经基因修饰以消除T细胞受体和β2-微球蛋白表达的永生化CAR-T细胞的制作方法
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本发明涉及表达嵌合抗原受体(car)的工程化永生化t细胞系；其制备方法；及其作为药物、特别是用于免疫疗法的用途。本发明的工程化永生化cart细胞的特征在于例如通过使用内切核酸酶来抑制内源性t细胞受体(tcr)和β2-微球蛋白(b2m)的表达，所述内切核酸酶能够选择性地使tcr和b2m基因失活，以便使得永生化cart细胞是非同种异体反应性的。工程化永生化cart细胞系特别适用于同种异体移植，尤其是因为它既降低了被宿主的免疫系统排斥的风险，也降低了发生移植物抗宿主病的风险。本发明为使用t细胞来治疗癌症、感染和自身免疫疾病的标准且负担得起的过继性免疫疗法策略开辟了道路。
背景技术：
过继性免疫疗法涉及离体产生的自体抗原特异性t细胞的转移，是治疗病毒感染和癌症的一种有前途的策略。可通过对抗原特异性t细胞的扩增或通过基因工程将t细胞重定向来产生用于过继性免疫疗法的t细胞(park,rosenberg等人2011)。
通过转基因t细胞受体或嵌合抗原受体(car)的遗传转移已成功产生了在t细胞中的新型特异性(jena,dotti等人2010)。car是由与单个融合分子中的一个或多个信号结构域相关的靶向部分组成的合成受体。一般来讲，car的结合部分由例如单链抗体(scfv)的抗原结合结构域组成，所述抗原结合结构域包含通过柔性接头连接的单克隆抗体的轻链片段和可变片段。第一代car的信号结构域源于cd3ζ或fc受体γ链的胞质区。已证明第一代car成功地重定向t细胞的细胞毒性。然而，它们未能在体内提供长效的扩增和抗肿瘤活性。已将来自共同刺激分子(包括cd28、ox-40(cd134)和4-1bb(cd137))的信号结构域单独地(第二代)或组合地(第三代)添加以增强存活并增加car修饰的t细胞的增殖。car已成功地允许t细胞针对在来自各种恶性肿瘤(包括淋巴瘤和实体瘤)的肿瘤细胞的表面处表达的抗原进行重定向(jena,dotti等人2010)。
当前使用过继性免疫疗法治疗患者的方案基于自体细胞转移。在这种方法中，从患者中回收t淋巴细胞，将其进行基因修饰或离体选择、体外培养以便在必要时扩增细胞数量，并且最后输注到患者体内。除了淋巴细胞输注外，可通过支持t细胞移植或其参与免疫应答的其他方式来操纵宿主，所述其他方式例如是预处理(使用放射或化学疗法)和施用淋巴细胞生长因子(诸如il-2)。每名患者接受使用患者自己的淋巴细胞单独构成的治疗(即自体疗法)。自体疗法在实际应用中面临巨大的技术和后勤障碍，其产生需要昂贵的专用设施和专家人员，它们必须在患者的诊断后短时间内产生，并且在许多情况下，患者的预治疗已导致免疫功能降低，使得患者的淋巴细胞可能功能不佳并且以很低的数量存在。因为这些障碍，每名患者的自体细胞制剂实际上是一种新产品，导致功效和安全性发生巨大变化。理想的是，人们希望使用一种标准化疗法，其中可将同种异体治疗细胞预先制造出、进行详细表征并且可用于立即向患者施用。所谓同种异体是指细胞获自属于相同物种但在遗传上相异的个体。然而，目前使用同种异体细胞具有许多缺点。在具有免疫能力的宿主中，同种异体细胞被迅速排斥，这一过程被称为宿主抗移植物排斥(hostversusgraftrejection，hvg)，并且这大幅限制了转移细胞的功效。在免疫失能的宿主中，同种异体细胞能够移植，但是它们的内源性t细胞受体(tcr)特异性可能将宿主组织识别为异物，从而导致移植物抗宿主病(gvhd)，这可能导致严重的组织损伤和死亡。
因此，本领域仍然需要开发规避时间、制造费用以及对患者特异性t细胞产品排斥的风险的方法和试剂。
技术实现要素：
本发明提供了适用于免疫疗法目的的工程化永生化t细胞系。本发明更具体地提供了不表达对免疫识别和组织相容性重要的某些效应分子的t细胞系。
在一个总的方面，本发明涉及表达car的工程化永生化t细胞系，所述car包含胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，所述胞外结构域包含抗原结合区。本发明的工程化永生化t细胞系不表达至少一种内源性t细胞受体(tcr)，并且不表达β2-微球蛋白(b2m)。
在一个实施方案中，通过基因敲除来消除所述至少一种内源性tcr和b2m的表达。在一个具体的实施方案中，本发明的工程化永生化t细胞系不表达tcr-α。在另一个实施方案中，本发明的工程化永生化t细胞系不表达kir3dl2。
在另一个实施方案中，本发明的工程化永生化t细胞系不表达b2m。
在另一个实施方案中，本发明的工程化永生化t细胞系包含car，所述car包含与肿瘤相关抗原特异性地结合的胞外结构域。在一个具体的实施方案中，工程化永生化t细胞系可包含car，所述car包含与bcma特异性地结合的胞外结构域。
在另一个实施方案中，工程化永生化t细胞系可包含car，所述car包含与iii型纤连蛋白(fn3)结构域特异性地结合的胞外结构域。
在另一个总的方面，本发明涉及表达car的工程化tall-104细胞系，所述car包含胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，所述胞外结构域包含抗原结合区。本发明的工程化tall-104细胞系不表达至少一种内源性t细胞受体(tcr)，并且不表达β2-微球蛋白(b2m)。
在一个实施方案中，通过基因敲除来消除所述至少一种内源性tcr和b2m的表达。在一个具体的实施方案中，本发明的工程化tall-104细胞系不表达tcr-α。在另一个实施方案中，本发明的工程化tall-104细胞系不表达kir3dl2。
在另一个实施方案中，本发明的工程化tall-104系不表达b2m。
在另一个实施方案中，本发明的工程化tall-104细胞系包含car，所述car包含与肿瘤相关抗原特异性地结合的胞外结构域。在一个具体的实施方案中，工程化tall-104系可包含car，所述car包含与bcma特异性地结合的胞外结构域。
在另一个实施方案中，工程化tall-104细胞系可包含car，所述car包含与iii型纤连蛋白(fn3)结构域特异性地结合的胞外结构域。
在另一个总的方面，本发明涉及表达car的工程化tall-104细胞系，所述car包含：
(a)信号肽，所述信号肽具有seqidno:3的氨基酸序列；
(b)胞外结构域，所述胞外结构域包含具有seqidno:8-44中的任一者的氨基酸序列的fn3结构域；
(c)铰链区，所述铰链区具有seqidno:4的氨基酸序列；
(d)跨膜结构域，所述跨膜结构域具有seqidno:5的氨基酸序列；以及
(e)胞内信号结构域，所述胞内信号结构域包含具有seqidno:6的氨基酸序列的共同刺激结构域以及具有seqidno:7的氨基酸序列的初级信号结构域；
其中所述细胞系不表达trca、kir3dl2和b2m。
在另一个总的方面，本发明涉及表达car的工程化tall-104细胞系，所述car包含：
(a)胞外结构域，所述胞外结构域包含具有seqidno:54和55中的任一者的氨基酸序列的scfv；
(b)铰链区，所述铰链区具有seqidno:4的氨基酸序列；
(c)跨膜结构域，所述跨膜结构域具有seqidno:5的氨基酸序列；以及
(d)胞内信号结构域，所述胞内信号结构域包含具有seqidno:6的氨基酸序列的共同刺激结构域以及具有seqidno:7的氨基酸序列的初级信号结构域；
其中所述细胞系不表达trca、kir3dl2和b2m。
在另一个总的方面，本发明还涉及产生表达car的工程化永生化t细胞系的体外方法，所述方法包括以下步骤：
a.提供永生化t细胞系；
b.抑制至少一种内源性t细胞受体和b2m的表达；以及
c.将编码car的多核苷酸引入所述永生化t细胞中。
在一个实施方案中，步骤b发生在步骤c之前。
在另一个实施方案中，步骤c发生在步骤b之前。
在另一个实施方案中，步骤b通过使用内切核酸酶来执行。在一个具体的实施方案中，rna引导的内切核酸酶是tal核酸酶、大范围核酸酶、锌指核酸酶(zfn)或cas9。
在另一个实施方案中，通过电穿孔将编码car的多核苷酸引入永生化t细胞中。
在另一个实施方案中，经由基于病毒的基因转移系统将编码car的多核苷酸引入永生化t细胞中。在具体的实施方案中，基于病毒的基因转移系统包含逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或慢病毒载体。
在另一个总的方面，本发明涉及包含本发明的工程化永生化t细胞的药物组合物。
在另一个总的方面，本发明涉及治疗对其有需要的受治疗者中的癌症的方法，所述方法包括向所述受治疗者施用治疗有效量的本发明的药物组合物。在一个优选的实施方案中，癌症是多发性骨髓瘤。
在另一个总的方面，本发明涉及制备药物组合物的方法，所述方法包括将本发明的工程化永生化t细胞系与药学上可接受的载体组合以获得所述药物组合物。
根据以下公开内容，包括本发明的详细描述和其优选的实施方案以及所附权利要求书，本发明的其他方面、特征和优点将显而易见。
附图说明
图1a和1b：tall-104细胞中i类hla(a)和tcr(b)的crispr-cas9介导的基因编辑的流式细胞术分析。根据制造商的说明书，将用β2微糖蛋白(b2m)和tcra核糖核蛋白(rnp)复合物电穿孔的tall-104细胞重新悬浮在facs染色缓冲液中，并且添加抗体。将细胞在黑暗中于4℃下孵育45分钟，并且在bdfacscalibur流式细胞仪上收集数据。
图2a和2b：b2m/hla-1(a)和tcr(b)敲除的tall-104细胞群的纯化。将先前用b2m或tcra核糖核蛋白(rnp)复合物电穿孔的tall-104细胞用pe抗b2m(a)或pe抗cd3抗体进行标记。将抗体标记的细胞与抗pe微珠一起孵育，并且通过附接到quadromacs分离器的ls柱。将收集在洗脱液中的b2m和cd3-ko细胞亚群离心，并且重新悬浮在完全tall-104细胞培养基中并于37℃下培养。
图3a和3b：通过流式细胞术在tall-104细胞上靶向bcma或fn3结构域的cars的表达和检测。使用bdbiosciencesfacscalibur，对tall-104bcma-car细胞(a)和tall-104抗fn3结构域car细胞(b)测量与结合模拟物(无mrna)电穿孔的对照细胞(灰色)相比多克隆抗fn3结构域抗体和缀合的fn3结构域分别与细胞的结合。使用flowjo版本10分析数据，以通过散点来门控细胞群并通过alexa647或apc强度来门控阳性结合。
图4a-4c：表达tall-104car的细胞对bcma靶细胞的杀伤。在与bcma特异性或非靶向对照(nt)fn3结构域共同孵育之后的20小时(a)和40小时(b)评估tall-104抗fn3结构域car细胞对bcma靶细胞的杀伤。在共同孵育细胞之后20小时，评估tall-104bcma-car细胞(c)对bcma靶细胞的杀伤。
图5：用编码人tert基因和egfp的慢病毒转导tall-104细胞。针对egfp表达分选细胞，并且然后允许其在tall-104培养条件下扩增。显示了在野生型非转导细胞在培养中停止增殖之后的生长概况。
图6：用慢病毒p102转导htert阳性tall-104细胞，并使其在不存在外源性il-2的情况下维持。
图7：将稳定表达胞内il-2(p102)或wttall-104细胞的tall-104细胞用编码f11bcma靶向car序列的mrna电穿孔，并且以不同的e:t比与mm1s细胞一起孵育。相对于e:t比绘制了死的靶mm1s细胞的百分比。
具体实施方式
定义
背景以及说明书全篇中引用或描述了各种出版物、文章和专利；这些参考文献中的每一者全文均以引用方式并入本文。本说明书中包括的对文件、行为、材料、设备、文章等的讨论旨在为本发明提供上下文。此类讨论并不是承认这些事项中的任一事项或全部事项均相对于所公开或受权利要求书保护的任何发明形成现有技术的一部分。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。否则，本文所用的某些术语具有本说明书中所述的含义。本文引用的所有专利、公布的专利申请和出版物均以引用方式并入本文，如同在本文中进行了充分阐述。应该注意的是，除非上下文清楚地指明，否则本文和所附权利要求中所用的单数形式“一个/一种”和“所述/该”包括复数引用物。
