具有改善的稳定性的枯草杆菌蛋白酶变体的制作方法

本文公开了一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体、以及与其生产和使用有关的组合物和方法，所述一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包括与一种或多种参比枯草杆菌蛋白酶相比具有改善的稳定性和/或污垢去除性的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体。

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背景技术：

蛋白酶(也称为朊酶)是指具有分解其他蛋白质的能力的酶蛋白质。蛋白酶具有通过在形成蛋白质的肽或多肽链中将氨基酸连接在一起的肽键的水解进行蛋白水解的能力。蛋白酶作为蛋白质消化酶的这种活性被称为蛋白水解活性。存在许多众所周知的测量蛋白水解活性的方法(kalisz,“microbialproteinases,[微生物蛋白酶]”fiechter(编),advancesinbiochemicalengineering/biotechnology[生化工程/生物技术进展],(1988))。例如，蛋白水解活性可以通过分析各个蛋白酶水解商业底物的能力的比较测定来确定。可用于分析蛋白酶或蛋白水解活性的示例性底物包括但不限于二甲基酪蛋白(西格玛公司(sigma)c-9801)、牛胶原(西格玛公司(sigma)c-9879)、牛弹性蛋白(西格玛公司(sigma)e-1625)和牛角蛋白(icn生物医学公司(icnbiomedical)902111)。使用这些底物的比色测定是本领域熟知的(参见例如wo99/34011和美国专利号6,376,450，这两者都通过引用并入本文)。

丝氨酸蛋白酶是具有启动蛋白质肽键水解的活性位点丝氨酸的酶(ec编号3.4.21)。丝氨酸蛋白酶包含种类繁多的具有广泛特异性和生物学功能的酶，基于这些酶的结构，这些酶被进一步划分为胰凝乳蛋白酶样(胰蛋白酶样)和枯草杆菌蛋白酶样。原型枯草杆菌蛋白酶(ec编号3.4.21.62)最初从枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)获得。枯草杆菌蛋白酶(有时也称为枯草杆菌酶)及其同源物是merops分类方案的s8肽酶家族的成员。s8家族的成员在其氨基酸序列中具有顺序为asp、his和ser的催化三联体。尽管已经开发了许多可用于清洁应用的变体蛋白酶，但是仍然需要改善的枯草杆菌蛋白酶变体。

技术实现要素：

在一个实施例中，本公开提供了一种或多种与seqidno:1具有至少50％氨基酸序列同一性的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述多肽相对于seqidno:1具有以下特征中的至少三个：在位置3处的q、t或v；在位置9处的e；在位置24处的q；在位置40处的e；在位置69处的s；在位置76处的d；在位置78处的n；在位置87处的d；在位置118处的r；在位置124处的i；在位置128处的q、r或s；在位置129处的p；在位置130处的s；在位置145处的r；在位置166处的q；在位置182处的e；在位置185处的q；在位置210处的i；在位置211处的p；在位置217处为l或q；在位置218处的s；在位置248处的d；以及在位置259处的p，其中所述氨基酸位置与seqidno:1相对应编号，并且其中所述变体不具有与天然存在的分子相同的氨基酸序列。

其他实施例涉及相对于seqidno:1具有以下特征中的至少三个的枯草杆菌蛋白酶变体：在位置3处的q、t或v；在位置9处的e；在位置24处的q；在位置40处的e；在位置69处的s；在位置76处的d；在位置78处的n；在位置87处的d；在位置118处的r；在位置124处的i；在位置128处的q、r或s；在位置129处的p；在位置130处的s；在位置145处的r；在位置166处的q；在位置182处的e；在位置185处的q；在位置210处的i；在位置211处的p；在位置217处为l或q；在位置218处的s；在位置248处的d；以及在位置259处的p，其中所述氨基酸位置与seqidno:1相对应编号，其中所述变体衍生自与seqidno:1、2、10或15的氨基酸序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％氨基酸序列同一性的亲本多肽或参比多肽。

仍其他实施例涉及相对于seqidno:1具有以下特征中的至少三个的枯草杆菌蛋白酶变体：在位置3处的q、t或v；在位置9处的e；在位置24处的q；在位置40处的e；在位置69处的s；在位置76处的d；在位置78处的n；在位置87处的d；在位置118处的r；在位置124处的i；在位置128处的q、r或s；在位置129处的p；在位置130处的s；在位置145处的r；在位置166处的q；在位置182处的e；在位置185处的q；在位置210处的i；在位置211处的p；在位置217处为l或q；在位置218处的s；在位置248处的d；以及在位置259处的p，其中所述氨基酸位置与seqidno:1相对应编号，其中所述变体包含与seqidno:1、2、10或15的氨基酸序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

另一个实施例涉及改善枯草杆菌蛋白酶分子的稳定性的方法，其中所述方法包括将至少一个取代引入编码枯草杆菌蛋白酶多肽的多核苷酸中，所述取代产生具有以下特征中的至少三个的枯草杆菌蛋白酶多肽：在位置3处的q、t或v；在位置9处的e；在位置24处的q；在位置40处的e；在位置69处的s；在位置76处的d；在位置78处的n；在位置87处的d；在位置118处的r；在位置124处的i；在位置128处的q、r或s；在位置129处的p；在位置130处的s；在位置145处的r；在位置166处的q；在位置182处的e；在位置185处的q；在位置210处的i；在位置211处的p；在位置217处为l或q；在位置218处的s；在位置248处的d；以及在位置259处的p，其中所述氨基酸位置与seqidno:1相对应编号，并且其中所述变体不具有与天然存在的分子相同的氨基酸序列。

又另一个实施例涉及包含至少一种枯草杆菌蛋白酶变体的组合物，其中所述至少一种枯草杆菌蛋白酶变体与seqidno:1具有至少50％的氨基酸序列同一性，其中所述多肽相对于seqidno:1具有以下特征中的至少三个：在位置3处的q、t或v；在位置9处的e；在位置24处的q；在位置40处的e；在位置69处的s；在位置76处的d；在位置78处的n；在位置87处的d；在位置118处的r；在位置124处的i；在位置128处的q、r或s；在位置129处的p；在位置130处的s；在位置145处的r；在位置166处的q；在位置182处的e；在位置185处的q；在位置210处的i；在位置211处的p；在位置217处为l或q；在位置218处的s；在位置248处的d；以及在位置259处的p，其中所述氨基酸位置与seqidno:1相对应编号，并且其中所述变体不具有与天然存在的分子相同的氨基酸序列。

另一个实施例涉及清洁方法，所述方法包括使需要清洁的表面或物品与至少一种枯草杆菌蛋白酶变体或具有至少一种枯草杆菌蛋白酶变体的组合物接触，其中所述至少一种枯草杆菌蛋白酶变体与seqidno:1具有至少50％的氨基酸序列同一性，其中所述多肽相对于seqidno:1具有以下特征中的至少三个：在位置3处的q、t或v；在位置9处的e；在位置24处的q；在位置40处的e；在位置69处的s；在位置76处的d；在位置78处的n；在位置87处的d；在位置118处的r；在位置124处的i；在位置128处的q、r或s；在位置129处的p；在位置130处的s；在位置145处的r；在位置166处的q；在位置182处的e；在位置185处的q；在位置210处的i；在位置211处的p；在位置217处为l或q；在位置218处的s；在位置248处的d；以及在位置259处的p，其中所述氨基酸位置与seqidno:1相对应编号，并且其中所述变体不具有与天然存在的分子相同的氨基酸序列。

在另一个实施例中，提供了一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，其具有的多肽序列与bpn`(seqidno:1)具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％的氨基酸序列同一性，其中所述多肽具有选自由s003q/v、s009e、s024q、p040e、a069s、n076d、s078n、s087d、n118r、m124i、g128s、s145r、g166q、s182e、y217l/q、n218s和d259p组成的组的至少三个特征，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置与seqidno:1的氨基酸序列相对应编号。

在又另一个实施例中，提供了一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，其具有的多肽序列与aprl(seqidno:15)具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％的氨基酸序列同一性，其中所述多肽具有选自由t003v、p009e、a069s、t078n、s087d、m124i、g128q/r/s、a129p、g166q、s182e、n185q、p210i、t211p、l217q、n218s和s259p组成的组的至少三个特征，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置与seqidno:1的氨基酸序列相对应编号。

在仍另一个实施例中，提供了一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，其具有的多肽序列与gg36(seqidno:2)具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％的氨基酸序列同一性，其中所述多肽具有选自由s003q/t/v、p040e、n076d、s078n、s087d、g118r、s128r、s166q、q182e、n185q、p210i、g211p、l217q、n218s、n248d和s259p组成的组的至少三个特征，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置与seqidno:1的氨基酸序列相对应编号。

在另一个实施例中，提供了一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，其具有的多肽序列与bg46(seqidno:10)具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％的氨基酸序列同一性，其中所述多肽具有选自由t003q、t009e、s024q、s040e、n076d、n087d、n118r、s128q/r、d129p、f130s、g166q、q182e、r185q、p210i、m217l/q、n218s、n248d和n259p组成的组的至少三个特征，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置与seqidno:1的氨基酸序列相对应编号。

一些另外的实施例涉及包含本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的组合物。另外的实施例涉及清洁方法，所述方法包括使需要清洁的表面或物品与有效量的本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体或有效量的本文描述的一种或多种组合物接触。

仍其他的实施例涉及用于生产本文描述的变体的方法，所述方法包括用包含编码本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的多核苷酸的表达载体稳定地转化宿主细胞。仍另外的实施例涉及包含编码本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的核酸序列的多核苷酸。

附图说明

图1描绘了表9中列出的有益位点的子集在来自解淀粉芽孢杆菌(b.amyloliquefaciens)的bpn’枯草杆菌蛋白酶(pdb条目2st1)结构上的位置的一个实例。bpn’枯草杆菌蛋白酶的主链折叠以浅灰色示意性表示，催化三联体显示为灰色球体，发生稳定取代的位点(相对于bpn’枯草杆菌蛋白酶序列seqidno:1编号)显示为黑色线条图。

图2描绘了表9中列出的有益位点的子集在来自地衣芽孢杆菌(b.licheniformis)的枯草杆菌蛋白酶carlsberg(pdb条目1cse)结构上的位置的一个实例。枯草杆菌蛋白酶carlsberg的主链折叠以浅灰色示意性表示，催化三联体显示为灰色球体，发生稳定取代的位点(相对于bpn’枯草杆菌蛋白酶序列seqidno:1编号)显示为黑色线条图。

图3描绘了表9中列出的有益位点的子集在来自迟缓芽孢杆菌(b.lentus)的枯草杆菌蛋白酶(pdb条目1jea)结构上的位置的一个实例。来自迟缓芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶的主链折叠以浅灰色示意性表示，催化三联体显示为灰色球体，发生稳定取代的位点(相对于bpn’枯草杆菌蛋白酶序列seqidno:1编号)显示为黑色线条图。

图4描绘了表9中列出的有益位点的子集在来自吉氏芽孢杆菌(b.gibsonii)进化枝的bsp-00801枯草杆菌蛋白酶(wo2016205755中描述)结构上的位置的一个实例。吉氏芽孢杆菌进化枝枯草杆菌蛋白酶的主链折叠以浅灰色示意性表示，催化三联体显示为灰色球体，发生稳定取代的位点(相对于bpn’枯草杆菌蛋白酶序列seqidno:1编号)显示为黑色线条图。bgi02446的野生型氨基酸用单字母命名法表示。

图5提供了使用3dm软件进行的以下的结构比对的一个实例：bpn’(解淀粉芽孢杆菌)、aprl(地衣芽孢杆菌)、gg36(迟缓芽孢杆菌)和bgi02446(吉氏芽孢杆菌)。结构上同源的残基以大写字母显示。bpn’的可变区域以小写字母显示，aprl、gg36和bgi02446的可变区用破折号‘-’表示。表9中列出的位置在比对下方标有星号‘*’。

具体实施方式

本公开提供了具有在多肽序列的位置处具有三个或更多个特征(例如取代)的组合的氨基酸序列的枯草杆菌蛋白酶变体，所述组合使所述变体枯草杆菌蛋白酶具有与缺乏所述三个或更多个特征的组合的参比枯草杆菌蛋白酶相比改善的稳定性。如以下更详细地提供的，所述特征在选自以下的位置的组合中找到：3、9、24、40、69、76、78、87、118、124、128、129、130、145、166、182、185，210、211、217、218、248和259(位置编号对应于bpn’(seqidno:1)的氨基酸位置)，并且包括取代或在一些情况下在鉴定的位置处野生型氨基酸和取代的组合，所述取代或组合提供与亲本或参比枯草杆菌蛋白酶多肽相比改善的稳定性。还提供了包含此类枯草杆菌蛋白酶变体的组合物(例如洗涤剂组合物(例如餐具洗涤组合物和衣物洗涤剂组合物))以及使用此类变体和组合物的方法。

未定义的术语和缩写应当符合本领域中所使用的常规含义。除非本文另有定义，否则本文所使用的全部科技术语都具有如本领域普通技术人员通常理解的相同含义。本文提供的任何定义将在说明书的上下文中作为整体进行解释。除非上下文另有明确指示，如本文所使用的，单数“一个/一种”(a/an)和“该/所述”(the)包括复数。除非另有指示，否则核酸序列从左至右以5'至3'方向书写；并且氨基酸序列从左至右以氨基至羧基方向书写。本文使用的每一数值范围将包括落入此类较宽数值范围内的每一较窄数值范围，如同此类较窄数值范围在本文中全部明确写出一样。

如本文与数值结合所用的，术语“约”是指数值的+/-0.5的范围，除非所述术语在上下文中另有具体定义。例如，短语“约6的ph值”是指ph值为5.5至6.5，除非所述ph值另有具体定义。

本文所描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸取代的命名法使用以下一项或多项：位置；位置：氨基酸或一个或多个氨基酸取代；或一个或多个起始氨基酸：位置：一个或多个氨基酸取代。对“位置”(即5、8、17、22等)的提及涵盖了可能存在于此类位置处的任何起始氨基酸，以及可能存在于此类位置处的任何取代。对位置的提及可以列举若干种形式，例如，位置003也可以称为位置3。对“位置：一种或多种氨基酸取代”(即1s/t/g、3g、17t等)的提及涵盖了可能存在于此类位置处的任何起始氨基酸和可能取代此类起始氨基酸的一种或多种氨基酸。对起始或经取代的氨基酸的提及可以进一步表示为由斜线(foreslash)(“/”)分开的若干个起始或经取代的氨基酸。例如，d275s/k指示位置275被丝氨酸(s)或赖氨酸(k)取代，并且p/s197k指示位置197处的起始氨基酸脯氨酸(p)或丝氨酸(s)被赖氨酸(k)取代。对x作为位置上的氨基酸的提及是指所列举位置处的任何氨基酸。

除非另有说明，给定的氨基酸序列中的氨基酸残基的位置通过与seqidno:1的氨基酸序列相对应来编号。即，seqidno:1所示的bpn’的氨基酸序列用作参比序列。在一个实施例中，使用如本文描述的比对算法，根据图5，将本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸序列与seqidno:1的氨基酸序列进行比对，并且与seqidno:1中的氨基酸残基比对(优选地，最佳对齐)的给定的氨基酸序列中的每个氨基酸残基通过参考相应氨基酸残基的数字位置而方便地编号。当与查询序列比较时，例如像本文描述的那些序列比对算法将鉴定在主题序列中发生插入或缺失的位置。

术语“蛋白酶”(protease)和“朊酶”(proteinase)是指具有分解蛋白质和肽的能力的酶。蛋白酶具有通过在形成蛋白质的肽或多肽链中将氨基酸连接在一起的肽键的水解进行“蛋白水解”的能力。蛋白酶作为蛋白质消化酶的这种活性被称为“蛋白水解活性”。存在许多熟知的程序用于测量蛋白水解活性。例如，蛋白水解活性可以通过分析各自蛋白酶水解合适底物的能力的比较测定来确定。可用于分析蛋白酶或蛋白水解活性的示例性底物包括但不限于二甲基酪蛋白(西格玛公司(sigma)c-9801)、牛胶原(西格玛公司(sigma)c-9879)、牛弹性蛋白(西格玛公司(sigma)e-1625)和牛角蛋白(icn生物医学公司(icnbiomedical)902111)。利用这些底物的比色测定是本领域熟知的(参见例如，wo99/34011和us6,376,450)。pna肽基测定(参见例如，delmar等人,analbiochem[分析生物化学],99:316-320,1979)还可用于确定活性酶浓度。该测定测量当酶水解可溶性合成底物如琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-对硝基苯胺(suc-aapf-pna)时释放对硝基苯胺的速率。在分光光度计上在405nm或410nm下测量来自水解反应的黄色的生成速率并且该速率与活性酶浓度成正比。另外，在280纳米(nm)处的吸光度测量可以用于确定纯化的蛋白质样品中的总蛋白质浓度。底物/蛋白质浓度的活性给出了酶比活性。

短语“一种或多种基本上不含硼的组合物”或“一种或多种基本上不含硼的洗涤剂”分别是指一种或多种含有痕量硼(例如，小于约1000ppm(1mg/kg或1mg/l等于1ppm)、小于约100ppm、小于约50ppm、小于约10ppm、或小于约5ppm、或小于约1ppm)的组合物或洗涤剂，所述硼可能来自其他组合物或洗涤剂成分。

如本文所使用的，“芽孢杆菌属”包括如本领域技术人员已知的“芽孢杆菌”属内的所有物种，包括但不限于：枯草芽孢杆菌(b.subtilis)、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌(b.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(b.stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(b.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌(b.clausii)、耐盐芽孢杆菌(b.halodurans)、巨大芽孢杆菌(b.megaterium)、凝结芽孢杆菌(b.coagulans)、环状芽孢杆菌(b.circulans)、吉氏芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌(b.thuringiensis)。应认识到，芽孢杆菌属不断进行分类学重组。因此，该属旨在包括已重新分类的物种，包括但不限于：例如嗜热脂肪芽孢杆菌(现在命名为“嗜热脂肪土芽孢杆菌(geobacillusstearothermophilus)”)或多黏芽孢杆菌(b.polymyxa)(现在是“多黏类芽孢杆菌(paenibacilluspolymyxa)”)的此类生物体。在胁迫环境条件下的抗性内生孢子的产生被认为是芽孢杆菌属的定义性特性，尽管这个特征也适用于最近命名的脂环酸芽孢杆菌属(alicyclobacillus)、双芽孢杆菌属(amphibacillus)、硫胺素芽孢杆菌属(aneurinibacillus)、厌氧芽孢杆菌属(anoxybacillus)、短芽孢杆菌属(brevibacillus)、线性杆菌属(filobacillus)、薄壁芽孢杆菌属(gracilibacillus)、喜盐芽孢杆菌属(halobacillus)、类芽孢杆菌属(paenibacillus)、需盐芽孢杆菌属(salibacillus)、耐热芽孢杆菌属(thermobacillus)、脲芽孢杆菌属(ureibacillus)和枝芽孢杆菌属(virgibacillus)。

术语“载体”是指用于将一个或多个核酸引入或转移到靶细胞或靶组织中的核酸构建体。典型地，载体用于将外源dna引入细胞或组织中。载体包括质粒、克隆载体、噬菌体、病毒(例如病毒载体)、黏粒、表达载体、穿梭载体等。典型地，载体包括复制起点、多克隆位点和选择性标记。典型地，将载体插入靶细胞的过程被称为转化。在一些实施例中，本发明包括：包含有效地连接到合适的前导序列(例如分泌、信号肽序列等)的编码丝氨酸蛋白酶多肽(例如，前体或成熟丝氨酸蛋白酶多肽)的dna序列的载体，该载体能够在合适的宿主中实现dna序列的表达，以及重组多肽链的折叠和易位。

如本文所使用的，在将核酸序列引入细胞中的上下文中，术语“引入”是指适合于将核酸序列转移到细胞中的任何方法。此类引入方法包括但不限于：原生质体融合、转染、转化、电穿孔、轭合和转导。转化是指由摄取、任选的基因组掺入和遗传物质(例如dna)的表达引起的细胞的遗传改变。

术语“表达”是指衍生自本公开的核酸分子的正义(mrna)或反义rna的转录和稳定积累。表达也可指将mrna翻译成多肽。因此，术语“表达”包括涉及“多肽的生产”的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、分泌等。

短语“表达盒”或“表达载体”是指重组或合成产生的用于在靶细胞中表达目的核酸(例如外源核酸或转基因)的核酸构建体或载体。典型地，目的核酸表达目的蛋白。典型地，表达载体或表达盒包含驱动或促进外源核酸表达的启动子核苷酸序列。典型地，表达载体或表达盒还包括其他的允许特定核酸在靶细胞中转录的指定核酸元件。重组表达盒可以整合在质粒、染色体、线粒体dna、质体dna、病毒或核酸片段中。一些表达载体具有在宿主细胞或宿主细胞基因组中掺入并表达异源dna片段的能力。许多原核和真核表达载体是可商购的。从掺入表达载体的核酸序列中选择用于表达蛋白质的适当的表达载体在本领域技术人员的知识范围内。

如本文所使用的，当将核酸与另一个核酸序列一起置于功能关系时，该核酸与另一个核酸序列“有效地连接”。例如，如果启动子影响编码序列的转录，启动子或增强子有效地连接到核苷酸编码序列。如果核糖体结合位点被定位以便促进编码序列的翻译，该核糖体结合位点可以有效地连接到编码序列。典型地，“有效地连接的”dna序列是连续的。然而，增强子不必需是连续的。通过在方便的限制位点处连接来实现连接。如果此类位点不存在，则可以根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。

术语“基因”是指编码多肽并且包括编码区之前和之后的区域的多核苷酸(例如，dna区段)。在一些情况下，基因包括个体编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)。

当关于细胞使用时，术语“重组”典型地指示细胞已经通过引入外源核酸序列而被修饰，或者细胞衍生自已如此修饰的细胞。例如，重组细胞可以包含天然(非重组)形式的细胞中不以相同形式存在的基因，或者重组细胞可以包含已经被修饰并且重新引入细胞中的天然基因(发现于细胞的天然形式中)。重组细胞可以包含细胞内源的核酸，该核酸已经被修饰而不从细胞中除去该核酸；此类修饰包括通过基因置换、位点特异性突变以及本领域普通技术人员已知的相关技术获得的那些。重组dna技术包括用于在体外生产重组dna并且将该重组dna转移到其可以被表达或传播的细胞中从而生产重组多肽的技术。多核苷酸或核酸的“重组(recombination和recombining)”通常是指装配或组合两个或更多个核酸或多核苷酸链或片段以产生新的多核苷酸或核酸。

如果在其天然状态下或当通过本领域技术人员已知的方法操纵时，核酸或多核苷酸可以被转录和/或翻译以生产多肽或其片段，那么称该核酸或多核苷酸“编码”该多肽。此类核酸的反义链也被称为编码该序列。

术语“宿主菌株”和“宿主细胞”是指对于包含目的dna序列的表达载体而言合适的宿主。

“蛋白质”或“多肽”包含氨基酸残基的聚合序列。术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换地使用。贯穿本公开使用了遵照iupac-iub生物化学术语联合委员会(jointcommissiononbiochemicalnomenclature，jcbn)定义的氨基酸的单字母和三字母代码。单字母x是指二十个氨基酸中的任一个。还应当理解，由于遗传密码的简并性，多肽可以由多于一种核苷酸序列编码。

术语“前导序列”或“前导肽序列”是指在信号肽序列与成熟蛋白酶序列之间的、蛋白酶的正确折叠和分泌所涉及的氨基酸序列；它们有时被称为分子内伴侣。前序列或前肽序列的切割产生成熟的活性蛋白酶。细菌丝氨酸蛋白酶通常表示为前酶。例如，在wo2016/205710中提供了经修饰的前导肽的实例。

