用于癌症治疗的工程化干细胞的制作方法

本发明涉及用于治疗癌症的工程化干细胞。具体而言，这些工程化干细胞至少包含自杀基因及免疫检查点基因。

背景技术：

通过与pd-1/pd-l1路径相互作用的检查点免疫疗法处于癌症治疗的前沿(cuttingage)，且为癌症的治愈提供希望。由此基因编码的蛋白质是天然细胞毒性受体(ncr3)，其可帮助nk细胞溶解肿瘤细胞。然而，高达70％的患者对治疗无反应，在一些临床病例中甚至引起严重的并发症(thejournalofclinicalendocrinology&metabolism2013,98(4):1361-1375)。业内亟需改良，使得抑制剂能够选择性地在肿瘤内累积且不会在外周正常组织中引起自体免疫反应。

us20180214544提供免疫检查点阻断及造血干细胞移植及/或造血干细胞动员的组合，其在疾病疗法中产生协同效应。然而，仍然需要改良免疫检查点抑制剂的效应。

技术实现要素：

本揭示内容提供工程化干细胞，其包含载体，所述载体包含聚核苷酸，所述聚核苷酸含有自杀基因的核酸序列、免疫检查点基因的核酸序列和天然细胞毒性触发受体序列或tnf相关的细胞凋亡诱导配体序列，其中所述干细胞是靶向肿瘤的细胞。

所述工程化干细胞的某些实施例包括胚胎干细胞、骨髓基质细胞、造血干细胞及神经干细胞。所述工程化干细胞的特定实施例是msc。所述工程化干细胞的另一特定实施例是脐带间充质干细胞(umsc)。

所述自杀基因的某些实施例包括胞嘧啶去胺酶基因、水痘带状疱疹病毒胸苷激酶基因、硝基还原酶基因、大肠杆菌(escherichiacoli)gpt基因、大肠杆菌deo基因、胸苷激酶基因(tk)、半胱天冬酶1、半胱天冬酶3、半胱天冬酶6、半胱天冬酶7、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9及fas或胞嘧啶去胺酶(cd)。

所述免疫检查点基因的某些实施例包括e3泛素连接酶cbl-b、ctla-4、pd-1、tim-3、杀手细胞抑制性受体(kir)、lag-3、cd73、fas、芳烃受体、smad2、smad4、tgf-β受体、ilt-3、ido、kir及lag3。

所述天然细胞毒性触发受体的某些实施例包括ncr1、ncr2及ncr3。

trail基因的某一实施例包括tic10。

本揭示内容提供套组或组合，其包含本揭示内容的载体或工程化细胞及视情况另一活性剂。

本揭示内容亦提供用于治疗个体的癌症或增强肿瘤内免疫性的方法，其包含向所述个体投与有效量的本揭示内容的工程化干细胞。在一个实施例中，有效量是在100,000(1×10⁵)至2,000,000(2×10⁶)个细胞范围内。在一个实施例中，癌症是转移性癌症。

附图说明

图1a至1g显示umsc及umsc-trail-tk-pd-1的活体外表征。a.来自华通氏胶(wharton’sjelly，wj)的脐带间充质干细胞(umsc)的细胞形态及生物性质。b.流式细胞术图显示细胞对cd1q、cd3、cd10、cd14、cd31、cd34、cd45、cd49d、cd56、cd117及hla-dr呈阴性，但对cd13、cd29、cd44、cd73、cd90、cd105、cd166、cd49b及hla-abc呈阳性。c.rfp及pd-1流式细胞术及利用转基因(umsc-pd-1及umsc-trail-tk-pd-1)转导的结果。d-e.umsc-trail-tk-pd-1-luc保留萤光素酶表达超过100天，且e通过brdu掺入的细胞增殖分析及通过transwell分析的迁移揭示在培育14h后，与未经标记的umsc相比，遗传修饰不影响活体外umsc-trail-tk-pd-1细胞存活率(e-(a))、细胞增殖(e-(b))或迁移(e-(c))。f.umsc-trail-tk-pd-1展示与无质粒标记的普通umsc类似的行为。g.通过利用map-2、tuj-1及gfap的免疫萤光鉴别umsc-trail-tk-pd-1的神经胶质细胞分化；结果展现如普通umsc一样的折光性细胞体形态以及排列成网络的延伸神经突样结构。

图2a至2d显示umsc-trail-tk-pd-1的活体外免疫评价。a.hrp偶联的pd-1蛋白的结合亲和力从剂量依赖性方式显著增加。b.门控策略是基于第一门的合理性、通过fsc-a及fsc-h排除双联体、通过选择7-aad⁺(r&dsystems)/cd45⁺或fsc-a排除死细胞(b-(a)及b-(b))。c.umsc(在1:1的比率下)显著抑制cd4⁺及cd8⁺t细胞二者的增殖(c-(a)及c-(b))。然而，在1:1或1:10的比率下，umsc-trail-tk-pd-1显著增加cd4⁺及cd8⁺t细胞二者的增殖(c-(a)及c-(b))。d.与umsc相比，经cd3-cd28刺激的umsc-trail-tk-pd-1展现cd4⁺inf-γ⁺的含量显著增加(d-(a))且cd8⁺cd122⁺减少(d-(b))。

图3a至3e显示umsc-trail-tk-pd-1-gfp的活体外自杀及旁观者效应。a.通过西方墨点(westernblot)，与umsc-akt及umsc相比，在umsc-trail-tk-pd-1中发现tk的含量增加。b.gcv自身并不影响umsc的细胞增殖。根据免疫组织化学，在gcv处理后，磷酸化的gcv在24h及48h诱导umsc-trail-tk-pd-1-gfp中的细胞凋亡样细胞损伤(白色箭头)(b-(b))。umsc-trail-tk-pd-1-gfp的细胞增殖是从剂量依赖性方式被抑制(b-(a))。c.在0μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、100μg/mlgcv存在下，在共培养24h,48h及72h后，umsc-trail-tk-pd-1-gfp显著减弱4t1-luc细胞(c-(a)、c-(b))、hep55.1c(c-(c)及c-(d))、pan18-luc(c-(e)及c-(f))、ct26-luc(c-(g)及c-(h))及gl261-luc(c-(i)及c-(j))的生长。d-e.在此共培养系统中，因自杀效应所致的细胞死亡率在前两天期间缓慢达到整个系统的约三分之一，且然后随后自第3天加速至第6天。相同发现显示，大多数4t1-luc细胞自第3天至第5天被杀死。此外，使用流式细胞术，通过pi/膜联蛋白-v染色在此旁观者效应下对凋亡细胞的定量评价显示gcv剂量依赖性及时间依赖性方式的显著细胞毒性(e-(a)至e-(d))。图4a至4c显示表达trail的umsc-trail-tk-pd-1在4t1-luc及hep55.1c-luc细胞中展示活体外抗肿瘤活性。a.如通过facs分析所量测，经遗传修饰的umsc-trail-tk-pd-1容许umsc细胞表面上的相关trail蛋白表达(90％)。b.表达trail的umsc-trail-tk-pd-1尤其在共培养后72小时诱导细胞凋亡(4t1-luc、hep55.1c-luc)，细胞凋亡从细胞皱缩、贴壁4t1-luc细胞的减少(b-(a))及具有细胞碎片外观的hep55.1c-luc(b-(b))为代表，其由碘化丙啶染色(pi染色)证实(b-(c))。c.定量地，如通过facs分析所量测，在24小时、48小时及72小时发生细胞死亡(c-(a)及c-(b))，在共培养物中检测到大量膜联蛋白-v⁺pi⁺死细胞(≥70％)，其中umsc-trail-tk-pd-1是从剂量依赖性方式存在。

图5a至5g显示在一些肿瘤模型中，umsc-trail-tk-pd-1-luc的肿瘤靶向。a.如通过活体外ivis所量测，生物发光强度从umsc-trail-tk-pd-1-luc细胞剂量依赖性方式而增加。b.umsc-trail-tk-pd-1-luc存活且重新定位至皮下4t1肿瘤。最初在静脉内umsc-trail-tk-pd-1-luc注射后5天观察到ivis影像中皮下肿瘤区域的生物发光信号，之后强度逐渐增加，且在第14天达到峰值。c-e.股动脉内注射后2小时，动脉内umsc-trail-tk-pd-1-luc移植直接募集至正位4t1肿瘤区域(c)而无肺压迫(lungentrapment)(亦适用于hep55.1c(d)及pan18肿瘤区域(e))。随后，umsc-trail-tk-pd-1-luc存活且重新定位至肿瘤部位。f.如在多个转移部位中通过ivis所量测，来自原始4t1-肿瘤模型的转移肿瘤显著募集umsc-trail-tk-pd-1-luc，从而增加生物发光强度。g.根据免疫组织化学分析，在治疗后1天，在4t1肿瘤中发现多个gfp⁺萤光素酶⁺细胞，此指示umsc-trail-tk-pd-1-gfp募集至肿瘤微环境中。

