在37℃和150rpm下孵育直至od600nm达到0.6-0.8。通过添加1mm异丙基-b-d-硫代半乳糖苷(iptg)(sigmaaldrich)诱导ago蛋白表达。在30℃和150rpm下在细菌摇床中继续表达6小时。通过在4℃下以5000xg离心10分钟来收获细胞。将沉淀冷冻并储存在-80℃下。将冷冻的细胞在4℃下解冻，并重悬于补充有1mm苯甲磺酰(carlroth)和5mmβ-巯基乙醇(sigmaaldrich)的25ml缓冲液i(50mmtris/hclph7.5、0.5m氯化钠、5％甘油)中。通过用bransondigitalsonifier(型号102c，3mm尖端)进行超声处理来破碎重悬的细胞。超声处理：步骤1：25％振幅；5秒钟开，2秒钟关，持续2分钟；重复两次；每次循环后暂停3分钟；步骤2：35％振幅；5秒钟开，2秒关，持续30秒钟。在超声处理期间，将裂解的沉淀保持在冰上。将裂解物在4℃下以15000xg离心15分钟，然后将上清液用于his-tag亲和层析纯化。将ni-nta琼脂糖(qiagen)在补充有5mmβ-巯基乙醇的10cv(柱体积)缓冲液i中平衡，并在离心(50xg，5分钟)后以1:1的比率用缓冲液i稀释。将澄清的裂解物与350μl稀释的ni-nta琼脂糖悬浮液在转轮上孵育(在4℃下30分钟)。离心(50xg，5分钟)后，将ni-nta琼脂糖珠转移至空的bio-spin色谱柱(biorad)中。用补充有5mmβ-巯基乙醇的60cv(柱体积)的缓冲液i洗涤柱。用补充有5mmβ-巯基乙醇和渐增浓度的咪唑的缓冲液i逐渐洗脱his标记的ago蛋白(洗脱级分(ef)1:25mm–11cv；ef2:50mm–11cv；ef3:75mm–11cv；ef4:125mm–2.5cv；ef5:250mm–2.5cv；ef6:250mm–2.5cv；ef7:250mm–2.5cv)。将argo蛋白和空对照(仅用于蛋白制备物杂质的表达载体对照)纯化，跑sds-聚丙烯酰胺凝胶，并在考马斯亮蓝中染色1小时，然后在含有水/乙酸/甲醇的溶液中脱色。使用图像j对蛋白质进行定量，图15a、图15b、图15c、图15d和图15e。为了确定最初用于argo#41的超声处理方案是否使用其他argo序列起作用，测试了argo#17和argo#30连同argo#41，以观察超声处理条件是否适用于其他argo。如本文所用，argo序列可以互换地称为ago#或argo#。例如，在表18中可以找到argo#的序列。用2.5ul每种制备物进行对照切割测定。由于ago#17和ago#41显示ssdna切割，因此使用bsa标准品以imagej评价所用蛋白制备物的浓度为：argo#41：0.58μg/反应，argo#17：0.15μg/反应，和argo#30：0.53μg/反应。基于此，利用了0.3μg蛋白/反应，图16。表20：argo蛋白定量表21：裂解条件实施例11：argonaute活性测定对于活性测定，将含有argo蛋白的洗脱级分(ef5)用含有5mmβ-巯基乙醇和250mm咪唑的缓冲液i稀释至最终蛋白浓度为30μg/ml。将总计10μl蛋白质样品与18.5μl反应缓冲液中的0,25μmsgdna或sgrna混合(ago预上样步骤：0,3μg蛋白，0,25μmsgdna/sgrna，20mmtris/hcl，5mmmncl2；250mmnacl，83,3mm咪唑，1.6mmβ-巯基乙醇，1.6％甘油)。将反应物在37℃孵育15分钟。预孵育后，添加ssdna(0,25μm)或dsdna(100ng)模板(1μl)，并在37℃孵育1小时。ago蛋白制备物：dna酶i或超声处理裂解(裂解条件6)洗脱级分4(ef4)：125mm咪唑洗脱级分5(ef5)：250mm咪唑sgdna(表25)：d1...靶向sgdnad2...靶向sgdnant...未靶向sgdna模板：90ntssdna(表24)预期切割产物，对于d1：66bp，24bp预期切割产物，对于d2：69bp，21bp最终缓冲液浓度mncl2:5mmtris/hcl,ph8:15mmnacl：如所示咪唑：32,25mm(ef4),62,5mm(ef5)孵育时间：预孵育(ago+sgdna)：在37℃下，15分钟孵育：在37℃下，1小时为了使ssdna切割测定反应失活，将样品与tbe尿素样品缓冲液(biorad)以1:1的比率在95℃孵育10分钟。将ssdna切割产物在15％tbe尿素凝胶(invitrogen)上解析。