术语“信号序列”和“信号肽”是指可以参与蛋白质的成熟或前体形式的分泌或定向转运的氨基酸残基序列。通常，信号序列位于前体或成熟蛋白序列的n-末端。信号序列可以是内源的或外源的。成熟蛋白中一般不存在信号序列。通常，在蛋白质转运后，信号序列通过信号肽酶从蛋白质切割。

术语“成熟”形式的蛋白质、多肽或肽是指没有信号肽序列和前导肽序列的功能形式的蛋白质、多肽或肽。

术语“前体”形式的蛋白质或肽是指具有有效地连接到所述蛋白质的氨基或羧基末端的前序列的成熟形式的蛋白质。前体还可以具有有效地连接到前序列的氨基末端的“信号”序列。前体还可以具有涉及翻译后活性的另外的多肽(例如，从其切割以留下成熟形式的蛋白质或肽的多肽)。

关于多肽，术语“野生型”是指在一个或多个氨基酸位置处不包括人造的取代、插入或缺失的天然存在的多肽。相似地，关于多核苷酸，术语“野生型”是指在一个或多个核苷酸处不包括人造的取代、插入或缺失的天然存在的多核苷酸。然而，编码野生型多肽的多核苷酸不限于天然存在的多核苷酸，并且涵盖编码野生型或亲本多肽的任何多核苷酸。

关于多肽，术语“亲本”包括提及天然存在的或野生型的多肽，或其中在一个或多个氨基酸位置上进行了人造取代、插入或缺失的天然存在的多肽。关于多肽，术语“亲本”还包括具有蛋白酶活性的任何多肽，所述多肽充当改变(如取代、添加和/或缺失)的起始多肽，以产生与所述起始多肽相比具有一个或多个改变的变体。即，亲本或参比多肽不限于天然存在的野生型多肽，并且涵盖任何野生型、亲本或参比多肽。类似地，关于多核苷酸，术语“亲本”可以指天然存在的多核苷酸或确实包括在一个或多个核苷酸处的人造取代、插入或缺失的多核苷酸。关于多核苷酸，术语“亲本”还包括编码具有蛋白酶活性的多肽的任何多核苷酸，所述多核苷酸充当改变的起始多核苷酸，从而产生与所述起始多核苷酸相比具有诸如取代、添加和/或缺失等的修饰的变体蛋白酶。即，编码野生型、亲本或参比多肽的多核苷酸不限于天然存在的多核苷酸，并且涵盖编码野生型、亲本或参比多肽的任何多核苷酸。

术语“天然存在的”是指，例如，自然界中发现的序列和其中含有的残基(例如，多肽序列和其中含有的氨基酸或核酸序列和其中含有的核苷酸)。相反，术语“非天然存在的”是指，例如，自然界中未发现的序列和其中含有的残基(例如，多肽序列和其中含有的氨基酸或核酸序列和其中含有的核苷酸)。

如本文所使用的，关于氨基酸残基位置，“对应于”(correspondingto或correspondsto)或“对应”是指在蛋白质或肽中所列举位置处的氨基酸残基，或类似于、同源于或等同于蛋白质或肽中所列举残基的氨基酸残基。如本文所使用的，“对应区域”通常是指相关蛋白质或参比蛋白质中的类似位置。

术语“衍生自”和“获得自”不仅是指由所讨论的生物体的菌株生产或可以由其生产的蛋白质，而且是指由从此类菌株分离的dna序列编码并且在含有此类dna序列的宿主生物体中生产的蛋白质。另外，所述术语是指由合成的和/或cdna来源的dna序列编码并且具有所讨论的蛋白质的鉴定特征的蛋白质。举例来说，“衍生自芽孢杆菌属的蛋白酶”是指具有由芽孢杆菌属天然生产的蛋白水解活性的那些酶，以及丝氨酸蛋白酶，如由芽孢杆菌属来源生产但是通过使用遗传工程技术由用编码丝氨酸蛋白酶的核酸转化的其他宿主细胞生产的那些。

在两个多核苷酸或多肽序列的上下文中，术语“同一性”是指在两个序列中的核苷酸或氨基酸在比对最大对应关系时相同，如使用以下描述的或本领域已知的序列比较或分析算法测量的。

短语“％同一性”或“百分比同一性”或“pid”是指蛋白质序列同一性。百分比同一性可以使用本领域已知的标准技术来确定。可以通过比对序列以直接比较序列信息来确定目的序列共有的百分比氨基酸同一性，例如通过使用诸如blast、muscle或clustal等程序。blast算法描述于例如，altschul等人,jmolbiol[分子生物学杂志],215:403-410(1990)和karlin等人,procnatlacadsciusa[美国国家科学院院报],90:5873-5787(1993)。百分比(％)氨基酸序列同一性值由匹配相同残基的数值除以“参比”序列的残基总数(包括由程序为最佳/最大比对创建的任何空位)来确定。blast算法将“参比”序列称为“查询”序列。

如本文所使用的，“同源蛋白质”或“同源蛋白酶”是指在一级、二级和/或三级结构中具有不同相似性的蛋白质。当比对蛋白质时，蛋白质同源性可以是指线性氨基酸序列的相似性。可以通过氨基酸序列比对来确定同源性，例如使用诸如blast、muscle或clustal的程序。蛋白质序列的同源搜索可以使用来自ncbiblast的blastp和psi-blast使用阈值(e值截止值)0.001进行。(altschul等人,“gappedblastandpsiblastanewgenerationofproteindatabasesearchprograms”[空位blast和psiblast：新一代蛋白质数据库搜索程序],nucleicacidsres[核酸研究],第1组；25(17):3389-402(1997))。blast程序使用几个搜索参数，其中大部分设置为默认值。ncbiblast算法按照生物相似性找到最相关的序列，但是不推荐用于少于20个残基的查询序列(altschul等人,nucleicacidsres[核酸研究],25:3389-3402,1997和schaffer等人，nucleicacidsres[核酸研究],29:2994-3005,2001)。核酸序列搜索的示例性默认blast参数包括：相邻字长阈值＝11；e值截止值＝10；评分矩阵(scoringmatrix)＝nuc.3.1(匹配＝1，错配＝-3)；空位开放(gapopening)＝5；以及空位延伸＝2。氨基酸序列搜索的示例性默认blast参数包括：字长＝3；e值截止值＝10；评分矩阵＝blosum62；空位开放＝11；以及空位延伸＝1。使用该信息，可以将蛋白质序列分组和/或从中构建系统发生树。可以在诸如vectorntiadvance套件等程序中输入氨基酸序列，并且可以使用邻接(neighborjoining(nj))法创建引导树(saitou和nei,molbiolevol[分子生物学与进化],4:406-425,1987)。可以使用针对序列距离的kimura校正并且忽略具有空位的位置来计算树结构。程序如alignx可以在系统发生树上显示的分子名称之后的括号内显示计算的距离值。

在已经确定了蛋白质的三维结构或创建了同源模型的实施例中，可以确定两个或更多个分子之间的结构同源氨基酸位置。对于具有显著结构相似性的分子，可以预期的是，在一个分子的结构同源位点处引入在另一个分子中赋予改善作用的取代，可赋予这些分子在性能和/或稳定性方面类似的改善。可以通过进行结构比对来鉴定结构同源的氨基酸位置，所述结构比对尝试根据蛋白质结构的形状和三维构象确定两个或更多个蛋白质结构之间的同源性。结构比对可以产生原子坐标集的叠加，并在结构之间产生最小的均方根偏差。创建结构比对的方法的实例有距离比对矩阵法(dali)(holml,sanderc(1996)“mappingtheproteinuniverse[蛋白质世界图谱绘制]”,science[科学],273(5275):595-603)、组合延伸(ce)(shindyalov,i.n.；bournep.e.(1998)“proteinstructurealignmentbyincrementalcombinatorialextension(ce)oftheoptimalpath[通过最优路径的增量组合延伸(ce)进行的蛋白质结构比对]”,proteinengineering[蛋白质工程],11(9):739-747)，以及顺序结构比对程序(ssap)(taylorwr,florestp,orengoca(1994)“multipleproteinstructurealignment[多蛋白质结构比对]”,proteinsci.[蛋白质科学],3(10):1858-70)。通过将多序列比对与结构比对组合，可以在尚未确定三维结构的分子中鉴定结构同源的氨基酸位置。用于创建基于多序列比对的结构比对的方法的实例有3dcoffee(poiroto等人(2004)“3dcoffee@igs:awebserverforcombiningsequencesandstructuresintoamultiplesequencealignment[3dcoffee@igs：用于将序列和结构组合为多序列比对的web服务器]”nucleicacidsres.[核酸研究],2004年7月1日；32:w37-40)、promals3d(peij等人(2008)“promals3d:atoolformultipleproteinsequenceandstructurealignments[promals3d：用于多蛋白质序列和结构比对的工具].”nucleicacidsres.[核酸研究],36(7):2295-300)和3dm(kuipers,rk等人(2010)“3dm:systematicanalysisofheterogeneoussuperfamilydatatodiscoverproteinfunctionalities[3dm：异源超家族数据的系统分析以发现蛋白质功能]”proteins[蛋白质],78(9):2101-13)。了解分子之间的同源性可以揭示分子的进化历史以及它们的功能信息；如果新测序的蛋白质与已经表征的蛋白质同源，则存在新蛋白质的生物化学功能的强烈指示。如果两个分子衍生自共同的祖先，则它们被称为是同源的。同源分子或同源物可以分为两类：旁系同源物和直系同源物。旁系同源物是存在于一个物种内的同源物。旁系同源物在它们的详细生物化学功能上往往不同。直系同源物是存在于不同物种内并且具有非常相似或完全相同功能的同源物。蛋白质超家族是可以推断出共同祖先的蛋白质的最大分组(进化枝)。通常这个共同祖先是基于序列比对和机械相似性。通常，超家族含有若干个在该家族内显示序列相似性的蛋白质家族。基于merops蛋白酶分类系统，术语“蛋白质宗族”通常用于蛋白酶超家族。如本文所使用，术语“枯草杆菌蛋白酶”包括如merops-肽酶数据库(rawlings,n.d.等人(2016)twentyyearsofthemeropsdatabaseofproteolyticenzymes,theirsubstratesandinhibitors[蛋白水解酶、其底物和抑制剂的二十年merops数据库].nucleicacidsres[核酸研究]44,d343-d350)中描述的s8丝氨酸蛋白酶家族的任何成员。

clustalw算法是序列比对算法的另一个实例(参见thompson等人,nucleicacidsres[核酸研究]22:4673-4680,1994)。clustalw算法的默认参数包括：空位开放罚分＝10.0；空位延伸罚分＝0.05；蛋白质权重矩阵＝blosum系列；dna权重矩阵＝iub；延迟发散序列％＝40；空位分隔距离＝8；dna转换权重＝0.50；列表亲水残基＝gpsndqekr；使用负性矩阵＝关；切换特殊残基罚分＝开；切换亲水罚分＝开；以及切换结束空位分隔罚分＝关。在clustal算法中，包括在任一末端发生的缺失。例如，在500个氨基酸的多肽的任一末端(或多肽内)具有五个氨基酸缺失的变体相对于“参比”多肽具有99％(495/500个同一的残基×100)的百分比序列同一性。此类变体将被与所述多肽具有“至少99％的序列同一性”的变体所涵盖。

当核酸或多核苷酸与其他成分至少部分或完全分开时，其被“分离”，所述其他成分包括但不限于其他蛋白质、核酸、细胞等。类似地，当多肽、蛋白质或肽与其他成分至少部分或完全分开时，其被“分离”，所述其他成分包括但不限于其他蛋白质、核酸、细胞等。以摩尔数计，分离的物质种类比组合物中其他物质种类更丰富。例如，分离的物质种类可以占存在的所有大分子物质种类的至少约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、或约100％(以摩尔计)。优选地，将目的物种纯化至基本均一性(即，通过常规检测方法不能在组合物中检测到污染物物种)。可以分别使用本领域熟知的许多技术如核酸或蛋白质样品的琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，接着通过染色后可视化来确定纯度和均一性。如果需要，可以使用高分辨率技术如高效液相色谱法(hplc)或类似方法来纯化物质。

术语“经纯化的”如应用于核酸或多肽时通常表示基本上不含其他组分的核酸或多肽，如通过本领域熟知的分析技术确定的(例如，纯化的多肽或多核苷酸在电泳凝胶、色谱洗脱液和/或经历密度梯度离心的介质中形成离散的带)。例如，在电泳凝胶中产生基本上一条带的核酸或多肽是“经纯化的”。经纯化的核酸或多肽是至少约50％纯的，通常是至少约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约99.5％、约99.6％、约99.7％、约99.8％或更加纯的(例如，在摩尔基础上按重量计的百分比)。在相关意义上，当在应用纯化或富集技术之后存在分子的浓度的大幅度增加时，对于所述分子而言组合物被富集了。术语“富集”是指化合物、多肽、细胞、核酸、氨基酸或其他特定物质或组分以高于在起始组合物中的相对或绝对浓度存在于组合物中。

术语“清洁活性”是指在本公开的蛋白水解、水解、清洁或其他过程期间主要的条件下由丝氨酸蛋白酶多肽或参比枯草杆菌蛋白酶实现的清洁性能。在一些实施例中，丝氨酸蛋白酶或参比枯草杆菌蛋白酶的清洁性能可以通过使用用于清洁在物品或表面上的一种或多种酶敏感性污渍(例如，由食物、草地、血液、墨汁、奶、油和/或卵蛋白质引起的污渍)的各种测定来确定。本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体或参比枯草杆菌蛋白酶的清洁性能可以通过使在物品或表面上的污渍经受一个或多个标准洗涤条件并且通过使用各种色谱法、分光光度法或其他定量方法来评估污渍除去的程度来确定。示例性清洁测定和方法是本领域已知的，并且包括但不限于在wo99/34011和us6,605,458中描述的那些，以及包括在下面所提供的实例中的那些清洁测定和方法。

关于蛋白酶变体，术语“稳定的”和“稳定性”是指在蛋白水解、水解、清洁或其他过程中普遍存在的条件(或“应激条件”)下，在给定的时间段内暴露于变化的温度后，与亲本或参比蛋白酶相比保留更大量的残余活性的蛋白酶。残余活性是测试后与所述样品的初始活性相比残余的活性量，可以以百分比形式报告，例如残余活性百分比。“改变的温度”涵盖温度升高或降低。在一些实施例中，所述蛋白酶在暴露于改变的温度下给定的时间段后，例如，至少约20分钟、至少约40分钟、至少约60分钟、约90分钟、约120分钟、约180分钟、约240分钟、约300分钟、约360分钟、约420分钟、约480分钟、约540分钟、约600分钟约660分钟、约720分钟、约780分钟、约840分钟、约900分钟、约960分钟、约1020分钟、约1080分钟、约1140分钟或约1200分钟后，保留至少约25％、约30％、约35％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约85％、约90％、约92％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的蛋白水解活性(残余活性)。

可替代地，关于蛋白酶变体，术语“稳定的”和“稳定性”还指在蛋白水解、水解、清洁或其他过程中普遍存在的条件(或“应激条件”)下在给定的时间段内暴露于变化的温度后，保留比亲本或参比蛋白酶更高的残余活性的蛋白酶。“改变的温度”涵盖温度升高或降低。变体蛋白酶的稳定性性能指数(pi)可以通过将变体蛋白酶的残余活性除以亲本或参比蛋白酶的残余活性来获得。在一些实施例中，所述蛋白酶变体在暴露于改变的温度下给定的时间段后，例如，至少约20分钟、至少约40分钟、至少约60分钟、约90分钟、约120分钟、约180分钟、约240分钟、约300分钟、约360分钟、约420分钟、约480分钟、约540分钟、约600分钟、约660分钟、约720分钟、约780分钟、约840分钟、约900分钟、约960分钟、约1020分钟、约1080分钟、约1140分钟、或约1200分钟后，具有约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约2、约2.5、约3、约4或高于4的pi。

可替代地，关于蛋白酶变体，术语“稳定的”和“稳定性”还指在蛋白水解、水解、清洁或其他过程中普遍存在的条件(或“应激条件”)下在给定的时间段内暴露于变化的温度后，表现出比亲本或参比蛋白酶更长的灭活半衰期(half-livesforinactivation，t1/2)的蛋白酶。“改变的温度”涵盖温度升高或降低。关于蛋白酶变体，“灭活半衰期”是指所述蛋白酶保留初始酶活性一半的时间，如实例2所示。在一些实施例中，100％cns洗涤剂中在40℃下灭活半衰期大于1小时。

术语“稳定性”包括储存稳定性和使用过程中(例如洗涤过程中)的稳定性，它反映了根据本发明的枯草杆菌蛋白酶变体随时间变化的稳定性，例如当所述枯草杆菌蛋白酶变体在溶液中(特别是在洗涤剂溶液中时)保留多少活性。稳定性受许多因素影响，例如ph、温度、洗涤剂成分，例如助洗剂的量、表面活性剂，水含量，蛋白酶抑制剂/稳定剂等。所述枯草杆菌蛋白酶变体的稳定性可以使用实例2和7中所描述的测定进行测量。术语“改善的稳定性”或“增加的稳定性”在本文中定义为相对于亲本枯草杆菌蛋白酶的稳定性，变体枯草杆菌蛋白酶在溶液中显示出增加的稳定性。术语“改善的稳定性”和“增加的稳定性”包括“改善的化学稳定性”或“改善的洗涤剂稳定性”。

术语“改善的洗涤剂稳定性”在本文中定义为变体枯草杆菌蛋白酶在洗涤剂或洗涤剂化学组分存在下孵育一段时间后显示出酶活性的保留，这降低了所述亲本酶的酶活性。改善的洗涤剂稳定性还可以产生在这种洗涤剂或化学组分存在下更能催化反应的变体。术语“洗涤剂稳定性”或“改善的洗涤剂稳定性”特别指当将本发明的枯草杆菌蛋白酶变体混合到液体洗涤剂制剂中并在40℃至72℃之间的温度(例如45℃、50℃、55℃、60℃、65℃或70℃)下孵育时，蛋白酶活性的改善的稳定性。

在氧化、螯合剂、变性剂、表面活性剂、热和/或ph稳定的蛋白酶的上下文中，术语“增强的稳定性”或“改善的稳定性”是指与参比蛋白酶(例如，野生型蛋白酶或亲本蛋白酶)相比，随时间推移的较高地保留的蛋白水解活性。自溶已经被鉴定为液体洗涤剂中枯草杆菌蛋白酶活性丧失的一种模式。(stoner等人,2004proteaseautolysisinheavy-dutyliquiddetergentformulations:effectsofthermodynamicstabilizersandproteaseinhibitors[2004蛋白酶在重垢液体洗涤剂制剂中的自溶作用：热力学稳定剂和蛋白酶抑制剂的作用],enzymeandmicrobialtechnology[酶和微生物技术]34:114-125.)

本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体或参比枯草杆菌蛋白酶的术语“有效量”是指在具体清洁组合物中达到希望的酶活性水平的蛋白酶的量。此类有效量可以由本领域普通技术人员容易地确定，并且基于许多因素，如所使用的特定蛋白酶、清洁应用、清洁组合物的具体组成、以及是否需要液体或干燥(例如，颗粒、片剂、棒状)组合物等。

术语“辅助材料”是指除了本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体之外在清洁组合物中包含的任何液体、固体或气体物质，或重组多肽或其活性片段。在一些实施例中，本公开的清洁组合物包括一种或多种清洁辅助材料。典型地，取决于清洁组合物的具体类型和形式(例如液体、颗粒、粉末、棒状、糊剂、喷雾、片剂、凝胶、泡沫或其他组合物)来选择每种清洁辅助材料。优选地，每种清洁辅助材料与在组合物中使用的蛋白酶相容。

清洁组合物和清洁制剂包括适合于清洁、漂白、消毒和/或灭菌任何物体、物品和/或表面的任何组合物。这样的组合物和制剂包括但不限于，例如，液体和/或固体组合物，包括清洁剂或洗涤剂组合物(例如液体、片剂、凝胶、条、颗粒和/或固体衣物清洁剂或洗涤剂组合物和精细织物洗涤剂组合物)；硬质表面清洁剂和制剂，如用于玻璃、木材、陶瓷和金属台面和窗户的清洁剂和制剂；地毯清洁剂；烤箱清洁剂；织物清新剂；织物柔软剂；以及纺织品、衣物增效清洁剂或洗涤剂组合物，衣物添加剂清洁组合物和衣物预去污清洁组合物；餐具洗涤组合物，包括手洗或手动餐具洗涤组合物(例如“手洗”或“手动”餐具洗涤剂)和自动餐具洗涤组合物(例如“自动餐具洗涤剂”)。本发明还可使用单一剂量单位形式，包括但不限于丸剂、片剂、囊形片(gelcap)或其他单一剂量单位如预先测量的粉末或液体。

除非另有指示，否则如本文所使用的清洁组合物或清洁制剂包括颗粒或粉末形式的通用的或重垢洗涤剂，特别是清洁洗涤剂；液体、颗粒、凝胶、固体、片剂、糊剂或单位剂型的通用清洗剂，尤其是所谓的重垢液体(hdl)洗涤剂或重垢干(hdd)洗涤剂类型；液体精细织物洗涤剂；手洗或手动餐具洗涤剂，包括高泡型餐具洗涤剂；手洗或手动餐具洗涤剂、自动餐具洗涤剂(adw)或盘碟或碗筷洗涤剂，包括供家庭和公共设施使用的各种片剂、粉末、固体、颗粒、液体、凝胶和漂洗助剂类型；液体清洁和消毒剂，包括抗菌手洗类型、清洁棒、漱口水、假牙清洁剂、洗车香波、地毯香波、浴室清洁剂；用于人类和其他动物的毛发香波和/或毛发染发剂；沐浴露和泡沫浴和金属清洁剂；以及清洁助剂，如漂白添加剂和“去污棒”或预处理类型。在一些实施例中，颗粒组合物是呈“紧密”形式；在一些实施例中，液体组合物是呈“浓缩”形式。

关于旨在用于清洁污染或肮脏物体(包括特定织物和/或非织物物体或物品)的洗涤介质中使用的组合物，使用术语“洗涤剂组合物”或“洗涤剂制剂”。在一些实施例中，本公开的洗涤剂包含本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，另外还包含一种或多种表面活性剂、一种或多种转移酶、水解酶、氧化还原酶、助洗剂(例如助洗剂盐)、漂白剂、漂白活化剂、上蓝剂、荧光染料、结块抑制剂、掩蔽剂、酶稳定剂、钙、酶活化剂、抗氧化剂和/或增溶剂。在一些情况下，助洗剂盐是硅酸盐和磷酸盐的混合物，优选具有比磷酸盐(例如三聚磷酸钠)更多的硅酸盐(例如偏硅酸钠)。一些实施例涉及不包含任何磷酸盐(例如磷酸盐或磷酸盐助洗剂)的清洁组合物或洗涤剂组合物。

术语“漂白”是指处理材料(例如织物、衣物、纸浆等)或表面持续足够长的时间和/或在适当的ph和/或温度条件下处理材料(例如织物、衣物、纸浆等)或表面以实现该材料的增白(即变白)和/或清洁。适用于漂白的化学物质的实例包括但不限于例如clo2、h2o2、过酸、no2等。漂白剂还包括酶促漂白剂，如过水解酶和芳基酯酶。另一个实施例涉及包含本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体和一种或多种过水解酶的组合物，例如像描述于wo2005/056782、wo2007/106293、wo2008/063400、wo2008/106214、和wo2008/106215中的过水解酶。

术语蛋白酶(例如，本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体、或其重组多肽或活性片段)的“洗涤性能”是指与不添加本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体至组合物的洗涤剂相比，本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体对洗涤提供另外的清洁性能的贡献。在相关洗涤条件下比较洗涤性能。在一些测试系统中，其他相关因素，如洗涤剂组合物、泡沫浓度(sudconcentration)、水硬度、洗涤力学、时间、ph和/或温度能按以下这样的方式进行控制：模仿在某些细分市场(例如手洗或手动餐具洗涤、自动餐具洗涤、餐具清洁、桌面器具清洁、织物清洁等)中对于家庭应用典型的一种或多种条件。