图6a至6g显示umsc-trail-tk-pd-1在4t1-luc模型中的治疗效应。a.通过ivis、肿瘤体积及q4dx3疗程方案后的存活时间来评价经基因修饰的umsc的各种策略治疗的表达萤光素酶的荷4t1-luc及hep55.1c-luc肿瘤的小鼠中的杀肿瘤效应。b.在治疗之前，使每组测试细胞于3％o2中经受低氧预处理培养，从时间依赖性方式诱导cxcr4过表达(通过西方墨点)，从而增强干细胞归巢。c.umsc-pd-1(up)组及umsc-trail(ut)组展现治疗效应，其与如通过ivis所量测的igg对照组的彼等肿瘤体积相比降低肿瘤体积。此外，umsc-tk-pd-1+gcv(utpg)组、umsc-trail-tk+gcv(uttg)组及umsc-trail-pd-1(utp)组分别显示更强的抗肿瘤效应且展现对肿瘤生长的抑制。d.与其他组(d-(a)至d-(d))相比，静脉内utp显著延长4t1及hempa55.1c模型的存活时间。e.与对照小鼠的肺中超过20个转移相比，在经utp治疗的小鼠中发现少于5个肺转移结节。然而，与对照组相比，umsc-tk(ut)、up及utp并不显示转移的显著降低。f-g.接下来，为验证动脉内注射umsc-trail-tk-pd-1是否在q7dx2疗程方案后在4t1-luc及hep55.1c-luc模型中展示显著强劲的治疗效应，分成四个群组(umsc-tk-pd-1+gcv(utpg)组、umsc-trail-tk-pd-1(uttp)组及umsc-trail-tk-pd-1+gcv(uttpg)组)从检查肿瘤生长及中值存活时间(f-(a))。在动脉内注射的分析之前，umsc-trail-tk-pd-1+gcv(uttpg)组的静脉内投与分别显示较igg对照、utpg及uttp的其他组更强的抗肿瘤效应(f-(b))。重要的是，动脉内植入揭示强有力优于静脉内植入的治疗效应。此外，在4t1-luc(f-(c-d))及hep55.1c-luc(g-(a-b))模型中，uttpg组分别较igg对照、utpg及uttp的其他组显著抑制肿瘤生长且延长小鼠的中值存活时间。不幸的是，在4t1-luc模型中，投与抗pd-l1并不显示任何显著的治疗效应(f-(c))。

图7a至7d显示uttpg治疗增强肿瘤微环境(tme)中的免疫性。a.门控策略是基于第一门的合理性、通过fsc-a及fsc-h排除双联体、通过选择7-aad⁺(r&dsystems)/cd45⁺或fsc-a排除死细胞(a-(a))。跨越uttpg治疗组及其他治疗组，肿瘤浸润性cd45⁺白血球的百分比存在总体增加(a-(b))。与其他组相比，在uttpg治疗中，cd3⁺cd8⁺及cd3⁺cd4⁺t细胞二者的频率显著增加(a-(c)及a-(d))。b-c.uttpg诱导treg及tam的显著减少(b-(a)及b-(b))，且通过此逆转肿瘤内cd8⁺(c-(b))及cd4⁺(c-(a))t细胞对treg的比率。另外，tam的数量因应uttpg治疗而急剧减少，此增加tme中cd8⁺(c-(d))及cd4⁺(c-(c))t细胞对tam的比率。d.细胞内颗粒酶b(grb⁺)(d-(b))及ki67⁺(d-(a))细胞的显著上调指示uttpg治疗不仅增加抗肿瘤免疫群体，且亦有效地达成til的活化及增殖。

具体实施方式

除非另有定义，否则本文所使用的所有技术及科学术语均具有与熟习本发明所属领域技术者通常所理解的含义相同的含义。通常，将在下文中阐述的本文所使用的命名法及实验方法是业内熟知且通常采用的那些命名法及实验方法。

如本文所使用，术语「一(a、an)」、「所述(the)」及类似引用应解释为涵盖单数及多数二者。

如本文所使用，术语「经遗传修饰的细胞」、「重定向细胞」、「遗传工程化细胞」或「经修饰细胞」是指表达本发明的重组聚核苷酸的细胞。

术语「聚核苷酸」、「核酸」及「寡核苷酸」在本文中可互换使用从而指任一长度的核苷酸的聚合形式，无论为去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。

如本文所使用，术语「基因」是指含有至少一个开放阅读框(orf)的聚核苷酸，其能够在转录且转译之后编码特定多肽或蛋白质。

如本文所使用，术语「编码」在其应用于聚核苷酸时是指认为「编码」多肽的聚核苷酸，其若从其天然状态或在通过熟习此项技术者所熟知的方法操控时，可转录及/或转译从而产生多肽及/或其片段的mrna。反义链是此一核酸的补体，且可自其推断出编码序列。

如本文所使用，术语「依可操作方式连接」是指调控序列与异源核酸序列之间的功能链接体，从而使后者表达。举例而言，当第一核酸序列与第二核酸序列位于功能关是中时，所述第一核酸序列与所述第二核酸序列依可操作方式连接。例如，若启动子影响编码序列的转录或表达，则所述启动子依可操作方式连接至所述编码序列。

如本文所使用，术语「表达」是指聚核苷酸转录成mrna的过程及/或经转录的mrna随后转译成肽、多肽或蛋白质的过程。

如本文所使用，术语「表达载体」是指包含重组聚核苷酸的载体，所述重组聚核苷酸包含依可操作方式连接至欲表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包含足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其他元件可由宿主细胞或在活体外表达系统中供应。

如本文所使用，术语「胸苷激酶」或「tk」意指胸苷激酶自杀基因「tk」，其在业内已知为重组载体提供生物安全性。除非另有指定，否则术语「tk」意指业内已知基因的野生型(wt)及/或突变形式。

如本文所使用，术语「骨髓基质细胞」亦称为「间充质干细胞」或msc，其是可分化成多种细胞类型的多能干细胞。

如本文所使用，术语「个体(subject、individual)」或「患者」可互换使用，且是指脊椎动物、优选地哺乳动物、更佳地人类。

如本文所使用，术语「治疗(treatment或treating)」应理解为包括在治疗、缓和或改善损伤、病理或病状方面的任何成功迹象。此可包括诸如以下等参数：减轻；缓解；减少症状；使退化或衰退速率减缓；使退化终点较少地减弱；改良患者的身体或心理健康；或预防疾病发作。

如本文所使用，术语「治疗有效量」在提及疾病/病状的症状使用时是指改善、减弱或消除一或多种疾病/病状的症状或预防或延迟一或多种症状发作的化合物的量及/或浓度。

间充质干细胞(msc)被视为是通过基因转移表达治疗性蛋白质的细胞媒介，且显示独特的将抗癌物质靶向递送至各种肿瘤(包括黑色素瘤、神经胶母细胞瘤及乳癌)的动物模型的肿瘤归巢向性。存在若干种优点，例如易于分离及扩增、免疫耐受性质及全身或局部递送。尽管目前通过病毒转导dna至msc的遗传工程化方法可应用为用于癌症治疗的诊断及治疗性策略，但其可诱导有害转变从而增加继发性恶性病风险。

测试msc是否可代表递送抗癌功能的遗传材料的有效媒介是必不可少的。肿瘤坏死因子(tnf)相关的细胞凋亡诱导配体(trail)是与tnf及fasl具有序列同源性的有希望抗癌死亡配体，其可通过结合至其死亡受体(dr)来介导细胞凋亡效应，此乃因特定而言在trail-r1/dr4及trail-r2/dr5活化时，同三聚体(蛋白质复合物)引起半胱天冬酶-8活化，从而触发细胞凋亡(natrevcancer2008；8:782-98；science1998；281:1305-8；eurjcancer2006；42:2233-40)。此外，自杀基因疗法是基于转移编码单纯疱疹病毒胸苷激酶(hsv-tk)的自杀蛋白的基因，其通过经由病毒tk酶优先将无毒前药更昔洛韦(ganciclovir，gcv)单磷酸化成有毒化合物使其对gcv选择性地敏化(molbiolcell2002；13:4279-95)。嵌合抗原受体-t细胞(car-t)免疫疗法与自杀基因修饰组合已证实不仅抑制肿瘤过生长，且亦改良安全性概况从而促进临床开发(journalofcancer2011；2:378-382)。

尚未证实pd-1或ncr3过表达的msc是否将增强至肿瘤中的迁移及免疫敏化、诱导肿瘤死亡以及降低发炎。本揭示内容开发具有固有抗肿瘤能力的天然奈米粒子，从而在治疗基因工程化中发挥重要作用。

在一实施例中，本揭示内容提供工程化干细胞，其包含载体，所述载体包含聚核苷酸，所述聚核苷酸含有自杀基因的核酸序列、免疫检查点基因核酸序列和天然细胞毒性触发受体序列或tnf相关的细胞凋亡诱导配体序列；其中所述干细胞是靶向肿瘤的细胞。