除非另行指出，否则任何数值，诸如本文所述的浓度或浓度范围被理解为在所有情况下用术语“约”修饰。因此，数值通常包括所述值±10％。例如，1mg/ml的浓度包括0.9mg/ml至1.1mg/ml。同样，1％至10％(w/v)的浓度范围包括0.9％(w/v)至11％(w/v)。除非上下文另有明确指示，否则如本文所用，使用的数值范围明确地包括所有可能的子范围、该范围之内的所有单个数值，包括此类范围之内的整数和该范围之内的分数。
存在三种一般类型的细胞培养物：(1)原代—源于人或动物组织和器官(多能干细胞和组织特异性祖细胞包括在这种类别中)；(2)永生化(或连续的)—源于被工程改造以在培养物中无限分裂和增殖的原代细胞(这些细胞保留了正常原代细胞的许多特征，例如在粘附的成纤维细胞的情况下对生长的接触抑制)；以及(3)转化的—源于癌组织或在体外被诱导癌症的病毒致癌性地转化(这些细胞与正常原代细胞不相似并且行为像肿瘤细胞)。转化的细胞表现出失去接触抑制、不依赖生长因子或对可溶性生长因子和血清的需求减少、以及锚定(ecm)非依赖性生长(flint等人,2004)。对于大多数生物医学和药物研究与开发应用(例如，药理学候选药物的体外功效和毒性测试)，通常期望使用严密概括正常生理状况的细胞背景。虽然原代培养物与正常组织微环境极为相似，但是从人或动物组织中获得这些细胞和复杂的监管要求(例如，机构动物护理和使用委员会(institutionalanimalcare&usagecommittees)；人类受治疗者研究机构审查委员会(humansubjectsresearch-institutionalreviewboards))方面却存在重大困难，并且与在体外维持和生长原代细胞相关的一般困难(生长因子和基质依赖性)使得难以将这些细胞用于大多数应用。原代细胞在它们经历危机和衰老之前具有有限的加倍能力(通常为40-60个复制周期)(raweinberg，2007)。使用原代培养物还可能引入重大的再现性错误，因为必须连续地再分离这些细胞以进行多次实验。
因此，如本文所用，关于源于原代细胞的细胞系的细胞特性而言，术语“永生化”或“连续的”是指被工程改造以在培养物中无限地分裂和增殖的t淋巴细胞(或t细胞)。这些细胞保留了正常原代细胞的许多特征，例如在贴壁细胞的情况下生长的接触抑制和il-2依赖性。
如本文所用，术语“t细胞”是指在胸腺中成熟的一种淋巴细胞类型。t细胞在细胞介导的免疫中起重要作用，并且通过在细胞表面上存在t细胞受体而与其他淋巴细胞(诸如b细胞)区分开。可从可商购获得的来源分离或获得t细胞。“t细胞”包括表达cd3的免疫细胞的所有类型，包括t辅助细胞(cd4+细胞)、细胞毒性t细胞(cd8+细胞)、自然杀伤t细胞、t调节性细胞(treg)和γ-δt细胞。“细胞毒性细胞”包括cd8+t细胞、自然杀伤(nk)细胞和嗜中性粒细胞，所述细胞能够介导细胞毒性反应。可商购获得的t细胞系的非限制性示例包括细胞系bcl2(aaa)jurkat(
如本文所用，术语“嵌合抗原受体(car)”可被称为例如人工t细胞受体、嵌合t细胞受体或嵌合免疫受体，并且涵盖将人工特异性移植到特定的免疫效应细胞上的工程化受体。可使用car来将单克隆抗体的特异性赋予到t细胞上，从而允许所产生的大量特异性t细胞例如用于过继细胞疗法中。在具体的实施方案中，例如，car将细胞的特异性引导至肿瘤相关抗原。在一些实施方案中，car包含胞内激活结构域、跨膜结构域和包含肿瘤相关抗原结合区的胞外结构域。在特定方面，car包含源于单克隆抗体的单链可变片段(scfv)与cd3-ζ跨膜和内结构域(endodomain)融合的融合物。在其他方面，car包含iii型纤连蛋白结构域与cd3-ζ跨膜和内结构域融合的融合物。其他car设计的特异性可能源于受体的配体(例如肽)或dectin。在特定实施方案中，人们可通过使用对b谱系分子bcma具有特异性的嵌合免疫受体重定向t细胞的特异性来靶向恶性b细胞。在某些情况下，car包含用于额外的共同刺激信号传导的结构域，例如cd3-ζ、fcr、cd27、cd28、cd137、dap10和/或ox40。在一些情况下，分子可与car共同表达。这些包括共同刺激分子，用于成像(例如，用于正电子发射断层摄影)的报告基因，在添加前药、归巢受体、细胞因子和细胞因子受体后条件性地消融t细胞的基因产物。
如本文所用，术语“胞外结构域”是指car的位于细胞膜外部并能够结合抗原、靶标或配体的部分。
如本文所用，术语“跨膜结构域”是指跨越细胞膜延伸并使car锚定于细胞膜的car的一部分。
如本文所用，术语“胞内信号结构域”是指car的位于细胞膜内部并能够转导效应信号的部分。
如本文所用，术语“表达”是指基因产物的生物合成。该术语涵盖基因到rna的转录。该术语还涵盖rna到一个或多个多肽的翻译，并且还涵盖所有天然存在的转录后和翻译后修饰。可将所表达的t细胞受体和β-2微球蛋白锚定在t细胞膜上。
如本文所用，术语“t细胞受体(tcr)”是指t细胞上由阿尔法(a)和贝塔(β)链的异二聚体构成的蛋白质受体，但是在一些细胞中tcr由伽玛和德尔塔(γ/δ)链组成。在本发明的实施方案中，可在包含tcr的任何细胞上修饰tcr，所述细胞包括例如辅助t细胞、细胞毒性t细胞、记忆t细胞、调节性t细胞、自然杀伤t细胞和γδt细胞。
“β-2微球蛋白”，也称为“b2m”，是i类mhc分子的轻链，并且因此是主要组织相容性复合物的整体部分。在人类中，b2m由位于染色体15上的与位于染色体6上作为基因簇定位的其他mhc基因相对的b2m基因编码。人蛋白质由119个氨基酸构成，并且具有11.8千道尔顿的分子量。β-2微球蛋白缺陷的小鼠模型表明，b2m是i类mhc的细胞表面表达和肽结合沟槽的稳定性所必需的。其进一步表明，由于β-2微球蛋白基因中的靶向突变，来自正常细胞表面mhci表达缺陷的小鼠的造血移植物被正常小鼠中的nk1.1+细胞所排斥，这表明mhci分子的表达缺陷使得骨髓细胞易于被宿主免疫系统排斥(bix等人1991)。
如本文所用，术语“bcma”是指b细胞成熟抗原蛋白质(也称为tnfrsf17、bcm或cd269)，即肿瘤坏死因子受体(tnfr)家族成员，表达于浆细胞和成熟b细胞上。例如，人bcma是由994个核苷酸长的初级mrna转录物(nm_001192.2)编码的184个氨基酸长的蛋白质。人bcma的氨基酸序列用genbank登录号np_001183.2表示。如本文所用，术语“bcma”包括包含全长野生型bcma的突变，例如点突变、片段、插入、缺失和剪接变体的蛋白质。术语“bcma”还涵盖bcma氨基酸序列的翻译后修饰。翻译后修饰包括但不限于n-和o-连接型糖基化。
如本文所用，术语“iii型纤连蛋白结构域”或“fn3结构域”指在蛋白质中频繁出现的结构域，所述蛋白质包括纤连蛋白、腱生蛋白、胞内细胞骨架蛋白、细胞因子受体和原核酶(bork和doolittle,pnasusa89:8990-8994,1992；meinke等人,jbacteriol175:1910-1918,1993；watanabe等人,jbiolchem265:15659-15665,1990)，或它们的衍生物。示例性fn3结构域是存在于人腱生蛋白c中的15个不同的fn3结构域、存在于人纤连蛋白(fn)中的15个不同的fn3结构域以及非天然合成的fn3结构域(例如us8278419中)。单个的fn3结构域用结构域编号和蛋白质名称来表示，例如腱生蛋白的第三fn3结构域(tn3)或纤连蛋白的第十fn3结构域(fn10)。
如本文所用，术语“载体”是指任何赋形剂、稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂、油、类脂、含脂质囊泡、微球体、脂质体包囊、或本领域公知的用于药物制剂的其他材料。应当理解，载体、赋形剂或稀释剂的特征将取决于具体应用的施用途径。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指不干扰根据本发明的组合物的效果或根据本发明的组合物的生物活性的非毒性材料。
如本文所用，术语“受治疗者”是指动物，并且优选地指哺乳动物。根据特定实施方案，受治疗者是哺乳动物，包括非灵长类(例如骆驼、驴、斑马、牛、猪、马、山羊、绵羊、猫、犬、大鼠、兔子、豚鼠或小鼠)或灵长类(例如猴、黑猩猩或人)。在特定实施方案中，受治疗者是人。
如本文所用，术语“癌症”意指以本领域中已知的不受调控的细胞生长或复制为特征的任何疾病、病症、性状、基因型或表型。“癌细胞”是在不受控制的生长下异常地分裂和繁殖的细胞。在称为癌细胞转移的过程中，此细胞可脱离其起源部位(例如肿瘤)并且传播到身体的其他部分并建立另一个部位(例如另一个肿瘤)。“肿瘤”是由不受控制和进行性的过度细胞分裂引起的异常组织团，并且也被称为赘生物。肿瘤可以是良性的(非癌性的)或恶性的。本文所述的组合物和方法可用于治疗癌症和肿瘤细胞，即恶性和良性肿瘤二者。因此，在本文所述的方法和组合物的各种实施方案中，癌症可包括但不限于血红素癌、淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、结直肠癌、食管癌、胃癌、膀胱癌、胰腺癌、肾癌、宫颈癌、肝癌、卵巢癌和睾丸癌。
如本文所用，术语“治疗有效量”是指在受治疗者中引起期望的生物学或药物学应答的活性成分或组分的量。治疗有效量可相对于指定目的根据经验以常规方式进行确定。
如本文所用，术语“治疗”和“处理”均旨在意指与癌症或自体免疫性疾病有关的至少一种可测量物理参数的改善或逆转，其不一定是受治疗者中可识别的，但能够在受治疗者中识别。术语“处理”和“治疗”也可指导致消退，预防发展，或至少延缓疾病、障碍或病症的发展。在特定实施方案中，“处理”和“治疗”是指减轻、预防发展或发作，或缩短与疾病、障碍或病症(诸如肿瘤或更优选癌症)相关的一种或多种症状的持续时间。在特定实施方案中，“处理”和“治疗”是指预防疾病、障碍或病症的复发。在特定实施方案中，“处理”和“治疗”是指患有疾病、障碍或病症的受治疗者的存活提高。在特定实施方案中，“处理”和“治疗”是指受治疗者中疾病、障碍或病症的消除。
本发明的一般实施方案
通过将胞外抗原结合结构域与跨膜结构域和胞内信号结构域(内结构域)连接，将嵌合抗原受体(car)设计用于过继性免疫疗法。其是通过过继转移表达嵌合抗原受体的t细胞以识别肿瘤细胞上存在的特异性抗原并激活t细胞以特异性地裂解这些肿瘤细胞的一种有用的根除肿瘤细胞的抗肿瘤方法。这种car策略的关键方面是选择靶表位，所述靶表位在肿瘤上特异性地或选择性地表达、存在于所有肿瘤细胞上并且是不易于从细胞表面脱落或调节的膜表位。然而，理想的是，car-t细胞将能够被用作适用于任何哺乳动物(诸如人)接受者的通用试剂或药物。为了以这样的方式使用细胞，人们必须在不损害car依赖性效应功能的情况下防止其在移植物抗宿主反应中被排斥。
在本发明的实施方案中，提供了从表达嵌合抗原受体(car)的t细胞(car-t细胞)的t细胞受体(tcr)α破坏以建立基于“通用”t细胞的免疫疗法。可通过car将t细胞特异性重定向至所需的抗原。然而，从患者离体产生car-t细胞受到时间和费用的限制。此外，由于多轮淋巴毒性(淋巴清除)化学疗法，源于患者的t细胞有时在功能上有缺陷。为此，本发明的实施方案涉及由可用作“现成试剂”的永生化t细胞产生的car-t细胞。换句话讲，可预先制备工程化永生化t细胞，并且然后将其输注到多名接受者中。这将有利于通用t细胞的“集中”制造以及随后将t细胞预先定位在需要输注的区域设施中，使得进行以功效为动力的临床试验成为可能，并且有利于其中可将通用t细胞与其他生物制剂和治疗剂一起施用的组合疗法。为了实现这点，人们可消除导致不需要的同种异体免疫反应的内源性tcr和b2m表达。此类步骤可通过任何合适的方式发生，所述任何合适的方式包括通过引入cas9/crispr复合物，例如靶向tcrα恒定区或β恒定区。本发明的实施方案是独特的，因为它们组合(i)通过引入car重定向永生化t细胞的特异性和(ii)消除内源性tcr和b2m的表达以产生所需的t细胞产物。在某些实施方案中，通过电穿孔以稳定地表达car和体外转录mrna的所需瞬时转染实现car的引入和tcr/b2m的消除。在本发明的实施方案中，将输注的特定工程化永生化car-t细胞预先制备并解冻以按需作为现成试剂输注。
发明人证明，靶向t细胞中的内源性tcr或b2m的cas9/crispr复合物导致所需的tcr表达损失。可以预知，这些经修饰的t细胞在混合淋巴细胞反应测定中不响应于tcr刺激，但是保持了它们对示例性抗原bcma的car介导的重定向特异性。