本文中使用的短语“相关洗涤条件”指示在手洗餐具洗涤、自动餐具洗涤或衣物洗涤剂细分市场中实际用于家庭中的条件，特别是洗涤温度、时间、洗涤力学、泡沫浓度、洗涤剂类型和水硬度。

术语“消毒”是指从表面除去污染物，以及在物品表面上抑制或杀死微生物。

本文中清洁组合物的术语“紧密”形式最好通过密度来反映，并且就组合物而言通过无机填料盐的量来反映。无机填料盐是呈粉末形式的洗涤剂组合物的常规成分。在常规洗涤剂组合物中，填料盐以相当大的量存在，典型地为按总组合物的重量计约17％至约35％。相比之下，在紧密的组合物中，填料盐以不超过总组合物的约15％的量存在。在一些实施例中，填料盐以按组合物的重量计不超过约10％、或更优选地约5％的量存在。在一些实施例中，无机填料盐选自硫酸盐和氯化物的碱盐和碱土金属盐。在一些实施例中，填料盐是硫酸钠。

本文公开了可用于，例如，清洁组合物和清洁应用、清洁方法以及多种工业应用的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体。本文公开了一种或多种分离的、重组的、基本上纯的或非天然存在的枯草杆菌蛋白酶变体。在一些实施例中，本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体可用于清洁应用中，并且可以掺入可用于清洁有需要的物品或表面的方法中的清洁组合物中。

在一个实施例中，本公开提供了一种或多种与seqidno:1具有至少50％氨基酸序列同一性的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述多肽相对于seqidno:1具有以下特征中的至少三个：在位置3处的q、t或v；在位置9处的e；在位置24处的q；在位置40处的e；在位置69处的s；在位置76处的d；在位置78处的n；在位置87处的d；在位置118处的r；在位置124处的i；在位置128处的q、r或s；在位置129处的p；在位置130处的s；在位置145处的r；在位置166处的q；在位置182处的e；在位置185处的q；在位置210处的i；在位置211处的p；在位置217处为l或q；在位置218处的s；在位置248处的d；以及在位置259处的p，其中所述氨基酸位置与seqidno:1相对应编号，并且其中所述变体不具有与天然存在的分子相同的氨基酸序列。

其他实施例涉及相对于seqidno:1具有以下特征中的至少三个的枯草杆菌蛋白酶变体：在位置3处的q、t或v；在位置9处的e；在位置24处的q；在位置40处的e；在位置69处的s；在位置76处的d；在位置78处的n；在位置87处的d；在位置118处的r；在位置124处的i；在位置128处的q、r或s；在位置129处的p；在位置130处的s；在位置145处的r；在位置166处的q；在位置182处的e；在位置185处的q；在位置210处的i；在位置211处的p；在位置217处为l或q；在位置218处的s；在位置248处的d；以及在位置259处的p，其中所述氨基酸位置与seqidno:1相对应编号，其中所述变体衍生自与seqidno:1、2、10或15的氨基酸序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％氨基酸序列同一性的亲本多肽或参比多肽。

仍其他实施例涉及相对于seqidno:1具有以下特征中的至少三个的枯草杆菌蛋白酶变体：在位置3处的q、t或v；在位置9处的e；在位置24处的q；在位置40处的e；在位置69处的s；在位置76处的d；在位置78处的n；在位置87处的d；在位置118处的r；在位置124处的i；在位置128处的q、r或s；在位置129处的p；在位置130处的s；在位置145处的r；在位置166处的q；在位置182处的e；在位置185处的q；在位置210处的i；在位置211处的p；在位置217处为l或q；在位置218处的s；在位置248处的d；以及在位置259处的p，其中所述氨基酸位置与seqidno:1相对应编号，其中所述变体包含与seqidno:1、2、10或15的氨基酸序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

进一步的实施例涉及相对于seqidno:1具有以下特征中的至少三个的枯草杆菌蛋白酶变体：在位置3处的t或v；在位置9处的e；在位置40处的e；在位置69处的s；在位置76处的d；在位置78处的n；在位置118处的r；在位置124处的i；在位置128处的q或s；在位置129处的p；在位置130处的s；在位置145处的r；在位置166处的q；在位置185处的q；在位置217处的l；在位置218处的s；在位置248处的d；在位置259处的p，其中所述位置与seqidno:1的氨基酸序列相对应编号，其中所述变体包含与seqidno:1、2、10或15的氨基酸序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

在另一个实施例中，枯草杆菌蛋白酶变体相对于seqidno:1具有以下特征中的至少三个：在位置3处的v；在位置40处的e；在位置69处的s；在位置76处的d；在位置78处的n；在位置118处的r；在位置128处的q或s；在位置129处的p；在位置145处的r；在位置166处的q；在位置185处的q；在位置218处的s；在位置248处的d；以及在位置259处的p，其中所述氨基酸位置与seqidno:1相对应编号，其中所述变体包含与seqidno:1、2、10或15的氨基酸序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

在另一个实施例中，枯草杆菌蛋白酶变体相对于seqidno:1具有以下特征中的至少三个：在位置3处的v；在位置40处的e；在位置69处的s；在位置76处的d；在位置78处的n；在位置118处的r；在位置128处的q或s；在位置129处的p；在位置145处的r；在位置166处的q；在位置185处的q；在位置218处的s；在位置248处的d；以及在位置259处的p，其中所述氨基酸位置与seqidno:1相对应编号，其中所述特征为取代，并且其中所述变体包含与seqidno:1、2、10或15的氨基酸序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

在另一个实施例中，枯草杆菌蛋白酶变体相对于seqidno:1具有以下特征中的至少三个：在位置3处的q；在位置24处的q；在位置87处的d；在位置128处的r；在位置182处的e；在位置210处的i；在位置211处的p；以及在位置217处的q，其中所述氨基酸位置与seqidno:1相对应编号，其中所述变体包含与seqidno:1、2、10或15的氨基酸序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

在另一个实施例中，枯草杆菌蛋白酶变体相对于seqidno:1具有以下特征中的至少三个：在位置9处的e；在位置40处的e；在位置76处的d；在位置128处的r；在位置166处的q；在位置182处的e；以及在位置218处的s，其中所述氨基酸位置与seqidno:1相对应编号，其中所述变体包含与seqidno:1、2、10或15的氨基酸序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

仍其他实施例涉及相对于seqidno:1具有以下特征中的至少三个的枯草杆菌蛋白酶变体：在位置3处的q、t或v；在位置9处的e；在位置24处的q；在位置40处的e；在位置69处的s；在位置76处的d；在位置78处的n；在位置87处的d；在位置118处的r；在位置124处的i；在位置128处的q、r或s；在位置129处的p；在位置130处的s；在位置145处的r；在位置166处的q；在位置182处的e；在位置185处的q；在位置210处的i；在位置211处的p；在位置217处为l或q；在位置218处的s；在位置248处的d；以及在位置259处的p，其中所述氨基酸位置与seqidno:1相对应编号，其中所述变体包含与seqidno:1的氨基酸序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些这样的实施例中，所述与bpn`(seqidno:1)具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％氨基酸序列同一性的枯草杆菌蛋白酶变体具有选自由s003q/v、s009e、s024q、p040e、a069s、n076d、s078n、s087d、n118r、m124i、g128s、s145r、g166q、s182e、y217l/q、n218s和d259p组成的组的至少三个特征，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置与seqidno:1的氨基酸序列相对应编号。

仍其他实施例涉及相对于seqidno:1具有以下特征中的至少三个的枯草杆菌蛋白酶变体：在位置3处的q、t或v；在位置9处的e；在位置24处的q；在位置40处的e；在位置69处的s；在位置76处的d；在位置78处的n；在位置87处的d；在位置118处的r；在位置124处的i；在位置128处的q、r或s；在位置129处的p；在位置130处的s；在位置145处的r；在位置166处的q；在位置182处的e；在位置185处的q；在位置210处的i；在位置211处的p；在位置217处为l或q；在位置218处的s；在位置248处的d；以及在位置259处的p，其中所述氨基酸位置与seqidno:1相对应编号，其中所述变体包含与seqidno:2的氨基酸序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些这样的实施例中，所述与gg36(seqidno:2)具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％氨基酸序列同一性的枯草杆菌蛋白酶变体具有选自由s003q/t/v、p040e、n076d、s078n、s087d、g118r、s128r、s166q、q182e、n185q、p210i、g211p、l217q、n218s、n248d和s259p组成的组的至少三个特征，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置与seqidno:1的氨基酸序列相对应编号。

仍其他实施例涉及相对于seqidno:1具有以下特征中的至少三个的枯草杆菌蛋白酶变体：在位置3处的q、t或v；在位置9处的e；在位置24处的q；在位置40处的e；在位置69处的s；在位置76处的d；在位置78处的n；在位置87处的d；在位置118处的r；在位置124处的i；在位置128处的q、r或s；在位置129处的p；在位置130处的s；在位置145处的r；在位置166处的q；在位置182处的e；在位置185处的q；在位置210处的i；在位置211处的p；在位置217处为l或q；在位置218处的s；在位置248处的d；以及在位置259处的p，其中所述氨基酸位置与seqidno:1相对应编号，其中所述变体包含与seqidno:10的氨基酸序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些这样的实施例中，所述与bg46(seqidno:10)具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％氨基酸序列同一性的枯草杆菌蛋白酶变体具有选自由t003q、t009e、s024q、s040e、n076d、n087d、n118r、s128q/r、d129p、f130s、g166q、q182e、r185q、p210i、m217l/q、n218s、n248d和n259p组成的组的至少三个特征，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置与seqidno:1的氨基酸序列相对应编号。

仍其他实施例涉及相对于seqidno:1具有以下特征中的至少三个的枯草杆菌蛋白酶变体：在位置3处的q、t或v；在位置9处的e；在位置24处的q；在位置40处的e；在位置69处的s；在位置76处的d；在位置78处的n；在位置87处的d；在位置118处的r；在位置124处的i；在位置128处的q、r或s；在位置129处的p；在位置130处的s；在位置145处的r；在位置166处的q；在位置182处的e；在位置185处的q；在位置210处的i；在位置211处的p；在位置217处为l或q；在位置218处的s；在位置248处的d；以及在位置259处的p，其中所述氨基酸位置与seqidno:1相对应编号，其中所述变体包含与seqidno:15的氨基酸序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些这样的实施例中，所述与aprl(seqidno:15)具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％氨基酸序列同一性的枯草杆菌蛋白酶变体具有选自由t003v、p009e、a069s、t078n、s087d、m124i、g128q/r/s、a129p、g166q、s182e、n185q、p210i、t211p、l217q、n218s和s259p组成的组的至少三个特征，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体的氨基酸位置与seqidno:1的氨基酸序列相对应编号。

本文提供的枯草杆菌蛋白酶变体可具有3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23个所列举的特征。在一些实施例中，其中所列举的特征是给定亲本或参比枯草杆菌蛋白酶多肽中的野生型氨基酸，其他特征中的至少一个是相对于参比枯草杆菌蛋白酶多肽的取代，产生自然界中未发现的变体枯草杆菌蛋白酶多肽序列。

在其他实施例中，本文公开的枯草杆菌蛋白酶变体包含相对于seqidno:1的以下三个或更多个特征的组合：在位置3处的q、t或v；在位置9处的e；在位置24处的q；在位置40处的e；在位置69处的s；在位置76处的d；在位置78处的n；在位置87处的d；在位置118处的r；在位置124处的i；在位置128处的q、r或s；在位置129处的p；在位置130处的s；在位置145处的r；在位置166处的q；在位置182处的e；在位置185处的q；在位置210处的i；在位置211处的p；在位置217处为l或q；在位置218处的s；在位置248处的d；以及在位置259处的p，其中所述三个或更多个特征的组合选自由以下组成的组：x076d-x166q-x218s、x076d-x078n-x218s、x076d-x218s-x248d、x003v-x076d-x218s、x040e-x076d-x218s、x078n-x166q-x218s、x076d-x078n-x166q、x076d-x218s-x259p、x076d-x185q-x218s、x009e-x076d-x218s、x166q-x218s-x248d、x076d-x166q-x248d、x003v-x166q-x218s、x003v-x076d-x166q、x040e-x166q-x218s、x040e-x076d-x166q、x128q-x076d-x218s、x166q-x218s-x259p、x076d-x166q-x259p、x166q-x185q-x218s、x076d-x166q-x185q、x009e-x166q-x218s、x009e-x076d-x166q、x076d-x118r-x218s、x003q-x076d-x218s、x076d-x129p-x218s、x076d-x130s-x218s、x078n-x218s-x248d、x076d-x078n-x248d、x003v-x078n-x218s、x003v-x076d-x078n、x076d-x087d-x218s、x128q-x166q-x218s、x128q-x076d-x166q、x040e-x078n-x218s、x040e-x076d-x078n、x118r-x166q-x218s、x076d-x118r-x166q、x003q-x166q-x218s、x003q-x076d-x166q、x078n-x218s-x259p、x076d-x078n-x259p、x129p-x166q-x218s、x076d-x129p-x166q、x078n-x185q-x218s、x076d-x078n-x185q、x009e-x078n-x218s、x009e-x076d-x078n、x128s-x076d-x218s、x130s-x166q-x218s、x076d-x130s-x166q、x003v-x218s-x248d、x003v-x076d-x248d、x217q-x076d-x218s、x217l-x076d-x218s、x040e-x218s-x248d、x040e-x076d-x248d、x003v-x040e-x218s、x003v-x040e-x076d、x078n-x166q-x248d、x003v-x078n-x166q、x087d-x166q-x218s、x076d-x087d-x166q、x218s-x248d-x259p、x076d-x248d-x259p、x003v-x218s-x259p、x003v-x076d-x259p、x185q-x218s-x248d、x076d-x185q-x248d、x040e-x078n-x166q、x009e-x218s-x248d、x003v-x185q-x218s、x009e-x076d-x248d、x003v-x076d-x185q、x003v-x009e-x218s、x003v-x009e-x076d、x040e-x218s-x259p、x040e-x076d-x259p、x076d-x210i-x218s、x040e-x185q-x218s、x040e-x076d-x185q、x069s-x076d-x218s、x009e-x040e-x218s、x009e-x040e-x076d、x128q-x078n-x218s、x128q-x076d-x078n、x078n-x166q-x259p、x076d-x182e-x218s、x078n-x166q-x185q、x009e-x078n-x166q、x128s-x166q-x218s、x128s-x076d-x166q、x128r-x076d-x218s、x078n-x118r-x218s、x076d-x078n-x118r、x185q-x218s-x259p、x076d-x185q-x259p、x009e-x218s-x259p、x009e-x076d-x259p、x009e-x185q-x218s、x009e-x076d-x185q、x003q-x078n-x218s、x003q-x076d-x078n、x078n-x129p-x218s、x003v-x166q-x248d、x076d-x078n-x129p、x076d-x145r-x218s、x217q-x166q-x218s、x217q-x076d-x166q、x217l-x166q-x218s、x217l-x076d-x166q、x040e-x166q-x248d、x003v-x040e-x166q、x078n-x130s-x218s、x076d-x078n-x130s、x024q-x076d-x218s、x128q-x218s-x248d、x128q-x076d-x248d、x166q-x248d-x259p、x003v-x128q-x218s、x003v-x128q-x076d、x003v-x166q-x259p、x166q-x185q-x248d、x009e-x166q-x248d、x003v-x166q-x185q、x003v-x009e-x166q、x076d-x118r-x248d、x003v-x118r-x218s、x003v-x076d-x118r、x128q-x040e-x218s、x128q-x040e-x076d、x040e-x166q-x259p、x166q-x210i-x218s、x076d-x166q-x210i、x040e-x166q-x185q、x069s-x166q-x218s、x069s-x076d-x166q、x009e-x040e-x166q、x078n-x087d-x218s、x003q-x218s-x248d、x076d-x078n-x087d、x003q-x076d-x248d、x129p-x218s-x248d、x076d-x129p-x248d、x003t-x076d-x218s、x040e-x118r-x218s、x128q-x078n-x166q、x040e-x076d-x118r、x003v-x129p-x218s、x003v-x076d-x129p、x166q-x182e-x218s、x076d-x166q-x182e、x128r-x166q-x218s、x128r-x076d-x166q、x003q-x040e-x218s、x003q-x040e-x076d、x128q-x218s-x259p、x078n-x118r-x166q、x128q-x076d-x259p、x040e-x129p-x218s、x128q-x185q-x218s、x040e-x076d-x129p、x128q-x076d-x185q、x166q-x185q-x259p、x128q-x009e-x218s、x128q-x009e-x076d、x009e-x166q-x259p、x130s-x218s-x248d、x076d-x130s-x248d、x009e-x166q-x185q、x003v-x130s-x218s、x003v-x076d-x130s、x003q-x078n-x166q、x118r-x218s-x259p、x076d-x211p-x218s、x076d-x118r-x259p、x076d-x118r-x185q、x145r-x166q-x218s、x076d-x145r-x166q、x009e-x118r-x218s、x009e-x076d-x118r、x128s-x078n-x218s、x128s-x076d-x078n、x003q-x218s-x259p、x003q-x076d-x259p、x040e-x130s-x218s、x040e-x076d-x130s、x003q-x185q-x218s、x003q-x076d-x185q、x129p-x218s-x259p、x003q-x009e-x218s、x003q-x009e-x076d、x129p-x185q-x218s、x076d-x129p-x185q、x009e-x129p-x218s、x009e-x076d-x129p、x003v-x078n-x248d、x217q-x078n-x218s、x217q-x076d-x078n、x024q-x166q-x218s、x024q-x076d-x166q、x076d-x087d-x248d、x217l-x078n-x218s、x217l-x076d-x078n、x130s-x218s-x259p、x003v-x087d-x218s、x003v-x076d-x087d、x130s-x185q-x218s、x076d-x130s-x185q、x128q-x166q-x248d、x040e-x078n-x248d、x009e-x130s-x218s、x009e-x076d-x130s、x003v-x128q-x166q、x003v-x040e-x078n、x040e-x076d-x087d、x118r-x166q-x248d、x003v-x118r-x166q、x078n-x087d-x166q、x003q-x166q-x248d、x129p-x166q-x248d、x003v-x078n-x259p、x003t-x166q-x218s、x078n-x185q-x248d、x003t-x076d-x166q、x040e-x118r-x166q、x003v-x129p-x166q、x003v-x078n-x185q、x128s-x076d-x248d、x003v-x009e-x078n、x003v-x128s-x218s、x087d-x218s-x259p、x076d-x087d-x259p、x124i-x076d-x218s、x076d-x087d-x185q、x003q-x040e-x166q、x128q-x166q-x259p、x040e-x078n-x259p、x078n-x210i-x218s、x076d-x078n-x210i、x128q-x166q-x185q、x069s-x078n-x218s、x069s-x076d-x078n、x128q-x009e-x166q、x128s-x040e-x218s、x130s-x166q-x248d、x003v-x130s-x166q、x128q-x118r-x218s、x166q-x211p-x218s、x118r-x166q-x259p、x076d-x166q-x211p、x217q-x076d-x248d、x078n-x182e-x218s、x076d-x078n-x182e、x003v-x217q-x218s、x003v-x217q-x076d、x217l-x218s-x248d、x217l-x076d-x248d、x128s-x078n-x166q、x003v-x217l-x218s、x128r-x078n-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在其他实施例中，本文公开的枯草杆菌蛋白酶变体包含相对于seqidno:1的以下四个或更多个特征的组合：在位置3处的q、t或v；在位置9处的e；在位置24处的q；在位置40处的e；在位置69处的s；在位置76处的d；在位置78处的n；在位置87处的d；在位置118处的r；在位置124处的i；在位置128处的q、r或s；在位置129处的p；在位置130处的s；在位置145处的r；在位置166处的q；在位置182处的e；在位置185处的q；在位置210处的i；在位置211处的p；在位置217处为l或q；在位置218处的s；在位置248处的d；以及在位置259处的p，其中所述四个或更多个特征的组合选自以下组成的组：x076d-x078n-x166q-x218s、x076d-x166q-x218s-x248d、x003v-x076d-x166q-x218s、x040e-x076d-x166q-x218s、x076d-x166q-x218s-x259p、x076d-x166q-x185q-x218s、x009e-x076d-x166q-x218s、x076d-x078n-x218s-x248d、x003v-x076d-x078n-x218s、x040e-x076d-x078n-x218s、x076d-x118r-x166q-x218s、x003q-x076d-x166q-x218s、x076d-x078n-x218s-x259p、x076d-x078n-x185q-x218s、x009e-x076d-x078n-x218s、x003v-x076d-x218s-x248d、x003v-x040e-x076d-x218s、x076d-x078n-x166q-x248d、x003v-x078n-x166q-x218s、x003v-x076d-x078n-x166q、x076d-x087d-x166q-x218s、x003v-x076d-x218s-x259p、x076d-x185q-x218s-x248d、x040e-x078n-x166q-x218s、x040e-x076d-x078n-x166q、x003v-x076d-x185q-x218s、x003v-x009e-x076d-x218s、x040e-x076d-x218s-x259p、x128q-x076d-x078n-x218s、x078n-x166q-x218s-x259p、x076d-x078n-x166q-x259p、x076d-x078n-x166q-x185q、x009e-x078n-x166q-x218s、x009e-x076d-x078n-x166q、x128s-x076d-x166q-x218s、x076d-x078n-x118r-x218s、x009e-x076d-x185q-x218s、x003q-x076d-x078n-x218s、x003v-x166q-x218s-x248d、x076d-x078n-x129p-x218s、x003v-x076d-x166q-x248d、x040e-x076d-x166q-x248d、x003v-x040e-x166q-x218s、x003v-x040e-x076d-x166q、x076d-x078n-x130s-x218s、x128q-x076d-x218s-x248d、x076d-x166q-x248d-x259p、x003v-x128q-x076d-x218s、x003v-x166q-x218s-x259p、x003v-x076d-x166q-x259p、x166q-x185q-x218s-x248d、x076d-x166q-x185q-x248d、x003v-x166q-x185q-x218s、x009e-x076d-x166q-x248d、x003v-x076d-x166q-x185q、x003v-x009e-x166q-x218s、x003v-x009e-x076d-x166q、x076d-x118r-x218s-x248d、x003v-x076d-x118r-x218s、x040e-x166q-x218s-x259p、x040e-x076d-x166q-x259p、x076d-x166q-x210i-x218s、x040e-x076d-x166q-x185q、x069s-x076d-x166q-x218s、x076d-x078n-x087d-x218s、x076d-x129p-x218s-x248d、x040e-x076d-x118r-x218s、x128r-x076d-x166q-x218s、x003q-x040e-x076d-x218s、x078n-x118r-x166q-x218s、x076d-x078n-x118r-x166q、x166q-x185q-x218s-x259p、x076d-x166q-x185q-x259p、x009e-x166q-x218s-x259p、x009e-x076d-x166q-x259p、x076d-x130s-x218s-x248d、x009e-x166q-x185q-x218s、x009e-x076d-x166q-x185q、x003q-x078n-x166q-x218s、x003q-x076d-x078n-x166q、x076d-x118r-x218s-x259p、x128s-x076d-x078n-x218s、x003q-x076d-x218s-x259p、x003q-x009e-x076d-x218s、x003v-x078n-x218s-x248d、x003v-x076d-x078n-x248d、x217q-x076d-x078n-x218s、x217l-x076d-x078n-x218s、x040e-x076d-x078n-x248d、x003v-x128q-x166q-x218s、x003v-x040e-x078n-x218s、x003v-x040e-x076d-x078n、x076d-x118r-x166q-x248d、x003v-x118r-x166q-x218s、x003v-x076d-x118r-x166q、x078n-x087d-x166q-x218s、x076d-x078n-x087d-x166q、x076d-x078n-x248d-x259p、x003v-x078n-x218s-x259p、x003v-x076d-x078n-x259p、x003t-x076d-x166q-x218s、x040e-x118r-x166q-x218s、x040e-x076d-x118r-x166q、x003v-x129p-x166q-x218s、x003v-x078n-x185q-x218s、x009e-x076d-x078n-x248d、x003v-x076d-x078n-x185q、x003v-x009e-x078n-x218s、x003v-x009e-x076d-x078n、x003v-x128s-x076d-x218s、x003q-x040e-x166q-x218s、x128q-x166q-x218s-x259p、x040e-x078n-x218s-x259p、x040e-x076d-x078n-x259p、x076d-x078n-x210i-x218s、x128q-x076d-x166q-x185q、x069s-x076d-x078n-x218s、x128q-x009e-x076d-x166q、x009e-x040e-x078n-x218s、x003v-x130s-x166q-x218s、x118r-x166q-x218s-x259p、x076d-x166q-x211p-x218s、x076d-x118r-x166q-x259p、x076d-x078n-x182e-x218s、x076d-x118r-x166q-x185q、x009e-x118r-x166q-x218s、x128s-x078n-x166q-x218s、x128r-x076d-x078n-x218s、x003q-x166q-x218s-x259p、x003q-x076d-x166q-x185q、x128q-x076d-x129p-x218s、x129p-x166q-x218s-x259p、x003v-x040e-x076d-x248d、x003q-x009e-x166q-x218s、x078n-x185q-x218s-x259p、x076d-x078n-x185q-x259p、x076d-x129p-x166q-x185q、x003q-x076d-x118r-x218s、x003v-x078n-x166q-x248d、x076d-x078n-x145r-x218s、x217q-x078n-x166q-x218s、x076d-x087d-x166q-x248d、x217l-x078n-x166q-x218s、x128q-x076d-x130s-x218s、x003v-x087d-x166q-x218s、x003v-x076d-x087d-x166q、x003v-x218s-x248d-x259p、x003v-x076d-x248d-x259p、x076d-x130s-x166q-x185q、x003v-x076d-x185q-x248d、x003v-x009e-x076d-x248d、x076d-x210i-x218s-x248d、x003v-x040e-x218s-x259p、x003v-x040e-x076d-x259p、x040e-x076d-x185q-x248d、x003v-x076d-x210i-x218s、x024q-x076d-x078n-x218s、x009e-x040e-x076d-x248d、x003v-x069s-x076d-x218s、x003v-x009e-x040e-x076d、x076d-x129p-x130s-x218s、x003v-x128q-x078n-x218s、x003v-x078n-x166q-x259p、x003v-x076d-x182e-x218s、x040e-x076d-x210i-x218s、x003v-x128s-x166q-x218s、x087d-x166q-x218s-x259p、x076d-x087d-x166q-x259p、x003v-x128r-x076d-x218s、x076d-x078n-x118r-x248d、x124i-x076d-x166q-x218s、x003v-x078n-x118r-x218s、x003v-x076d-x078n-x118r、x185q-x218s-x248d-x259p、x076d-x185q-x248d-x259p、x003v-x185q-x218s-x259p、x009e-x076d-x248d-x259p、x003v-x076d-x185q-x259p、x076d-x078n-x166q-x210i、x003v-x009e-x218s-x259p、x009e-x185q-x218s-x248d、x069s-x078n-x166q-x218s、x009e-x076d-x185q-x248d、x069s-x076d-x078n-x166q、x003q-x078n-x218s-x248d、x128s-x040e-x166q-x218s、x003t-x076d-x078n-x218s、x040e-x078n-x118r-x218s、x040e-x076d-x078n-x118r、x003v-x078n-x129p-x218s、x076d-x210i-x218s-x259p、x076d-x078n-x166q-x182e、x003v-x217q-x166q-x218s、x040e-x076d-x185q-x259p、x003q-x076d-x087d-x218s、x069s-x076d-x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-x009e-x185q-x248d、x003q-x069s-x078n-x166q、x124i-x128s-x076d-x218s、x003v-x129p-x185q-x259p、x003v-x009e-x129p-x259p、x009e-x129p-x185q-x248d、x069s-x145r-x166q-x218s、x078n-x087d-x145r-x218s、x009e-x166q-x182e-x185q、x128s-x069s-x078n-x218s、x003q-x069s-x218s-x259p、x003v-x217q-x078n-x259p、x128r-x009e-x166q-x185q、x003q-x009e-x040e-x185q、x024q-x166q-x185q-x248d、x128q-x009e-x185q-x259p、x009e-x040e-x129p-x185q、x130s-x185q-x248d-x259p、x003v-x130s-x185q-x259p、x185q-x211p-x218s-x259p、x009e-x130s-x185q-x248d、x003v-x078n-x210i-x248d、x217q-x069s-x078n-x218s、x003q-x078n-x211p-x218s、x078n-x129p-x130s-x248d、x009e-x145r-x166q-x185q、x003v-x076d-x087d-x210i、x217l-x069s-x078n-x218s、x003v-x124i-x040e-x218s、x003q-x009e-x185q-x259p、x009e-x040e-x130s-x185q、x128s-x078n-x145r-x218s、x009e-x129p-x185q-x259p、x128q-x129p-x130s-x166q、x003v-x124i-x078n-x166q、x124i-x087d-x166q-x218s、x128q-x217l-x129p-x218s、x128q-x217l-x076d-x129p、x003v-x124i-x218s-x259p、x003v-x087d-x185q-x259p、x009e-x024q-x166q-x185q、x009e-x087d-x185q-x248d、x128q-x040e-x129p-x248d、x003v-x124i-x009e-x218s、x009e-x130s-x185q-x259p、x217q-x078n-x145r-x218s、x003t-x076d-x166q-x210i、x003v-x069s-x078n-x259p、x217l-x078n-x145r-x218s、x128s-x040e-x185q-x248d、x128s-x024q-x078n-x218s、x124i-x040e-x218s-x259p、x003v-x128s-x069s-x218s、x003v-x128q-x211p-x218s、x003v-x128q-x118r-x259p、x003v-x166q-x211p-x259p、x124i-x069s-x076d-x218s、x128q-x217l-x130s-x218s、x128q-x217l-x076d-x130s、x128q-x040e-x130s-x248d、x124i-x078n-x166q-x259p、x003v-x128q-x129p-x259p、x128q-x129p-x185q-x248d、x124i-x128s-x166q-x218s、x128q-x009e-x129p-x248d、x217q-x040e-x185q-x248d、x217q-x024q-x078n-x218s、x128s-x185q-x248d-x259p、x003t-x009e-x166q-x185q、x124i-x078n-x118r-x218s、x003v-x128s-x185q-x259p、x003v-x217l-x076d-x210i、x128r-x076d-x078n-x210i、x128s-x009e-x185q-x248d、x003v-x129p-x211p-x218s、x003v-x118r-x129p-x259p、x124i-x009e-x218s-x259p、x009e-x087d-x185q-x259p、x217l-x129p-x130s-x218s、x217l-x076d-x129p-x130s、x124i-x009e-x076d-x185q、x003q-x124i-x078n-x218s、x003q-x124i-x076d-x078n、x003v-x128q-x130s-x259p、x040e-x129p-x130s-x248d、x128q-x130s-x185q-x248d、x128q-x211p-x218s-x259p、x128q-x009e-x130s-x248d、x124i-x217q-x166q-x218s、x128s-x009e-x040e-x185q、x217q-x185q-x248d-x259p、x124i-x217l-x166q-x218s、x003v-x217q-x185q-x259p、x069s-x078n-x145r-x218s、x217q-x009e-x185q-x248d、x003v-x217l-x185q-x259p、x003v-x124i-x040e-x166q、x003q-x128q-x009e-x185q、x128q-x009e-x129p-x185q、x129p-x130s-x185q-x248d、x217q-x009e-x040e-x185q、x009e-x129p-x130s-x248d、x128s-x009e-x185q-x259p、x003v-x128q-x087d-x259p、x003v-x069s-x076d-x210i、x024q-x069s-x078n-x218s、x003v-x124i-x128q-x218s、x003v-x124i-x166q-x259p、x124i-x166q-x185q-x248d、x128q-x009e-x130s-x185q、x003v-x076d-x182e-x210i、x217q-x009e-x185q-x259p、x128q-x078n-x129p-x130s、x003v-x124i-x118r-x218s、x128r-x076d-x210i-x248d、x003v-x128r-x076d-x210i、x124i-x069s-x166q-x218s、x003v-x185q-x210i-x259p、x003v-x069s-x185q-x259p、x009e-x185q-x210i-x248d、x009e-x069s-x185q-x248d、x003t-x076d-x078n-x210i、x182e-x185q-x248d-x259p、x009e-x129p-x130s-x185q、x003v-x182e-x185q-x259p、x009e-x182e-x185q-x248d、x003q-x124i-x040e-x218s、x124i-x128q-x218s-x259p、x128q-x118r-x129p-x248d、x003v-x078n-x211p-x259p、x128r-x009e-x185q-x248d、x124i-x009e-x166q-x185q、x003q-x124i-x078n-x166q、x124i-x118r-x218s-x259p、x009e-x040e-x182e-x185q、x124i-x145r-x166q-x218s、x124i-x128s-x078n-x218s、x003v-x128q-x217q-x259p、x128q-x217q-x185q-x248d、x003v-x145r-x185q-x259p、x003q-x124i-x218s-x259p、x128q-x118r-x130s-x248d、x009e-x145r-x185q-x248d、x003v-x128q-x217l-x259p、x003q-x124i-x009e-x218s、x128q-x129p-x130s-x248d、x009e-x182e-x185q-x259p、x124i-x217q-x078n-x218s、x124i-x024q-x166q-x218s、x024q-x185q-x248d-x259p、x118r-x129p-x130s-x248d、x009e-x024q-x185q-x248d、x128q-x040e-x129p-x130s、x128q-x217q-x009e-x185q、x003v-x124i-x118r-x166q、x009e-x024q-x040e-x185q、x128s-x009e-x129p-x185q、x003v-x128q-x210i-x259p、x003v-x128q-x069s-x259p、x128q-x087d-x129p-x248d、x003v-x124i-x078n-x259p、x128q-x129p-x130s-x185q、x128q-x009e-x129p-x130s、x003v-x128q-x182e-x259p、x128q-x182e-x185q-x248d、x003v-x124i-x128s-x218s、x003t-x009e-x185q-x248d、x128s-x009e-x130s-x185q、x009e-x024q-x185q-x259p、x124i-x069s-x078n-x218s、x128q-x087d-x130s-x248d、x003v-x069s-x129p-x259p、x003v-x185q-x211p-x259p、x003v-x128q-x145r-x259p、x003v-x124i-x217l-x218s、x003q-x124i-x166q-x259p、x124i-x128s-x218s-x259p、x087d-x129p-x130s-x248d、x003q-x124i-x118r-x218s、x128q-x009e-x182e-x185q、x128q-x217l-x129p-x248d、x128s-x129p-x130s-x248d、x128q-x217l-x130s-x248d、x003v-x124i-x069s-x218s、x124i-x040e-x069s-x218s、x003v-x124i-x128s-x166q、x128q-x118r-x129p-x130s、x128q-x009e-x024q-x185q、x003v-x124i-x185q-x259p、x217l-x129p-x130s-x248d、x124i-x009e-x185q-x248d、x128s-x217q-x009e-x185q、x124i-x069s-x078n-x166q、x003q-x128s-x217q-x078n、x003v-x124i-x145r-x218s、x003v-x128q-x211p-x259p、x124i-x069s-x218s-x259p、x003v-x129p-x211p-x259p、x124i-x128s-x118r-x218s、x003q-x124i-x128s-x218s、x003v-x124i-x069s-x166q、x128q-x087d-x129p-x130s、x003v-x124i-x128q-x259p、x124i-x069s-x166q-x259p、x003v-x124i-x129p-x259p、x124i-x069s-x118r-x218s、x003q-x124i-x069s-x218s、x128q-x217l-x129p-x130s。