在一个实施例中，所述靶向肿瘤的细胞是选自由以下组成的群的干细胞：胚胎干细胞、骨髓基质细胞、造血干细胞和神经干细胞。

在一个实施例中，干细胞是msc。在一个实施例中，msc具有表型cd34^-/cd45^-/cd105⁺/cd90⁺/cd73⁺。已显示msc在活体外或活体内分化，包括成骨细胞、软骨细胞、肌细胞和脂肪细胞。间充质是胚胎结缔组织，其源自中胚层且分化成造血及结缔组织，而msc不分化成造血细胞。基质细胞是结缔组织细胞，其形成组织的功能细胞驻留其中的支撑结构。

在遗传学中，自杀基因将引起细胞经由细胞凋亡杀死自身。在一些实施例中，自杀基因是胞嘧啶去胺酶基因、水痘带状疱疹病毒胸苷激酶基因、硝基还原酶基因、大肠杆菌gpt基因、大肠杆菌deo基因、胸苷激酶基因(tk)、半胱天冬酶1、半胱天冬酶3、半胱天冬酶6、半胱天冬酶7、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9、fas或胞嘧啶去胺酶(cd)。在某一实施例中，自杀基因是胸苷激酶基因。在一个实施例中，tk基因是野生型tk基因。在另一实施例中，tk基因是所述基因的突变形式。在一些实施例中，胸苷激酶序列包括(但不限于)以下序列。

hsv1-tk序列

无cpg的hsv1-tk序列

免疫检查点是免疫系统的调控者。免疫检查点分子由于其用于多种类型的癌症中的潜力而被视为癌症免疫疗法的靶标。免疫检查点基因的实例包括(但不限于)e3泛素连接酶cbl-b、ctla-4、pd-1、tim-3、杀手细胞抑制性受体(kir)、lag-3、cd73、fas、芳烃受体、smad2、smad4、tgf-β受体、ilt-3、ido、kir和lag3。在某一实施例中，免疫检查点基因是pd-1。在一些实施例中，pd-1序列包括(但不限于)以下序列。

pd-1序列

天然细胞毒性触发受体亦可用于本揭示内容的载体中。天然细胞毒性触发受体的实例包括(但不限于)ncr1、ncr2和ncr3。在某一实施例中，天然细胞毒性触发受体是ncr3。在一些实施例中，ncr3序列包括(但不限于)以下序列。

ncr3序列

tnf相关的细胞凋亡诱导配体(trail)是作为诱导细胞死亡过程的配体起作用的蛋白质。trail基因的实例包括(但不限于)tic10。在一些实施例中，tic10序列包括(但不限于)以下序列。

trail序列

本揭示内容的载体包含一或多个控制序列从而调控本揭示内容的聚核苷酸的表达。已分离的聚核苷酸在插入载体中之前，依所利用的表达载体而定，可能需要或必要对其进行操纵。利用重组dna方法修饰聚核苷酸及核酸序列的技术为业内所熟知。在一些实施例中，控制序列尤其包括启动子、前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、信号肽序列及转录终止子。在一些实施例中，适宜启动子是依据所选择的宿主细胞来选择。

揭示一种重组表达载体，其包含本揭示内容的聚核苷酸及一或多个表达调控区，例如启动子和终止子、复制起点等，此取决于其计画引至其中的宿主的类型而定。组成型启动子的非限制性实例包括sffv、cmv、pkg、mdnu3、sv40、ef1a、ubc及cagg。

在一些实施例中，本文所阐述的各种核酸及控制序列接合在一起，产生重组表达载体，其包括一或多个合宜限制位点，从而容许本揭示内容的聚核苷酸在这些位点处插入或取代。或者，在一些实施例中，通过将聚核苷酸或包含所述序列的核酸构筑体插入至适当表达载体中来表达本揭示内容的聚核苷酸。在涉及产生表达载体的一些实施例中，使编码序列定位于载体中，从而使得所述编码序列与适当控制序列依可操作方式连接，从而进行表达。重组表达载体是方便接受重组dna程序且可达成本揭示内容的聚核苷酸表达的任何适宜载体(例如质粒或病毒)。载体的选择通常取决于载体与欲引入所述载体的宿主细胞的相容性。载体可是线性或闭环质粒。在一个实施例中，载体是病毒载体。病毒载体的实例包括反转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、阿尔法病毒(alphavirus)载体及诸如此类。在某一实施例中，病毒载体是慢病毒载体。慢病毒载体是基于或源自致癌反转录病毒(含有mlv的反转录病毒的亚群)及慢病毒(含有hiv的反转录病毒的亚群)。这些病毒的实例包括(但不限于)人类免疫缺失病毒(hiv)、马传染性贫血病毒(eiav)、猿猴免疫缺失病毒(siv)及猫免疫缺失病毒(fiv)。或者，预期其他反转录病毒可用作载体骨架的基础，例如鼠类白血病病毒(mlv)。

在一些实施例中，本揭示内容中所使用的载体是plas3w、plas3w.ppuro、plas3w.pneo、plas3w.phyg及plas3w.pbsd、pcmv-δr8.91或pmd.g。

在另一实施例中，本发明提供套组或组合，其包含本揭示内容的载体或工程化细胞及视情况另一活性剂。在一个实施例中，所述另一活性剂是gcv。

本揭示内容的载体或工程化细胞通常与另一载剂组合，所述另一载剂是例如化合物或组合物、惰性(例如可检测试剂或标记)或活性物，例如佐剂、稀释剂、黏合剂、稳定剂、缓冲剂、盐、亲脂性溶剂、防腐剂、佐剂或诸如此类且包括医药上可接受的载剂。载剂亦包括医药赋形剂及添加剂、蛋白质、肽、氨基酸、脂质及碳水化合物(例如糖，包括单醣、二醣、三醣、四醣及寡醣；衍生糖，例如醛醣醇、醛醣酸、酯化糖及诸如此类；及多醣或糖聚合物)。例示性蛋白质赋形剂包括血清白蛋白，例如人类血清白蛋白(hsa)、重组人类白蛋白(rha)、明胶、酪蛋白及诸如此类。载剂进一步包括缓冲剂或ph调整剂；通常，缓冲剂是自有机酸或碱制备的盐。代表性缓冲剂包括有机酸盐，例如柠檬酸盐、抗坏血酸盐、葡萄糖酸盐、碳酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、乙酸盐或苯二甲酸盐；tris、胺丁三醇盐酸盐或磷酸盐缓冲剂。

本文所阐述的任一组合物可包含于套组中。在非限制性实例中，用于细胞疗法的细胞或一或多种从而产生细胞的试剂可包含于套组中。套组亦可包含第二容器器件，其用于含有无菌、医药上可接受的缓冲剂及/或其他稀释剂。在套组中存在一种以上的组分时，套组通常亦将含有第二、第三或其他额外容器，其中可单独地放置这(些)其他组分。然而，组分的各种组合可包含于小瓶中。套组可具有单一容器器件，及/或其可具有针对每一化合物的不同容器器件。本发明的套组通常亦将包括用于容纳用于商业销售的呈封闭限制形式的任何容器的器件。这些容器可包括期望小瓶保存于其中的注射或吹塑成型塑胶容器。

在另一实施例中，本发明提供用于治疗个体的癌症或增强肿瘤内免疫性的方法，其包含向所述个体投与有效量的本揭示内容的工程化干细胞。在一个实施例中，有效量是在100,000(1×10⁵)至2,000,000(2×10⁶)个细胞范围内。在一些实施例中，有效量是在1×10⁵至1×10⁶个细胞范围内。

在一个实施例中，癌症是转移性癌症。

在一个实施例中，所述方法经由增加具有中枢记忆潜能的肿瘤特异性cd8⁺ifn-γ⁺cd44⁺t细胞来增强肿瘤微环境中的免疫性。在一个实施例中，所述方法诱导treg的显著减少，且通过此逆转肿瘤内cd8⁺及cd4⁺t细胞对treg的比率。所述方法亦减少tam的数量，此增加tme中cd8⁺及cd4⁺t细胞对tam的比率。在一个实施例中，有效量是在100,000(1×10⁵)至2,000,000(2×10⁶)个细胞范围内。在一些实施例中，有效量是在1×10⁵至1×10⁶个细胞范围内。

使用如本文所阐述的方法及组合物治疗的例示性癌症是乳癌、结肠癌、直肠癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、皮肤癌、脑癌、膀胱癌、子宫内膜癌、肾癌、胰脏癌、甲状腺癌或黑色素瘤或其转移性癌症。例示性癌细胞包括(但不限于)癌、黑色素瘤、白血病、纤维肉瘤、肉瘤、腺癌和神经胶质瘤。

递送方法包括(但不限于)动脉内、肌内及静脉内。在具体实施例中，可期望将本揭示内容的医药组合物及/或细胞局部投与至需要治疗的区域；此可通过(例如但不限于)在手术期间的局部输注、通过注射或藉助导管来达成。在一些实施例中，通过静脉内注射投与这些组合物或细胞。在另一实施例中，通过肌内注射投与这些组合物或细胞。这些组合物可从一次注射或从多次注射来投与。含有这些细胞的溶液可于适宜稀释剂中来制备，例如水、乙醇、甘油、液体聚乙二醇、各种油类及/或其混合物以及熟习此项技术者已知的其他稀释剂。在一些实施例中，本揭示内容的工程化干细胞可从静脉内或动脉内方式而投与个体。本揭示内容意外地发现，本揭示内容的工程化干细胞的以上投与在治疗癌症、增强肿瘤内免疫性或增强肿瘤微环境中的免疫性方面具有有利效能。具体而言，动脉内投与展现优于静脉内投与的效能。