在本发明的某些实施方案中，离体将永生化t细胞基因修饰以表达嵌合抗原受体(car)以将特异性重定向至肿瘤相关抗原(taa)，从而赋予体内抗肿瘤活性。表达bcma特异性car的t细胞在与mhc无关的多名接受者中识别b细胞恶性肿瘤，因为特异性结构域是从抗bcmafn3结构域克隆而来。本发明涵盖迈向以下的一个重要步骤：通过产生可施用至多名接受者的“通用”工程化永生化taa特异性t细胞来消除产生患者特异性t细胞的需要。这是通过基因编辑特定的cart细胞以消除内源性tcr和b2m的表达来实现的，以防止移植物抗宿主反应而不损害car依赖性效应功能。通过用设计者cas9/crispr复合物永久缺失tcr和b2m、随后稳定地引入感兴趣的特定car来产生经基因修饰的t细胞。发明人示出，这些工程化t细胞显示出已重定向对bcma的特异性而不响应于tcr刺激的预期属性。可将这些工程化永生化car-t细胞用作现成疗法用于许多种类型癌症的研究性治疗。
具体地，为了测试使用工程化永生化car-t细胞的可行性，发明人修改了用于产生car-t细胞以包括编辑永生化t细胞基因组以不可逆地消除tcr和b2m的表达的培养过程。为了敲除tcr和b2m基因座，发明人开发了cas9/crispr复合物，所述cas9/crispr复合物由与来自cas9内切核酸酶的dna切割结构域融合的dna结合结构域构成，靶向内源性tcr和b2m恒定区中的基因组序列，cas9/crispr通过催化基因组中dna双链断裂(dsb)的形成介导基因组编辑。先前已表明，将dsb靶向基因编码序列内的预定位点导致经由通过非同源末端连接(nhej)的修复而引起功能性靶基因表达的永久丧失，所述非同源末端连接是导致在切割位点处的核苷酸的插入或缺失的一种容易出错的细胞修复途径(santiago等人,2008；perez等人,2008)。
嵌合抗原受体
如本文所用，术语“抗原”是能够被抗体或t细胞受体结合的分子。此外，抗原能够诱导体液免疫应答和/或细胞免疫应答，导致产生b和/或t淋巴细胞。
本发明涉及核酸，包括编码抗原特异性嵌合抗原受体(car)(包括已被人源化以降低免疫原性的car(hcar))的核酸；包含胞内信号结构域、跨膜结构域和包含一个或多个信号基序的胞外结构域的多肽。在某些实施方案中，car可识别由一种或多种抗原之间的共享空间构成的表位。在某些实施方案中，结合区可包含单克隆抗体的互补决定区、单克隆抗体的可变区、和/或其抗原结合片段。互补决定区(cdr)是在抗原受体(例如免疫球蛋白和t细胞受体)蛋白质的可变结构域中发现的短氨基酸序列，所述短氨基酸序列补充抗原并因此向受体提供其针对所述特定抗原的特异性。抗原受体的每条多肽链含有三个cdr(cdr1、cdr2和cdr3)。由于抗原受体通常由两条多肽链构成，因此每个抗原受体存在可与抗原接触的六个cdr—每条重链和轻链都含有三个cdr。由于在cdr中发现了与免疫球蛋白和t细胞受体相关的大多数序列变异，因此有时将这些区域被称为高变结构域。在这些之中，cdr3显示出最大的可变性，因为它由vj(在重链和tcrαβ链的情况下为vdj)区的重组编码。预期人car核酸是增强针对人患者的细胞免疫疗法的人基因。
在其他实施方案中，所述特异性源于由来自人腱生蛋白-c的十五个fn3结构域的共有序列设计的非天然存在的fn3结构域，称为tencon(jacobs等人,proteinengineering,design,andselection,25:107-117,2012；us2010/0216708)。tencon的晶体结构示出六个表面暴露环，这些环连接七个β-链作为fn3结构域的特性，所述β-链称为a、b、c、d、e、f和g，并且所述环称为ab、bc、cd、de、ef和fg环(bork和doolittle,pnasusa89:8990-8992,1992；us6673901)。这些环或每个环中所选择的残基可随机化，以便构建可用于选择出结合感兴趣的抗原的新型分子的fn3结构域文库。根据tencon序列(seqidno:1)设计的文库可以因此在一个或多个环或链中具有随机化序列。例如，基于tencon的文库可在ab环、bc环、cd环、de、ef环和fg环中的一者或多者具有随机化序列。例如，tenconbc环的长度为7个氨基酸，因此1、2、3、4、5、6或7个氨基酸可在bc环处多样化的基于tencon序列的文库中随机化。tenconcd环的长度为6个氨基酸，因此1、2、3、4、5或6个氨基酸可在cd环处多样化的基于tencon序列的文库中随机化。tenconef环的长度为5个氨基酸，因此1、2、3、4或5个氨基酸可在ef环处多样化的基于tencon序列的文库中随机化。tenconfg环的长度为7个氨基酸，因此1、2、3、4、5、6或7个氨基酸可在fg环处多样化的基于tencon序列的文库中随机化。tencon文库中的环处的进一步多样性可通过环处残基的插入和/或缺失来实现。例如，bc、cd、ef和/或fg环可延伸1-22个氨基酸，或减少1-3个氨基酸。tencon中的fg环的长度为7个氨基酸，而抗体重链中的相应环在4-28个残基的范围内。为了提供最大的多样性，fg环在序列以及长度方面可为多样化的以对应于4-28个残基的抗体cdr3长度范围。例如，fg环在长度方面可通过将环延伸额外的1、2、3、4或5个氨基酸进一步多样化。根据tencon序列设计的文库也可具有随机化可选表面，所述表面在fn3结构域的侧面上形成并且包含两条或更多条β链，以及至少一个环。一个这样的可选表面由cβ-链和fβ-链以及cd环和fg环中的氨基酸形成(c-cd-f-fg表面)。基于tencon可选c-cd-f-fg表面的文库设计在us2013/0226834中有所描述。基于tencon序列设计的文库还包括基于tencon变体设计的文库，诸如在第11、17、46和/或86位残基位置处具有取代的tencon变体，并且所述变体显示出改善的热稳定性。示例性tencon变体在us2011/0274623中有所描述，并且包括tencon27(seqidno:2)，其与tencon相比具有取代e11r、l17a、n46v和e86i。可使用随机的或定义的氨基酸集合在所选残基位置处使tencon文库和基于其他fn3序列的文库随机化。例如，可使用nnk密码子(其编码所有20种天然存在的氨基酸)产生具有随机取代的文库中的变体。在其他多样化方案中，dvk密码子可用于编码氨基酸ala、trp、tyr、lys、thr、asn、lys、ser、arg、asp、glu、gly和cys。另选地，nns密码子可用于产生所有20种氨基酸残基，与此同时降低终止密码子的频率。可例如使用
在一个具体的实施方案中，本发明包括全长carcdna或编码区。抗原结合区或结构域可包含源于特定人单克隆抗体的单链可变片段(scfv)的vh和vl链的片段。抗原结合区或结构域还可以包含fn3结构域。
本发明的嵌合受体的胞内信号结构域负责激活其中已放置嵌合受体的免疫细胞的至少一种正常效应功能。术语“效应功能”是指分化细胞的特化功能。t细胞的效应功能例如可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。记忆或记忆型t细胞中的效应功能包括抗原依赖性增殖。因此，术语“胞内信号结构域”是指蛋白质的一部分，其转导效应功能信号并指导细胞执行特化功能。尽管通常将使用整个胞内信号结构域，但是在许多情况下，将不必使用整个胞内多肽。在可发现使用胞内信号结构域的截短部分的方面来说，可使用这种截短部分代替完整链，只要它仍转导效应功能信号即可。因此，术语胞内信号结构域意在包括胞内信号结构域的足以转导效应功能信号的任何截短部分。示例包括t细胞受体的ζ链或其任何同源物(例如，η、δ、γ或ε)；mb1链；b29；fcyrut；fcyr；以及信号分子(诸如ο′o3ζ和cd2.8、4-1bb、ox40)的组合；以及它们的组合；以及其他类似的分子和片段。可使用激活蛋白家族的其他成员的胞内信号部分，诸如fcyriii和fcsrl。关于使用这些替代性跨膜和胞内结构域的ctcr的公开内容，参见gross等人(1992)、stancovski等人(1993)、moritz等人(1994)、hwu等人(1995)、weijtens等人(1996)和hekele等人(1996)。在一个优选的实施方案中，将人cd3ζ胞内结构域拿来用于激活。
抗原特异性胞外结构域和胞内信号结构域可通过跨膜结构域连接，所述跨膜结构域例如为人igg4fc铰链和fc区、人cd4跨膜结构域、人cd28跨膜结构域、跨膜人cd3结构域、或半胱氨酸突变的人€′o3ζ结构域、或来自其他人跨膜信号蛋白(诸如cd16和cd8和促红细胞生成素受体)的其他跨膜结构域。
在一些实施方案中，car核酸包含编码其他共同刺激受体的序列，诸如跨膜结构域和经修饰的cd28胞内信号结构域。其他共同刺激受体包括但不限于cd28、ox-40(cd134)、dap10和4-ibb(cd137)中的一种或多种。除了通过cd3引发的初级信号外，由插入人car中的人共同刺激受体提供的额外信号对于t细胞的完全激活也很重要，并且可帮助改善过继性免疫疗法的体内持久性和治疗成功。在特定实施方案中，本发明涉及分离的核酸片段和掺入编码car的dna序列的表达盒。本发明的载体主要被设计以在调控的真核启动子(例如mndu3启动子或eflα启动子或泛素启动子)的控制下向免疫细胞(优选地t细胞)递送所需的基因。而且，如果没有其他原因，载体可含有选择性标记，以促进其体外操作。
嵌合抗原受体分子是重组的，并且因它们经由其细胞质尾巴中存在的免疫受体激活基序(itam)结合抗原并转导激活信号的能力而著名。利用抗原结合部分(例如，由单链抗体(scfv)产生)的受体构建体提供“通用”的额外优点，因为它们以hla非依赖性方式结合靶细胞表面上的天然抗原。例如，若干个实验室已经报道了与编码cd3复合物的ζ链(ζ)、fc受体γ链和天空酪氨酸激酶的胞内部分的序列融合的scfv构建体(eshhar等人,1993；fitzer-attas等人,1998)。重定向的t细胞效应机制(包括通过ctl的肿瘤识别和裂解)已经在几种鼠类和人类抗原-scfv:ζ系统中得到证明(eshhar，1997；altenschmidt等人,1997)。
迄今为止，通常将非人抗原结合区用于构建嵌合抗原受体。使用非人抗原结合区诸如鼠类单克隆抗体的潜在问题是缺乏人效应功能和不能渗透到肿瘤块中。换句话讲，此类抗体可能无法通过抗体依赖性细胞毒性或fc受体介导的吞噬作用来介导补体依赖性裂解或裂解人靶细胞，从而破坏表达car的细胞。此外，非人单克隆抗体可被人宿主识别为外来蛋白质，并且因此，重复注射此类外来抗体可导致免疫应答的诱导，从而导致有害的超敏反应。对于基于鼠类的单克隆抗体，这通常被称为人抗小鼠抗体(hama)反应。因此，更优选的是使用人源抗体，因为它们不像鼠源抗体那样引起强烈的hama反应。类似地，在car中使用人序列可避免免疫介导的识别，因此可通过驻留在接受者中的内源性t细胞消除，并在hla的情况下识别经过加工的抗原。在一些实施方案中，嵌合抗原受体包含：(a)包含抗原结合区的胞外结构域；(b)跨膜结构域；以及(c)胞内信号结构域。
在具体的实施方案中，car中的胞内受体信号结构域包括例如t细胞抗原受体复合物的那些，诸如cd3的ζ链，还有fcγriii共同刺激信号结构域、cd28、dap10、cd2(单独或与cd3ζ串联)。在具体的实施方案中，胞内结构域(其可被称为胞质结构域)包含tcrζ链、cd28、ox40/cd134、4-1bb/cd137、fcsrty、icos/cd278、ilrb/cd122、il-2rg/cd132、dap分子、cd27、dap10、dap12和cd40中的一种或多种的部分或全部。在一些实施方案中，人们在胞内结构域中使用内源性t细胞受体复合物的任何部分。例如，可使用一个或多个胞质结构域，因为所谓的第三代car具有至少两个或三个融合在一起的信号结构域，以产生加合效应或协同效应。在嵌合抗原受体的某些实施方案中，受体的抗原特异性部分(其可被称为包含抗原结合区的胞外结构域)包含肿瘤相关抗原或病原体特异性抗原。
肿瘤相关抗原可以是任何种类的，只要它在肿瘤细胞的细胞表面上表达即可。肿瘤相关抗原的示例性实施方案包括bcma、cd19、cd20、癌胚抗原、甲胎蛋白、ca-125、muc-1、上皮肿瘤抗原、黑素瘤相关抗原、突变的p53、突变的ras等等。
在某些实施方案中，可靶向胞内肿瘤相关抗原，诸如ha-1、wt1或p53。这可通过在通用t细胞上表达的car来实现，所述car识别在hla的情况下来自胞内肿瘤相关抗原的所述经过加工的肽。此外，可对通用t细胞进行基因修饰以表达在hla的情况下识别胞内加工的肿瘤相关抗原的t细胞受体对。