所述枯草杆菌蛋白酶变体相对于seqidno:1具有以下特征中的至少三个：在位置3处的q、t或v；在位置9处的e；在位置24处的q；在位置40处的e；在位置69处的s；在位置76处的d；在位置78处的n；在位置87处的d；在位置118处的r；在位置124处的i；在位置128处的q、r或s；在位置129处的p；在位置130处的s；在位置145处的r；在位置166处的q；在位置182处的e；在位置185处的q；在位置210处的i；在位置211处的p；在位置217处为l或q；在位置218处的s；在位置248处的d；在位置259处的p，其中所述氨基酸位置与seqidno:1相对应编号，包括衍生自以下的枯草杆菌蛋白酶多肽的变体：apre(例如wp_003233171)；wp_082194748(以前为wp_008359041)；chemgen_164a(美国专利5,275,945中的seqidno:2)；cp474(例如wo2015038792中的seqidno:3)；zp00454(例如wp_010192403的变体，wo2015/038792中的seqidno:7)；dsm14391(wo2018118917中的seqidno:13)；wp_010192403(以前为zp_07707657(wo2015038792中的seqidno:7)；bspz00056(wo2016069544中的seqidno:9)；bba02069(wo2016061438中的seqidno:3)；bspe04637-t1(wo2016069557中的seqidno:9)，bad02409(wo201069557中的seqidno:13)；bspap02013(wo2016069544中的seqidno:3)；bspak01305(wo2016069569中的seqidno:6)；bspz00258(wo2016069552中的seqidno:9)；bcl04009(wo2015089441中的seqidno:14)；bspai02518(wo2015089441中的seqidno:3)；bspag00296(wo2015143360中的seqidno:3)；bspe_01314(bspe04637-t1的变体，wo2017192300中的seqidno:19)；以及bpan01744(wo2016069563中的seqidno:3)。所公开的取代可用于的其他枯草杆菌蛋白酶多肽包括但不限于wo2016/001449中的seqidno:7；wo2012/139964中的seqidno:1；wo2012/163855中的seqidno:7；wo2016/001449中的seqidno:9；wo2016/001449中的seqidno:5；wo2016/001449中的seqidno:6；wo2014/177430中的seqidno:6；wo2011/036263中的seqidno:4；wo2016/174234中的seqidno:4；wo2015144932中的seqidno:7；us7981659中的seqidno:119；wo2016/001449中的seqidno:4；jp2004313043中的seqidno:2；us2015/275148中的seqidno:2；wo201600144中的seqidno:12；wo2016000970中的seqidno:2；us8530218中的seqidno:19；wo2016000973中的seqidno:8；wo2016001449中的seqidno:8；wo2016203064中的seqidno:21或22以及us8530218中的seqidno:21。即，在一些实施例中，本文提供的取代可用于与seqidno:1具有至少约50％序列同一性的任何枯草杆菌蛋白酶。例如，枯草杆菌蛋白酶，如wo2016203064中的seqidno21或22，可经工程化以相对于seqidno:1包括选自以下的一个、两个、三个或更多个附加特征：位置3处的q、t或v；在位置24处的q；在位置40处的e；在位置69处的s；在位置78处的n；在位置87处的d；在位置118处的r；在位置124处的i；在位置128处的q、r或s；在位置129处的p；在位置130处的s；在位置145处的r；在位置166处的q；在位置182处的e；在位置185处的q；在位置210处的i；在位置211处的p；在位置217处为l或q；在位置218处的s；在位置248处的d；以及在位置259处的p。在一个这样的实施例中，枯草杆菌蛋白酶，如wo2016203064中的seqidno21或22，可经工程化以相对于seqidno:1包括选自以下的两个、三个、四个或更多个取代：位置3处的q、t或v；在位置24处的q；在位置40处的e；在位置69处的s；在位置78处的n；在位置87处的d；在位置118处的r；在位置124处的i；在位置128处的q、r或s；在位置129处的p；在位置130处的s；在位置145处的r；在位置166处的q；在位置182处的e；在位置185处的q；在位置210处的i；在位置211处的p；在位置217处为l或q；在位置218处的s；在位置248处的d；以及在位置259处的p。

所公开的取代可用于的仍其他枯草杆菌蛋白酶多肽还包括但不限于以下公开的那些：wo_2012_175708_2；wo_2012_175708_4；us_7951573_b2_2；us_7951573_b2_4；us_7951573_b2_6；us_7951573_b2_37；us7727756-0001；；us9365844-0001；us7262042-0002；us20090275493-0002；us7811076-0004；us8455424-0003；wo03054184-cae48421/wo2015089447中的seqidno:25；wo2007131657-cas91385/wo2015089447中的seqidno:24；wo2008086916-cav33594/wo2015089447中的seqidno:26；wo2017089162-0001；wo2017089162-0002；wo2017089162-0003；wo2017089162-0004；wo2017089162-0005；wo2017089162-0006；wo2017089162-0007；以及wo2017089162-0008。

在甚至仍进一步的实施例中，本文所描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体具有改善的稳定性，例如，在洗涤剂组合物中的改善的稳定性。在另一个实施例中，亲本枯草杆菌蛋白酶包含seqidno:1、2、10或15的氨基酸序列，或者与seqidno:1、2、10或15的氨基酸序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在仍又另一个实施例中，根据实例2的稳定性测定，测量一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体在洗涤剂中的稳定性。

在其他实施例中，一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体比缺乏所述三种或多种特征的参比或亲本枯草杆菌蛋白酶更稳定。在一些实施例中，具有增加的稳定性的此类变体的特征在于，当在40至72摄氏度下置于10％cns洗涤剂溶液中20分钟后测量时，具有大于25％的残余活性。在其他实施例中，此类变体的特征还可在于，当在40至48摄氏度下孵育时，在100％cns洗涤剂中具有至少1小时的灭活半衰期。在又其他实施例中，所述具有增加的稳定性的变体的特征在于，在10％洗涤剂中在30至50摄氏度下孵育20分钟后，具有相对于亲本或参比蛋白酶大于约1.1的性能指数(pi)。在一些实施例中，所述参比枯草杆菌蛋白酶是指与所述变体枯草杆菌蛋白酶具有最高同一性但不包含所列举特征的枯草杆菌蛋白酶。

可以使本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体经受各种变化，如一个或多个氨基酸插入、缺失、和/或取代(保守或非保守的)，包括此类变化基本上不改变所述变体的酶活性的情况。类似地，编码本发明所述枯草杆菌蛋白酶变体的多核苷酸也可以进行各种变化，如一个或多个密码子中一个或多个核苷酸的一个或多个取代，使得特定的密码子编码相同或不同的氨基酸，从而产生沉默变化(例如，当编码的氨基酸没有被核苷酸突变改变时)或非沉默变化；所述序列中一个或多个核苷酸(或密码子)的一个或多个缺失；所述序列中一个或多个核苷酸(或密码子)的一个或多个添加或插入；和/或所述序列中一个或多个核苷酸(或密码子)的切割或一个或多个截短。与由原始核酸序列编码的多肽酶相比，所述核酸序列中的许多此类变化基本上不会改变所得的编码的多肽酶的酶活性。还可以对本文描述的核酸序列进行修饰以包括一个或多个密码子，所述密码子在表达系统(例如，细菌表达系统)中提供最佳表达，同时，如果需要，所述一个或多个密码子仍编码一个或多个相同的氨基酸。

本文描述的是一种或多种分离的、非天然存在的或重组的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体、或重组多肽或其活性片段的核酸序列。本文描述的一种或多种核酸序列可用于本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的重组生产(例如表达)，例如，通过表达包含编码本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体或其片段的序列的质粒表达载体。一个实施例提供了编码本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的核酸，其中所述变体是具有蛋白水解活性的成熟形式。在一些实施例中，用同源前导肽序列重组表达本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体。在其他实施例中，用异源前导肽序列(例如，来自迟缓芽孢杆菌的前导肽序列(seqidno:9))重组表达本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体。

本文描述的一种或多种核酸序列可以通过使用任何合适的合成、操作和/或分离技术或其组合来产生。例如，本文描述的一种或多种多核苷酸可以使用本领域技术人员熟知的标准核酸合成技术，如固相合成技术来产生。在此类技术中，典型地合成高至50个或更多个核苷酸碱基的片段，然后连接(例如通过酶或化学连接方法)以基本上形成任何希望的连续核酸序列。还可以通过本领域已知的任何合适的方法来促进本文描述的一种或多种多核苷酸的合成，包括但不限于使用以下方法的化学合成：经典的亚磷酰胺方法(参见例如，beaucage等人,tetrahedronletters[四面体快报]22:1859-69(1981))，或如通常在自动合成方法中所实践的在matthes等人,emboj.[欧洲分子生物学学会杂志]3:801-805(1984)中描述的方法。本文描述的一种或多种多核苷酸也可以通过使用自动dna合成仪产生。可以从各种商业来源(例如，atum(dna2.0)，美国加利福尼亚州纽瓦克；生命技术公司(lifetech)(geneart)，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德；金斯瑞公司(genscript)，加拿大安大略省；baseclearb.v.，荷兰莱顿市；集成dna技术公司(integrateddnatechnologies)，美国伊利诺伊州斯科基；银杏生物工作室(ginkgobioworks)(gen9)，美国马萨诸塞州波士顿；以及特威斯特生物科学公司(twistbioscience)，美国加利福尼亚州旧金山)订购定制核酸。合成核酸的其他技术和相关原理描述于，例如，itakura等人,ann.rev.biochem.[生物化学年度评论]53:323(1984)和itakura等人,science[科学]198:1056(1984)。

用于修饰核酸的重组dna技术是本领域熟知的，例如像限制性内切酶消化、连接、逆转录和cdna产生、以及聚合酶链式反应(例如pcr)。本文描述的一种或多种多核苷酸还可以通过使用一个或多个寡核苷酸探针来筛选cdna文库而获得，所述探针可以与编码本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体、或重组多肽或其活性片段的多核苷酸杂交或对其进行pcr扩增。用于筛选并分离cdna克隆的方法以及pcr扩增方法是本领域技术人员熟知的并且描述于本领域技术人员已知的标准参考文献中。本文描述的一种或多种多核苷酸可以通过例如已知的诱变程序(例如，定点诱变、位点饱和诱变和体外重组)改变天然存在的多核苷酸主链(例如，编码本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体或参比枯草杆菌蛋白酶的多核苷酸主链)来获得。适合于产生编码本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的经修饰的本文描述的多核苷酸的多种方法是本领域已知的，所述方法包括但不限于例如位点饱和诱变、扫描诱变、插入诱变、缺失诱变、随机诱变、定点诱变和定向进化、以及各种其他重组方法。

另外的实施例涉及一种或多种载体，所述载体包含本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体(例如，编码本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的多核苷酸)；表达载体或表达盒，所述表达载体或表达盒包含本文描述的一种或多种核酸或多核苷酸序列；分离的、基本上纯的、或重组的dna构建体，所述构建体包含本文描述的一种或多种核酸或多核苷酸序列；分离的或重组的细胞，所述细胞包含本文描述的一种或多种多核苷酸序列；以及组合物，所述组合物包含一种或多种此类载体、核酸、表达载体、表达盒、dna构建体、细胞、细胞培养物或其任何组合或混合物。

一些实施例涉及一种或多种重组细胞，所述重组细胞包含本文描述的一种或多种载体(例如表达载体或dna构建体)，所述载体包含本文描述的一种或多种核酸或多核苷酸序列。一些此类重组细胞使用这样的至少一种载体转化或转染，尽管其他方法在本领域中是可获得且已知的。此类细胞典型地称为宿主细胞。一些此类细胞包含细菌细胞，包括但不限于芽孢杆菌属细胞，如枯草芽孢杆菌细胞。其他的实施例涉及包含本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶的重组细胞(例如，重组宿主细胞)。