在一个实施例中，本揭示内容的工程化干细胞可与另一活性剂一起投与。在一些实施例中，可并行、分开或同时投与所述工程化干细胞及所述另一活性剂。在一个实施例中，可定期投与所述工程化干细胞及所述另一活性剂。在另一实施例中，所述另一活性剂是gcv。

应理解，若本文中提及任何先前技术出版物，则此提及并不构成承认所述出版物形成此项技术中公知常识的一部分。

尽管已出于清晰理解的目的藉助说明及实例相当详细地提供揭示内容，但熟习此项技术者将明了，可在不背离本揭示内容的精神或范围的情形下实践各种变化及修改。因此，前述说明及实例不应解释为具有限制性。

实例

方法及材料：

umsc及其他干细胞的制备、分离及表征

将由中国医药大学附设医院(chinamedicaluniversityhospital,taichung)的机构审查委员会(institutionalreviewboard，irb)批准的所收集的人类脐带组织用无ca²⁺及mg²⁺的pbs(dpbs,lifetechnology)洗涤三次。通过剪刀在中线方向上对其进行机械切割，且将脐动脉、静脉的血管及外层膜(outliningmembrane)自华通氏胶(wj)分离。然后将胶冻内容物粗略地切割成小于0.5cm³的碎片，利用1型胶原酶(sigma,stlouis,usa)处理且在37℃下于95％空气/5％co2湿润气氛下培育3h。然后将外植体于含有10％胎牛血清(fcs)及抗生素的dmem中在37℃下于95％空气/5％co2湿润气氛下培养。使其静置5-7天从而容许细胞自外植体迁移。脐带源间充质干细胞(umsc)的细胞形态在传代4-8次后在培养物中变为均匀纺锤形，且通过流式细胞分析表征来自wj的特异性表面分子。利用于pbs中的2mmedta使细胞分离，用含有2％bsa及0.1％迭氮化钠(sigma,usa)的pbs洗涤且与偶联有异硫氰酸萤光黄(fitc)或藻红素(pe)的各别抗体一起培育，所述各别抗体包括cd13、cd29、cd44、cd73、cd90、cd105、cd166、cd49b、cd1q、cd3、cd10、cd14、cd31、cd34、cd45、cd49d、cd56、cd117、hla-abc及hla-dr(bd,pharmingen)。此后，使用bectondickinson流式细胞仪(bectondickinson,sanjose,ca)来分析细胞。

可根据业内已知的程序获得且培养其他类型的干细胞。

质粒构筑：

通过特异性限制酶连接体(tk中的ecor1及nhe1、pd-1中的bamh1及not1)将来自tk(0.1μg)(puno1-hsv1tk,invivogen)、ncr3(0.1μg)(plenti-c-mgfp-ncr3,origene)、trail(0.1μg)(pcmv6-myc-ddk-trail,origene)或pdcd-1(0.1μg)(plenti-c-myc-ddk-pdcd1,origene)质粒的tk、ncr3、trail、pd-1及gfpcdna转移至pires(clontech)或psf-cmv-cmv-sbfi(oxfordgenetics)中从而构建pires-tk-pd-1、pires-tk-gfp、pires-pd-1-gfp等的构筑体，依照制造商的说明书通过xtremegenehpdna(roche)将所述构筑体转染至umsc中从而工程化为umsc-tk-pd-1、umsc-tk-gfp及umsc-pd-1-gfp。以上构筑体可转染至其他类型的干细胞中。

慢病毒质粒：

慢病毒载体(plas3w)及包装(pspax2)/包封质粒(pmd2.g)是自academiasinica,taiwan获得。通过特异性限制酶连接体(tk中的ecor1及nhe1、pd-1中的bamh1及not1)将自cdna(puno1-hsv1tk,invivogen；plenti-c-mgfp-ncr3,origene；pcmv6-myc-ddk-trail、origeneplenti-c-myc-ddk-pdcd1,origene)重组的编码全长人类tk、ncr3、trail、pd-1及对照gfp的cdna转移至pultra(addgene)及psf-cmv-cmv-sbf1(oxfordgenetics)中从而构建为pultra-trail-tk-pd-1、pultra-tk-pd-1、pultra-tk-gfp、pultra-pd-1-gfp及pultra-trail-gfp的构筑体。随后，使用特异性引物通过pcr扩增这些模板，且用限制酶消化，亚选殖至慢病毒载体骨架质粒plas2w及plas3w(academiasinica,taiwan)(lenti-tk-gfp、lenti-pd-1-gfp、lenti-trail-gfp、lenti-tk-pd-1-gfp、lenti-trail-pd-1-gfp及lenti-trail-tk-pd-1-gfp)。为产生携带tk、pd-1、trail及对照gfp的重组慢病毒，通过xtremegenehpdna(roche)转染，将重组质粒及载体与包装及包封质粒从3:3:1的比率共转染至293t细胞中。36小时后收集含有病毒粒子的培养上清液且在另一24小时后再次收集一半体积的培养上清液，且然后在15,000rpm/min下离心10min从而去除碎片，且然后转移至36-ml超速离心管中从而在25,000rpm/min下超速离心3h。将含有慢病毒的团粒重新悬浮。在即将滴定及细胞转导之前将病毒解冻。利用适当慢病毒感染umsc，其中基因转移效率达到至少80％。

慢病毒转导

在6孔板中进行慢病毒质粒转导。除非另外规定，否则将umsc以1×10⁵个细胞/孔以一式三份进行接种，最终体积为1ml/孔且感染复数(moi)为5。添加来自8mg/ml原液(于dmem-lg中，无菌过滤)的硫酸鱼精蛋白(sigma-aldrich)从而获得期望最终浓度。将细胞转导24小时，之后用1.5ml/孔更换从而构建为umsc-trail-tk-pd-1、umsc-tk-pd-1、umsc-trail-pd-1、umsc-trail、umsc-tk及umsc-pd-1。将过度生长的细胞接种至6孔板上从而使用1.0mg/mlg418或嘌呤霉素(puromycin)溶液(sigma)进行药物筛选。每2天更换培养基。基于培养基的色彩及细胞状态，使用倒置式萤光显微镜观察绿色萤光蛋白(gfp)的表达。筛选7天后，更换不含g418的完全培养基且继续培养。

用于稳定细胞系的piggybac转位子系统的构筑

使用含有多选殖位点(mcs)、piggybac末端重复序列(pb-tr)、核心绝缘子(ci)及嘌呤霉素选择标记物(bsd)并与由人类ef1α驱动的rfp融合的piggybac载体ppb-cmv-mcs-ef1α-redpuro作为基础载体(systembioscience)。将含有trail-tk-pd-1、tk-pd-1、trail-pd-1、trail、tk及pd-1(来自pultra-trail-tk-pd-1、pultra-tk-pd-1、pultra-trail-pd-1、pultra-trail、pultra-tk及pultra-pd-1)的dna片段进行pcr扩增且亚选殖至ppb-cmv-mcs-ef1α-redpuro载体中，其在ef1α的编码区前面。可应要求获得关于载体构筑的详细资讯。为产生umsc稳定细胞，通过电穿孔方法，使用amaxanucleofectorii(lonza)将以上质粒与piggybac转位酶表达载体(systembiosciences)共转染至umsc细胞中。在嘌呤霉素存在下选择稳定细胞(umsc-trail-tk-pd-1、umsc-tk-pd-1、umsc-trail-pd-1、umsc-trail、umsc-tk及umsc-pd-1)。

活体外增殖、迁移及分化分析

为检查细胞增殖及迁移，实施溴去氧尿苷(brdu)掺入及transwell迁移分析从而比较umsc-trail-tk-pd-1或umsc。通过使用brdu化学发光免疫分析套组(roche)量测brdu掺入(10μm)来测试umsc-trail-tk-pd-1或umsc的增殖，且通过计数台盼蓝(trypanblue)细胞来进一步确认。饥饿4-6h后(在缺少血清的培养基中培育)，将umsc在培养基中培育2天且如先前所阐述脉冲加载10μmbrdu达12h(jclininvest2009；119:1997)。然后将umsc与抗brdu-过氧化酶一起培育90min，且通过与受质溶液一起培育3min使染色显色。利用lmax微板光度计(moleculardevices)来读板。分析如图s5中所示的结果且呈现为相对于对照的增加百分比(％)。

如先前所阐述并经修改来评价细胞迁移分析(embomolmed2013；5:1227-1246)。简言之，根据制造商说明书(costar，编号3421)，将umsc-tk-pd-1或umsc从而将100μl置于上部室(transwell：6.5-mm直径，5.0-mm孔径)中。在下部室中使用sdf-1α(100ng/ml,r&dsystem，阳性对照)。于5％co2培育器中在37℃下4-h培育期内进行分析。由于在迁移后几乎所有细胞均停留在膜的底部侧，因此可通过简单地计数这些细胞来实施量化。如先前所阐述在显微镜下计数膜底部侧处的贴壁细胞。