病原体可以是任何种类，但是在具体的实施方案中，病原体是例如真菌、细菌或病毒。示例性病毒病原体包括以下科的那些：腺病毒科(adenoviridae)、eb病毒(ebv)、巨细胞病毒(cmv)、呼吸道合胞病毒(rsv)、jc病毒、bk病毒、hsv、hhv病毒家族、小核糖核酸病毒科(picornaviridae)、疱疹病毒科(herpesviridae)、肝脱氧核糖核酸病毒科(hepadnaviridae)、黄病毒科(flaviviridae)、逆转录病毒科(retroviridae)、正粘病毒科(orthomyxoviridae)、副粘病毒科(parainyxoviridae)、乳多空病毒科(papovaviridae)、多瘤病毒(polyomavirus)、弹状病毒科(rhabdoviridae)和披盖病毒科(togavkidae)。示例性致病病毒导致天花、流行性感冒、腮腺炎、麻疹、水痘、埃博拉和风疹。示例性致病真菌包括念珠菌属(candida)、曲霉属(aspergillus)、隐球菌属(cryplococcus)、组织胞浆菌属(histoplasma)、肺囊虫属(pneumocystis)和葡萄穗霉属(stachybotrys)。示例性致病细菌包括链球菌属(streptococcus)、假单胞菌属(pseudomonas)、志贺氏菌属(shigella)、弯曲杆菌属(campylobacter)、葡萄球菌属(staphylococcus)、螺杆菌属(helicobacter)、大肠杆菌(e.coli)、立克次氏体(rickettsia)、芽孢杆菌属(bacillus)、博代氏杆菌属(bordetella)、衣原体(chlamydia)、螺旋体(spirochetes)和沙门氏菌属(salmonella)。在一个实施方案中，可将病原体受体dectin-1用于产生识别真菌细胞壁上的碳水化合物结构的car。基于dectin-1的特异性经基因修饰以表达car的t细胞可识别曲霉菌属并靶向菌丝生长。在另一个实施方案中，可基于识别病毒决定簇(例如，来自cmv和埃博拉病毒的糖蛋白)以中断病毒感染和病理学的抗体来制备car。在一些实施方案中，致病性抗原是曲霉属碳水化合物抗原，其car中的胞外结构域识别真菌细胞壁的碳水化合物模式。
根据本发明的嵌合免疫受体可通过本领域已知的任何手段来产生，但是优选地其使用重组dma技术来产生。通过分子克隆的标准技术(基因组文库筛选、pcr、引物辅助连接、来自酵母和细菌的scfv文库、定点诱变等)，可制备编码嵌合受体的几个区的核酸序列并将其组装成完整的编码序列。可将所得的编码区插入表达载体中，并用于转化合适的表达宿主永生化t细胞系。如本文所用，“核酸构建体”或“核酸序列”或“多核苷酸”旨在表示可被转化或引入t细胞中并被转录和翻译以产生产物(例如嵌合受体)的dna分子。
在本发明中使用的示例性核酸构建体(多核苷酸)中，启动子可操作地连接至编码本发明的嵌合受体的核酸序列，即，它们被定位，以便促进从编码嵌合受体的dna转录信使rna。启动子可以是基因组来源的或是合成产生的。用于在t细胞中使用的多种启动子是本领域熟知的(例如，由marodon等人(2003)公开的cd4启动子)。例如，启动子可以是组成型或诱导型的，其中诱导与特定细胞类型或特定成熟水平相关。另选地，许多熟知的病毒启动子也是合适的。感兴趣的启动子包括β-肌动蛋白启动子、sv40早期和晚期启动子、免疫球蛋白启动子、人巨细胞病毒启动子、逆转录病毒启动子和弗氏(friend)脾脏聚焦形成病毒启动子。启动子可与增强子缔合或不与增强子缔合，其中所述增强子可与特定启动子天然地缔合或与不同启动子缔合。编码嵌合受体的开放阅读框的序列可从基因组dna来源、cdna来源获得，或可被合成(例如，经由pcr)，或它们的组合。根据基因组dna的大小和内含子的数量，可能期望使用cdna或其组合，因为发现内含子稳定mrna或提供t细胞特异性表达(barthel和goldfeki，2003)。而且，使用内源性或外源性非编码区来稳定mrna可能是进一步有利的。
对于表达本发明的嵌合受体，在靶宿主中可使用编码嵌合受体的n末端组分的核酸序列的天然存在的或内源性转录起始区来产生嵌合受体。另选地，可使用允许组成型或诱导型表达的外源性转录起始区，其中可根据靶宿主、所需的表达水平、靶宿主的性质等来控制表达。
同样，将嵌合受体引导至表面膜的信号序列可以是嵌合受体的n末端组分的内源性信号序列。可选地，在一些情况下，可能期望将此序列交换为不同的信号序列。但是，所选的信号序列应当与t细胞的分泌途径相容，使得嵌合受体出现在t细胞的表面上。类似地，可由编码嵌合受体的c末端组分的核酸序列的天然存在的或内源性转录终止区提供终止区。另选地，终止区可源于不同的来源。在大多数情况下，通常不认为终止区的来源对重组蛋白的表达至关重要，并且可使用多种多样的终止区而不会不利地影响表达。如本领域技术人员将理解的是，在一些情况下，例如，可缺失在car中的抗原结合结构域末端的一些氨基酸，通常不超过10个、更通常不超过5个残基。而且，可能期望在边界处引入少量氨基酸，通常不超过10个、更通常不超过5个残基。氨基酸的缺失或插入可能是由于以下的需要：构建、提供便利的限制性位点、易于操作、表达水平提高等。此外，出于类似的原因，可能发生一个不同的氨基酸取代一个或多个氨基酸，通常在任何一个结构域中取代不超过约五个氨基酸。
可按常规方式制备编码根据本发明的嵌合受体的嵌合构建体。因为在大多数情况下可使用天然序列，所以可酌情分离和操纵天然基因，以便允许各种组分的正确连接。因此，通过采用聚合酶链反应(pcr)，使用导致基因的不需要部分的缺失的适当引物，可分离编码嵌合受体的n末端和c末端蛋白质的核酸序列。另选地，可将克隆基因的限制性消化物用于产生嵌合构建体。在任一种情况下，都可选择序列以提供为平末端或具有互补悬突的限制性位点。
可在体外进行用于制备嵌合构建体的各种操作，并且在特定实施方案中，使用标准转化或转染方法将嵌合构建体引入载体中以在适当宿主中进行克隆和表达。因此，在每次操作之后，克隆来自dna序列连接的所得构建体，分离载体，并且筛选序列以确保所述序列编码所需的嵌合受体。可通过限制性分析、测序等来筛选所述序列。通过减小受治疗者中肿瘤的尺寸或阻止肿瘤的生长或再生长，本发明的嵌合构建体可应用于患有或怀疑患有癌症的这些受治疗者中。因此，本发明还涉及一种方法，所述方法用于通过将本发明的嵌合构建体引入工程化永生化t细胞中并将所述工程化永生化car-t细胞引入受治疗者中来减少受治疗者中的肿瘤生长或阻止肿瘤形成，从而实现抗肿瘤反应以减少或消除受治疗者的肿瘤。可使用的合适的永生化t细胞包括细胞毒性淋巴细胞(ctl)或需要破坏的具有t细胞受体的任何永生化细胞。
预期可将嵌合构建体作为裸dna或在合适的载体中引入永生化t细胞中。使用裸dna通过电穿孔稳定地转染t细胞的方法是本领域已知的。参见例如美国专利号6,410,319。裸dna通常是指以表达的正确取向包含在质粒表达载体中的、编码本发明的嵌合受体的dna。有利地，裸dna的使用减少了产生表达本发明的嵌合受体的永生化t细胞所需的时间。
另选地，可使用病毒载体(例如逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或慢病毒载体)将嵌合构建体引入永生化t细胞中。根据本发明的方法使用的合适载体在永生化t细胞中是非复制的。已知大量基于病毒的载体，其中病毒在细胞中维持的拷贝数低到足以维持细胞的活力。例示性载体包括pfb-neo载体
一旦确定经转染或转导的永生化t细胞能够在希望的调节的情况下且以所需的水平表达作为表面膜蛋白的嵌合受体，就可确定所述嵌合受体在宿主细胞中是否具有功能以提供所需的信号诱导。随后，将经转导的永生化t细胞重新引入或施用至受治疗者以激活受治疗者中的抗肿瘤反应。为了便于施用，可将根据本发明的经转导的t细胞与适当的载体或稀释剂一起制成药物组合物或制成适于体内施用的植入物，所述载体或稀释剂还可以是药学上可接受的。在本领域中已经描述了制备这样的组合物或植入物的手段(参见例如remington'spharmaceuticalsciences，第16版，mack，编辑(1980))。在适当的情况下，可将经转导的永生化t细胞按照其各自的施用途径的常规方式配制成制剂，所述制剂呈半固体或液体形式，诸如胶囊、溶液、注射剂、吸入剂或气溶胶。可利用本领域已知的手段来阻止或最小化组合物的释放和吸收，直到其到达靶组织或器官为止，或者确保组合物的定时释放。然而，理想地，使用药学上可接受的形式，其不影响表达嵌合受体的细胞。因此，理想地，可将经转导的永生化t细胞制成药物组合物，所述药物组合物含有平衡盐溶液，优选地汉克氏平衡盐溶液(hanks'balancedsaltsolution)或生理盐水。
示例性bcma特异性嵌合t细胞受体(或嵌合抗原受体，car)
mm疗法的潜在靶标是b细胞成熟抗原(bcma)，即主要表达于成熟b细胞上的肿瘤坏死因子受体家族的成员(coquery和erickson,critrevimmunol.2012；32(4):287-305)。bcma在结合其配体(tnf家族的b细胞活化剂(baff)和一种增殖诱导配体(april))时传送促存活信号。bcma触发b细胞中的抗原呈递，这取决于nf-κb和jnk信号转导。在健康个体中，bcma在介导维持长期体液免疫的浆细胞的存活中发挥作用，但其表达也与多种癌症、自身免疫性障碍和感染性疾病相关联。例如，bcmarna通常在mm细胞及其他淋巴瘤中检测出，并且已在mm患者的浆细胞表面检测到bcma蛋白质(novak等人,blood.2004年1月15日；103(2):689-94；neri等人,clincancerres.2007年10月1日；13(19):5903-9；bellucci等人,blood.2005年5月15日；105(10):3945-50；moreaux等人,blood.2004年4月15日；103(8):3148-57)。
在一个方面，本发明的组合物包含靶向bcma的car，所述car包含bcma特异性fn3结构域。
在一个方面，本发明涉及car，所述car包含：
a.胞外结构域，所述胞外结构域具有特异性地结合bcma的fn3结构域；
b.跨膜结构域；以及
c.胞内信号结构域。
在一些实施方案中，在新生car中，胞外结构域处在n末端处的信号肽之后。本发明可使用任何合适的信号肽。信号肽可源于天然的、合成的、半合成的或重组的来源。根据一个实施方案，信号肽是人cd8信号肽、人cd3δ信号肽、人cd3ε信号肽、人gmcsfr信号肽、人4-1bb信号肽、或它们的衍生物。根据特定实施方案，信号肽具有与seqidno:3有至少90％同一性的氨基酸序列，优选地具有seqidno:3的氨基酸序列。根据其他特定实施方案，信号肽具有与seqidno:46-49中的一者有至少90％同一性的氨基酸序列，优选地具有seqidno:50-53中的一者的氨基酸序列。信号肽可在完全易位期间或之后被信号肽酶裂解，以生成不含信号肽的成熟car。
根据本发明的实施方案，car的胞外结构域包含bcma特异性fn3结构域。根据本发明的实施方案的任何bcma特异性fn3结构域(包括但不限于根据seqidno8-44的氨基酸序列)都可在car的胞外结构域中使用。
根据本发明的实施方案，car还可包含使胞外结构域和跨膜结构域连接的铰链区。铰链区用于使胞外结构域远离工程化免疫细胞的表面移动以实现适当的细胞/细胞接触，从而结合靶标或抗原并且活化(patel等人,genetherapy,1999；6:412-419)。任何合适的铰链区均可用于本发明的car。它可源于天然的、合成的、半合成的或重组的来源。根据一些实施方案，car的铰链区是6xgs肽(seqidno:66)或其片段，或来自cd8蛋白质的铰链区，或它们的衍生物。在特定实施方案中，铰链区具有与seqidno:4有至少90％同一性的氨基酸序列，优选地具有seqidno:4的氨基酸序列。
任何合适的跨膜结构域均可用于本发明的car。跨膜结构域可源于天然的、合成的、半合成的或重组的来源。根据一些实施方案，跨膜结构域是来自诸如cd8、cd28、cd4、cd2、gmcsfr等分子的跨膜结构域。在特定实施方案中，跨膜结构域具有与seqidno:5有至少90％同一性的氨基酸序列，优选地具有seqidno:5的氨基酸序列。在其他实施方案中，跨膜结构域具有与seqidno:50-53中的一者有至少90％同一性的氨基酸序列，优选地具有seqidno:50-53中的一者的氨基酸序列。