在一些实施例中，本文描述的一种或多种载体是表达载体或表达盒，其包含有效地连接到有效的基因表达所需的一种或多种另外的核酸区段上(例如，有效地连接到本文描述的一种或多种多核苷酸序列的启动子)的本文描述的一种或多种多核苷酸序列。载体可以包括转录终止子和/或选择基因(例如抗生素抗性基因)，所述转录终止子和/或选择基因能够通过在含有抗微生物剂的培养基中生长来实现质粒感染的宿主细胞的连续培养维持。

表达载体可以衍生自质粒或病毒dna，或在替代性实施例中，含有这两者的元件。示例性载体包括但不限于pc194、pjh101、pe194、php13(参见harwood和cutting[编辑]，第3章，molecularbiologicalmethodsforbacillus[针对芽孢杆菌的分子生物学方法]，约翰威利父子公司(johnwiley&sons)(1990))；枯草芽孢杆菌的适合的复制质粒包括第92页列出的那些)。(另请参见，perego,“integrationalvectorsforgeneticmanipulationsinbacillussubtilis[枯草芽孢杆菌遗传操纵的整合载体]”；sonenshein等人[编]；“bacillussubtilisandothergram-positivebacteria:biochemistry,physiologyandmoleculargenetics[枯草芽孢杆菌和其他革兰氏阳性细菌：生物化学、生理学和分子遗传学]”,americansocietyformicrobiology[美国微生物学会],华盛顿特区(1993),第615-624页)；以及p2jm103bbi)。

为了在细胞中表达和生产目的蛋白(例如，本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体)，包含编码本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的多核苷酸的一种或多种拷贝(并且在一些情况下包含多个拷贝)的一种或多种表达载体在适合于变体表达的条件下被转化到细胞中。在一些实施例中，将编码本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的多核苷酸序列(以及包含在载体中的其他序列)整合到宿主细胞的基因组中；然而在其他的实施例中，包含编码本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的多核苷酸序列的质粒载体在所述细胞内保持为自主的染色体外元件。一些实施例提供了染色体外核酸元件以及整合到宿主细胞基因组中的输入性核苷酸序列。本文描述的载体可用于生产本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体。在一些实施例中，编码本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的多核苷酸构建体存在于整合载体上，所述整合载体能够将编码所述变体的多核苷酸整合到宿主染色体中并且任选地在宿主染色体中扩增。整合位点的实例是本领域技术人员熟知的。在一些实施例中，编码本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的多核苷酸的转录通过如下启动子来实现，所述启动子是亲本枯草杆菌蛋白酶的野生型启动子。在一些其他的实施例中，所述启动子与本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体是异源的，但是在宿主细胞中具有功能。用于细菌宿主细胞的示例性启动子包括但不限于amye、amyq、amyl、psts、sacb、pspac、papre、pveg、phpaii启动子；嗜热脂肪芽孢杆菌(b.stearothermophilus)生麦芽糖淀粉酶基因的启动子；解淀粉芽孢杆菌(ban)淀粉酶基因；枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶基因；克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶基因；短小芽孢杆菌木糖苷酶基因；苏云金芽孢杆菌cryiiia；以及地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因。另外的启动子包括但不限于a4启动子，以及噬菌体λpr或pl启动子以及大肠杆菌lac、trp或tac启动子。

本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体可以在任何合适的微生物(包括细菌和真菌)的宿主细胞中产生。在一些实施例中，本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体可以在革兰氏阳性细菌中产生。在一些实施例中，所述宿主细胞是芽孢杆菌属物种(bacillusspp.)、链霉菌属物种(streptomycesspp.)、埃希氏菌属物种(escherichiaspp.)、曲霉属物种(aspergillusspp.)、木霉属物种(trichodermaspp.)、假单胞菌属物种(pseudomonasspp.)、棒状杆菌属物种(corynebacteriumspp.)、酵母属物种(saccharomycesspp.)或毕赤酵母属物种(pichiaspp.)。在一些实施例中，本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体由芽孢杆菌属物种宿主细胞产生。可用于本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的生产的芽孢杆菌属宿主细胞的实例包括但不限于：地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌，以及芽孢杆菌属内的其他生物体。在一些实施例中，枯草芽孢杆菌宿主细胞用于生产本文描述的变体。uspn5,264,366和4,760,025(re34,606)描述了可以用于生产本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的各种芽孢杆菌属宿主菌株，但是可以使用其他合适的菌株。

可以用于生产本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的几种细菌菌株包括非重组(即野生型)芽孢杆菌属菌株，以及天然存在的菌株和/或重组菌株的变体。在一些实施例中，宿主菌株是重组菌株，其中编码本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的多核苷酸已经被引入宿主中。在一些实施例中，宿主菌株是枯草芽孢杆菌宿主菌株，特别是重组枯草芽孢杆菌宿主菌株。许多枯草芽孢杆菌菌株是已知的，包括但不限于例如1a6(atcc39085)、168(1a01)、sb19、w23、ts85、b637、pb1753至pb1758、pb3360、jh642、1a243(atcc39,087)、atcc21332、atcc6051、mi113、de100(atcc39,094)、gx4931、pbt110、和pep211菌株(参见例如hoch等人,genetics[遗传学]73:215-228(1973)；另请参见，us4,450,235；us4,302,544；和ep0134048)。枯草芽孢杆菌作为表达宿主细胞的使用是本领域众所周知的(参见，例如，palva等人,gene[基因]19:81-87(1982)；fahnestock和fischer,j.bacteriol.[细菌学杂志],165:796-804(1986)；和wang等人,gene[基因]69:39-47(1988))。

在一些实施例中，所述芽孢杆菌属宿主细胞是包括至少一个以下基因中的突变或缺失的芽孢杆菌属物种：degu、degs、degr和degq。在一些实施例中，所述突变是在degu基因中，并且在一些实施例中，突变为degu(hy)32(参见例如，msadek等人,j.bacteriol.[细菌学杂志]172:824-834(1990)；以及olmos等人,mol.gen.genet.[分子遗传学和普通遗传学]253:562-567(1997))。在一些实施例中，所述芽孢杆菌宿主在以下中包含突变或缺失：scoc4(参见，例如，caldwell等人,j.bacteriol.[细菌学杂志]183:7329-7340(2001))；spoiie(参见，例如，arigoni等人,mol.microbiol.[分子微生物学]31:1407-1415(1999))；和/或oppa或opp操纵子的其他基因(参见例如，perego等人,mol.microbiol.[分子微生物学]5:173-185(1991))。实际上，预期引起与oppa基因中的突变相同的表型的opp操纵子中的任何突变将可用于本文描述的经改变的芽孢杆菌属菌株的一些实施例中。在一些实施例中，这些突变单独发生，而在其他的实施例中，存在突变的组合。在一些实施例中，可以用于生产本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的经改变的芽孢杆菌属宿主细胞菌株是已经包含上述基因中的一个或多个的突变的芽孢杆菌属宿主菌株。另外，可使用包含内源蛋白酶基因的一个或多个突变和/或一个或多个缺失的芽孢杆菌属物种宿主细胞。在一些实施例中，芽孢杆菌属宿主细胞包含apre和npre基因的缺失。在其他的实施例中，芽孢杆菌属物种宿主细胞包含5个蛋白酶基因的缺失，而在其他的实施例中，芽孢杆菌属物种宿主细胞包含9个蛋白酶基因的缺失(参见例如，us2005/0202535)。

使用本领域已知的任何合适的方法用编码本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的一种或多种核酸序列转化宿主细胞。利用质粒dna构建体或载体将核酸(例如dna)引入芽孢杆菌属细胞或大肠杆菌细胞并且将此类质粒dna构建体或载体转化到这样的细胞中的方法是熟知的。在一些实施例中，质粒随后从大肠杆菌细胞中分离并且转化到芽孢杆菌属细胞中。然而，没有必要使用介入微生物如大肠杆菌，并且在一些实施例中，将dna构建体或载体直接引入芽孢杆菌属宿主中。

将本文描述的一种或多种核酸序列引入芽孢杆菌属细胞的示例性方法描述于，例如，ferrari等人,“genetics[遗传学]”,在hardwood等人[编辑],bacillus[芽孢杆菌属],plenumpublishingcorp.[普莱南出版公司](1989),第57-72页；saunders等人,j.bacteriol.[细菌学杂志],157:718-726(1984)；hoch等人,j.bacteriol.[细菌学杂志],93:1925-1937(1967)；mann等人,currentmicrobiol.[现代微生物学],13:131-135(1986)；holubova,foliamicrobiol.[福里亚微生物学],30:97(1985)；chang等人,mol.gen.genet.[分子遗传学和普通遗传学]168:11-115(1979)；vorobjeva等人,femsmicrobiol.lett.[fems微生物学快报]7:261-263(1980)；smith等人,appl.env.microbiol[应用与环境微生物]51:634(1986)；fisher等人,arch.microbiol.[微生物学档案],139:213-217(1981)；以及mcdonald,j.gen.microbiol[遗传微生物学杂志]130:203(1984))。实际上，包括原生质体转化和转染、转导和原生质体融合在内的转化方法是熟知的并且适合用于本文。本领域已知的用于转化芽孢杆菌属细胞的方法包括例如质粒标记拯救转化的方法，其涉及通过携带部分同源的驻留质粒的感受态细胞摄取供体质粒(参见，contente等人，plasmid[质粒]2:555-571[1979]；haima等人,mol.gen.genet.[分子遗传学和普通遗传学]223:185-191(1990)；weinrauch等人，j.bacteriol.[细菌学杂志]，154:1077-1087(1983)；和weinrauch等人，j.bacteriol.[细菌学杂志]，169:1205-1211(1987))。在该方法中，输入性供体质粒在模拟染色体转化的过程中与驻留的“辅助”质粒的同源区重组。

除了通常使用的方法之外，在一些实施例中，用包含编码本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的一种或多种核酸的dna构建体或载体直接转化宿主细胞(即，在引入宿主细胞之前，中间细胞不用于扩增或以其他方式处理dna构建体或载体)。将本文描述的dna构建体或载体引入宿主细胞包括本领域已知的将核酸序列(例如dna序列)引入宿主细胞而不插入宿主基因组中的那些物理和化学方法。此类方法包括但不限于氯化钙沉淀、电穿孔、裸dna和脂质体。在另外的实施例中，dna构建体或载体与质粒一起共转化而不插入质粒。在进一步的实施例中，通过本领域已知的方法从经改变的芽孢杆菌菌株中缺失选择标记(参见，stahl等人,j.bacteriol.[细菌学杂志]158:411-418(1984)；以及palmeros等人,gene[基因]247:255-264(2000))。

在一些实施例中，将转化细胞在常规营养培养基中培养。合适的具体培养条件，如温度、ph等是本领域技术人员已知的，并且详细描述于科学文献中。一些实施例提供了培养物(例如，细胞培养物)，其包含本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体或核酸序列。

在一些实施例中，将用编码本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的一种或多种多核苷酸序列转化的宿主细胞在允许该变体表达的条件下在合适的营养培养基中培养，其后从该培养物中回收所得的变体。在一些实施例中，通过常规程序从培养基中回收由细胞生产的变体，该常规程序包括但不限于例如通过离心或过滤从培养基中分离宿主细胞、借助于盐(例如硫酸铵)沉淀上清液或滤液的蛋白质组分和层析法纯化(例如离子交换、凝胶过滤、亲和等)。

在一些实施例中，由重组宿主细胞产生的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体被分泌到培养基中。编码纯化促进结构域的核酸序列可以用于促进所述变体的纯化。包含编码本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的多核苷酸序列的载体或dna构建体可以进一步包含编码促进变体纯化的纯化促进结构域的核酸序列(参见例如，kroll等人,dnacellbiol.[dna细胞生物学]12:441-53(1993))。此类促进纯化的结构域包括但不限于，例如，金属螯合肽，如允许在固定化的金属上纯化的组氨酸-色氨酸模块(参见porath,proteinexpr.purif.[蛋白质表达与纯化]3:263-281[1992])，允许在固定化的免疫球蛋白上纯化的蛋白a结构域，以及在flags延伸/亲和纯化系统中利用的结构域。还发现在纯化结构域和异源蛋白之间包含可切割的接头序列如因子xa或肠激酶(例如，可获自加利福尼亚州圣地亚哥的英杰公司(invitrogen)的序列)可用于促进纯化。

可以使用各种方法来确定宿主细胞中本文描述的一种或多种成熟枯草杆菌蛋白酶变体的生产水平。此类方法包括但不限于例如利用对蛋白酶特异的多克隆或单克隆抗体的方法。示例性方法包括但不限于酶联免疫吸附测定(elisa)、放射免疫测定(ria)、荧光免疫测定(fia)和荧光激活细胞分选术(facs)。这些和其他测定是本领域熟知的(参见例如，maddox等人,j.exp.med.[实验医学杂志]158:1211(1983))。

一些其他的实施例提供了用于制备或生产本文描述的一种或多种成熟枯草杆菌蛋白酶变体的方法。成熟的枯草杆菌蛋白酶变体不包括信号肽或前导肽序列。一些方法包括在重组细菌宿主细胞(例如像芽孢杆菌属细胞(例如，枯草芽孢杆菌细胞))中制备或生产本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体。其他的实施例提供了生产本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的方法，其中所述方法包括在有利于生产该变体的条件下培养包含重组表达载体的重组宿主细胞，所述重组表达载体包含编码本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的核酸序列。一些此类方法进一步包括从培养物中回收所述变体。

进一步的实施例提供了产生一种或多种本文所述的枯草杆菌蛋白酶变体的方法，其中所述方法包括：(a)将包含编码所述变体的核酸的重组表达载体引入细胞群(例如，细菌细胞，如枯草芽孢杆菌细胞)中；并且(b)在有利于生产由所述表达载体编码的变体的条件下在培养基中培养细胞。一些此类方法进一步包括：(c)从细胞或从培养基中分离所述变体。

除非另外指出，本文提供的所有组分或组合物水平参考所述组分或组合物的活性水平给出，并且不包括可能存在于可商购的来源中的杂质，例如残余溶剂或副产物。酶组分重量是基于总的活性蛋白。除非另有指示，所有百分比和比率均按重量计算。除非另有指示，所有百分比和比率均基于总组合物计算。本文描述的组合物包括清洁组合物，如洗涤剂组合物。在示例的洗涤剂组合物中，通过按总组合物的重量计的纯酶表达酶水平并且除非另外指定，按总组合物的重量计表达洗涤剂成分。

在一个实施例中，本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体可用于清洁应用中，例如像但不限于用于清洁餐具物品、桌面器具物品、织物、医疗器械和具有硬表面的物品(例如，桌子、桌面、墙、家具物品、地板、天花板等的硬表面)。在其他的实施例中，本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体可用于消毒应用中，例如像但不限于消毒自动餐具洗涤机或洗衣机。在其他实施例中，本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体以及包含这种变体的组合物可用于去除或防止恶臭的应用，如但不限于在衣物、硬表面、自动餐具洗涤机或洗衣机上。

另一个实施例涉及包含本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的组合物。在一些实施例中，所述组合物是清洁组合物。在其他实施例中，所述组合物是洗涤剂组合物。在又其他的实施例中，所述组合物选自衣物洗涤剂组合物、自动餐具洗涤(adw)组合物、手洗(手动)餐具洗涤剂组合物、硬表面清洁组合物、眼镜清洁组合物、医疗器械清洁组合物、消毒剂(例如，恶臭或微生物)组合物、和个人护理清洁组合物。在仍其他的实施例中，所述组合物是衣物洗涤剂组合物、adw组合物、或手洗(手动)餐具洗涤剂组合物。甚至仍另外的实施例涉及织物清洁组合物，而其他的实施例涉及非织物清洁组合物。在一些实施例中，所述清洁组合物不含硼。在其他的实施例中，所述清洁组合物不含磷酸盐。在仍其他的实施例中，所述组合物包含本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体以及一种或多种赋形剂、辅助材料、和/或另外的酶。

在又仍另外的实施例中，本文描述的组合物含有磷酸盐、不含磷酸盐、含有硼、不含硼、或是其组合。在其他的实施例中，所述组合物是无硼组合物。在一些实施例中，不含硼的组合物是未添加硼酸盐稳定剂的组合物。在另一个实施例中，不含硼的组合物是含有小于5.5％硼的组合物。在仍另外的实施例中，不含硼的组合物是含有小于4.5％硼的组合物。在又仍另一个实施例中，不含硼的组合物是含有小于3.5％硼的组合物。在又仍另外的实施例中，不含硼的组合物是含有小于2.5％硼的组合物。在甚至另外的实施例中，不含硼的组合物是含有小于1.5％硼的组合物。在另一个实施例中，不含硼的组合物是含有小于1.0％硼的组合物。在仍另外的实施例中，不含硼的组合物是含有小于0.5％硼的组合物。在仍另外的实施例中，无硼组合物是基本上不含硼的组合物。在其他的实施例中，所述组合物是不含或基本上不含酶稳定剂或肽抑制剂的组合物。

在另一个实施例中，本文描述的一种或多种组合物是呈选自凝胶、片剂、粉末、颗粒、固体、液体、单位剂量及其组合的形式。在又另一个实施例中，本文描述的一种或多种组合物是呈选自低水紧密配方、低水hdl或单位剂量(ud)、或高水配方或hdl的形式。在一些实施例中，本文描述的清洁组合物是呈单位剂型。在其他的实例中，所述单位剂型选自丸剂、片剂、胶囊、囊形片、小药囊、小袋、多隔室小袋和预先测量的粉末或液体。在一些实施例中，单位剂型被设计成在多隔室小袋(或其他单位剂型)内提供对成分的控制释放。合适的单位剂量和控制释放形式描述于例如ep2100949；wo02/102955；us4,765,916；us4,972,017；和wo04/111178。在一些实施例中，所述单位剂型是包含在水溶性膜或小袋中的片剂或粉末。

示例性衣物洗涤剂组合物包括但不限于例如液体和粉末衣物洗涤剂组合物。示例性硬表面清洁组合物包括但不限于例如用于清洁非餐具物品、非桌面器具物品、桌子、桌面、家具物品、墙壁、地板和天花板的硬表面的组合物。示例性硬表面清洁组合物描述于例如uspn6,610,642、6,376,450和6,376,450中。示例性个人护理组合物包括但不限于用于清洁假牙、牙齿、头发、隐形眼镜和皮肤的组合物。此类口腔护理组合物的示例性组分包括在例如us6,376,450中描述的那些。

在一些实施例中，本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体在低温下清洁。在其他的实施例中，本文描述的一种或多种组合物在低温下清洁。在其他实施例中，本文所述的一种或多种组合物包含有效量的本文所述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，该变体对于清洁需要蛋白质污渍去除的表面有用或有效。

在一些实例中，掺入辅助材料，例如，用以辅助或增强清洁性能；用于处理要清洁的底物；或用以改变所述清洁组合物的美感，如在香水、着色剂、染料等的情况下。一个实施例涉及包含本文描述的一种或多种辅助材料和一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的组合物。另一个实施例涉及包含本文描述的一种或多种辅助材料和一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的组合物，其中所述辅助材料选自：漂白催化剂、另外的酶、酶稳定剂(包括，例如酶稳定系统)、螯合剂(chelant)、光亮剂、污垢释放聚合物、染料转移剂、分散剂、泡沫抑制剂、染料、香料、着色剂、填充剂、光活化剂、荧光剂、织物调理剂、可水解表面活性剂、防腐剂、抗氧化剂、抗收缩剂、抗皱剂、杀菌剂、杀真菌剂、颜色点缀剂、银护理剂、抗晦暗剂、抗腐蚀剂、碱性来源、增溶剂、载体、加工助剂、色素、ph控制剂、表面活性剂、助洗剂、螯合剂(chelatingagent)、染料转移抑制剂、沉积助剂、催化材料、漂白活化剂、漂白增效剂、过氧化氢、过氧化氢源、预成型过酸、聚合物分散剂、黏土污垢去除/抗再沉积剂、结构增弹剂、织物柔顺剂、载体、助水溶物、加工助剂、色素及其组合。示例性辅助材料和使用水平可以在uspn5,576,282；6,306,812；6,326,348；6,610,642；6,605,458；5,705,464；5,710,115；5,698,504；5,695,679；5,686,014和5,646,101。在一种或多种清洁辅助材料与本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体不相容的实施例中，使用将辅助材料和一种或多种变体保持分离(即，彼此不接触)的方法，直到这两种组分的组合合适为止。此类分离方法包括本领域已知的任何合适的方法(例如，囊形片、包封、片剂、物理分离等)。

一些实施例涉及包含本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的清洁添加剂产品。在一些实施例中，所述添加剂被包封于用于添加至清洁过程中的剂型中。在一些实施例中，添加剂被包封在用于添加至清洁过程中的剂型中，在该清洁过程中使用过氧化物来源并且增加的漂白效果是希望的。

用于颗粒组合物的示例性填料或载体包括但不限于例如硫酸盐、碳酸盐和硅酸盐的各种盐；滑石；和黏土。用于液体组合物的示例性填料或载体包括但不限于例如水或低分子量伯醇和仲醇(包括多元醇和二元醇，例如甲醇、乙醇、丙醇和异丙醇)。在一些实施例中，所述组合物含有约5％至约90％的此类填料或载体。在此类组合物中可包括酸性填料以降低清洁方法或应用中所得溶液的ph。

在一个实施例中，本文描述的一种或多种清洁组合物包含有效量的本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，所述变体是单独的或与一种或多种另外的酶组合的。典型地，清洁组合物包含至少约0.0001至约20wt％、从约0.0001至约10wt％、从约0.0001至约1wt％、从约0.001至约1wt％、或从约0.01至约0.1wt％的一种或多种蛋白酶。在另一个实施例中，本文所述的一种或多种清洁组合物包含从约0.01至约10mg、约0.01至约5mg、约0.01至约2mg、约0.01至约1mg、约0.05至约1mg、约0.5至约10mg、约0.5至约5mg、约0.5至约4mg、约0.5至约3mg、约0.5至约2mg、约0.5至约1mg、约0.1至约10mg、约0.1至约5mg、约0.1至约4mg、约0.1至约3mg、约0.1至约2mg、约0.1至约1mg、或约0.1至约0.5mg的一种或多种蛋白酶/克组合物。

典型地配制本文描述的清洁组合物使得在水性清洁操作中使用期间，洗涤水将具有从约4.0至约11.5、或甚至从约5.0至约11.5、或甚至从约5.0至约8.0、或甚至从约7.5至约10.5的ph。液体产品制剂典型地被配制成具有从约3.0至约9.0或甚至从约3至约5的ph。颗粒洗衣产品典型地被配制成具有从约8至约11的ph。在一些实施例中，本发明的清洁组合物可以被配制成在洗涤条件下具有碱性ph，如从约8.0至约12.0、或从约8.5至约11.0、或从约9.0至约11.0的ph。在一些实施例中，本发明的清洁组合物可以被配制成在洗涤条件下具有中性ph，如从约5.0至约8.0、或从约5.5至约8.0、或从约6.0至约8.0、或从约6.0至约7.5的ph。在一些实施例中，当清洁组合物在20℃以1:100(wt:wt)溶解于去离子水中时，可以测量中性ph条件，使用常规ph计进行测量。用于将ph控制在推荐的使用水平的技术包括使用缓冲液、碱、酸等，并且是本领域的普通技术人员熟知的。

在一些实施例中，将本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体包封以在储存期间保护其免于组合物中的其他组分和/或在清洁期间控制变体的可用性。在一些实施例中，包封增强了变体和/或另外的酶的性能。在一些实施例中，所述包封材料典型地包封本文描述的枯草杆菌蛋白酶变体的至少一部分。典型地，所述包封材料是水溶性和/或水分散性的。在一些实施例中，所述包封材料具有0℃或更高的玻璃化转变温度(tg)。示例性包封材料包括但不限于：碳水化合物、天然或合成胶、甲壳素、壳聚糖、纤维素和纤维素衍生物、硅酸盐、磷酸盐、硼酸盐、聚乙烯醇、聚乙二醇、石蜡及其组合。当所述包封材料是碳水化合物时，其典型地选自单糖、寡糖、多糖及其组合。在一些实施例中，所述包封材料是淀粉(参见例如，ep0922499、us4,977,252、us5,354,559、和us5,935,826)。在一些实施例中，所述包封材料是由塑料(如热塑性塑料、丙烯腈、甲基丙烯腈、聚丙烯腈、聚甲基丙烯腈及其混合物)制成的微球。示例性的商业微球包括但不限于(stockviksverken，瑞典)；以及pm6545、pm6550、pm7220、pm7228、和(pq公司.，宾夕法尼亚州福吉谷)。