根据先前所阐述的方法来诱导成脂分化(jorthopres2002；20:1060)。简言之，使umsc-tk-pd-1或umsc的铺满单层培养物在成脂分化培养基中生长，所述培养基是由以下组成：dmem-高葡萄糖(dmem-hg,sigma)、100u/ml青霉素、100mg/ml链霉素、100mm胰岛素(sigma)、500mm3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(sigma)、1mm地塞米松(dexamethasone)(sigma)、100mm吲哚美辛(indomethacin)(sigma)及10％fcs。维持在普通umsc培养基中的细胞用作阴性对照。每周三次更换成脂分化。为评价成脂分化，将细胞用0.3％油红o(sigma)在室温下染色10min(从而标记细胞内脂质累积)，且用苏木精复染。

为诱导成骨分化，使铺满单层umsc-tk-pd-1或umsc培养物在含有100u/ml青霉素(sigma)、100mg/ml链霉素(sigma)、50mg/mll-抗坏血酸2-磷酸盐(sigma)、10mmb-甘油磷酸盐(sigma)、100nm地塞米松(sigma)及10％fcs的dmem-高葡萄糖(dmem-hg,sigma)中生长。维持在普通umsc培养基中的细胞用作阴性对照。每周三次更换成骨分化培养基。使用茜素红s染色(1％,sigma)来测定骨生成程度从而检测钙矿化(jbiomedmaterres1998,42,433)。

使用高密度团粒细胞培养系统(jbiomedmaterres1998,42,433)来诱导umsc-tk-pd-1或umsc的成软骨分化。于无血清成软骨分化培养基中洗涤细胞，所述培养基是由以下组成：dmem-hg、100u/ml青霉素、100mg/ml链霉素、50mg/mll-抗坏血酸2-磷酸盐、40mg/ml脯胺酸(sigma)、100mg/ml丙酮酸钠(sigma)、100nm地塞米松及its-plus(10mg/ml牛胰岛素、5.5mg/ml运铁蛋白、5mg/ml亚硒酸钠、4.7mg/ml亚麻油酸及0.5mg/ml牛血清白蛋白，sigma)。将250,000个细胞的等分试样重新悬浮于成软骨分化培养基中且在250×g下离心，且然后添加10ng/mltgf-β1(r&dsystems)。维持于不含tgf-β1的成软骨分化培养基中的团粒用作阴性对照。每周两次更换培养基。使用硫酸化蛋白多醣的艾尔逊蓝(alcianblue)染色(sigma)在组织学上确认团粒培养物的成软骨分化。另外，如先前所阐述，通过在预先涂覆有基质胶(300μl/孔；bectondickinson)及血管内皮生长因子(vegf,10ng/ml,sigma)的24孔板上于ebm(cambrex)中培养umsc-tk-pd-1或umsc达2-3天来诱导内皮细胞从而分化成血管管形成(natrevcancer2002,2,826)。

为诱导神经细胞分化，使用改良的三步法(stemcellstranslmed.2015；4:775-88)利用dmem培育umsc-tk-pd-1或umsc。简言之，在神经诱导步骤中，将细胞从低密度平铺于含有纤连蛋白(sigma)的6孔板上，且然后依序暴露于(1)含有10％fcs及10ng/mlbfgf(r&dsystem)的dmem-hg(sigma)达24h，(2)在神经约束步骤中，含有1mmβ-巯基乙醇(βme,sigma)及10ng/mlnt-3(r&dsystems)的dmem-hg达2天，及(3)在神经分化步骤中，含有nt-3(10ng/ml,r&dsystems)、ngf(10ng/ml,r&dsystems)及bdnf(50ng/ml,r&dsystems)的dmem-hg达3至7天。在细胞分化后，使细胞留待进行免疫组织化学分析。

流式细胞术

对于细胞表面标记物表达的分析，利用于pbs中的2mmedta使细胞分离，用含有bsa(2％)及迭氮化钠(0.1％)的pbs洗涤，且然后与偶联有异硫氰酸萤光黄(fitc)或藻红素(pe)的各别抗体一起培育直至分析。根据先前文献(mucosalimmunol2013,6(3):498-510)，基于第一门的调整、通过fsc-a及fsc-h排除双联体、通过选择7-aad⁺(r&dsystems)/cd45⁺或fsc-a排除死细胞来实施门控。作为对照，将细胞用小鼠igg1同型对照抗体染色。用于流式细胞术的针对pd-1、pd-l1、cd3、cd8、cd4、cd25、foxp3、cd44、cd45、cd11b、f4/80、ifn-γ、cd206、trail及gfp的抗体是购自bdbiosciences。使用具有cellquestanalysis(bdbiosciences)及flowjo软体v.8.8(treestarinc.)的facscan(bd)分析细胞。结果从而阳性染色细胞相对于总细胞数的百分比来表示。对于表面蛋白质表达的定量比较，将每一样品的萤光强度呈现为中位萤光强度(mfi)。对于ki-67及颗粒酶b的细胞内染色，将til在1μg/ml抗cd3存在下培养48h。然后使细胞与抗cd8一起培育，之后利用triton×100进行可渗透化处理，且然后利用针对ki-67(millipore)及颗粒酶b的抗体进行染色。使用具有cellquestanalysis(bdbiosciences)及flowjov.8.8(treestar)的facscan(bd)分析数据。

抗原特异性t细胞反应的活体外分析

将来自balb/c小鼠的脾细胞(2×10⁶)于24孔板上在补充有10％fbs(sigma)、1％青霉素/链霉素(gibco)的rpmi-1640培养基(gibco)中进行培养。然后，使与umsc-trail-tk-pd-1一起共培养的脾细胞(2×10⁵)保持不受刺激或与cd3-cd28珠粒(dynabeads,thermo)一起培育。对于增殖分析，如先前所阐述利用羧基萤光黄琥珀酰亚氨基酯(cfse)(invitrogen)将脾细胞染色(natprotoc.2007；2:2049-56)。使用增殖指数(pi)估计细胞的增殖/分裂，其可通过以下公式来计算：pi＝增殖后的总数/增殖前的总数。在培养6天后，收获细胞且经染色从而分析treg、cd4-及cd8-t细胞子集的增殖。或者，为分析细胞数量有限的纵向样品中6天培养后的增殖，如先前所阐述培养非cfse染色的脾细胞，且利用ki67或同型对照抗体染色。将增殖(fc增殖)的倍数变化计算为umsc-trail-tk-pd-1条件下的增殖除以对照条件下的增殖的比率。

此外，通过于平底96孔微量滴定板中将1×10⁵个来自小鼠脾且通过耐纶毛管柱(polysciences)富集的细胞反应者cd4⁺t细胞与同种异体树突细胞(dc)从而将10:1的比率(t:dc)共培养来实施混合淋巴球反应(mlr)分析。使cd4⁺t细胞及同种异体dc在umsc-tk-pd-1(10²、10³及10⁴)不存在或存在下培育6天。将效应t细胞连续刺激总计三次。在第5天收获培养上清液从而用于ifn-γ及il-12分泌的elisa分析(r&d)。

umsc-tk-pd-1与更昔洛韦(gcv)在活体外的自杀效应

为研究活体外的生物效应，分析umsc-tk-pd-1与gcv组合的自杀能力。在37℃下于5％co2中培育24h后，将各种剂量的gcv(0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml及100μg/ml)每天添加于每一孔中，连续7天。通过mtt分析(invitrogen)评估细胞存活率，且通过光度计(promega)评估gfp萤光强度。

活体外旁观者效应分析

将在37℃下于5％co2中在含有10％fbs的dmem中共培育的4t1-luc(bcrc,taiwan)、ct26-luc(bcrc,taiwan)或hep-55.1c-luc(bcrc,taiwan)细胞(1×10⁴个细胞)及各种数量的umsc-trail-tk-pd-1细胞(umsc-trail-tk-pd-1:肿瘤细胞比率＝1:1、1:4、1:16、1:32及1:64)接种于24孔板上。每天用含有100μg/mlgcv的新鲜培养基更换培养基连续7天。亦将umsc-trail-tk-pd-1及4t1-luc细胞接种于含有10％fbs而不含gcv的dmem培养基中作为相应对照组。8天后，自5个随机视野获取根据光度计(promega)的萤光素酶萤光强度从而确定细胞密度。每天在相同数量的接种于含有gcv(100μg/ml)的12孔培养板中的umsc-trail-tk-pd-1及4t1-luc细胞中实施对以上共培养系统的旁观者效应的时程的进一步研究。经由光度计(promega)将细胞死亡比率量测为gfp及萤光素酶的萤光强度百分比。

活体外细胞凋亡分析

为研究针对各种肿瘤细胞的促凋亡潜能，从而1:2比率进行共培养且使用facscantoii通过膜联蛋白-v-fitc/碘化丙啶(pi)染色(ebioscience)在24h评估细胞毒性。基于前向散射(fsc)及侧向散射(ssc)参数对肿瘤细胞群体进行门控。