任何合适的胞内信号结构域均可用于本发明的car。在特定实施方案中，使用整个胞内信号结构域。在其他特定实施方案中，使用转导效应信号的信号结构域的截短部分。根据本发明的实施方案，胞内信号结构域产生的信号促进含car细胞(例如car-t细胞)的免疫效应功能，包括但不限于增殖、活化和/或分化。在特定实施方案中，该信号促进例如car-t细胞的溶细胞活性、辅助细胞活性和/或细胞因子分泌。
根据一些实施方案中，胞内信号结构域包含源于以下项的功能信号结构域：cd3ζ、tcrζ、fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd16、cd22、cd27、cd28、cd30、cd79a、cd79b、cd134(也称为tnfrsf4或ox-40)、4-1bb(cd137)、cd278(也称为icos)、fcεri、dap10、dap12、itam结构域或cd66d等。
根据特定实施方案，胞内信号结构域包含初级信号结构域以及一个或多个共同刺激信号结构域。
在一个实施方案中，胞内信号结构域包含具有源于人cd3ζ的功能信号结构域的初级胞内信号结构域。在特定实施方案中，初级胞内信号结构域具有与seqidno:7有至少90％同一性的氨基酸序列，优选地具有seqidno:7的氨基酸序列。
根据一些实施方案，胞内信号结构域还包含源于人4-1bb的共同刺激胞内信号结构域。在特定实施方案中，共同刺激胞内信号结构域具有与seqidno:6有至少90％同一性的氨基酸序列，优选地具有seqidno:6的氨基酸序列。
在一个实施方案中，胞内信号结构域具有与seqidno:45有至少90％同一性的氨基酸序列，优选地具有seqidno:45的氨基酸序列。
在特定实施方案中，car具有如下结构，所述结构从n末端到c末端包含bcma特异性fn3结构域(centyrin)、人cd8铰链区、人cd8跨膜区、人4-1bb胞内结构域和人cd3ζ胞内结构域。新生car还包含人cd8信号肽，其随后在成熟car中被切除。
在一个实施方案中，本发明的car与表达car的宿主细胞结合。
在另一个实施方案中，本发明的car存在于工程化永生化t细胞中。
在另一个实施方案中，将本发明的car从表达car的宿主细胞的其他组分中纯化或分离。
靶向示例性fn3结构域的嵌合t细胞受体(或嵌合抗原受体，car)
在其他总的方面，本发明涉及包含fn3结构域特异性scfv的靶向fn3结构域的car。
在一个方面，本发明涉及car，所述car包含：
a.胞外结构域，所述胞外结构域具有scfv，所述scfv特异性地结合fn3结构域的非随机化区；
b.跨膜结构域；以及
c.胞内信号结构域。
可将包含fn3结构域特异性scfv的car用于控制使用靶向fn3结构域的t细胞介导的杀伤，所述靶向fn3结构域可预先加载到工程化细胞上或将其给药并控制以防止毒性。而且，可将非靶向fn3结构域与配体缀合，来以配体/受体特异性方式结合其他细胞类型或实现同时结合多个配体的选择性。
在一些实施方案中，在新生car中，胞外结构域处在n末端处的信号肽之后。本发明可使用任何合适的信号肽。信号肽可源于天然的、合成的、半合成的或重组的来源。
根据本发明的实施方案，car的胞外结构域包含特异性地结合fn3结构域的非随机化区的scfv。与根据本发明实施方案的fn3结构域特异性地结合的任何scfv(包括但不限于根据seqidno:54和55的氨基酸序列)都可在car的胞外结构域中使用。
在一些实施方案中，在新生car中，胞外结构域处在n末端处的信号肽之后。本发明可使用任何合适的信号肽。信号肽可源于天然的、合成的、半合成的或重组的来源。根据一个实施方案，信号肽是人cd8信号肽、人cd3δ信号肽、人cd3ε信号肽、人gmcsfr信号肽、人4-1bb信号肽、或它们的衍生物。根据特定实施方案，信号肽具有与seqidno:3有至少90％同一性的氨基酸序列，优选地具有seqidno:3的氨基酸序列。根据其他特定实施方案，信号肽具有与seqidno:46-49中的一者有至少90％同一性的氨基酸序列，优选地具有seqidno:50-53中的一者的氨基酸序列。信号肽可在完全易位期间或之后被信号肽酶裂解，以生成不含信号肽的成熟car。
任何合适的跨膜结构域均可用于本发明的car。跨膜结构域可源于天然的、合成的、半合成的或重组的来源。根据一些实施方案，跨膜结构域是来自诸如cd8、cd28、cd4、cd2、gmcsfr等分子的跨膜结构域。在特定实施方案中，跨膜结构域具有与seqidno:5有至少90％同一性的氨基酸序列，优选地具有seqidno:5的氨基酸序列。在其他实施方案中，跨膜结构域具有与seqidno:50-53中的一者有至少90％同一性的氨基酸序列，优选地具有seqidno:50-53中的一者的氨基酸序列。
任何合适的胞内信号结构域均可用于本发明的car。在特定实施方案中，使用整个胞内信号结构域。在其他特定实施方案中，使用转导效应信号的信号结构域的截短部分。根据本发明的实施方案，胞内信号结构域产生的信号促进含car细胞(例如car-t细胞)的免疫效应功能，包括但不限于增殖、活化和/或分化。在特定实施方案中，该信号促进例如car-t细胞的溶细胞活性、辅助细胞活性和/或细胞因子分泌。在其他实施方案中，在本发明的car中不使用胞内信号结构域，并且包含特异性地结合本发明的fn3结构域的scfv的car与用于将该效应细胞靶向靶细胞的fn3结构域一起使用。
根据一些实施方案中，胞内信号结构域包含源于以下项的功能信号结构域：cd3ζ、tcrζ、fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd16、cd22、cd27、cd28、cd30、cd79a、cd79b、cd134(也称为tnfrsf4或ox-40)、4-1bb(cd137)、cd278(也称为icos)、fcεri、dap10、dap12、itam结构域或cd66d等。
根据特定实施方案，胞内信号结构域包含初级信号结构域以及一个或多个共同刺激信号结构域。
在一个实施方案中，胞内信号结构域包含具有源于人cd3ζ的功能信号结构域的初级胞内信号结构域。在特定实施方案中，初级胞内信号结构域具有与seqidno:7有至少90％同一性的氨基酸序列，优选地具有seqidno:7的氨基酸序列。
根据一些实施方案，胞内信号结构域还包含源于人4-1bb的共同刺激胞内信号结构域。在特定实施方案中，共同刺激胞内信号结构域具有与seqidno:6有至少90％同一性的氨基酸序列，优选地具有seqidno:6的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明的car与表达car的宿主细胞结合。
在另一个实施方案中，本发明的car存在于表达car的宿主细胞的分离的细胞膜中。
在另一个实施方案中，将本发明的car从表达car的宿主细胞的其他组分中纯化或分离。
用于破坏tcr和b2m的示例性内切核酸酶
作为本发明的结果，可获得具有改善的特性的工程化永生化t细胞。具体地，本发明提供了工程化(优选地永生化)t细胞，其特征在于tcr和b2m的表达被抑制。
根据某些实施方案，工程化永生化t细胞表达能够通过dna切割选择性地失活感兴趣的基因(诸如编码tcr或b2m的基因)的内切核酸酶。术语“内切核酸酶”是指能够催化dna或rna分子(优选地dna分子)内核酸之间的键的水解(切割)的野生型或变体酶。具体地讲，所述内切核酸酶是高度特异性的，识别长度为10至45个碱基对(bp)范围内，通常长度为10至35个碱基对范围内，更通常12至20个碱基对的核酸靶位点。根据本发明的内切核酸酶识别特定的多核苷酸序列(进一步称为“靶序列”)，并且根据所述内切核酸酶的分子结构切割在这些靶序列内部或与其相邻的序列中的核酸。内切核酸酶可识别特定的多核苷酸序列，并在特定的多核苷酸序列上产生单链或双链断裂。
在特定实施方案中，所述内切核酸酶是cas9/crispr复合物。cas9/crispr内切核酸酶构成新一代的基因组工程化工具，其中cas9与rna分子缔合。在这个系统中，rna分子核苷酸序列决定靶标特异性并激活内切核酸酶(gasiunas,barrangou等人2012；jinek,chylinski等人2012；cong,ran等人2013；mali,yang等人2013)。cas9，也称为csn1，是参与crrna生物发生和破坏入侵dna的一种大型蛋白质。已描述过在不同细菌物种(诸如嗜热链球菌(s.thermophiles)、英诺克李斯特菌(listeriainnocua)(gasiunas,barrangou等人2012；jinek,chylinski等人2012)和酿脓链球菌(s.pyogenes)(deltcheva,chylinski等人2011)中的cas9。大型cas9蛋白(>1200个氨基酸)含有两个预测的核酸酶结构域，即位于蛋白质中间的hnh(mcra样)核酸酶结构域和分隔的ruvc样核酸酶结构域(rna酶h折叠)。cas9变体可以是在自然界中不天然地存在的cas9内切核酸酶，并且通过蛋白质工程化或通过随机诱变获得。根据本发明的cas9变体可以例如通过突变(即从酿脓链球菌(sipyogenes)cas9内切核酸酶(cog3513)的氨基酸序列中的至少一个残基的缺失、插入或取代)获得。
在其他实施方案中，所述内切核酸酶也可以是归巢内切核酸酶，也以大范围核酸酶的名称著称。此类归巢内切核酸酶是本领域熟知的(stoddard2005)。归巢内切核酸酶是高度特异性的，识别长度为12至45个碱基对(bp)范围内、通常长度为14至40bp范围内的dna靶位点。根据本发明的归巢内切核酸酶可以例如对应于laglidadg(seqidno:67)内切核酸酶、hnh内切核酸酶或giy-yig内切核酸酶。根据本发明的优选归巢内切核酸酶可以是i-crel变体。“变体”内切核酸酶(即自然界中不天然地存在且通过基因工程化或通过随机诱变获得的内切核酸酶)可结合与由野生型内切核酸酶识别的序列不同的dna序列(参见国际申请wo2006/097854)。
在其他实施方案中，所述稀切内切核酸酶可以是“锌指核酸酶”(zfn)，其通常是在iis型限制性酶fokl的切割结构域与含有3个或更多个c2h2锌指基序的dna识别结构域之间的融合物。在两个单独的zfn的dna中的特定位置处以精确的取向和间距异二聚化导致dna中的双链断裂(dsb)。此类嵌合内切核酸酶的使用已在本领域中广泛报道，如urnov等人(genomeeditingwithengineeredzincfingernucleases(2010)naturereviewsgenetics11:636-646)所综述。标准zfn将切割结构域融合到每个锌指结构域的c末端。为了允许两个切割结构域二聚化并切割dna，所述两个单独的zfn结合dna的相反链，所述两个单独的zfn的c末端相隔一定距离。锌指结构域与切割结构域之间最常用的接头序列要求每个结合位点的5'边缘分开5至7bp。产生新的锌指阵列的最直接方法是组合具有已知特异性的较小锌指“模块”。最常见的模块化组装过程涉及组合三个单独的锌指，每个锌指可识别3个碱基对dna序列，以产生可识别9个碱基对靶位点的3指阵列。已经使用多种选择方法来产生能够靶向所需序列的锌指阵列。最初的选择工作利用噬菌体展示从大的部分随机化锌指阵列池中选择结合给定dna靶标的蛋白质。最近的工作已经利用酵母单杂交系统、细菌单杂交和二杂交系统、以及哺乳动物细胞。