存在各种洗涤条件，包括本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体可能暴露的不同的洗涤剂制剂、洗涤水体积、洗涤水温度、和洗涤时间的长短。低洗涤剂浓度系统涉及含有小于约800ppm洗涤剂组分的洗涤水。中等洗涤剂浓度系统涉及含有约800ppm至约2000ppm的洗涤剂组分的洗涤水。高洗涤剂浓度系统涉及含有大于约2000ppm洗涤剂组分的洗涤水。在一些实施例中，本发明的“冷水洗涤”使用适合于在从约10℃至约40℃、从约20℃至约30℃、或从约15℃至约25℃、以及在约15℃至约35℃或10℃至40℃范围内的所有其他组合的温度下洗涤的“冷水洗涤剂”。

不同的地理位置具有不同的水硬度。硬度是水中钙(ca²⁺)和镁(mg²⁺)的量的量度。通常按照颗粒/加仑(gpg)混合的ca²⁺/mg²⁺来描述水硬度。在美国，大部分水都是硬水，但是硬度不同。中等硬(60-120ppm)至硬(121-181ppm)水具有60至181ppm(可以通过将ppm除以17.1而将ppm转化为颗粒/美国加仑)的硬度矿物。

其他的实施例涉及一种或多种清洁组合物，所述组合物包含按组合物重量计从约0.00001％至约10％的本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，和按组合物重量计从约99.999％至约90.0％的一种或多种辅助材料。在另一个实施例中，所述清洁组合物包含按组合物重量计从约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、或约0.005％至约0.5％的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体，和按组合物重量计从约99.9999％至约90.0％、约99.999％至约98％、约99.995％至约99.5％的一种或多种辅助材料。

在其他的实施例中，本文描述的组合物包含本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体和一种或多种另外的酶。所述一种或多种另外的酶选自酰基转移酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、芳基酯酶、β-半乳糖苷酶、角叉菜胶酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、软骨素酶、角质酶、内切-β-1,4-葡聚糖酶、内切-β-甘露聚糖酶、酯酶、外切-甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、透明质酸酶、角蛋白酶、漆酶、乳糖酶、木质素酶、脂肪酶、脂加氧酶、甘露聚糖酶、金属蛋白酶、核酸酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂合酶、果胶乙酰酯酶、果胶酶、戊聚糖酶、过氧化物酶、酚氧化酶、磷酸酶、磷脂酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、聚酯酶、另外的蛋白酶、支链淀粉酶、还原酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、β-葡聚糖酶、鞣酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖乙酰酯酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶、木糖苷酶、及其任何组合或混合物。一些实施例涉及包含常规酶(像淀粉酶、脂肪酶、角质酶和/或纤维素酶)的酶的组合(即“混合物”)，所述酶的组合与本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体和/或一种或多种另外的蛋白酶结合。

在另一个实施例中，本文描述的一种或多种组合物包含本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体和一种或多种另外的蛋白酶。在一个实施例中，所述另外的蛋白酶是丝氨酸蛋白酶。在另一个实施例中，所述另外的蛋白酶是碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。合适的另外的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的那些蛋白酶。在一些实施例中，所述另外的蛋白酶是微生物蛋白酶。在其他实施例中，所述另外的蛋白酶是化学或遗传修饰的突变体。在另一个实施例中，另外的蛋白酶是金属蛋白酶、真菌枯草杆菌蛋白酶、碱性微生物蛋白酶或胰蛋白样蛋白酶。示例性的碱性蛋白酶包括衍生自例如芽孢杆菌(例如，枯草芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、吉氏芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168)的枯草杆菌蛋白酶。示例性的另外的蛋白酶包括但不限于在wo92/21760、wo95/23221、wo2008/010925、wo09/149200、wo09/149144、wo09/149145、wo10/056640、wo10/056653、wo2010/0566356、wo11/072099、wo2011/13022、wo11/140364、wo12/151534、wo2015/038792、wo2015/089447、wo2015/089441、us公开号2008/0090747、us5,801,039、us5,340,735、us5,500,364、us5,855,625、re34,606、us5,955,340、us5,700,676us6,312,936、us6,482,628、us8,530,219、us临时申请号62/180673和62/161077、pct申请号pct/us2015/021813、pct/us2015/055900、pct/us2015/057497、pct/us2015/057492、pct/us2015/057512、pct/us2015/057526、pct/us2015/057520、pct/us2015/057502、pct/us2016/022282、及pct/us16/32514中描述的那些蛋白酶，以及wo1999014341、wo1999033960、wo1999014342、wo1999034003、wo2007044993、wo2009058303、wo2009058661、wo2014071410、wo2014194032、wo2014194034、wo2014194054和wo2014/194117中描述的金属蛋白酶。示例性另外的蛋白酶包括但不限于胰蛋白酶(例如猪或牛起源的)和描述于wo89/06270中的镰孢菌属(fusarium)蛋白酶。示例性商业蛋白酶包括但不限于maxacal^tm、maxapem^tm、oxp、puramax^tm、excellase^tm、preferenz^tm蛋白酶(例如p100、p110、p280、p300)、effectenz^tm蛋白酶(例如p1000、p1050、p2000)、excellenz^tm蛋白酶(例如p1000)、和purafast^tm(杜邦公司(dupont))；和变体，16l、ultra、durazym^tm、liquanase和(novozymes)；blap^tm和blap^tm变体(汉高公司(henkel))；kap(嗜碱芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶(花王公司(kao))；和(ab酶)。示例性金属蛋白酶包括在枯草芽孢杆菌中表达的重组形式的中性金属蛋白酶npre(参见例如wo07/044993)和来自解淀粉芽孢杆菌的纯化的中性金属蛋白酶pmn。

另一个实施例涉及包含本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体和一种或多种脂肪酶的组合物。在一些实施例中，所述组合物包含按组合物重量计从约0.00001％至约10％、约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、或约0.005％至约0.5％的脂肪酶。示例性脂肪酶可以是化学或遗传修饰的突变体。示例性脂肪酶包括但不限于例如细菌或真菌来源的那些，例如像绵毛状腐质菌(h.lanuginosa)脂肪酶(参见例如ep258068和ep305216)、疏棉状嗜热丝孢菌(t.lanuginosus)脂肪酶(参见例如wo2014/059360和wo2015/010009)、米黑根毛霉(rhizomucormiehei)脂肪酶(参见例如ep238023)、假丝酵母属(candida)脂肪酶如南极洲假丝酵母(c.antarctica)脂肪酶(例如南极洲假丝酵母脂肪酶a或b)(参见例如ep214761)、假单胞菌属脂肪酶例如产碱假单胞菌(p.alcaligenes)和假产碱假单胞菌(p.pseudoalcaligenes)脂肪酶(参见例如，ep218272)、洋葱假单胞菌(p.cepacia)脂肪酶(参见例如，ep331376)、施氏假单胞菌(p.stutzeri)脂肪酶(参见例如，gb1,372,034)、萤光假单胞菌(p.fluorescens)脂肪酶、芽孢杆菌属脂肪酶(例如枯草芽孢杆菌脂肪酶(dartois等人,biochem.biophys.acta[生物化学与生物物理学报]1131:253-260(1993))、嗜热脂肪芽孢杆菌脂肪酶(参见例如，jp64/744992)、和短小芽孢杆菌脂肪酶(参见例如，wo91/16422))。示例性经克隆的脂肪酶包括但不限于沙门柏干酪青霉(penicilliumcamembertii)脂肪酶(参见yamaguchi等人,gene[基因]103:61-67(1991))；白地霉(geotricumcandidum)脂肪酶(参见schimada等人,j.biochem.[生物化学杂志],106:383-388(1989))；以及各种根霉属(rhizopus)脂肪酶，如德氏根霉(r.delemar)脂肪酶(参见hass等人,gene[基因]109:117-113(1991))，雪白根霉(r.niveus)脂肪酶(kugimiya等人,biosci.biotech.biochem.[生物科学、生物技术与生物化学]56:716-719(1992))和米根霉(r.oryzae)脂肪酶。其他脂肪分解酶(如角质酶)也可用于本文描述的一种或多种组合物中，包括但不限于例如衍生自门多萨假单胞菌(pseudomonasmendocina)(参见wo88/09367)和/或豌豆根腐镰孢菌(fusariumsolanipisi)(参见wo90/09446)的角质酶。示例性商业脂肪酶包括但不限于m1lipase^tm、lumafast^tm、和lipomax^tm(杜邦公司)；和ultra(诺维信公司)；和lipasep^tm(天野药业有限公司(amanopharmaceuticalco.ltd))。

仍另外的实施例涉及包含本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体和一种或多种淀粉酶的组合物。在一个实施例中，所述组合物包含按组合物重量计从约0.00001％至约10％、约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、或约0.005％至约0.5％的淀粉酶。适合用于碱性溶液中的任何淀粉酶(例如，α淀粉酶和/或β淀粉酶)可以用于包括在此类组合物中。示例性淀粉酶可以是化学或遗传修饰的突变体。示例性淀粉酶包括但不限于细菌或真菌来源的那些，例如像描述于gb1,296,839、wo9100353、wo9402597、wo94183314、wo9510603、wo9526397、wo9535382、wo9605295、wo9623873、wo9623874、wo9630481、wo9710342、wo9741213、wo9743424、wo9813481、wo9826078、wo9902702、wo9909183、wo9919467、wo9923211、wo9929876、wo9942567、wo9943793、wo9943794、wo9946399、wo0029560、wo0060058、wo0060059、wo0060060、wo0114532、wo0134784、wo0164852、wo0166712、wo0188107、wo0196537、wo02092797、wo0210355、wo0231124、wo2004055178、wo2004113551、wo2005001064、wo2005003311、wo2005018336、wo2005019443、wo2005066338、wo2006002643、wo2006012899、wo2006012902、wo2006031554、wo2006063594、wo2006066594、wo2006066596、wo2006136161、wo2008000825、wo2008088493、wo2008092919、wo2008101894、wo2008/112459、wo2009061380、wo2009061381、wo2009100102、wo2009140504、wo2009149419、wo2010/059413、wo2010088447、wo2010091221、wo2010104675、wo2010115021、wo10115028、wo2010117511、wo2011076123、wo2011076897、wo2011080352、wo2011080353、wo2011080354、wo2011082425、wo2011082429、wo2011087836、wo2011098531、wo2013063460、wo2013184577、wo2014099523、wo2014164777、和wo2015077126中的淀粉酶。示例性商业淀粉酶包括但不限于stainzymestainzymestainzyme和ban^tm(诺维信公司)；effectenz^tms1000、powerase^tm、preferenz^tms100、preferenz^tms110、excellenz^tms2000、和p(杜邦公司)。

又仍另外的实施例涉及包含本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体和一种或多种纤维素酶的组合物。在一个实施例中，所述组合物包含按组合物重量计从约0.00001％至约10％、0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、或约0.005％至约0.5％的纤维素酶。任何合适的纤维素酶可用于本文描述的组合物中。示例性纤维素酶可以是化学或遗传修饰的突变体。示例性纤维素酶包括但不限于细菌来源或真菌来源的那些纤维素酶，例如像在以下中所描述的那些：wo2005054475、wo2005056787、us7,449,318、us7,833,773、us4,435,307；ep0495257；以及美国临时申请号62/296,678。示例性商业纤维素酶包括但不限于

和premium(诺维信公司)；revitalenz^tm100，revitalenz^tm200/220和2000(杜邦公司)；和kac-500(b)^tm(花王公司(kaocorporation))。在一些实例中，纤维素酶作为成熟野生型或变体纤维素酶(其中n-末端的一部分缺失)的部分或片段掺入(参见例如，us5,874,276)。

甚至仍另外的实施例涉及包含本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体和一种或多种甘露聚糖酶的组合物。在一个实施例中，所述组合物包含按组合物重量计从约0.00001％至约10％、约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、或约0.005％至约0.5％的甘露聚糖酶。示例性甘露聚糖酶可以是化学或遗传修饰的突变体。示例性甘露聚糖酶包括但不限于细菌或真菌来源的那些，例如，以下中描述的那些：wo2016/007929；uspn6,566,114；6,602,842；和6,440,991：以及美国临时申请号62/251516、62/278383和62/278387。示例性商业甘露聚糖酶包括但不限于(诺维信公司(novozymes))和effectenz^tmm1000、m100、和purabrite^tm(杜邦公司(dupont))。

又甚至仍另外的实施例涉及包含本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体以及一种或多种过氧化物酶和/或氧化酶的组合物。在一个实施例中，所述组合物包含按组合物重量计从约0.00001％至约10％、约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、或约0.005％至约0.5％的过氧化物酶或氧化酶。过氧化物酶可以与过氧化氢或其来源(例如过碳酸盐、过硼酸盐或过硫酸盐)组合使用，并且氧化酶可以与氧气组合使用。将单独的或与增效剂组合的过氧化物酶和氧化酶用于“溶液漂白”(即当织物在洗涤液中一起洗涤时防止纺织染料从一种染色的织物转移到另一种织物上)(参见例如wo94/12621和wo95/01426)。示例性过氧化物酶和/或氧化酶可以是化学或遗传修饰的突变体。示例性过氧化物酶/氧化酶包括但不限于植物、细菌或真菌来源的那些。

另一个实施例涉及包含本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体和一种或多种过水解酶的组合物，例如像描述于wo2005/056782、wo2007/106293、wo2008/063400、wo2008/106214、和wo2008/106215中的那些。

另一个实施例涉及包含一种或多种本文所述的枯草杆菌蛋白酶变体和一种或多种果胶酸裂合酶的组合物，例如像

在又另一个实施例中，本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体以及在本文描述的一种或多种组合物中含有的一种或多种另外的酶可以各自独立地变动至约10％，其中所述清洁组合物的余量为一种或多种辅助材料。

在一些实施例中，本文描述的一种或多种组合物可发现用作洗涤剂添加剂，其中所述添加剂为固体或液体形式。此类添加剂产品旨在补充和/或提高常规洗涤剂组合物的性能，并且可以在清洁过程的任何阶段添加。在一些实施例中，衣物洗涤剂组合物的密度范围为从约400至约1200g/升，而在其他的实施例中，其范围为在20℃测量的约500至约950g/升的组合物。

一些实施例涉及衣物洗涤剂组合物，其包含一种或多种本文描述的枯草杆菌蛋白酶变体和一种或多种选自以下的辅助材料：表面活性剂、酶稳定剂、助洗剂化合物、聚合化合物、漂白剂、另外的酶、泡沫抑制剂、分散剂、钙皂分散剂、污垢悬浮剂、抗再沉积剂、腐蚀抑制剂及其组合。在一些实施例中，所述洗衣组合物还含有柔顺剂。

另外的实施例涉及手动餐具洗涤组合物，所述组合物包含本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体和一种或多种选自以下的辅助材料：表面活性剂、有机聚合化合物、增泡剂、ii族金属离子、溶剂、助水溶物和另外的酶。

其他的实施例涉及本文描述的一种或多种组合物，其中所述组合物是用于有色织物洗涤或通过洗涤容量提供柔顺的紧密颗粒状织物清洁组合物，或者是重垢液体(hdl)织物清洁组合物。示例性织物清洁组合物和/或制备此类组合物的方法描述于uspn6,610,642和6,376,450中。其他示例性清洁组合物描述于例如uspn6,605,458；6,294,514；5,929,022；5,879,584；5,691,297；5,565,145；5,574,005；5,569,645；5,565,422；5,516,448；5,489,392；和5,486,303；4,968,451；4,597,898；4,561,998；4,550,862；4,537,706；4,515,707；和4,515,705。

在一些实施例中，所述清洁组合物包含酸化颗粒或氨基羧酸助洗剂。氨基羧酸助洗剂的实例包括氨基羧酸、其盐和衍生物。在一些实施例中，所述氨基羧酸助洗剂是氨基多羧酸助洗剂，如甘氨酸-n,n-二乙酸或具有通式mooc-chr-n(ch2coom)2(其中r是c1-12烷基并且m是碱金属)的衍生物。在一些实例中，所述氨基羧酸助洗剂可以是甲基甘氨酸二乙酸(mgda)、glda(谷氨酸-n,n-二乙酸)、亚氨基二琥珀酸(ida)、羧基甲基菊粉及其盐和衍生物、天冬氨酸-n-单乙酸(asma)、天冬氨酸-n,n-二乙酸(asda)、天冬氨酸-n-单丙酸(asmp)、n-(2-磺基甲基)天冬氨酸(smas)、n-(2-磺基乙基)天冬氨酸(seas)、n-(2-磺基甲基)谷氨酸(smgl)、n-(2-磺基乙基)谷氨酸(segl)、ids(亚氨基二乙酸)及其盐和衍生物如n-甲基亚氨基二乙酸(mida)、α-丙氨酸-n,n-二乙酸(α-alda)、丝氨酸-n,n-二乙酸(seda)、异丝氨酸-n,n-二乙酸(isda)、苯丙氨酸-n,n-二乙酸(phda)、邻氨基苯甲酸-n,n-二乙酸(anda)、磺胺酸-n,n-二乙酸(slda)、牛磺酸-n,n-二乙酸(tuda)和磺基甲基-n,n-二乙酸(smda)、以及其碱金属盐和衍生物。在一些实例中，酸化颗粒的重量几何平均粒度为从约400微米至约1200微米，并且体积密度为至少550g/l。在一些实施例中，所述酸化颗粒包含至少约5％的助洗剂。

在一些实施例中，所述酸化颗粒可以包含任何酸，包括有机酸和无机酸。有机酸可以具有一个或两个羧基，并且在一些情况下可以具有多达15个碳，特别是多达10个碳，如甲酸、乙酸、丙酸、癸酸、草酸、琥珀酸、己二酸、马来酸、富马酸、癸二酸、苹果酸、乳酸、乙醇酸、酒石酸和水合乙醛酸。在一些实施例中，所述酸是柠檬酸。无机酸包括盐酸和硫酸。在一些情况下，所述酸化颗粒是包含高水平氨基羧酸助洗剂的高活性颗粒。也已经发现硫酸进一步有助于最终颗粒的稳定性。

另外的实施例涉及清洁组合物，其包含一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体和一种或多种表面活性剂和/或表面活性剂系统，其中所述表面活性剂选自非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性表面活性剂、兼性离子表面活性剂、半极性非离子表面活性剂及其混合物。在一些实施例中，以清洁组合物的重量计，表面活性剂以从约0.1％至约60％的水平存在，而在替代性实施例中，该水平为从约1％至约50％，而在又另外的实施例中，该水平为从约5％至约40％。

在一些实施例中，本文描述的一种或多种组合物包含一种或多种洗涤剂助洗剂或助洗剂系统。在一个实施例中，所述组合物包含按组合物重量计约1％、从约0.1％至约80％、从约3％至约60％、从约5％至约40％、或从约10％至约50％的助洗剂。示例性的助洗剂包括但不限于碱金属；多磷酸盐的铵盐和链烷醇铵盐；碱金属硅酸盐；碱土金属和碱金属碳酸盐；铝硅酸盐；多元羧酸盐化合物；醚羟基多羧酸盐；马来酸酐与乙烯或乙烯基甲基醚、1,3,5-三羟基苯-2,4,6-三磺酸、和羧基甲基氧基琥珀酸的共聚物；聚乙酸的铵盐和取代的铵盐，如乙二胺四乙酸和次氮基三乙酸；多羧酸盐，如苯六甲酸、琥珀酸、柠檬酸、氧基二琥珀酸、聚马来酸、苯1,3,5-三羧酸、羧基甲基氧基琥珀酸；及其可溶性盐。在一些此类组合物中，所述助洗剂形成水溶性硬度离子络合物(例如螯合助洗剂)，如柠檬酸盐和多磷酸盐，例如三聚磷酸钠、三聚磷酸钠六水合物、三聚磷酸钾、以及混合的三聚磷酸钠和三聚磷酸钾。示例性助洗剂描述于例如ep2100949。在一些实施例中，所述助洗剂包括磷酸盐助洗剂和非磷酸盐助洗剂。在一些实施例中，所述助洗剂是磷酸盐助洗剂。在一些实施例中，所述助洗剂是非磷酸盐助洗剂。在一些实施例中，所述助洗剂包含磷酸盐和非磷酸盐助洗剂的混合物。示例性磷酸盐助洗剂包括但不限于单磷酸盐、二磷酸盐、三聚磷酸盐或低聚多磷酸盐，包括这些化合物的碱金属盐，包括钠盐。在一些实施例中，助洗剂可以是三聚磷酸钠(stpp)。另外，所述组合物可以包含碳酸盐和/或柠檬酸盐。其他合适的非磷酸盐助洗剂包括多元羧酸及其部分或完全中和盐、单体型多羧酸和羟基羧酸及其盐的均聚物和共聚物。在一些实施例中，上述化合物的盐包括铵盐和/或碱金属盐，即锂盐、钠盐和钾盐，包括钠盐。合适的多元羧酸包括无环的、脂环族的、杂环的和芳香族的羧酸，其中在一些实施例中，它们可以包含至少两个羧基基团，这些羧基基团在每种情况下彼此分离，在一些情况下被不超过两个碳原子分离。

在一些实施例中，本文描述的一种或多种组合物包含一种或多种螯合剂。在一个实施例中，所述组合物包含以组合物重量计从约0.1％至约15％或约3％至约10％的螯合剂。示例性螯合剂包括但不限于例如铜、铁、锰及其混合物。

在一些实施例中，本文描述的一种或多种组合物包含一种或多种沉积助剂。示例性沉积助剂包括但不限于例如聚乙二醇；聚丙二醇；聚羧酸盐；污垢释放聚合物，例如像聚对苯二甲酸；黏土，例如像高岭石、蒙脱石、硅镁土、伊利石、膨润土和多水高岭土；及其混合物。

在其他的实施例中，本文描述的一种或多种组合物包含一种或多种抗再沉积剂或非离子表面活性剂(其可以防止污垢的再沉积)(参见，例如，ep2100949)。例如，在adw组合物中，非离子表面活性剂可用于表面改性目的(具体是对于薄片)以避免成膜和沾上污渍并且改善光泽。这些非离子表面活性剂还可用于防止污垢的再沉积。在一些实施例中，非离子表面活性剂可以是乙氧基化非离子表面活性剂、环氧树脂封端的聚(烷氧基化)醇和氧化胺表面活性剂。

在一些实施例中，本文描述的一种或多种组合物包含一种或多种染料转移抑制剂。示例性聚合物染料转移抑制试剂包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮聚合物、多胺n-氧化物聚合物、n-乙烯吡咯烷酮与n-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮、聚乙烯咪唑及其混合物。在一个实施例中，所述组合物包含以组合物重量计从约0.0001％至约10％、约0.01％至约5％、或约0.1％至约3％的染料转移抑制剂。

在一些实施例中，本文描述的一种或多种组合物包含一种或多种硅酸盐。示例性硅酸盐包括但不限于硅酸钠，例如，二硅酸钠、偏硅酸钠和结晶页硅酸盐。在一些实施例中，硅酸盐以按所述组合物的重量计从约1％至约20％或约5％至约15％的水平存在。

在一些仍另外的实施例中，本文描述的一种或多种组合物包含一种或多种分散剂。示例性水溶性有机材料包括但不限于例如均聚合或共聚合的酸或其盐，其中聚羧酸包括至少两个被不超过两个碳原子彼此分开的羧基自由基。