小鼠模型及肿瘤接种

所有动物实验均是根据中国医药大学动物研究机构指南(institutionalguidelinesonanimalresearchofchinamedicaluniversity)来实施。使用4t1、ct26、hep-55.1c、ct26-luc、4t1-luc或hep-55.1c-luc，利用6周龄至8周龄雌性balb/c小鼠建立小鼠癌症模型。简言之，将4t1细胞(1×10⁶)在腹部右侧植入雌性balb/c小鼠的第4小鼠乳腺脂肪垫中，且在肿瘤植入后第8天开始治疗。

活体内umsc迁移分析

为检查静脉内或动脉内注射干细胞的生物分布，将萤光素酶基因(phagepgk-gfp-ires-luc-w,addgene)亚选殖至pultra-trail-tk-pd-1中，且然后亚选殖至plas3w中从而构筑lenti-trail-tk-pd-1-luc。在肿瘤接种后7天将由lenti-trail-tk-pd-1-luc工程化的umsc(umsc-trail-tk-pd-1-luc)(2×10⁶个细胞)注射至荷4t1肿瘤小鼠的股静脉或股动脉中数天。通过在umsc-trail-tk-pd-1-luc注射后的指示时间点(6h、1d、3d、6d、9d及14d)将整个动物置于ivislumina成像系统(xenogen)中并基于制造商的推荐分析萤光来实施离体成像。通过livingimage软体(xenogen)将萤光强度量化为光子/sec/cm²。在umsc注射后24小时处死小鼠，且然后分离各种器官(肺、肝、脾、心脏、肾及脑)。将每一器官切碎，用胶原酶处理，且准备用于流式细胞术分析。

生物发光成像(bli)

利用ivis成像系统200series(xenogen)使动物成像从而记录自4t1-luc、ct26-luc、hep-55.1c-luc发射的生物发光信号(萤光素酶表达)。动物经异氟醚麻醉，且从而将270mg/g体重的剂量接受d-萤光素(caliper)的腹膜内注射。在腹膜内注射萤光素后15min实施成像采集。对于bli分析，使用ivissystem(xenogen)界定涵盖颅内信号区域的所关注区，且记录总光子通量。为促进细胞植入速率的比较，在第14天将每一动物的发光评分针对其自身发光读数进行正规化，通过此容许每一小鼠用作其自身对照。

umsc-trail-tk-pd-1对荷瘤小鼠的活体内治疗效应

在4t1-luc及hep55.1c-luc小鼠模型中，首先检查与抗pd-1(roche)或igg对照相比，静脉内注射umsc-trail-tk-pd-1是否可显著诱导杀肿瘤效应。然后，将治疗组细分成六个群组(图6a)：igg-对照组；umsc-pd-1(up)组；umsc-trail(ut)组；umsc-trail-pd-1(utp)组；umsc-trail-tk+gcv(uttg)组；及umsc-tk-pd-1+gcv(utpg)组。在每次治疗之前，使细胞经受低氧预处理方案，其中于3％o2含量中培育24小时从而诱导cxcr4(millipore)上调，从而增强肿瘤归巢效应(cancerresearch2012；73:2333-2344)。通过在每组中从10天间隔重复第二次及第三次注射5×10⁵个细胞来评估序贯疗法的抗肿瘤效应。在每一治疗投与后第2天开始腹膜内投与gcv(50mg/kg)连续7天。

接下来，为进一步证实与umsc-tk-pd-1相比，经由股动脉动脉内注射umsc-trail-tk-pd-1是否可显著诱导杀肿瘤效应，将治疗组再细分成六个群组(图6f)：igg-对照组；umsc-tk-pd-1+gcv(utpg)组；umsc-trail-tk-pd-1(uttp)组；及umsc-trail-tk-pd-1+gcv(uttpg)组。

存活研究

为测定umsc-trail-tk-pd-1在活体内对4t1-luc及hep55.1c-luc肿瘤小鼠的存活的治疗效应，在肿瘤接种后10天内，每4天连续三次(q4d×3)经由右股静脉用六种不同的治疗靶标治疗小鼠(n＝8)。每2-3d使用数位卡尺(mitutoyo)使用以下公式监测肿瘤体积：肿瘤(公式1)，其中w是肿瘤的宽度且l是肿瘤的长度(w<l)。出于道德原因，当体积超过3,000mm³时，对动物实施安乐死。当肿瘤大小达到最大直径为2cm或当其体重降低至低于80％时，将小鼠处死。使用卡普兰-迈耶(kaplan-meier)存活分析法，从具有95％信赖区间的中值及平均存活时间报告存活率。通过对数秩分析法决定这些不同条件之间的统计差异(n＝8)。

浸润性白血球(til)、脾细胞及外周血单核细胞(pbmc)的分离

最后一次治疗后4周，自刚刚安乐死的小鼠收集肿瘤、脾或外周血中的白血球。使用先前所阐述的方法制备肿瘤浸润性淋巴球(til)的单细胞悬浮液(blood2005；06:2339)。简言之，利用iv型胶原酶(2.5mgml^-1,gibco)消解肿瘤组织20min，分离til，且通过不连续性percoll梯度(gehealthcare)离心法浓缩。通过在macs管柱上与αcd8微珠粒(miltenyibiotec)混合或在facsaria(bdbiosciences)分选器上用抗cd8抗体染色，分离til悬浮液中的cd8⁺t细胞(纯度>95％)。由cd8⁺t细胞百分比乘以得自percoll梯度的淋巴球总数，所述得数再除以100及肿瘤的重量，获得浸润性cd8⁺t细胞总数/克肿瘤。在用抗cd11b、抗cd206或抗f4/80抗体染色后，在facsaria(bdbiosciences)上检查til悬浮液中的肿瘤相关巨噬细胞(tam，cd11b⁺cd206⁺f4/80⁺细胞)(纯度>95％)。使用分离套组(miltenyibiotec)纯化调节性t淋巴球(treg,cd4+cd25+)(纯度>90％)。在用抗cd4、抗cd25及抗foxp3抗体染色后，在facsaria(bdbiosciences)上分析调节性t淋巴球(cd4⁺cd25⁺foxp3⁺细胞)(纯度>95％)。将脾拨开并用耐纶网筛将其过滤从而获得单细胞悬浮液。为进一步产生单细胞脾细胞悬浮液，通过使用rbc溶解缓冲液将红血球去除。通过在macs管柱上将细胞与αcd8微珠粒(miltenyibiotec)混合或在facsaria(bdbiosciences)分选器上用抗cd8抗体染色来分离脾cd8⁺t细胞(纯度>95％)。

自每一小鼠分离外周血单核细胞(pbmc)(blood.2001；98:3520-6)。使用ficoll-histopaque(sigmaaldrich)离心方法(science.1997；275:964-7)收集细胞，且用于pbs中的1mmedta洗涤两次从而进行进一步实验。

流式细胞术

用含有bsa(2％)及迭氮化钠(0.1％)的pbs洗涤til悬浮液。利用如下针对细胞表面标记物的各别萤光染料偶联的单株抗体对细胞进行染色：抗pd-l1(mih5)、抗cd3(145-2c11)、抗cd8(53-6.7)、抗cd11b(m1/70)、抗cd45(30-f11)、抗ifn-γ(xmg1.2)、抗cd44(im7.8.1r)、抗cd4(gk1.5)、抗cd25(pc61.5)、抗foxp3(mf23)、抗f4/80(bm8)及抗cd206(mr5d3)。作为对照，利用小鼠igg1同型对照或igg2同型对照抗体对细胞进行染色。使用具有cellquestanalysis(bdbiosciences)及flowjo软体v.8.8(treestarinc.)的facscan(bd)分析细胞。

根据先前文献(mucosalimmunol.2013；6:498-510)，基于第一门的正确合理性、通过fsc-a及fsc-h排除双联体、排除死细胞且进一步选择为7aad⁺/cd45⁺(或fsc-a)来实施门控。然后，使用具有cellquestanalysis(bdbiosciences)及flowjo软体v.8.8(treestarinc.)的facscan(bd)分析来自til或脾细胞悬浮液的cd8⁺t细胞、cd4⁺t细胞、treg及tam。结果从阳性染色细胞相对于总细胞数的百分比来表示。通过二因子anova以及newman-keuls事后测试来评估组间的差异。p值<0.05视为显著的。