将凝胶与sybrgold核酸凝胶染色剂(invitrogen)孵育15分钟，并使用uvsolots成像系统(biometra，analytikjena)可视化。在室温下用蛋白酶k溶液(20μg/反应)(qiagen)使dsdna切割测定反应失活，持续20分钟。将样品与6x上样染料(newenglandbiolabs)混合，然后将其在含有溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶上解析。作为标志物，使用了1kbgeneruler标志物(琼脂糖凝胶)或内部(in-house)制备的ssdna标志物(尿素凝胶)，图14a、图14b和图14c。为了确定由于作为加热结果的核酸解旋而导致的ssdna切割是否在升高的温度下发生，在进行切割测定之前，将argo制备物加热至95℃，持续30分钟，图14d。未消化的质粒用作对照，以观察蛋白质稳定性是否受较高的t影响，图18。基于这些ssdna切割测定，目前正在评价和优化dsdna切割测定。为了利用截短的引导多核酸确定argonaute切割效率，将含有argo蛋白的洗脱级分(ef5)用含有5mmβ-巯基乙醇和250mm咪唑的缓冲液i稀释至最终蛋白浓度为30μg/ml。将总共10μl蛋白质样品与30μl反应缓冲液(蛋白质，截短的sgdna/sgrna(表22)，tris/hcl,mncl2；nacl，咪唑，β-巯基乙醇和甘油)中的0,08μmsgdna或sgrna混合。将反应物在37℃孵育15分钟。预孵育后，添加ssdna(0,8μm)模板(1μl)，并在37℃孵育1小时，图26a和图26b。表22：截短的sgdna表23：dsdna切割测定表24：ssdna切割测定表25：sgdna/sgrna实施例12：哺乳动物细胞dna切割测定断裂荧光蛋白(fp)系统可以用作活细胞中蛋白质定位可视化中的蛋白标记工具。在该测定中，断裂荧光蛋白系统用于评估不同蛋白/构建体的dna切割活性。图18显示了该测定的概述。简而言之，构建了在荧光蛋白内具有移码的细胞系，其可以通过非同源末端连接修复，然后，修复的细胞显示出荧光。在自互补断裂的gfp1-10/11系统中，两个片段(g1-10和g11)可以通过自身缔合以形成功能性gfp信号。feng等人(2017)的一项研究显示，g1-10和g11之间插入96bp接头对gfp信号的荧光影响最小。因此，我们缺失了2bp的接头以对接头和gfp11片段移码，从而关闭了gfp信号。可以在94bp接头内选择不同的靶位点以进行dna切割。如果接头被切割或形成缺口，则来自非同源末端连接修复或同源定向修复的插入或缺失可以使接头和gfp11在框内，并且可以检测到gfp信号。所使用的gfp1-10/11系统的序列从先前报道的sfgfp工程化而来(cabantous,s.,terwilliger,t.c.,waldo,g.s.(2005)proteintagginganddetectionwithengineeredself-assemblingfragmentsofgreenfluorescentprotein.natbiotechnol.23,102-7)。该构建体用于制备稳定的哺乳动物细胞系6808。sffv启动子用于控制报告蛋白的表达，并且mcherry用作表达标志物以代表具有插入的94_接头的gfp1-10/11系统的表达。对于慢病毒的生成，将hek293t细胞分别以9:8:1的比率瞬时转染了phr构建体、pcmv–dr8.91和pmd2.g。转染后72小时收集病毒上清液，通过0.45μm过滤器，并通过在4℃孵育过夜，使用lenti-x浓缩器(clontech)浓缩10倍。通过用表达上述体系结构的慢病毒转导hek293t细胞来生成6808报告细胞系，该体系结构的实例也显示在图19-21和图35中。使用针对鉴定的转化细胞的mcherry标志物表达的bdfacsaria2，通过荧光激活细胞分选(facs)对单细胞进行分选。使用cas9系统验证了6808报告细胞系靶向94_接头。将6808细胞以每孔1x105的密度接种在12孔板/孔中。对于切割和缺口实验的瞬时转染，将细胞在用每孔1.5μg总质粒(sgrna和cas9或cas9n在同一质粒上)接种之后使用transitlt1转染试剂(mirus)以6μl转染试剂：1.5μg质粒的比率，转染1天。转染72小时后收集转染的细胞以分析gfp表达。为了分析gfp表达，使用0.05％胰蛋白酶edta(lifetechnologies)解离细胞，并在bdlsrii上通过流式细胞术进行分析。使用flowjo分析流式细胞术数据。