在其他实施方案中，所述内切核酸酶是“tale-核酸酶”或“mbbbd-核酸酶”，其来源于dna结合结构域(通常源于转录激活子样效应蛋白(tale)或源于模块化逐碱基结合结构域(modularbase-per-basebindingdomain，mbbbd))与具有内切核酸酶活性的催化结构域的融合。这种催化结构域通常来自酶，例如i-tevl、coie7、nuca和fok-i。可根据所选择的催化结构域以单体或二聚体形式形成tale核酸酶(wo2012138927)。此类工程化tale核酸酶可以商品名talentm(cellectis,8ruedelacroixjarry,75013paris,france)商购获得。一般来讲，dna结合结构域源于转录激活子样效应蛋白(tale)，其中序列特异性由来源于黄单胞菌属(xanthomonas)或罗尔斯通菌属(ralstonia)细菌蛋白avrbs3、pthxo1、avrhah1、ptha、tal1c作为非限制性示例一系列33-35个氨基酸重复驱动。这些重复本质上因指定与碱基对的相互作用的两个氨基酸位置而不同(boch,scholze等人2009；moscou和bogdanove2009)。dna靶标中的每个碱基对通过单个重复接触，其特异性由所述重复的两个变体氨基酸(所谓的重复可变二肽，rvd)产生。tale结合结构域可以还包含负责靶序列的第一胸腺嘧啶碱基(to)的需要的n末端易位结构域以及含有核定位信号(nls)的c末端结构域。tale核酸结合结构域通常对应于包含多个tale重复序列的工程化核心tale支架，每个重复包含对tale识别位点的每个核苷酸碱基具有特异性的rvd。在本发明中，所述核心支架的每个tale重复序列由30至42个氨基酸(更优选地33或34个氨基酸组成，其中位于位置12和13处的两个关键氨基酸(所谓的重复可变二肽，rvd)介导所述tale结合位点序列的一个核苷酸的识别；等效的两个关键氨基酸可位于大于33个或34个氨基酸长度的tale重复序列中除12和13以外的位置。优选地，与识别不同核苷酸相关的rvd是用于识别c的hd、用于识别t的ng、用于识别a的ni、用于识别g或a的nn。在另一个实施方案中，可将关键氨基酸12和13突变为其他氨基酸残基，以便调节其对核苷酸a、t、c和g的特异性并且尤其增强此特异性。tale核酸结合结构域通常包含在8个与30个之间的tale重复序列。更优选地，本发明的所述核心支架包含在8个与20个之间的tale重复序列；再次更优选地15个tale重复序列。它也可包含由位于所述tale重复序列组的c末端的20个氨基酸组成的额外的单截短tale重复序列，即额外的c末端半tale重复序列。在wo2014/018601中描述了其他模块化逐碱基特异性核酸结合结构域(mbbbd)。所述mbbbd可例如从新鉴定的蛋白质(即来自内共生真菌根霉素伯克霍尔德菌(burkholderiarhizoxinica)的最近测序的基因组的eav36_burrh、e5aw43_burrh、e5aw45_burrh和e5aw46_burrh蛋白质进行工程改造。这些核酸结合多肽包含为碱基特异性的约31个至33个氨基酸的模块。这些模块显示出与黄单胞菌属(xanthomonas)tale常见重复有少于40％的序列同一性，并且呈现出更多的多肽序列可变性。来自伯克霍尔德菌属和黄单胞菌属的上述蛋白质的不同结构域(模块，n末端和c末端)可用于工程化对特定核酸序列具有结合特性的新蛋白质或支架，并且可组合以形成嵌合的tale-mbbbd蛋白质。
与本发明的实施方案有关的方法和组合物
在某些方面，本发明包括制备和/或扩增抗原特异性重定向的工程化永生化car-t细胞的方法，所述方法包括用含有编码car的dna构建体的表达载体转染tcr/b2m缺陷型永生化t细胞。
在另一方面，本发明是使用裸dna通过电穿孔或其他非病毒基因转移(例如但不限于声穿孔(sonoporation))来稳定地转染和重定向工程化永生化t细胞的方法。大多数研究人员已使用病毒载体将异源基因带到t细胞中。通过使用裸dna，可减少产生重定向的t细胞所需的时间。“裸dna”意指编码以正确的表达取向包含在表达盒或载体中的嵌合t细胞受体(ctcr)的dna。本发明的电穿孔方法产生稳定的转染子，所述转染子在其表面上表达并带有嵌合tcr(ctcr)。
“嵌合tcr”意指由t细胞表达并且包含胞内信号结构域、跨膜结构域和胞外结构域的受体，其中所述胞外结构域能够以mhc不受限制的方式特异性地结合通常不被t细胞受体以那种方式结合的抗原。抗原在正确的条件下刺激t细胞导致所述细胞的增殖(扩增)。本发明的示例性bcma和fn3结构域特异性嵌合受体是嵌合tcr的示例。但是，所述方法适用于对其他靶抗原具有特异性的嵌合tcr的转染，所述嵌合tcr例如为对以下具有特异性的嵌合tcr：her2/neu、erbb2、叶酸结合蛋白、肾细胞癌和hiv-1包膜糖蛋白gp20和gp41。其他细胞表面靶抗原包括但不限于cd20、癌胚抗原、间皮素、c-met、cd56、herv-k、gd2、gd3、甲胎蛋白、cd23、cd30、cd123、il-llrα、κ链、λ链、cd70、ca-125、muc-1、egfr及变体、上皮肿瘤抗原等。
在某些方面，t细胞是永生化人t细胞。条件包括使用mrna和dna以及电穿孔。在转染后，可将细胞立即输注或可储存。在某些方面，在转染后，细胞可在基因转移到细胞中后约1、2、3、4、5天或更长时间内作为混合群体离体繁殖几天、几周或几个月。在另外的方面，在转染后，克隆转染子，并且一个克隆表明存在单个整合的或游离维持的表达盒或质粒，并且嵌合受体的表达被离体扩增。选择用于扩增的克隆展示出特异性地识别和裂解表达bcma的靶细胞的能力。可通过用il-2或结合共同γ链的其他细胞因子(例如，il-7、il-15、il-21等)刺激来扩增重组永生化t细胞。在另外的方面，可将经基因修饰的细胞冷冻保存。
在输注之后t细胞繁殖(存活)可通过以下方法进行评估：(i)使用对car特异的引物进行q-pcr；和/或(ii)使用对car特异的抗体进行流式细胞术。
本发明还代表使用缺乏tcr和b2m表达的重定向永生化t细胞用为bcma特异的细胞表面表位靶向癌症(更具体地多发性骨髓瘤)。恶性b细胞是重定向t细胞的优异靶标，因为b细胞可充当t细胞的免疫刺激性抗原呈递细胞。在本发明的某些实施方案中，将本发明的工程化永生化t细胞递送至对其有需要的个体(诸如患有癌症或感染的个体)。然后所述细胞增强个体的免疫系统，以攻击相应的癌症或致病细胞。在一些情况下，向个体提供一个或多个剂量的抗原特异性工程化永生化t细胞。如果向个体提供两个或更多个剂量的抗原特异性工程化永生化t细胞，则在两次施用之间的持续时间应足以允许在个体中繁殖的时间，并且在特定实施方案中，在两个剂量之间的持续时间为1、2、3、4、5、6、7天或更多天。
被修饰以包括嵌合抗原受体并且缺乏功能性tcr和b2m的永生化t细胞的来源可以是任何种类，但在特定实施方案中，从例如脐带血、外周血、人胚胎干细胞或诱导型多能干细胞的库中获得所述细胞。不同的库将不共享相同的hla，因此可使用多个库。
实现治疗效果的合适剂量将是例如，优选地在一系列给药周期中，每剂量至少105个或在约105个与约1010个之间的细胞。示例性给药方案由四个一周给药周期的递增剂量，从第0天的至少约105个细胞开始，例如在开始患者内剂量递增方案的几周内逐渐增加最多至约1010个细胞的靶标剂量。合适的施用模式包括静脉内、皮下、腔内(例如通过库进入装置)、腹膜内和直接注射到肿瘤块中。
本发明的药物组合物可单独使用或与可用于治疗癌症的其他已确立的药剂组合使用。不管是单独递送还是与其他药剂组合递送，本发明的药物组合物都可经由各种途径递送到哺乳动物(特别是人)体内的各个部位，以实现特定的效果。本领域技术人员将认识到，尽管可使用超过一种途径进行施用，但是特定的途径可比另一种途径提供更直接和更有效的反应。例如，皮内递送可有利地超过吸入用于治疗黑素瘤。局部或全身递送可通过包括以下的施用来完成：将配制物应用或滴注到体腔中、气溶胶吸入或吹入、或通过肠胃外引入(包括肌内、静脉内、门静脉内、肝内、腹膜内、皮下或皮内施用)。
本发明的组合物可以单位剂型提供，其中每个剂量单位(例如注射剂)含有预定量的单独的或与其他活性剂适当地组合的组合物。如本文所用，术语单位剂型是指适合作为用于人和动物受治疗者的单位剂量的物理上离散的单位，每个单位含有在适当的情况下与药学上可接受的稀释剂、载体或媒介物相结合的、以足以产生所需效果的量计算的、预定量的单独的或与其他活性剂组合的本发明组合物。本发明的新型单位剂型的规格取决于与特定受治疗者中的药物组合物相关的特定药效动力学。
理想地，有效量或足够数量的工程化永生化t细胞存在于组合物中并被引入受治疗者中，以便建立长期、特异性抗肿瘤反应来减小肿瘤的尺寸或消除肿瘤生长或再生长，否则将导致在不存在这种治疗的情况下的其他结果。理想地，重新引入受治疗者中的工程化永生化t细胞的量导致与其中不存在工程化永生化t细胞的其他相同条件相比，肿瘤尺寸减少了10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或100％。
因此，所施用的工程化永生化t细胞的量应考虑施用途径，并且应当使得将引入足够数量的工程化永生化t细胞，以便实现所需的治疗反应。此外，本文所述的组合物中包括的每种活性剂的量(例如，每个将要接触的细胞的量或每某一体重的量)在不同应用中可以变化。一般来讲，理想地，工程化永生化t细胞的浓度应足以在被治疗的受治疗者中提供至少从约1×106个至约1×109个工程化永生化t细胞，甚至更理想地，从约1×107个至约5×108个工程化永生化t细胞，但是可使用上述的任何合适的量，例如大于5×108个细胞，或低于例如小于1×107个细胞。给药时间表可基于已确立的基于细胞的疗法(参见例如，topalian和rosenberg,1987；美国专利号4,690,915)、或者可使用另选的连续输注策略。
这些值提供了执业医生在优化用于实施本发明的本发明方法后将要使用的工程化永生化t细胞的范围的通用指南。如在特定应用中可能授权的，本文中对此类范围的表述决不排除使用更高或更低量的组分。例如，根据组合物是否与其他药物组合物组合施用，或根据药代动力学、药物处置和代谢的个体间差异，实际剂量和时间表可以变化。本领域技术人员可根据特定情况的紧急状态容易地进行任何必要的调整。
免疫系统和免疫疗法
在一些实施方案中，通过转移引发特定免疫应答的重定向永生化t细胞来治疗医学障碍。在本发明的一个实施方案中，通过转移引发特定免疫应答的重定向t永生化t细胞来治疗癌症或医学障碍。因此，对免疫应答的基本了解是有必要。
适应性免疫系统的细胞是一种白细胞类型，称为淋巴细胞。b细胞和t细胞是淋巴细胞的主要类型。b细胞和t细胞均源于相同的多能造血干细胞，并且彼此之间是不能区分的，直到在它们被激活之后。b细胞在体液免疫应答中起很大的作用，然而t细胞密切地参与细胞介导的免疫应答。它们可通过在其细胞表面上存在一种称为t细胞受体(tcr)的特殊受体而与其他淋巴细胞类型(诸如b细胞和nk细胞)区分开来。在几乎所有其他脊椎动物中，b细胞和t细胞由骨髓中的干细胞产生。t细胞传播至胸腺并在胸腺中发育，它们由此而得名。在人类中，每小时大约1％-2％的淋巴细胞池再循环，以优化抗原特异性淋巴细胞在次级淋巴组织内找到其特异性抗原的机会。
t淋巴细胞起源于骨髓中的造血干细胞，并迁移到胸腺中成熟。t细胞在其膜上表达独特的抗原结合受体(t细胞受体)，所述抗原结合受体只能识别与其他细胞表面上的主要组织相容性复合物(mhc)分子相关的抗原。存在至少两个t细胞群，称为t辅助细胞和t细胞毒性细胞。t辅助细胞和t细胞毒性细胞的主要区别在于它们分别显示膜结合糖蛋白cd4和cd8。t辅助细胞分泌对b细胞、t细胞毒性细胞、巨噬细胞和免疫系统的其他细胞的激活至关重要的各种淋巴因子。相比之下，识别抗原-mhc复合物的t细胞毒性细胞增殖并分化为称为细胞毒性t淋巴细胞(ctl)的效应细胞，ctl通过产生导致细胞裂解的物质消除体内显示抗原的细胞，诸如病毒感染的细胞和肿瘤细胞。自然杀伤细胞(或nk细胞)是构成先天免疫系统的主要组分的一种细胞毒性淋巴细胞类型。nk细胞在肿瘤和被病毒感染的细胞的排斥中起主要作用。所述细胞通过释放导致靶细胞通过凋亡而死亡的称为穿孔素和颗粒酶的蛋白质的小胞质颗粒而杀伤。
b细胞在其表面上的抗体与特定外源抗原结合时鉴定病原体。这种抗原/抗体复合物被b细胞吸收，并且通过蛋白水解而被加工成肽。然后，b细胞在其表面ii类mhc分子上显示这些抗原肽。mhc和抗原的这种组合吸引了匹配的辅助t细胞，所述辅助t细胞释放淋巴因子并激活b细胞。随着激活的b细胞然后开始分裂，其后代(浆细胞)分泌数百万个拷贝的识别这种抗原的抗体。这些抗体在血浆和淋巴中循环、与表达所述抗原的病原体结合并标记(包围(hem)以通过补体激活进行破坏或通过吞噬细胞进行摄取和破坏。抗体也可通过结合细菌毒素或通过干扰病毒和细菌用于感染细胞的受体来直接中和攻击(challenges)。
nk细胞或自然杀伤细胞被定义为大颗粒淋巴细胞，所述大颗粒淋巴细胞不表达t细胞抗原受体(tcr)或pant标记cds或表面免疫球蛋白(ig)b细胞受体，但通常表达人类中的表面标记cd16(fcyriii)和cd56、以及某些小鼠品系中的nkl.l/nk1.2。
包括巨噬细胞、b淋巴细胞和树突状细胞在内的抗原呈递细胞通过它们对特定mhc分子的表达而区别开来。apc将抗原内在化，并在其外细胞膜上与mhc分子一起重新表达所述抗原的一部分。主要组织相容性复合物(mhc)是具有多个基因座的大型遗传复合物。mhc病灶编码两大类的mhc膜分子，称为i类和ii类mhc。t辅助淋巴细胞通常识别与ii类mhc分子相关的抗原，并且t细胞毒性淋巴细胞识别与i类mhc分子相关的抗原。在人类中，mhc被称为hla复合物，并且在小鼠中被称为h-2复合物。