自til分离cd8⁺cd44⁺ifn-γ⁺t细胞

通过在macs管柱上与αcd8微珠粒(miltenyibiotec)混合来分离til悬浮液中的cd8⁺t细胞。为检查ifn-γ及cd44的表达，使用抗小鼠cd28mab(0.5μg)、莫能菌素(monensin)及布雷菲德菌素a(brefeldina)将经分离的cd8⁺t细胞处理3小时。与此同时，使其与1×10⁶个经辐照4t1-luc细胞(在84cgymin^-1的速率下，0.5-mmcu滤波器，philipsx射线单元)在37℃下共培养24h。然后使用bdcytofix/cytopermplus套组，遵循制造商的说明书实施ifn-γ及cd44表达的流式细胞分析。

cd8⁺t细胞中ki-67及颗粒酶b表达的评估

对于ki-67及颗粒酶b的细胞内染色，将til在抗cd3(1μgml^-1)存在下培养48h。然后使细胞与抗cd8一起培育，之后利用tritonx100进行可渗透化处理，且利用针对ki-67及颗粒酶b的抗体(millipore)进行染色。

cfse测试

使自肿瘤分离的treg与经羧基-二乙酸萤光黄琥珀酰亚氨基酯(cfse)处理的脾cd8⁺t细胞在cd3抗体存在下一起共培养，且使用cfse的萤光强度来监测cd8⁺t细胞的增殖。cfse^低细胞定义为萤光强度低于原始群体的细胞，其代表增殖的cd8⁺t细胞。

细胞介素量测

将来自经不同方案治疗的小鼠的til以2×10⁵个细胞/ml的密度于6孔板中于含有2mml-麸酰胺酸(sigma-aldrich)的prmi-1640(invitrogen)培养基中直接培养48h。利用quantikineelisa套组(r&dsystems)量测tnf-α、vegf、il-10及tgf-β的含量。实施培养上清液及血清中的tnf-α、vegf、il-10及tgf-β含量的半定量分析。使用分光光度计(moleculardevices)量测光学密度，且利用程式softmax(moleculardevices)生成标准曲线。

抗转移能力的评估

通过直接目视计数转移结节来检查受4t1-luc、ct26-luc或hep-55.1c-luc肿瘤攻击的小鼠的肺转移。然后将肺切除且于水中洗涤一次并进一步通过浸入4％pfa中来固定，且在室温下于30％蔗糖中脱水。表面转移随后表达为白色结节且在显微镜下计数。

免疫组织化学评价

利用水合氯醛(0.4g/kg,ip)对动物进行麻醉且通过用盐水穿心灌注、之后浸入4％多聚甲醛中来固定其腹部皮肤组织。于30％蔗糖中使组织样品脱水，于干冰上冷冻，且然后使用低温恒温器切割成一系列相邻6-μm厚的冠状切片。切片用h&e及普鲁士蓝(prussianblue)(用于鉴别铁)染色从而通过光学显微镜(nikon,e600)进行观察。使用偶联有fitc或cy-3的二级抗体(1:500；jacksonimmunoresearch)，利用针对cd4(1:100；bd)、cd8(1:400；bd)的抗体对每一切片进行免疫染色，且然后使用carlzeisslsm510雷射扫描共焦显微镜在三维影像中进行分析。如先前所阐述量测经细胞类型特异性标记物共染色的细胞总数(j.cereb.bloodflowmetab.2008；28,1804-1810)。

tunel分析

如先前所阐述，使用市售tunel染色套组(deadendfluorimetrictunel系统；promega)通过免疫组织化学分析细胞凋亡(proceedingsofthenationalacademyofsciences2009；106,9391-9396)。tunel标记百分比表示为tunel阳性细胞核的数量除以经dapi染色的细胞核的总数(nat.protocols2016；11:688-713；plosgenet.2009；5:e1000379)。细胞凋亡指数表示为tunel阳性凋亡细胞核的百分比除以自随机选择的显微镜视野的计数获得的通过dapi复染而可视化的细胞核的总数。

免疫相关不良事件(irae)的评价

评估各组治疗后的irae，包括：(1)重量监测，(2)组织学，(3)免疫细胞浸润及(4)肝及肾功能。在治疗期间监测小鼠的体重。另外，在肿瘤接种后4周评估各组经治疗小鼠(n＝6)的h&e染色的肝、肺、脾、肾及结肠切片从而供组织学分析。通过ihc检查肝、结肠、肾及肺的cd8⁺及cd4⁺t细胞浸润(cancerres2016；76:5288-5301)，且通过计数每mm²10个高倍视野中的阳性细胞数来评分。此外，使用每组(n＝6)来自连续时间点(0d、5d、10d、15d、20d、25d及30d)的小鼠血清通过beckmanunicelldxc800分析仪量测alt、ast、肌酸酐及葡萄糖的生物化学曲线。

统计学分析

此研究中的所有量测均是从而盲化设计来实施。结果表示为平均值±sem。使用双尾司徒顿t测试(two-tailedstudent’sttest)来评估对照组与治疗组之间的平均差异的显著性。通过二因子anova以及newman-keuls事后测试来评估组间的差异。p值<0.05视为显著的。

实例1umsc及umsc-tk-pd-1的活体外表征

自华通氏胶(wj)制备脐带间充质干细胞(umsc)的原代培养物并分析细胞形态及生物性质(图1a)。流式细胞术揭示，细胞对cd1q、cd3、cd10、cd14、cd31、cd34、cd45、cd49d、cd56、cd117及hla-dr呈阴性，但对cd13、cd29、cd44、cd73、cd90、cd105、cd166、cd49b及hla-abc呈阳性(图1b)。这些观察结果指示，umsc具有与间充质干细胞(msc)相同的表面标记物，此与骨髓msc的观察结果一致(jcellsci2004,117,2971)。

为评估umsc转染效能，通过流式细胞术研究分析umsc-trail-tk-pd-1的rfp萤光及pd-1表达程度。在转染后36h至48h，经由rfp及pd-1流式细胞术的结果证实摄取效能平均为55％-65％(图1c)。随后，在嘌呤霉素或g418筛选3-5天后，超过90％的细胞完全经转基因转导(图1c)。

umsc-trail-tk-pd-1-luc保留萤光素酶表达超过100天(图1d)，且通过mtt分析的细胞存活率、通过brdu掺入的细胞增殖分析及通过transwell分析的迁移(图1e)揭示与未经标记的umsc相比，在培育14h后，plas3w-trail-tk-pd-1标记并不影响活体外umsc-trail-tk-pd-1细胞存活率、细胞增殖或迁移。

为证实umsc-trail-tk-pd-1是否仍具有多能分化潜能，分析成脂、成软骨、成骨及血管形成，此证实umsc-trail-tk-pd-1展示与不具有质粒标记的普通umsc相似的行为(图1f)。通过map-2、tuj-1及gfap的免疫萤光鉴别umsc-trail-tk-pd-1的神经胶质细胞分化，且其展现如普通umsc一样的折光性细胞体形态以及排列成网络的延伸神经突样结构(图1g)。因此，umsc-trail-tk-pd-1在活体外并不丧失细胞分化潜能。

实例2pd-l1与umsc-trail-tk-pd-1在活体外的特异性蛋白质结合

由于肿瘤细胞出于免疫逃逸的目的而表达pd-l1(trendsimmunol.2006；27:195-201)，因此建立umsc-trail-tk-pd-1的经基因修饰的umsc，其中呈递的pd-1可通过pd-1/pd-l1相互作用捕获肿瘤细胞。为说明umsc-trail-tk-pd-1的蛋白质-配体结合亲和力，通过elisa分析各种浓度下的hrp偶联的pd-1蛋白的rlu。将umsc-trail-tk-pd-1与hrp偶联的pd-l1蛋白一起在37℃下培育2小时。hrp偶联的pd-1蛋白的结合亲和力从剂量依赖性方式显著增加(图2a)。结果指示，umsc-trail-tk-pd-1具有与pd-l1的高结合效率。

实例3人类t细胞中umsc-trail-tk-pd-1的活体外活性

为确定刺激效应是否是t细胞与msc的间的直接相互作用，利用cd3-cd28珠粒刺激脾细胞t细胞。门控策略是基于图2b中所绘示的第一门的合理性、通过fsc-a及fsc-h排除双联体、通过选择7-aad⁺(r&dsystems)/cd45⁺或fsc-a排除死细胞。利用cfse标记t细胞，且然后与经cd3-cd28珠粒刺激6天的umsc或umsc-trail-tk-pd-1一起共培养。umsc(在1:1的比率下)显著抑制cd4⁺及cd8⁺t细胞二者的增殖(图2c)，但在1:10的比率下则不。然而，在1:1或1:10的任一比率下，umsc-trail-tk-pd-1均显著增加cd4⁺及cd8⁺t细胞二者的增殖(图2c)。此外，与umsc相比，经cd3-cd28珠粒刺激的umsc-trail-tk-pd-1显著增加cd4⁺inf-γ⁺的含量且降低cd8⁺cd122⁺(图2d)。这些结果表明，umsc-trail-tk-pd-1的任一比率均可支持t细胞增殖，而较高的比率则具有抑制性。

实例4umsc-trail-tk-pd-1在活体外的自杀效应

为研究umsc-trail-tk-pd-1中胸苷激酶(tk)诱导的细胞杀死效应，通过在各种浓度的gcv存在下评估umsc-trail-tk-pd-1的细胞存活率来测试自杀效应。首先，在umsc-trail-tk-pd-1中发现从时间及剂量依赖性方式显著增加的tk含量(图3a)。gcv自身并不影响umsc的细胞增殖(图3b)。在gcv处理后，磷酸化的gcv诱导umsc-trail-tk-pd-1中的细胞凋亡样细胞损伤(图3b)。umsc-trail-tk-pd-1的细胞增殖从剂量依赖性方式受抑制(图3b)。此指示，umsc-trail-tk-pd-1在转染trail-tk-pd-1的质粒后可表达tk，且可通过诱导对umsc自身的细胞毒性将gcv活化为其毒性形式。