每个样品分析10,000个活细胞。表26中提供了选择的序列。使用未转化的hek293t细胞(图22a)进行了一系列对照实验，和使6808细胞进一步暴露于以下：无质粒，单独的cas9，cas9和非靶向引导rna，cas9和非靶向引导rna及跨越双链断裂的单链寡脱氧核苷酸供体(ssodn_3或ssodn_4)，或在具有或没有非靶向引导rna的情况下的cas9切口酶(ncas9)，和单链寡脱氧核苷酸供体(ssodn_3和ssodn_4)(图22b-k)。通过荧光激活细胞分选对处理的细胞进行分析，其中gfp荧光截止值为105。如图22a-k所观察到的，对照实验显示出非常低的荧光细胞比率，在所有情况下均远低于0.1％。图23显示了使用cas9和靶向94_接头的引导rna(sgrna6819，示于图19中)进行实验的结果，这种处理的结果是17.2％的细胞获得了荧光。图24显示了使用cas9切口酶和靶向94_接头的引导rna(sgrna6821，示于图20中)进行实验的结果，在这种情况下，8.23％的细胞获得了荧光。荧光细胞的数量可以通过用cas9切口酶、靶向94_接头的引导rna及ssodn_3或ssodn_4供体处理6806细胞来进一步增加。这些处理分别导致46.3％(图25a)和54.2％(图25b)的细胞发荧光。为了分析在不同处理条件下发生的dna修复的形式，从gfp阳性细胞中收集dna并测序。由于多个拷贝的报告片段整合至细胞中，因此通过miseq分析了gfp阳性细胞中的nhej和hdr百分比。转染72小时后收集转染的细胞以分析gfp表达。使用bdfacsaria2，通过荧光激活细胞分选(facs)对gfp阳性群体细胞进行批量分选。收集每个样品的100万个gfp阳性细胞以制备总dna(dneasyblood&tissue试剂盒，qiagen)。将扩增子固定在300bp，并且sgrna靶向位点位于测序可有效覆盖的区域中。按照手册使用kapahifipcr试剂盒(kapabiosystems)进行pcr扩增。pcr条件：95℃5min；98℃,20s,64℃,20s,72℃20s,23个循环,72℃,5min。通过凝胶电泳检查pcr产物的正确扩增子。然后汇集每个样品的10个pcr，并在75bp配对末端miseq测序运行上运行。图27a显示了对未处理的6808细胞进行测序反应的结果，仅0.5％的读段显示出与非同源末端连接修复一致的修饰，而99.5％的读段显示出未修饰的dna。图27b显示了对用ncas9、非靶向引导rna和ssodn_4处理的6808细胞进行测序反应的结果，仅0.3％的读段显示出与非同源末端连接修复一致的修饰，而99.7％的读段显示出未修饰的dna。图28显示了对用ncas9和sgrna6821处理的6808细胞进行测序反应的结果。有趣的是，2.1％的读段显示出与非同源末端连接修复一致的修饰，而97.9％的读段显示出未修饰的dna。图29显示了对用ncas9、sgrna6821和ssodn_4供体处理的6808细胞进行测序反应的结果，35.8％的读段显示出与同源定向修复一致的修饰，0.6％的读段显示出与非同源末端连接修复一致的修饰，0.7％的读段显示出与混合的同源定向修复和非同源末端连接修复一致的修饰，以及62.8％的读段显示出未修饰的dna。图30显示了对用cas9和sgrna6825处理的6808细胞进行测序反应的结果，95.7％的读段显示出与非同源末端连接修复一致的修饰，以及4.3％的读段显示出未修饰的dna。图31显示了对用cas9、sgrna6825和ssodn_4供体处理的6808细胞进行测序反应的结果；10.9％的读段显示出与同源定向修复一致的修饰，82％的读段显示出与非同源末端连接修复一致的修饰，0.9％的读段显示出与混合的同源定向修复和非同源末端连接修复一致的修饰，以及仅10.9％的读段显示出未修饰的dna。如本文所述，6808细胞测定用于评估不同ago的dna编辑活性。将报告细胞系293t6808以每孔100k接种在具有1ml含5％fbs的dmem培养基的12孔板中。转染前，使用表27中的配方列表将细胞生长24小时。转染后72小时，将细胞从板中胰蛋白酶化，通过70um细胞滤网过滤，并如上所述通过facs分析。图32a和32b显示了测定结果。如图32a和图32b中所观察到的，一些ago蛋白导致gfp阳性细胞百分比显著高于阴性对照。表26：6808细胞测定中使用的序列表27：用ago蛋白进行6808细胞测定的配方表28：ssdna切割测定中所用的表达载体当前第1页12