t细胞受体或tcr是在t淋巴细胞(或t细胞)表面上发现的分子，所述分子通常负责识别与主要组织相容性复合物(mhc)分子结合的抗原。它是异二聚体，在95％的t细胞中由α和β链组成，而5％的t细胞具有由γ和δ链组成的tcr。tcr与抗原和mhc的结合导致其t淋巴细胞通过由相关酶、共同受体和专门辅助分子介导的一系列生物化学事件激活。在免疫学中，cds抗原(cd代表分化簇)是由哺乳动物中的四条不同链(cdsv、cd35和两倍cdse)构成的一种蛋白质复合物，所述四条不同链与称为t细胞受体(tcr)的分子和ζ链缔合以在t淋巴细胞中产生激活信号。tcr、ζ链和cds分子一起构成tcr复合物。cd3y、cd38和cd3s链是含有单个胞外免疫球蛋白结构域的、免疫球蛋白超家族的高度相关的细胞表面蛋白。cds链的跨膜区带负电，这一特性允许这些链与带正电的tcr链(tcra和tcrfi)缔合。cds分子的胞内尾部含有保守的基序，称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或简称itam，这对于't'cr的信号传导能力至关重要。
cd28是在t细胞上表达的分子之一，所述t细胞提供t细胞激活所需的共同刺激信号。cd28是b7.1(cd80)和b7.2(cd86)的受体。当被toil样受体配体激活时，b7.1表达在抗原呈递细胞(apc)中上调。抗原呈递细胞上的b7.2表达是组成型的。cd28是在幼稚t细胞上组成型表达的唯一b7受体。除tcr以外，通过cd28刺激可为t细胞提供有效的共同刺激信号，以产生各种白介素(尤其是il-2和il-6)。
在临床试验中已经验证分离和扩增抗原特异性t细胞作为人类疾病的治疗干预的策略(riddell等人,1992；walter等人,1995；heslop等人,1996)。
恶性b细胞似乎是重定向t细胞的优异靶标，因为b细胞可充当t细胞的免疫刺激性抗原呈递细胞(glimcher等人,1982)。淋巴瘤凭借其淋巴结的趋向性，在解剖学上处于t细胞介导的识别和消除的理想位置。已在接受hiv特异性cd8+ctl克隆输注的hiv患者中记录了大量的输注t细胞定位到淋巴结。在这些患者中，对淋巴结活检材料的评估揭露输注的克隆构成淋巴结cd8+细胞的大约2％-8％。通过在组成型启动子下用编码l选择分子的cdna构建体共同转染t细胞可进一步改善淋巴结归巢，因为这种粘附分子将循环t细胞引导回淋巴结并且通过体外扩增而下调(chao等人,1997)。本发明可提供一种治疗与表达内源性bcma的细胞相关的人类病症的方法，所述方法包括向患者输注治疗有效剂量的如上所述重组人bcma特异性car表达细胞。与表达内源性bcma的细胞相关的人类病症可选自由以下项构成的组：多发性骨髓瘤、淋巴瘤、白血病、非霍奇金淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞性白血病和b细胞相关的自身免疫疾病。
多发性骨髓瘤(mm)是一种以克隆浆细胞的积聚为特征的癌症。mm是第二常见的血液恶性肿瘤，并且其占全部癌症死亡数多至2％。mm是异质性疾病，并且以宽泛的侵袭性和治疗抗性范围为特征。一些患者在诊断后存活十年或更久，而其他患者则遭受迅速的治疗抗性进展并在2年内死亡。尽管新治疗剂的开发取得进展，目前mm仍是无法治愈的。虽然当前疗法通常导致mm缓解，但疾病最终在几乎所有患者中复发并最终致死(naymagonandabdul-hay,jhematoloncol.2016年6月30日；9(1):52)。此外，常规治疗方法，包括化学疗法和放射疗法由于毒副作用而具有有限的实用性。
白血病是一种血液或骨髓癌，并且特征在于血细胞(通常是白血细胞(白细胞))的异常增殖(按倍增产生)。其是称为血液肿瘤的一大组疾病的一部分。白血病是涵盖一连串疾病的广义术语。白血病在临床和病理学上被分为其急性和慢性形式。
急性白血病的特征在于未成熟血细胞的迅速增殖。这种聚集使骨髓无法产生健康的血细胞。急性形式的白血病可发生在儿童和青壮年中。实际上，与其他类型的恶性疾病相比，它是美国儿童死亡的较常见原因。在急性白血病中由于恶性细胞的迅速进展和积累而需要立即治疗，然后所述恶性细胞溢出到血流中并扩散到身体的其他器官。尽管所述疾病偶尔可引起脑神经麻痹，但中枢神经系统(cns)的累及并不常见。慢性白血病通过相对成熟但仍异常的血细胞的过度积累而区分开来。通常花费几个月到几年的时间进展，所述细胞以比正常细胞高得多的速率产生，从而导致血液中出现许多异常的白血细胞。慢性白血病主要发生在老年人中，但理论上可发生在任何年龄组。虽然急性白血病必须立即治疗，但有时在治疗之前监测慢性形式持续一段时间以确保疗法的最大效果。
此外，将所述疾病分为淋巴细胞性或淋巴母细胞性以及骨髓性或髓样，所述淋巴细胞性或成淋巴细胞性表明癌变发生在通常继续形成淋巴细胞的一种骨髓细胞类型中，所述骨髓性或髓样表明癌变发生在通常继续形成红细胞、一些类型的白细胞和血小板的一种骨髓细胞类型中(参见淋巴样细胞与髓样细胞)。
急性淋巴细胞性白血病(也称为急性淋巴母细胞性白血病或all)是幼儿中最常见的白血病类型。这种疾病还影响成人，尤其是65岁及以上的那些成人。慢性淋巴细胞性白血病(cll)最常影响55岁以上的成人。它有时发生在较年轻的成人中，但几乎不影响儿童。急性骨髓性白血病(也称为急性髓样白血病或aml)在成人中比在儿童中的发生更常见。这种类型的白血病先前被称为“急性非淋巴细胞性白血病”。慢性骨髓性白血病(cml)主要发生在成人中，极少数的儿童也发展这种疾病。
淋巴瘤是起源于淋巴细胞(在脊椎动物免疫系统中的一种白血细胞类型)的一种癌症类型。存在许多类型的淋巴瘤。根据美国国立卫生研究院，淋巴瘤占美国所有癌症病例的约百分之五，并且霍奇金淋巴瘤尤其占美国所有癌症病例的少于百分之一。由于淋巴系统是人体的免疫系统的部分，因此具有减弱的免疫系统(诸如由于hiv感染或由于某些药物(drugs或medication))的患者也具有较高的淋巴瘤发生率。
在19世纪和20世纪所述疾病被称为霍奇金病，因为托马斯·霍奇金(thomashodgkin)于1832年发现了这种疾病。通俗地讲，淋巴瘤被大致分为霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤(所有其他类型的淋巴瘤)。淋巴瘤类型的科学分类更为详细。尽管较旧的分类是指组织细胞淋巴瘤，但在较新的分类中将这些识别为b、t或nk细胞谱系。
自身免疫疾病或自身免疫性是有机体无法将其自身组成部分(低至亚分子水平)识别为“自身”，这导致针对其自身细胞和组织的免疫应答。由这样的异常免疫应答引起的任何疾病都被称为自身免疫疾病。突出的示例包括腹腔疾病、1型糖尿病(iddm)、全身性红斑狼疮(sle)、干燥综合征(sjogren'ssyndrome)、多发性硬化症(ms)、桥本氏甲状腺炎(hashimoto'sthyroiditis)、格雷夫斯病(graves'disease)、特发性血小板减少性紫癜和类风湿性关节炎(ea)。
炎性疾病(包括自身免疫疾病)也是与b细胞障碍相关的一类疾病。自身免疫疾病的示例包括但不限于急性特发性血小板减少性紫癜、慢性特发性血小板减少性紫癜、皮肌炎、西登哈姆氏舞蹈病(sydenham'schorea)、重症肌无力、全身性红斑狼疮、狼疮性肾炎、风湿热、多腺性综合征、大疱性类天疱疮、糖尿病、过敏性紫癜(henoch-schonleinpurpura)、链球菌感染后肾炎(post-streptococcalnephritis)、结节性红斑、大动脉炎(takayasu'sarteritis)、爱迪生氏病(addison'sdisease)、类风湿性关节炎、多发性硬化症、结节病、溃疡性结肠炎、多形性红斑、iga肾病、结节性多动脉炎、强直性脊柱炎、肺出血肾炎综合征(goodpasture'ssyndrome)、血栓闭塞性脉管炎、干燥综合征、原发性胆汁性肝硬化、桥本氏甲状腺炎、甲状腺毒症、硬皮病、慢性活动性肝炎、多肌炎/皮肌炎、多软骨炎、寻常天疱疮、韦格纳氏肉芽肿(wegener'sgranulomatosis)、膜性肾病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、脊髓痨、巨细胞动脉炎/多肌痛、恶性贫血、急进性肾小球肾炎、牛皮癣和纤维性肺泡炎。最常见的治疗是皮质类固醇和细胞毒性药物，它们可能具有很高的毒性。这些药物还抑制整个免疫系统，可能导致严重感染，并且对骨髓、肝脏和肾脏具有不良影响。迄今为止，已经用于治疗iii类自身免疫疾病的其他治疗剂针对t细胞和巨噬细胞。需要治疗自身免疫疾病(尤其是iii类自身免疫疾病)的更有效方法。
本发明的试剂盒的实施方案
试剂盒中可包含本文所述的任何组合物。在一些实施方案中，在试剂盒中提供了工程化永生化car-t细胞，所述试剂盒还可包括适用于扩增细胞的试剂，诸如培养基。
在非限制性示例中，嵌合受体表达构建体、产生嵌合受体表达构建体的一种或多种试剂、用于转染表达构建体的细胞、和/或获得用于转染表达构建体的永生化t细胞的一种或多种仪器(这样的仪器可以是注射器、移液器、钳子和/或任何这种医学认可的装置)。
在一些实施方案中，试剂盒中提供了用于消除内源性tcr表达和b2m的表达构建体、产生所述构建体的一种或多种试剂、和/或car+t细胞。
在一些实施方案中，其包括编码cas9内切核酸酶的表达构建体。
在一些方面，试剂盒包含用于细胞电穿孔的试剂或装置。
在一些实施方案中，试剂盒包含人工抗原呈递细胞。
试剂盒可包含一种或多种适当等分的本发明组合物或产生本发明组合物的试剂。可将试剂盒的组分包装在水性介质中或冻干形式中。试剂盒的容器装置可包括可将组分放入其中并且优选地被适当等分的至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其他容器装置。在试剂盒中存在超过一种组分的情况下，试剂盒通常还将含有可将额外组分单独放入其中的第二、第三或其他额外的容器。然而，小瓶中可包含组分的各种组合。本发明的试剂盒通常还将包括用于容纳嵌合受体构建体的装置和用于商业销售的紧密禁闭的任何其他试剂容器。例如，此类容器可包括在其中保留所需小瓶的注射或吹塑模制塑料容器。
实施方案
本发明还提供以下非限制性实施方案。
1.一种表达嵌合抗原受体(car)的工程化永生化t细胞系，所述car包含：
(a)包含抗原结合区的胞外结构域；
(b)跨膜结构域；以及
(c)胞内信号结构域，
其中所述永生化t细胞系不表达至少一种内源性t细胞受体，并且不表达β2-微球蛋白(b2m)。
2.根据实施方案1所述的永生化t细胞系，其中所述抗原结合区结合肿瘤相关抗原。
3.根据实施方案2所述的永生化t细胞系，其中所述肿瘤相关抗原是bcma。
4.根据实施方案1所述的永生化t细胞系，其中所述抗原结合区结合iii型纤连蛋白(fn3)结构域。
5.根据实施方案1所述的永生化t细胞系，其中所述至少一种内源性t细胞受体被敲除。
6.根据实施方案1所述的永生化t细胞系，其中所述至少一种内源性t细胞受体是tcr-α。
7.根据实施方案1所述的永生化t细胞系，其中所述至少一种内源性t细胞受体是kir3dl2。
8.根据实施方案1所述的永生化t细胞系，其中b2m被敲除。
9.一种表达car的工程化tall-104细胞系，所述car包含：
(a)包含抗原结合区的胞外结构域；
(b)跨膜结构域；以及
(c)胞内信号结构域，
其中所述tall-104细胞系不表达至少一种内源性t细胞受体，并且不表达β2-微球蛋白(b2m)。
10.根据实施方案9所述的细胞系，其中所述抗原结合区结合肿瘤相关抗原。
11.根据实施方案10所述的细胞系，其中所述肿瘤相关抗原是bcma。
12.根据实施方案9所述的细胞系，其中所述抗原结合区结合iii型纤连蛋白(fn3)结构域。
13.根据实施方案9所述的细胞系，其中所述至少一种内源性t细胞受体被敲除。
14.根据实施方案9所述的细胞系，其中所述至少一种内源性t细胞受体是tcr-α。
15.根据实施方案9所述的细胞系，其中所述至少一种内源性t细胞受体是kir3dl2。
16.根据实施方案9所述的细胞系，其中b2m被敲除。
17.一种表达car的工程化tall-104细胞系，所述car包含：
(a)信号肽，所述信号肽具有seqidno:3的氨基酸序列；
(b)胞外结构域，所述胞外结构域包含具有seqidno:8-44中的任一者的氨基酸序列的fn3结构域；
(c)铰链区，所述铰链区具有seqidno:4的氨基酸序列；
(d)跨膜结构域，所述跨膜结构域具有seqidno:5的氨基酸序列；以及
(e)胞内信号结构域，所述胞内信号结构域包含具有seqidno:6的氨基酸序列的共同刺激结构域以及具有seqidno:7的氨基酸序列的初级信号结构域；