肿瘤细胞对umsc-trail-tk-pd-1的旁观者效应的活体外敏感性

为经由umsc-trail-tk-pd-1检查旁观者效应，通过在各种浓度的gcv下直接共培养不同比率的每一细胞来评估4t1(hep55.1c、pan18、ct26)及umsc-trail-tk-pd-1二者的细胞存活率(图3c)。在100μg/mlgcv存在下在共培养7天后，当比率最大为1:32且最小为1:1时，umsc-trail-tk-pd-1可显著减弱4t1-luc细胞(hep55.1c、pan18-luc、ct26-luc及gl261-luc)的生长(n＝3)。此外，证实最佳抑制效率是在1:1的比率下(图3d-3e)。

为进一步确认umsc-trail-tk-pd-1的旁观者效应，研究umsc-trail-tk-pd-1的自杀效应及旁观者效应二者的时程(在7天之前)。在此共培养系统中，因自杀效应所致的细胞死亡率在前两天期间缓慢达到整个系统的约三分之一，且然后随后自第3天加速至第6天。在旁观者效应实验中，相同发现显示，大多数4t1-luc细胞自第3天至第5天被杀死(图3c-3e)。此外，流式细胞术研究亦证实，与4t1细胞共培养的umsc-trail-tk-pd-1从gcv剂量依赖性方式显著增加凋亡细胞(pi⁺膜联蛋白-v⁺细胞)(图3c)。因此，在共培养系统中，umsc-trail-tk-pd-1的自杀效应及对4t1-luc细胞(hep55.1c、pan18-luc、ct26-luc及gl261-luc)的旁观者效应在第3天至第5天发生。

表达trail的umsc-trail-tk-pd-1在4t1-luc细胞中展示活体外抗肿瘤活性。

umsc-trail-tk-pd-1可经遗传修饰从而表达高含量的trail。通过编码全长人类trail的载体转导umsc-trail-tk-pd-1。facs分析显示umsc细胞表面上的相关trail蛋白表达(90％)(图4a)。

为证实umsc-trail-tk-pd-1是否可发挥对癌细胞的杀肿瘤效应，然后实施肿瘤细胞与umsc-trail-tk-pd-1之间的共培养实验。表达trail的umsc-trail-tk-pd-1尤其在共培养后48小时诱导细胞凋亡(4t1-luc、hep55.1c-luc)，细胞凋亡从细胞皱缩、贴壁4t1-luc细胞的减少及具有细胞碎片外观的hep55.1c-luc为代表，其由碘化丙啶染色(pi染色)证实(图4b)。为量化在24小时、48小时及72小时的细胞死亡，如通过facs分析所量测，在共培养物中检测到大量膜联蛋白-v⁺pi⁺死细胞(≥70％)，其中umsc-trail-tk-pd-1是从剂量依赖性方式存在(图4c)。

实例5umsc-trail-tk-pd-1-luc在4t1肿瘤模型中的肿瘤靶向

为证实umsc-trail-tk-pd-1归巢效应，使用ivis实施在静脉内或动脉内植入后umsc-trail-tk-pd-1-luc的生物分布。首先，如通过ivis在活体外所量测，生物发光强度从细胞剂量依赖性方式增加(图5a)。在健康小鼠中，静脉内umsc-trail-tk-pd-1-luc移植最初自注射后一天截留在肺毛细血管中，其显示在肺中ivis的生物发光影像增强(图5b)。umsc-trail-tk-pd-1-luc的归巢使得umsc-trail-tk-pd-1-luc存活且重新定位至皮下4t1肿瘤。最初在umsc-trail-tk-pd-1-luc注射后5天观察到ivis影像中皮下肿瘤区域的生物发光信号，之后强度逐渐增加，且在第14天达到峰值(图5b)。

股动脉内注射后2小时，umsc-trail-tk-pd-1-luc移植直接募集至正位4t1肿瘤区域而无肺压迫(亦适用于hep55.1c及pan18肿瘤区域)，其显示增强的ivis的生物发光影像(图5c-5e)。

随后，umsc-trail-tk-pd-1-luc的归巢使得umsc-trail-tk-pd-1-luc存活且重新定位至肿瘤部位。

为进一步证实umsc-trail-tk-pd-1-luc是否可追踪源自4t1-肿瘤模型的转移性基因座，在4t1-肿瘤模型诱导后21天实施umsc-trail-tk-pd-1-luc的动脉内植入。一致地，来自原始4t1肿瘤模型的转移性肺肿瘤显著募集umsc-trail-tk-pd-1-luc，从而增加如通过ivis所量测的在多个转移部位中的生物发光强度(图5f)。经由免疫组织化学分析，在治疗后1天，在4t1肿瘤中发现多个gfp⁺萤光素酶⁺细胞，此指示umsc-trail-tk-pd-1-gfp募集至肿瘤微环境中(图5g)。。

实例6umsc-trail-tk-pd-1对4t1-luc模型的治疗效应

通过ivis、肿瘤体积及q4dx3疗程方案后的存活时间来评价经基因修饰的umsc的各种策略治疗的表达萤光素酶的荷4t1-luc及hep55.1c-luc肿瘤的小鼠中的杀肿瘤效应(图6a)。在治疗之前，使每组测试细胞于3％o2中经受低氧预处理培养，此诱导cxcr4过表达，从而便以时间依赖性方式增强干细胞归巢(图6b)。明显地，umsc-pd-1(up)组及umsc-trail(ut)组展现治疗效应，其与如通过ivis所量测的igg对照组的那些肿瘤体积相比降低肿瘤体积(图6c)。此外，umsc-tk-pd-1+gcv(utpg)组、umsc-trail-tk+gcv(uttg)组及umsc-trail-pd-1(utp)组分别显示更强的抗肿瘤效应，且其各自展现对肿瘤生长的抑制(图6c)。经igg、up、ut、utpg、uttg及utp治疗的小鼠的中值存活时间分别为24天、32天、34天、34天、43天及44天(图6d)。与其他组相比，utp显著延长存活时间至63天(图6d)。此外，与其他治疗相比，utp显著预防肺中的肿瘤转移(图6e)。平均而言，与对照小鼠的肺中超过20个转移相比，在经utp治疗的小鼠中发现少于5个肺转移结节。然而，与对照组相比，umsc-tk(ut)、up及utp并不显示转移的显著降低。因此，假设转移不仅受utp诱导的旁观者效应抑制，且很大程度上受tme中来自utp的免疫增强效应的影响，此使得系统地分析肿瘤内免疫。

接下来，为验证动脉内注射umsc-trail-tk-pd-1是否在q7dx2疗程方案后在4t1-luc及hep55.1c-luc模型中展示显著的治疗效应(图6f)，检查四个群组(umsc-tk-pd-1+gcv(utpg)组、umsc-trail-tk-pd-1(uttp)组及umsc-trail-tk-pd-1+gcv(uttpg)组)的肿瘤生长及中值存活时间。在动脉内注射的分析之前，umsc-tk-pd-1+gcv(utpg)组、umsc-trail-tk-pd-1(uttp)组及umsc-trail-tk-pd-1+gcv(uttpg)组的静脉内投与分别显示更强的抗肿瘤效应且展现对肿瘤生长的抑制(图6f-6g)。重要的是，动脉内植入揭示强有力优于静脉内植入的治疗效应。此外，在4t1-luc及hep55.1c-luc模型中，uttpg组分别较igg对照、utpg及uttp的其他组显著抑制肿瘤生长且延长小鼠的中值存活时间(图6f-6g)。不幸的是，在4t1-luc模型及hepa55.1c模型中，投与抗pd-l1并不显示任何显著的治疗效应(图6f-6g)。

实例7uttpg治疗增强肿瘤微环境(tme)中的免疫性

受治疗结果鼓舞，评估4t1肿瘤模型中tme的免疫性质。重要的是，uttpg可逆转tme中的免疫衰退。跨越uttpg治疗组及其他治疗组，肿瘤浸润性cd45⁺白血球的百分比存在总体增加(图7a)。结果揭示，与其他组相比，在uttpg治疗中，cd3⁺cd8⁺及cd3⁺cd4⁺t细胞二者的频率显著增加(图7a)。uttpg亦诱导treg的显著减少(图7b)，且通过此逆转肿瘤内cd8⁺及cd4⁺t细胞对treg的比率(图7c)。另外，tam的数量因应uttpg治疗而急剧减少(图7b)，此增加tme中cd8⁺及cd4⁺t细胞对tam的比率(图7c)。应注意，细胞内颗粒酶b(grb⁺)及ki67⁺细胞的显著上调指示uttpg治疗不仅增加抗肿瘤免疫群体，且亦有效地达成til的活化及增殖(图7d)。