在一些另外的实例中，本文描述的一种或多种组合物包含一种或多种无机酶稳定剂。在一些实施例中，所述酶稳定剂是钙和/或镁离子的水溶性来源。在一些实施例中，所述酶稳定剂包括寡糖、多糖和无机二价金属盐(包括碱土金属盐，如钙盐)。在一些实施例中，本文使用的酶通过存在于为这些酶提供以下此类离子的成品组合物中的锌(ii)、钙(ii)和/或镁(ii)离子的水溶性来源，以及其他金属离子(例如，钡(ii)、钪(ii)、铁(ii)、锰(ii)、铝(iii)、锡(ii)、钴(ii)、铜(ii)、镍(ii)以及氧钒(iv))来稳定。氯化物和硫酸盐也可用于一些实施例中。示例性寡糖和多糖(例如，糊精)描述于例如wo07/145964中。在一些实施例中，可逆蛋白酶抑制剂也可用于如含硼化合物(例如硼酸盐、4-甲酰基苯基硼酸、和苯基硼酸衍生物(例如在wo96/41859中描述的那些))和/或肽醛(例如像在wo2009/118375和wo2013004636中进一步描述的)中。

在其他实施例中，本文提供的一种或多种组合物不包含酶稳定剂和肽抑制剂，或包含减少量的酶稳定剂和肽抑制剂，如肽醛。即，本文提供的枯草杆菌蛋白酶变体在缺乏酶稳定剂或肽抑制剂或包含减少量的酶稳定剂或肽抑制剂的组合物中相对于参比枯草杆菌蛋白酶具有增加的稳定性。

如前所述(wo199813458、wo2011036153、us20140228274)，肽醛可用作洗涤剂制剂中的蛋白酶稳定剂。肽醛稳定剂的实例是肽醛、酮或卤代甲基酮，并且可以是‘n-封端的’，例如具有脲基、氨基甲酸酯或脲部分，或‘双n-封端的’，例如具有羰基、脲基、草酰胺、硫脲基、二硫代草酰胺或硫代草酰胺部分(ep2358857b1)。这些抑制剂与蛋白酶的摩尔比可以是0.1:1至100:1，例如0.5:1-50:1、1:1-25:1或2:1-10:1。蛋白酶稳定剂的其他实例是二苯甲酮或苯甲酸苯胺衍生物，其可含有羧基基团(us7,968,508b2)。这些稳定剂与蛋白酶的摩尔比优选地是在1:1至1000:1的范围内，特别是1:1至500:1，尤其优选地从1:1至100:1，最尤其优选地从1:1至20:1。

在一些实施例中，本文描述的一种或多种组合物包含一种或多种漂白剂、漂白活化剂、和/或漂白催化剂。在一些实施例中，本文描述的一种或多种组合物包含一种或多种无机和/或有机漂白化合物。示例性无机漂白剂包括但不限于过氧化氢合物盐，例如过硼酸盐、过碳酸盐、过磷酸盐、过硫酸盐和过硅酸盐。在一些实施例中，无机过氧化氢合物盐是碱金属盐。在一些实施例中，包括为结晶固体但没有额外保护的无机过氧化氢合物盐，但是在一些其他实施例中，所述盐被包衣。漂白活化剂典型地为有机过酸前体，其在60℃及以下的温度下在清洁过程中增强漂白作用。示例性漂白活化剂包括如下化合物，所述化合物在过水解条件下给出具有从约1至约10个碳原子或从约2至约4个碳原子的脂肪族过氧羧酸、和/或任选地取代的过氧苯甲酸。示例性漂白活化剂描述于例如ep2100949中。示例性漂白催化剂包括但不限于锰三氮杂环壬烷和相关络合物，以及钴、铜、锰和铁络合物。另外的示例性漂白催化剂描述于例如us4,246,612；us5,227,084；us4,810,410；wo99/06521；和ep2100949中。

在一些实施例中，本文描述的一种或多种组合物包含一种或多种催化性金属络合物。在一些实施例中，可使用含金属的漂白催化剂。在一些实施例中，所述金属漂白催化剂包含一种催化体系，所述催化体系包括：具有限定的漂白催化活性的过渡金属阳离子(例如，铜、铁、钛、钌、钨、钼或锰阳离子)，具有很少或不具有漂白催化活性的辅助金属阳离子(例如，锌或铝阳离子)，以及对于催化性和辅助性金属阳离子具有限定的稳定性常数的螯合物，特别是乙二胺四乙酸、乙二胺四(亚甲基膦酸)及其水溶性盐(参见例如，us4,430,243)。在一些实施例中，本文所述的一种或多种组合物借助于锰化合物来催化。此类化合物和使用水平描述于例如us5,576,282中。在另外的实施例中，钴漂白催化剂可用于并包含于本文所述的一种或多种组合物中。多种钴漂白催化剂描述于例如uspn5,597,936和5,595,967中。

在一些另外的实施例中，本文描述的一种或多种组合物包含大多环刚性配体(mrl)的过渡金属络合物。作为实际问题而并非进行限制，在一些实施例中，对本文所述的组合物和清洁方法进行调节以提供至少一亿分之一数量级的，在洗涤液中约0.005ppm至约25ppm、约0.05ppm至约10ppm、或约0.1ppm至约5ppm的活性mrl。示例性mrl包括但不限于交联桥接的特殊超刚性配体，例如像5,12-二乙基-1,5,8,12-四氮杂双环(6.6.2)十六烷。示例性金属mrl描述于例如wo2000/32601和us6,225,464中。

在另一个实施例中，本文描述的一种或多种组合物包含一种或多种金属护理剂。在一些实施例中，所述组合物包含按组合物的重量计从约0.1％至约5％的金属护理剂。示例性金属护理剂包括例如铝、不锈钢和非铁金属(例如，银和铜)。另外的示例性金属护理剂描述于例如ep2100949、wo94/26860和wo94/26859中。在一些组合物中，所述金属护理剂是锌盐。

在一些实施例中，所述清洁组合物是包含本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的高密度液体(hdl)组合物。所述hdl液体衣物洗涤剂可以包含清洁型表面活性剂(10％-40％)，所述清洁型表面活性剂包含选自下组的阴离子清洁型表面活性剂：直链或支链或无规链，取代的或未取代的烷基硫酸盐、烷基磺酸盐、烷基烷氧基化硫酸盐、烷基磷酸盐、烷基膦酸盐、烷基羧酸盐、和/或其混合物；以及任选地选自下组的非离子表面活性剂：直链或支链或无规链，取代的或未取代的烷基烷氧基化醇，例如c8-c18烷基乙氧基化醇和/或c6-c12烷基苯酚烷氧基化物，任选地其中阴离子清洁型表面活性剂(亲水指数(hic)为从6.0至9)与非离子清洁型表面活性剂的重量比大于1:1。合适的清洁型表面活性剂还包括阳离子清洁型表面活性剂(选自烷基吡啶化合物、烷基季铵化合物、烷基季鏻化合物、烷基三元锍化合物和/或其混合物)；兼性离子和/或两性清洁型表面活性剂(选自链烷醇胺磺基-甜菜碱)；两性表面活性剂；半极性非离子表面活性剂；及其混合物。

在另一个实施例中，所述清洁组合物是液体或凝胶洗涤剂(其不是单位剂量的)，所述液体或凝胶洗涤剂可以是水性的，通常含有按重量计至少20％和高至95％的水，如按重量计高至约70％的水，按重量计高至约65％的水，按重量计高至约55％的水，按重量计高至约45％的水，或按重量计高至约35％的水。在水性液体或凝胶中可包括其他类型的液体(包括但不限于烷醇、胺、二醇、醚和多元醇)。水性液体或凝胶洗涤剂可包含从0至30％的有机溶剂。液体或凝胶洗涤剂可以是非水性的。

所述组合物可以任选地包括由两亲烷氧基化油脂清洁聚合物组成的表面活性增强聚合物，该两亲烷氧基化油脂清洁聚合物(选自以下组：具有支链亲水和疏水特性的烷氧基化聚合物，如烷氧基化聚亚烷基亚胺(在0.05wt％-10wt％范围内))和/或无规接枝聚合物(典型地包含含有单体的亲水主链，所述单体选自由以下组成的组：不饱和的c1-c6羧酸、醚、醇、醛、酮、酯、糖单元、烷氧基单元、马来酸酐、饱和的多元醇(如甘油)及其混合物)；以及一个或多个疏水侧链，所述疏水侧链选自由以下组成的组：c4-c25烷基基团、聚丙烯、聚丁烯、饱和的c2-c6单羧酸的乙烯酯、丙烯酸或甲基丙烯酸的c1-c6烷基酯及其混合物。

该组合物可以包含另外的聚合物，如去污聚合物，该去污聚合物包含例如阴离子封端的聚酯，例如srp1；处于无规或嵌段构型的、含有至少一种单体单元的聚合物，该单体单元选自糖类、二羧酸、多元醇及其组合；处于无规或嵌段构型的、基于对苯二甲酸乙二醇酯的聚合物及其共聚物，例如repel-o-texsf、sf-2和srp6；texcaresra100、sra300、srn100、srn170、srn240、srn300和srn325；marloquestsl；抗再沉积聚合物(0.1wt％至10wt％，包括，例如，羧酸盐聚合物，如包含至少一个选自丙烯酸、马来酸(或马来酸酐)、富马酸、衣康酸、乌头酸、中康酸、柠康酸、甲基丙二酸及其任何混合物的单体的聚合物；乙烯基吡咯烷酮均聚物；和/或分子量为500至100,000da的聚乙二醇)；纤维素聚合物(包括，例如，烷基纤维素；烷基烷氧基烷基纤维素；羧烷基纤维素；烷基羧烷基纤维素，其实例包括羧甲基纤维素、甲基纤维素、甲基羟乙基纤维素、甲基羧甲基纤维素；及其混合物)；以及聚合物羧酸盐(例如像马来酸酯/丙烯酸酯无规共聚物或聚丙烯酸酯均聚物)。

所述组合物可以进一步包含：饱和或不饱和的脂肪酸，优选饱和或不饱和的c12-c24脂肪酸(0-10wt％)；沉积助剂(包括例如，多糖，纤维素聚合物，聚联丙烯二甲基卤化铵(dadmac)，以及dadmac与乙烯基吡咯烷酮、丙烯酰胺、咪唑、咪唑啉卤化物及其混合物的共聚物(呈无规或嵌段构型))；阳离子瓜耳胶；阳离子纤维素，如阳离子羟乙基纤维素；阳离子淀粉；阳离子聚丙烯酰胺；及其混合物。

所述组合物可以进一步包含染料转移抑制剂，其实例包括锰酞菁、过氧化物酶、聚乙烯基吡咯烷酮聚合物、聚胺n-氧化物聚合物、n-乙烯基吡咯烷酮和n-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯基噁唑烷酮和聚乙烯基咪唑和/或其混合物；螯合剂，其实例包括乙二胺四乙酸(edta)、二亚乙基三胺五亚甲基膦酸(dtpmp)、羟基乙烷二膦酸(hedp)、乙二胺n,n'-二琥珀酸(edds)、甲基甘氨酸二乙酸(mgda)、二亚乙基三胺五乙酸(dtpa)、丙二胺四乙酸(pdta)、2-羟基吡啶-n-氧化物(hpno)、或甲基甘氨酸二乙酸(mgda)、谷氨酸n,n-二乙酸(n,n-二羧基甲基谷氨酸四钠盐(glda)、次氮基三乙酸(nta)、4,5-二羟基间苯二磺酸、柠檬酸及其任何盐、n-羟基乙基乙二胺三乙酸(hedta)、三亚乙基四胺六乙酸(ttha)、n-羟基乙基亚氨基二乙酸(heida)、二羟基乙基甘氨酸(dheg)、乙二胺四丙酸(edtp)、及其衍生物。

所述组合物可以进一步包含基于硅酮或基于脂肪酸的泡沫抑制剂；酶稳定剂；调色染料、钙和镁阳离子、视觉信号传导成分、抗泡沫剂(0.001wt％至约4.0wt％)和/或结构剂/增稠剂(0.01wt％-5wt％)，所述结构剂/增稠剂选自由以下组成的组：甘油二酸酯、甘油三酸酯、乙烯乙二醇二硬脂酸酯、微晶纤维素、基于纤维素的材料、超细纤维素、生物聚合物、黄原胶、结冷胶、及其混合物。

在一些实施例中，所述清洁组合物是包含本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的高密度粉末(hdd)组合物。所述hdd粉末衣物洗涤剂可包含清洁型表面活性剂，所述清洁型表面活性剂包括阴离子清洁型表面活性剂(选自直链或支链或无规链，取代或未取代的烷基硫酸盐、烷基磺酸盐、烷基烷氧基化硫酸盐、烷基磷酸盐、烷基膦酸盐、烷基羧酸盐和/或其混合物)，非离子清洁型表面活性剂(选自直链或支链或无规链，取代或未取代的c8-c18烷基乙氧基化物和/或c6-c12烷基酚烷氧基化物)，阳离子清洁型表面活性剂(选自烷基吡啶鎓化合物、烷基季铵化合物、烷基季鏻化合物、烷基三锍化合物及其混合物)；兼性离子和/或两性清洁型表面活性剂(选自链烷醇胺磺基甜菜碱)；两性表面活性剂；半极性非离子表面活性剂及其混合物；助洗剂(无磷酸盐助洗剂，例如沸石助洗剂，其实例包括0wt％至小于10wt％范围的沸石a、沸石x、沸石p和沸石map)；磷酸盐助洗剂，例如0wt％至小于10wt％范围的三聚磷酸钠；小于15wt％的柠檬酸、柠檬酸盐和次氮基三乙酸或其盐；硅酸盐(0wt％至小于10wt％范围的硅酸钠或硅酸钾或偏硅酸钠或者层状硅酸盐(sks-6))；碳酸盐(0wt％至小于10wt％范围的碳酸钠和/或碳酸氢钠)；以及漂白剂(光漂白剂，例如磺化锌酞菁、磺化铝酞菁、呫吨染料及其混合物)；疏水或亲水性漂白活化剂(例如，十二烷酰氧基苯磺酸盐、癸酰氧基苯磺酸盐、癸酰氧基苯甲酸或其盐、3,5,5-三甲基己酰氧基苯磺酸盐、四乙酰基乙二胺-taed和壬酰氧基苯磺酸盐-nobs、季铵腈及其混合物)；过氧化氢；过氧化氢的来源(无机过水合物盐，例如过硼酸盐、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐或过硅酸盐的一水合物或四水合物钠盐)；预制的亲水和/或疏水过酸(选自过羧酸和盐、过碳酸和盐、过亚氨酸和盐、过氧单硫酸和盐及其混合物)；和/或漂白催化剂(例如亚胺漂白增效剂，如亚胺阳离子和聚离子；亚胺兼性离子；改性胺；改性胺氧化物；n-磺酰基亚胺；n-膦酰基亚胺；n-酰基亚胺；噻二唑二氧化物；全氟亚胺；环状糖酮及其混合物)，含金属的漂白催化剂(例如铜、铁、钛、钌、钨、钼或锰阳离子以及辅助金属阳离子(如锌或铝)和螯合剂(如乙二胺四乙酸，乙二胺四(亚甲基膦酸)及其水溶性盐)。

所述组合物可以进一步包含另外的洗涤剂成分，包括香料微囊剂、淀粉包封的香料协调剂、酶稳定剂、调色剂、另外的聚合物(包括织物完整性和阳离子聚合物)、染料锁定成分、织物柔顺剂、增亮剂(例如c.i.荧光增亮剂)、絮凝剂、螯合剂、烷氧基化多胺、织物沉积助剂和/或环糊精。

在一些实施例中，所述清洁组合物是包含本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体的adw洗涤剂组合物。所述adw洗涤剂组合物可包含两种或更多种非离子表面活性剂，所述非离子表面活性剂选自按重量计0-10％的量存在的乙氧基化非离子表面活性剂、醇烷氧基化表面活性剂、环氧基封端聚(氧烷基化)醇和氧化胺表面活性剂；按重量计5％-60％范围的助洗剂，包括磷酸盐(单磷酸盐、二磷酸盐、三聚磷酸盐或低聚聚磷酸盐)、三聚磷酸钠-stpp助洗剂或不含磷酸盐的助洗剂(氨基酸基化合物，例如mgda(甲基-甘氨酸-二乙酸)及其盐和衍生物，glda(谷氨酸-n,n-二乙酸)及其盐和衍生物，ids(亚氨基二琥珀酸)及其盐和衍生物，羧甲基菊粉及其盐和衍生物及其混合物，次氮基三乙酸(nta)，二乙烯三胺五乙酸(dtpa)和b-丙氨酸二乙酸(b-ada)及其盐)，按重量计0.5％-50％范围的多元羧酸及其部分或完全中和的盐、单体多元羧酸和羟基羧酸及其盐的均聚物和共聚物；按重量计约0.1％至约50％范围的磺化/羧化聚合物(为产物提供尺寸稳定性)；按重量计约0.1％至约10％范围的干燥助剂(选自聚酯，尤其阴离子聚酯，任选地与另外的具有3-6官能度(特别是酸、醇或酯官能度)的有助于缩聚的单体，反应性环状碳酸酯和脲型的聚碳酸酯-、聚氨酯-和/或的聚脲-聚有机硅氧烷化合物或其前体化合物一起)；按重量计约1％至约20％范围的硅酸盐(硅酸钠或硅酸钾，例如二硅酸钠，偏硅酸钠和晶状页硅酸盐)；漂白无机物(例如过水合物盐，如过硼酸盐、过碳酸盐、过磷酸盐、过硫酸盐和过硅酸盐)和有机物(例如有机过氧酸，包括二酰基和四酰基过氧化物，尤其二过氧十二烷二酸，二过氧十四烷二酸和二过氧十六烷二酸)；按重量计约0.1％至约10％的漂白活化剂-有机过酸前体；漂白催化剂(选自三氮杂环壬烷锰及相关的络合物，钴、铜、锰和铁双吡啶胺及相关的络合物，以及五胺乙酸钴(iii)及相关的络合物)；以重量计约0.1％-5％范围的金属护理剂(选自苯并三唑、金属盐和络合物以及硅酸盐)；每克adw洗涤剂组合物约0.01-5.0mg活性酶范围的酶(酰基转移酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、芳基酯酶、β-半乳糖苷酶、角叉菜胶酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、软骨素酶、角质酶、内切β-1,4-葡聚糖酶、内切β-甘露聚糖酶、酯酶、外切甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、葡糖淀粉酶、半纤维素酶、透明质酸酶、角蛋白酶、漆酶、乳糖酶、木质素酶、脂肪酶、脂氧合酶、甘露聚糖酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂合酶、果胶乙酰酯酶、果胶酶、戊聚糖酶、过氧化物酶、酚氧化酶、磷酸酶、磷脂酶、植酸酶、聚酯酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、支链淀粉酶、还原酶、鼠李糖半乳糖苷、β-葡聚糖酶、鞣酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖乙酰酯酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶、木糖苷酶及其混合物)；以及酶稳定剂组分(选自寡糖、多糖和无机二价金属盐)。

更多实施例涉及使用本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体来处理织物(例如，使纺织品脱浆)的组合物和方法。织物处理方法是本领域中熟知的(参见例如，us6,077,316)。例如，可以通过包括使织物与溶液中的本文描述的变体接触的方法来改善织物的手感和外观。织物可以在压力下用溶液进行处理。

可以在纺织品的编织期间或之后、在脱浆阶段期间或一个或多个另外的织物加工步骤中应用本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体。在纺织品的编织期间，线暴露于相当大的机械应变。在机械织机上编织之前，通常用上浆淀粉或淀粉衍生物涂覆经纱以增加其抗张强度并防止断开。可在编织期间或之后应用本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体以除去上浆淀粉或淀粉衍生物。编织之后，可以在进一步处理织物之前使用该变体来除去浆涂层以确保均一和耐洗的结果。本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体可以单独使用或与其他脱浆化学试剂和/或脱浆酶一起使用，以作为洗涤剂添加剂(例如在水性组合物中)使织物(包括含棉的织物)脱浆。淀粉酶还可以用于在靛蓝染色的牛仔织物和服装上产生石磨的外观的组合物和方法中使用。对于服装生产而言，织物可被裁剪和缝制成服装或衣服，其随后被精整(finish)。特别地，对于牛仔布的生产，开发了不同的酶促精整方法。牛仔衣服的精整加工通常是以酶促脱浆步骤开始的，其中使衣服经受淀粉水解酶的作用以为织物提供柔软性，并且使棉更易于进行随后的酶促精整加工步骤。本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体可用于下列方法中：精整牛仔衣服(例如“生物磨砂方法”)、酶促脱浆并为织物提供柔软性和/或精整方法。

本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体可进一步用于纸浆(如化学纸浆、半化学纸浆、牛皮纸浆、机械纸浆或通过亚硫酸盐法制备的纸浆)的酶辅助漂白。一般来说，将纸浆与本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体在适合于漂白纸浆的条件下一起孵育。

在一些实施例中，纸浆是不含氯的纸浆，该纸浆经氧、臭氧、过氧化氢或过氧酸进行漂白。在一些实施例中，本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体用于展示出低木质素含量的纸浆的酶辅助漂白，所述纸浆是通过经改良的制浆方法或连续制浆方法生产的。在一些其他的实施例中，本文描述的一种或多种枯草杆菌蛋白酶变体单独地应用或优选地与木聚糖酶和/或内切葡聚糖酶和/或α-半乳糖苷酶和/或纤维二糖水解酶组合应用。

提供以下实例以证明和说明本公开的某些优选实施例和方面，并且不应被解释为限制性的。

实例1

酶变体的产生

bpn’和gg36蛋白酶变体的表达

如下所述产生解淀粉芽孢杆菌(bpn’)野生型枯草杆菌蛋白酶及其变体，以及迟缓芽孢杆菌(gg36)野生型枯草杆菌蛋白酶及其变体。成熟的bpn’亲本酶的氨基酸序列如seqidno:1所示，而成熟的gg36亲本酶(迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶)的氨基酸序列如seqidno:2所示。合成了编码bpn’亲本蛋白酶的合成基因(seqidno:3)，并利用常规分子生物学技术将其用于产生亲本和变体序列(参见，例如，sambrook等人,“molecularcloning[分子克隆]”,coldspringharborlaboratorypress[冷泉港实验室出版社])。还可以通过常规方法重新合成编码另外的bpn’变体的基因。随后将各种bpn’基因克隆到psb表达载体中(babélm，yoasts，dreyerm和schmidtbf“heterologousexpressionofhumangranzymekinbacillussubtilisandcharacterizationofitshydrolyticactivityinvitro[人粒酶k在枯草芽孢杆菌中的异源表达及其在体外的水解活性的表征]”,biotechnolapplbiochem.[生物技术与应用生物化学],27,第2部分,1998)或phyt表达载体中(衍生自phy300plk(takara-clontech))。所述表达盒含有apre启动子(seqidno:4)、apre信号肽(seqidno:5)、bpn’前肽(seqidno:6)和bpn’终止子序列(seqidno:7)。合成了编码gg36亲本蛋白酶的合成基因(seqidno:8)，并除了使用gg36前肽(seqidno:9)外，按如上所述将其用于产生亲本和变体序列。

使用本领域已知的技术组装编码各种目的成熟蛋白酶序列(亲本和变体)的dna片段。使用合适菌株的感受态枯草芽孢杆菌细胞进行表达，并将转化混合物铺板在含有1.6％脱脂奶和10ppm新霉素或四环素的la板上，并在37℃下孵育过夜。挑取单菌落并使其在含有10ppm新霉素的luria肉汤中于37℃生长。

为了进行蛋白表达实验，将转化的细胞在96孔微量滴定板(mtp)中的培养基(基于mop缓冲液的富集的半限定培养基，尿素为主要氮源，葡萄糖为主要碳源，补充1％大豆胨用于稳健细胞生长，含有抗生素选择)中，在振荡孵育器中在32℃、300rpm、80％湿度下生长3天。离心和过滤后，将含有目的蛋白酶的澄清培养物上清液用于测定。

通过上述方法生成了320个bpn’枯草杆菌蛋白酶变体的文库。所述文库包含在野生型序列(seqidno:1)上具有最少6个氨基酸取代和最多23个取代的变体。通过上述方法生成了640个gg36枯草杆菌蛋白酶变体的文库。所述文库包含在野生型序列(seqidno:2)上具有最少1个氨基酸取代和最多20个取代的变体。这些研究的结果总结在下面的实例3中。

bgi02446和aprl蛋白酶变体的设计和表达

吉氏芽孢杆菌bgi02446野生型枯草杆菌蛋白酶(描述于wo2015/089447中)及其变体按如下所述产生。使用包含以下的dna片段表达吉氏芽孢杆菌bgi02446亲本枯草杆菌蛋白酶(成熟蛋白，seqidno:10)及其变体：5’apre侧翼区，其含有枯草芽孢杆菌p1rrni启动子序列(seqidno:11)(所述枯草芽孢杆菌p1rrni启动子更全面地描述于us-2014-0329309中)；编码apre信号肽序列的核苷酸序列(seqidno:5)；编码迟缓芽孢杆菌前肽的核苷酸序列(seqidno:9)；对应于编码成熟吉氏芽孢杆菌进化枝bgi02446枯草杆菌蛋白酶的基因的序列(seqidno:12)；bpn’终止子(seqidno:7)；来自金黄色葡萄球菌(s.aureus)的氯霉素乙酰基转移酶(cat)基因表达盒(seqidno:13)；以及3’apre侧翼序列(seqidno:14)；按连续的顺序。该dna片段使用标准分子技术组装。以类似方法构建了bgi02446枯草杆菌蛋白酶的变体。如上所述构建地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶aprl(seqidno:15)及其变体，但是具有aprl前肽(seqidno:16)和对应于编码成熟aprl的基因的序列(seqidno:17)。使用表达盒的线性dna转化合适菌株的感受态枯草芽孢杆菌细胞。

将转化混合物铺板到含有1.6％脱脂奶和5ppm氯霉素的la板上，并在37℃孵育过夜。挑取单菌落并使其在含有5ppm氯霉素的luria肉汤中于37℃生长。

为了进行蛋白表达实验，将转化的细胞在96孔mtp中的培养基(基于mop缓冲液的富集的半限定培养基，尿素为主要氮源，葡萄糖为主要碳源，补充1％大豆胨用于稳健细胞生长，含有抗生素选择)中，在振荡孵育器中在32℃、300rpm、80％湿度下生长3天。离心和过滤后，将含有目的蛋白酶的澄清培养物上清液用于测定。

通过上述方法生成了640个bgi02446枯草杆菌蛋白酶变体的文库。所述文库包含在野生型序列(seqidno:10)上具有最少1个氨基酸取代和最多25个取代的变体。这些研究的结果总结在下面的实例3中。

通过上述方法生成了176个aprl枯草杆菌蛋白酶变体的文库。所述文库包含在野生型序列(seqidno:15)上具有最少6个氨基酸取代和最多17个取代的变体。这些研究的结果总结在下面的实例3中。

实例2

酶测定

蛋白质测定分析：对于高分辨率浓度确定，对蛋白质样品进行高效液相色谱法(hplc)方法。使用配备有安捷伦300sb-c8柱的安捷伦1100hplc进行蛋白质定量。使用在水中的0.1％三氟乙酸(tfa)和在乙腈中的0.1％tfa的梯度从柱洗脱样品。在220nm处测量吸光度，并使用chemstation软件(安捷伦科技公司(agilenttechnologies)，美国)对峰进行积分。基于亲本蛋白酶的标准曲线计算样品的蛋白质浓度。可替代地，通过uhplc使用zorbax300sb-c3柱以及0.1％三氟乙酸(缓冲液a)和在乙腈中的0.07％三氟乙酸(缓冲液b)的线性梯度，并在220nm处检测吸光度，确定样品蛋白酶在培养物上清液中的浓度。将培养物上清液稀释于10mmnacl、0.1mmcacl2、0.005％-80中以加载到柱上。基于纯化的亲本酶的标准曲线计算样品的蛋白质浓度。

蛋白酶活性：通过测量n-suc-aapf-pna底物的水解来测试亲本及其变体的蛋白酶活性。对于aapf测定，使用的试剂溶液为：100mmtrisph8.6，10mmcalcl2，0.005％-80(tris/ca缓冲液)和在dmso中的160mmsuc-aapf-pna(suc-aapf-pna原液)(西格玛：s-7388)。为了制备工作溶液，将1mlsuc-aapf-pna原液添加到100mltris/ca缓冲液中并混合。将酶样品添加到含有1mg/mlsuc-aapf-pna工作溶液的微量滴定板(mtp)中，并且使用spectramax板读数器以动力学方式在室温(rt)下经3-5min在405nm下测量吸光度来测定活性。将蛋白酶活性表达为mod/min。

清洁性能测定：这些研究中使用的洗涤剂列于表1中，并且包括重垢液体衣物洗涤(hdl)和自动餐具洗涤(adw)配方。于2014年购买了宝莹(persil)small&mighty非生物液体洗涤剂“宝莹非生物(persilnon-bio)”(pnb，联合利华(unilever))，并于2012年从当地超市购买了蓝月亮(bluemoon)(广州蓝月亮(guangzhoubluemoon))。中国国家标准(cns)洗涤剂于2017年从中国国家标准中心购买，其组成列于表2。不含酶的gsm-b无磷adw洗涤剂是从德国布鲁克格根的wfktestgewebegmbh(www.testgewebe.de)购买的，表3显示了其组成。

将含酶的商业洗涤剂(科克兰超净和蓝月亮)在95℃的水浴中热处理16小时以灭活酶，并按表1所述进行计量。灭活后使用aapf底物测定蛋白酶活性，以确保蛋白酶完全灭活，并且在hdl洗涤剂热处理后无法检测到。hdl洗涤剂：宝莹非生物small&mighty(宝莹非生物，宝莹公司，pnb)和cns被认为是无硼的，因为当测试硼元素含量时，它们含有≤5mg/kg的硼。将gsm-b粉末配方溶解至3g/l以便使用并且不调节ph。

测试了各变体相对于亲本在各种技术污垢上的清洁性能：bmi(empa-116，棉布上的血液/牛奶/墨水)，用于基于洗衣的应用；以及蛋黄(pas-38，丙纶织物上的蛋黄，老化并用炭黑染料着色)，用于洗碗碟应用。将empa-116样品用去离子水预漂洗20分钟并在室温下干燥过夜。对于所有污渍，mtp板(costar9017或greiner655101)中的预先穿孔的样品由荷兰弗拉尔丁恩(vlaardingen)的测试材料bv中心(centerfortestmaterialsbv)制备。在添加酶之前，将这些含微样品的板用洗涤剂填充。将酶的等分试样添加到含有微样品的洗涤剂填充的mtp中，达到最终体积为180微升，用于衣物洗涤测定，最终酶浓度为0.25-5ppm。使用hdl配方的衣物清洁测定在25℃下进行20分钟，而adw测定在40℃下进行30分钟。孵育后，将100-150微升的上清液转移到新鲜的mtp中，并且使用spectramax酶标仪在600nm处读取empa-116样品的吸光度或在405nm处读取pas-38样品的吸光度。通过从每个样品值中减去空白对照(无酶)的值来获得吸光度结果。对于实施例3中的每种条件和枯草杆菌蛋白酶变体，通过将减去空白的所述变体的吸光度除以相同浓度的相应亲本蛋白酶的吸光度来计算清洁性能指数(pi)。使用所述亲本蛋白酶的标准曲线确定在所述变体的对应浓度下所述亲本蛋白酶的减去空白的吸光度值，所述标准曲线包括在该测试中并使用朗缪尔(langmuir)拟合或希尔(hill)s形拟合(视情况而定)生成。

稳定性测定通用样品设置：测试枯草杆菌蛋白酶在各种应激条件下稳定性(如下表4所示)以确定在升高的温度下孵育后的残余活性。设定升高的温度以便能够在20分钟的孵育时间(在适于辨别变体酶与其亲本酶的差异的范围内)内辨别应激样品与未应激样品相比的残余活性。将稀释的酶样品与适当的洗涤剂混合，并立即测量aapf底物上的蛋白酶活性，以作为无应激值。随后将样品置于pcr板中，密封并使用热循环仪在高温下孵育20分钟，然后测定aapf活性以获得应激值。残余活性百分比是通过取胁迫活性与非胁迫活性的比率并乘以100来计算的。可替代地，通过将0、1、20h孵育时的归一化残余活性与指数衰减函数(at＝a0·0.5^t/t1/2)拟合，确定在100％cns洗涤剂中的灭活半衰期(t¹/2)，其中‘t’是孵育的小时数。

对于所有测定，一式三份测定所有酶样品。分别对每个枯草杆菌蛋白酶主链的每个清洁性能或稳定性测定进行数据集分析。应用蛋白质表达的下限截止值150ppm，并分析cv(变异系数)为20％或更低的数据。

实例3

在洗涤剂存在下具有增加的稳定性的变体枯草杆菌蛋白酶

使用表4中所述的一系列变体酶条件，测量了在各种洗涤剂存在下稳定性的增加，并与参比分子进行了比较。表5显示了一系列bpn’变体的结果，这些变体显示出与亲本酶(bpn’野生型)同等的清洁性能以及稳定性上的显著改善。nd表示该值未确定或该值超出所述测定的置信区间。

表6显示了一系列gg36变体的结果，这些变体显示出与亲本酶(gg36野生型)同等的清洁性能以及稳定性上的显著改善。nd表示该值未确定或该值超出所述测定的置信区间。

表7显示了一系列bgi02446变体的结果，这些变体显示出与亲本酶(bgi02446野生型)同等的清洁性能以及稳定性上的显著改善。nd表示该值未确定或该值超出所述测定的置信区间。

表8显示了一系列aprl变体的结果，这些变体显示出与亲本酶(aprl野生型)同等的清洁性能以及稳定性上的显著改善。nd表示该值未确定或该值超出所述测定的置信区间。

实例4

枯草杆菌蛋白酶的整体有益稳定性突变的鉴定

为了分析多个枯草杆菌蛋白酶主链中各个位置的氨基酸变化对酶稳定性的影响，采用了偏最小二乘(pls)建模(analyticachimicaacta[分析化学学报],1986,185,1-17)程序。pls适用于2个矩阵，x和y，其中前者在所述序列的每个位置容纳氨基酸残基，而后者是稳定性性能变量。为了找到x与y之间的关系，使用了simca程序(版本14.1，mksumetrics，赛多利斯斯泰帝生物技术(sartoriusstedimbiotech))，该程序使用数据集的居中和缩放功能进行配置，从而在0.5或更高的预测水平产生具有高r²和q²值的模型以及每个描述符的评分。r²指示变量的变化的解释程度，而q²指示变量的预测程度。取决于枯草杆菌蛋白酶主链bpn’(seqidno:1)、gg36(seqidno:2)、aprl(地衣芽孢杆菌carlsberg，seqidno:15)和bgi02446(seqidno:10)，使用simca的自动拟合与多达9个交叉验证组，每个模型的r²和q²值范围为0.7-0.97和0.49-0.74。有关r²和q²的定义，请参见eriksson等人,1996,chemometricsandintelligentlaboratorysystem[化学计量学和智能实验室系统],34。通过比较响应的预测值和实际值，在图表中直观地进一步确认了所述拟合。

对如实例1所述产生的每个枯草杆菌蛋白酶文库的成员进行simca分析。对于bpn’变体文库，评价包括的变体涵盖44个位点和57个氨基酸取代，每个取代的频率为5到268个实例。对于aprl变体文库，评价包括的变体涵盖51个位点和96个氨基酸取代，每个取代的频率为5到158个实例。对于gg36变体文库，评价包括的变体涵盖55个位点和86个氨基酸取代，每个取代的频率为5到427个实例。对于bgi02446变体文库，评价包括的变体涵盖56个位点和83个氨基酸取代，每个取代的频率为5到454个实例。

对于每个y变量，所述simca程序都会计算回归系数。这些表示y变量与模型中所有项之间的关系。默认情况下，回归系数与缩放的和居中的x变量相关。所述系数的大小表示当x变量从0变为1时，y变量的变化，以编码单位(当数据按比例缩放为单位方差uv时，一个标准偏差)计，而其他变量保持在它们的平均值。因此，零以上的系数会对每个模型项y有着正向影响。burnham及合著者的论文(burnham,a.j.,macgregor,j.f.,和viveros,r.(2001)interpretationofregressioncoefficientsunderalatentvariableregressionmodel[潜在变量回归模型下回归系数的解释],journalofchemometrics[化学计量学杂志],15:265-284)提供了对潜在变量回归模型下回归系数解释的进一步的见解。

表9提供了当存在于所指示主链的枯草杆菌蛋白酶变体(bpn’、gg36、bgi02446或aprl)中时，对于每个氨基酸取代的贡献而获得的回归系数评分，分析了如实例2中所述进行的稳定性测定的结果。先前收集了本研究中分析的aprl变体数据，并在专利申请pct/us2017/035217中进行了描述。如图5所示，基于多序列比对确定横跨主链的氨基酸位置，其中bpn’序列(seqidno:1)用作相应序列位置的基础。回归系数评分为0.0表示无有害贡献，正系数(大于0.0)表示有效益。表9所示的每个氨基酸取代在这项研究中评估的至少两个枯草杆菌蛋白酶主链中均提供了稳定性效益。nd表示该值未确定或该值超出所述测定的置信区间。

实例5

提供增强的稳定性的枯草杆菌蛋白酶位点的结构特征

四种枯草杆菌蛋白酶的三维结构：使用了wo2016205755中描述的解淀粉芽孢杆菌(bpn’)pdb(蛋白质数据库)条目2st1、地衣芽孢杆菌(aprl)pdb条目1cse、迟缓芽孢杆菌(gg36)pdb条目1jea和吉氏芽孢杆菌进化枝bsp-00801来检查鉴定为整体有益取代的位点。四个枯草杆菌蛋白酶的主链折叠的叠加(未显示)指示，所述结构沿序列的大部分重叠，具有共同的催化三联体，对应于残基asp32、his64、ser221(相对于枯草杆菌蛋白酶bpn’序列编号)和较小的差异，主要是在环和表面暴露区域。

图1-4示出了在四个枯草杆菌蛋白酶结构的每一个上，表9中列出的有益位点的子集的空间位置，显示了根据bpn’序列编号的残基。图1显示解淀粉芽孢杆菌，pdb条目2st1；图2显示地衣芽孢杆菌，pdb条目1cse；图3显示迟缓芽孢杆菌，pdb条目1jea；并且图4显示了wo2016205755中描述的吉氏芽孢杆菌进化枝枯草杆菌蛋白酶bsp-00801的结构。在每个图中，每个枯草杆菌蛋白酶的主链折叠均以浅灰色示意性表示，并且以下十九个位点描绘为黑色线条：3、24、40、76、78、87、118、128、129、130、145、166、182、185、210、211、217、218、259(bpn’编号)。这些位点都暴露在表面，并呈环状定位，在二级结构基序之外。此外，我们观察到位点9和248(bpn’编号)出现在螺旋中，并且暴露在表面(图中未显示)。可以注意到，在位置9和248处的有益取代(列于表9中)引入了负电荷(9e，248d)。

此外，观察到在图1-4中突出显示的位点的子集分布在多个环之间，这些环一起形成延伸表面。特别地，位点76和78(它们是同一环的一部分)位于空间上邻近位点3和40，这两个位点位于不同环上。此外，位点76空间上也邻近位点24，位点24又在空间上靠近位点87(属于不同的环)。位点40停留在空间上与位点210和211邻近的环上。因此，位点3、24、40、76、78、87、210和211(bpn’编号)沿着由这些位点所在的一系列环形成的表面定位。位点128、129和130(bpn’编号)在空间上邻近位点166，因为包含位点128、129和130的环靠近位点166所在的环。位点182和185也彼此空间上邻近定位——这些位点形成了它们所在的环中转弯的部分。虽然位点259位于不同的环上，但它显现与包含位点182和185的环形成同一表面的一部分。在三维结构上观察到彼此在空间上彼此邻近的另一对位点是由位点118和145形成的，它们位于两个相邻的平行α螺旋的底部。这两个位置的有益取代(列于表9中)引入正电荷(118r，145r)。表面暴露的位点3、9、24、40、76、78、87、118、128、129、130、145、166、182、185、210、211、217、218、248和259(bpn’编号)一起共占表9中列出的23个位点中的21个。这些位点的位置在分子表面，并且主要在二级结构基序之外的环区域中，表明表9中列出的氨基酸取代所提供的蛋白质稳定性改善的潜在结构共性。

实例6

同源枯草杆菌蛋白酶的基于结构的序列比对

使用3dm软件程序(kuipers,rk等人(2010)3dm:systematicanalysisofheterogeneoussuperfamilydatatodiscoverproteinfunctionalities[3dm：异源超家族数据的系统分析以发现蛋白质功能]proteins[蛋白质]78(9):2101-13)对bpn’(pdb条目代码：2st1)、aprl(pdb条目代码：1cse)、gg36(pdb条目代码：1jea)和吉氏芽孢杆菌进化枝枯草杆菌蛋白酶bsp-00801的三维结构(wo2016/205755中描述)进行结构比对。为了创建基于结构的比对，将所述四个结构插入3dm数据库，并通过将所述结构叠加并缺失结构可变区来创建三维多重序列比对，从而确定结构等效位置(称为核心位置)的共同核心。吉氏芽孢杆菌变体枯草杆菌蛋白酶bsp-00801与枯草杆菌蛋白酶bgi02446野生型具有96％的氨基酸序列同一性，并且从bsp-00801与bpn’、aprl和gg36序列的比对推断出bgi02446与bpn’、aprl和gg36的结构比对。图5提供了bpn’、aprl、gg36和bgi02446的结构比对，其中在所有四个分子中结构上均同源的残基以大写字母显示。除bpn’以外的蛋白质的所述3dm程序无法分配明确比对的蛋白质区域显示为缺口(-)符号(对于bpn’，那些未比对的残基以小写字母显示)。图5中用星号(*)表示鉴定出多于一个枯草杆菌蛋白酶主链的稳定化取代的位点(如表9所列)。

实例7

在洗涤剂中具有改善的稳定性的另外的枯草杆菌蛋白酶变体

在以下每个野生型枯草杆菌蛋白酶主链上产生了一系列变体，所述变体在目的位置上含有三个或四个氨基酸取代以增加酶稳定性，如实例4(表9)所述：bpn’(seqidno:1)、gg36(seqidno:2)、aprl(地衣芽孢杆菌carlsberg(seqidno:15)和bgi02446(seqidno:10)，使用与实例1中所述的方法类似的方法。为了进行蛋白表达实验，将转化的细胞在96孔mtp中的培养基(基于mop缓冲液的富集的半限定培养基，尿素为主要氮源，葡萄糖为主要碳源，补充1％大豆胨用于稳健细胞生长，含有抗生素选择)中，在振荡孵育器中在32℃、300rpm、80％湿度下生长3天。离心和过滤后，将含有目的蛋白酶的澄清培养物上清液用于测定。如实例2中大体所述并在下表10中所指定，测试了这些变体样品在10％洗涤剂溶液中的稳定性。通过将所述变体的残余活性除以该变体的亲本的残余活性，获得每种测定条件下每种变体的稳定性性能指数(pi)。

还使用如实例2中所述的宝莹非生物洗涤剂在bmi显微镜中测试了变体的清洁性能。在本实例中，对于每种条件和枯草杆菌蛋白酶变体，通过将所述变体的减去空白的吸光度除以相同浓度的相应亲本蛋白酶的吸光度来计算清洁性能指数(pi)。使用所述亲本蛋白酶的标准曲线确定在所述变体的对应浓度下所述亲本蛋白酶的减去空白的吸光度值，所述标准曲线包括在该测试中并使用朗缪尔(langmuir)拟合或希尔(hill)s形拟合(视情况而定)生成。

表11和表12显示了上述枯草杆菌蛋白酶主链中由3或4个取代组成的变体的评价结果。表11和12中的样品id如下：aprl枯草杆菌蛋白酶的变体带有blcarl后缀，bgi02446的变体带有bg46后缀，gg36的变体带有gg36后缀，而bpn’的变体带有bpn后缀。这些表中报告的所有变体均显示出显著改善，评价的三种洗涤剂中至少一种的pi≥1.1，并且与其各自的野生型亲本枯草杆菌蛋白酶相比，保留了至少50％的清洁性能。表11和表12中的pi值等于或大于4以≥4表示。在这些主链和洗涤剂配方中均观察到了多次取代的效益。在一些情况下，同一枯草杆菌蛋白酶变体出现在表11中的多于一个实例中，以突出显示多个主链共享的有益特征。nd表示在该条件下对特定变体而言数据不确定。根据bpn编号(seqidno:1)中的相应位置列出所有取代。在这些表中，术语特征对应于引入取代的目的氨基酸位置，或者在一些情况下，所述目的氨基酸是天然存在的。

实例8

另外的枯草杆菌蛋白酶主链中的取代

制备含有一些上述特征的另外的亲本蛋白酶中代表性的一组枯草杆菌蛋白酶变体，并按如前所述对其进行测试。除了表11和12中列出的变体之外，在以下每个亲本枯草杆菌蛋白酶主链上产生了一系列变体，所述变体在目的位置上含有三个或四个氨基酸取代基以增加酶稳定性，如实例4(表9)所述：apre(例如wp_003233171)(seqidno:18)；wp_082194748(以前为wp_008359041)(seqidno:19)；chemgen_164a(美国专利5,275,945中的seqidno:2)(seqidno:20)；dsm14391(wo2018118917中的seqidno:13)(seqidno:21)；bspz00056(wo2016069544中的seqidno:9)(seqidno:22)；bba02069(wo2016061438中的seqidno:3)(seqidno:23)；bad02409(wo201069557中的seqidno:13)(seqidno:24)；bspak01305(wo2016069569中的seqidno:6)(seqidno:25)；bspai02518(wo2015/089441中的seqidno:3)(seqidno:26)；以及bpan01744(wo2016069563中的seqidno:3)(seqidno:27)，使用与实例1中描述的方法类似的方法。

如实例7中大体所述，测试这些变体样品在10％洗涤剂溶液中的稳定性，其中选择应激温度，目标是使得参比或亲本枯草杆菌蛋白酶具有约30％的残余活性。下表13中提供的枯草杆菌蛋白酶变体在10％宝莹非生物洗涤剂溶液中的稳定性性能指数均等于或大于1.1。表13上的样品id如下：aprl枯草杆菌蛋白酶的变体带有blcarl后缀，bgi02446的变体带有bg46后缀，gg36的变体带有gg36后缀，bpn’的变体带有bpn后缀，apre的变体带有apre后缀，wp_082194748的变体带有wp082194748后缀，chemgen_164a的变体带有chemgen后缀，dsm14391的变体带有dsm14391后缀，bspz00056的变体带有bspz56后缀，bba02069的变体带有bba02069后缀，bad02409的变体带有bad02409的后缀，bspak01305的变体带有bspak01305后缀，bspai02518的变体带有bspai2518后缀，bpan01744的变体带有bpan01744后缀。根据bpn编号(seqidno:1)中的相应位置列出所有取代，其中根据可用的结构和同源性模型对成熟序列进行比对。在表13中，术语“特征”对应于引入取代的目的氨基酸位置，或者在一些情况下，所述目的氨基酸是天然存在的。

表14根据基于可用结构和同源模型的多序列比对，并使用geneoous软件中的muscle程序计算，提供了所述另外的枯草杆菌蛋白酶亲本主链与bpn’、aprl、gg36和bgi02446枯草杆菌蛋白酶主链相比的百分比同一性。

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