其中所述细胞系不表达trca、kir3dl2和b2m。
18.一种表达car的工程化tall-104细胞系，所述car包含：
(a)胞外结构域，所述胞外结构域包含具有seqidno:54和55中的任一者的氨基酸序列的scfv；
(b)铰链区，所述铰链区具有seqidno:4的氨基酸序列；
(c)跨膜结构域，所述跨膜结构域具有seqidno:5的氨基酸序列；以及
(d)胞内信号结构域，所述胞内信号结构域包含具有seqidno:6的氨基酸序列的共同刺激结构域以及具有seqidno:7的氨基酸序列的初级信号结构域；
其中所述tall-104细胞系不表达trca、kir3dl2和b2m。
19.一种产生表达car的工程化永生化t细胞系的体外方法，所述方法包括以下步骤：
a.提供永生化t细胞系；
b.抑制至少一种内源性t细胞受体和b2m的表达；以及
c.将编码car的多核苷酸引入所述永生化t细胞中。
20.根据实施方案19所述的方法，其中步骤b发生在步骤c之前。
21.根据实施方案19所述的方法，其中步骤c发生在步骤b之前。
22.根据实施方案19所述的方法，其中步骤b通过使用内切核酸酶来执行。
23.根据实施方案22所述的方法，其中所述内切核酸酶是tal核酸酶、大范围核酸酶、锌指核酸酶(zfn)或cas9。
24.根据实施方案19所述的方法，其中步骤c被进一步定义为通过电穿孔或基于病毒的基因转移系统将编码car的多核苷酸引入所述永生化t细胞中。
25.根据实施方案4所述的方法，其中所述基于病毒的基因转移系统包含逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或慢病毒载体。
26.一种药物组合物，所述药物组合物包含药学上可接受的载体和根据实施方案1-18中任一项所述的工程化免疫细胞。
27.一种治疗对其有需要的受治疗者中的癌症的方法，所述方法包括向所述受治疗者施用治疗有效量的根据实施方案26所述的药物组合物。
28.根据实施方案27所述的方法，其中所述癌症是多发性骨髓瘤。
29.一种制备药物组合物的方法，所述方法包括将根据实施方案1-18中任一项所述的工程化永生化t细胞系与药学上可接受的载体组合以获得所述药物组合物。
实施例
本发明的以下实施例旨在进一步说明本发明的性质。应当理解，以下实施例不限制本发明，并且本发明的范围由所附权利要求书确定。
实施例1：用于电穿孔的tall-104细胞的制备
将指数生长的tall-104细胞以0.7×106个细胞/ml的密度接种在完全tall-104细胞培养基[myeloculth5100培养基(stemcelltechnologies05150)；1％丙酮酸钠(invitrogen11360-070)；1％非必需氨基酸(invitrogen11140-050)；4um氢化可的松(stemcelltechnologies07904)；100iu/ml重组人il-2(r&dsystems202-il，2.1e4iu/ug)]中，并且在37℃下孵育。第二天，通过以100xg离心10min收集所需数量的细胞(1×106/电穿孔)。将细胞用10ml冷的opti-mem(thermofisherscientific，31985062)洗涤两次，以100xg离心10min并且重悬于0.1ml×(电穿孔实验总数+1)先前平衡至室温的opti-mem中。
实施例2：核糖核蛋白复合物的制备
指导rna
设计一种grna来靶向tcrα基因(trac)的恒定链的第一个外显子。位于tcrα跨膜结构域上游的所靶向的序列是tcrα和β组装并寻址细胞表面所必需的。在cas9内切核酸酶介导的dna切割后，非同源末端连接(nhej)或通过同源定向修复(hdr)整合car都将导致trac基因的消融。为了破坏b2m基因座，设计了靶向所述第一个外显子的grna。对于负责在自然杀伤细胞和t细胞亚组上产生跨膜糖蛋白的基因kir3dl2，设计了靶向第三个外显子的grna。
表1：用于基因编辑的指导rna的序列。
grna:tracrrna双链体的形成
由integrateddnatechnologies定制合成靶标特异性alt-rtmcrispr-cas9指导rna(grna)。从integrateddnatechnologies获得与grna杂交的通用67聚体alt-rtmcrispr-cas9tracrrna(1072534)。将alt-rtmcrispr-cas9grna和alt-rtmcrispr-cas9tracrrna重悬于idte缓冲液(integrateddnatechnologies，11-01-03-01)中，终浓度为200μm。在无菌微量离心管中将两种rna寡聚物以等摩尔浓度混合，最终双链体浓度为100μm。将grna:tracrrna混合物在95℃下加热5min，其后允许其在工作台上冷却至室温以促进双链体形成。
核糖核蛋白(rnp)复合物的形成
在无菌pcr管中，添加2.1ul的pbs、1.2ul(120pmol)的grna:tracrrna双链体和1.7ul(104pmol)的alt-r酿脓链球菌cas9酶(integrateddnatechnologies，1078728)。在室温下混合并孵育20min以允许rnp形成。
实施例3：用rnp复合物电穿孔tall-104细胞
将5μlrnp复合物和0.1μl(1×10^6个细胞)的制备tall-104细胞添加到2mm间隙大小btx电穿孔比色皿(btx，45-0135)中。按照制造商的规程，使用ecm830方波电穿孔系统(btx)以200v的单脉冲将细胞电穿孔10毫秒。将电穿孔的细胞立即转移到含有先前在37℃下平衡的tall-104细胞培养基的一个12孔板中。电穿孔后24小时更换培养基。
在facscalibur或lsrfortessa(bdbiosciences)上通过流式细胞术分析crispr-cas9介导的基因编辑的效率。通过以100xg离心10min，在rnp复合物电穿孔后5天收获100,000个细胞。将细胞用200ul染色缓冲液(bdbiosciences，554657)洗涤2次，并且重悬于100ul染色缓冲液中。添加根据制造商的说明书的相关抗体(pe标记的小鼠抗人β2微球蛋白(b2m)抗体(bdpharmingen，551337)或同种型对照抗体(biolegend，400214)、apc标记的小鼠抗人cd3抗体(biolegend，300439)或同种型对照(biolegend，400120))，并且将其在黑暗中于4℃下孵育45min。将细胞以100xg离心，用染色缓冲液洗涤2次，并且重悬于200ul染色缓冲液中。通过流式细胞术收集数据并将其使用flojo软件进行分析。图1示出了在用相关的rnp复合物电穿孔之后b2m和tcr敲除亚群的水平。
实施例4：crisprcas9介导的编辑后基因编辑的tall-104亚群的分离
通过涂覆有抗藻红蛋白单克隆抗体(mab)的磁珠，通过磁细胞分离(macs)技术从未编辑的野生型细胞中分离基因编辑的tall-104细胞。简而言之，对tall-104细胞进行计数，在4℃下以100xg离心10min，并且在5ml冷的脱气缓冲液x(含有0.5％bsa和2mmedta的pbs)中洗涤两次。将细胞重悬于1ml缓冲液x中，并且与根据制造商的说明书靶向感兴趣的蛋白质的pe缀合的抗体(pe抗cd3或pe抗b2m)一起在4℃下孵育45-60min。将细胞在4℃下以100xg离心10min，并且重悬于0.5ml含有抗pe微珠的冷的缓冲液x(miltenyibiotec，目录号130-105-639)。将混合物在黑暗中于4℃下孵育30min、离心并且重悬于500μl缓冲液x中。将细胞加载到预先用3ml缓冲液x平衡的、置于quadromacs分离器(miltenyibiotec，130-090-976)上的ls柱(miltenyibiotec130-042-401)中。将所述柱用1ml缓冲液x洗涤两次。将基因编辑敲除的tall-104细胞分离并收集在流出液中，并且在tall-104完全细胞培养基(0.7×106个细胞/ml)中在37℃和5％co2下培养。图2示出了使用macs磁珠标记技术分离基因编辑敲除的细胞。
实施例5：表达靶向bcma或iii型纤连蛋白结构域的car的工程化tall-104细胞的产生和分析
两种不同car序列的氨基酸序列通过信号肽、铰链序列、tm结构域和信号结构域进行反向翻译和工程改造。将完成的构建体克隆到t7体外转录载体中，以使用可商购获得的mmessage
表2：以可靶向bcma的胞外fn3结构域为特征的d08car构建体的氨基酸序列。
表3：靶向fn3结构域的as7b91car构建体的氨基酸序列。
使用ecm830方波电穿孔系统(btx)将mrna电穿孔到tall-104细胞中。已经在完全tall-104培养基中生长了三周的3.5×106个tall-104细胞按照根据制造商的规程在有或没有10μg的carmrna的情况下接受单电脉冲(400v、750us)。24小时后使用as7b91抗fn3结构域抗体评估d08car的表面表达。类似地，24小时后使用缀合的fn3结构域评估as7b91car的表面表达。图3所示的结果证明tall-104表达bcma和抗fn3结构域car。
实施例6：使用tall-104工程化细胞作为效应细胞的细胞毒性测定
使用表达bcma的细胞和celltrackertm绿色染色的rpmi-8226细胞(atcc：ccl-155)、daudi细胞(atcc：ccl-213)和k562细胞(atcc：ccl-243)(它们均以不同水平表达bcma)作为靶细胞，评价bcma靶向(d08)和fn3结构域靶向(as7b91)car-tall-104细胞的杀伤。将as7b91-car-tall-104细胞、d08-car-tall-104细胞和模拟物tall-104细胞(无电穿孔的mrna)与bcma靶细胞以每孔约0.2的e:t比共同孵育20小时。对于as7b91-car-tall-104细胞，将bcma特异性或非靶向对照(nt)fn3结构域与细胞共同孵育。在实验结束时，用hoechst33342(细胞核染色)加碘化丙啶(死细胞染色)将细胞染色15分钟。
将细胞在perkinelmeropera共聚焦显微镜上以20x进行成像(每孔5张图像)，以检测hoechst33342(紫外灯，其检测所有细胞的细胞核)、celltrackertm绿色(488nm激光，其仅检测靶细胞)和碘化丙啶(561nm激光，其检测所有死细胞)。使用perkinelmercolumbus软件分析图像以识别靶细胞(使用celltrackertm绿色强度)，并且根据细胞核中碘化丙啶染色的强度将它们定义为活的或死的。在graphpadprism软件中绘制每孔死靶细胞的百分比。在添加bcma特异性fn3结构域之后40小时，从原始杀伤测定反应混合物中收集细胞等分试样，并且再次染色并评估死靶细胞的百分比。图4示出了tall-104car表达细胞以靶标特异性方式杀伤靶细胞。对于细胞共同孵育之后20小时的as7b91-car-tall-104细胞(图4a)，与10nm非靶向对照(nt)fn3结构域(27％)相比，在共同孵育的0.32nmbcma特异性fn3结构域的存在下(40％杀伤)，对rpmi-8226细胞的杀伤增加了。在共同孵育的0.32nmbcma特异性fn3结构域的存在下，对daudi细胞的杀伤从17％(nt)增加至58％。在共同孵育的0.32nmbcma特异性fn3结构域的存在下，对k562细胞的杀伤没有增加。在40小时时(图4b)，对daudi细胞的as7b91-car-tall-104细胞杀伤从10nmntfn3结构域的15％增加至在0.32nmbcma特异性fn3结构域的存在下的70％。与nt对照的45％相比，对rpmi-8226细胞的as7b91-car-tall-104细胞杀伤在共同孵育的0.32nmbcma特异性fn3结构域的存在下为59％。在40小时时，在k562细胞中未观察到bcma特异性杀伤。对于共同孵育细胞之后20小时的d08-car-tall-104细胞(图4c)，与在共同孵育的0.32nmbcma特异性fn3结构域的存在下的模拟物tall-104细胞(23％)相比，对rpmi-8226细胞的杀伤增加了(37％杀伤)。对daudi细胞的杀伤从11％(模拟物tall-104)增加到在共同孵育的d08-car-tall-104细胞的存在下的42％。对k562细胞的杀伤从11％(模拟物tall-104)增加到在共同孵育的d08-car-tall-104细胞的存在下的20％。
实施例7：htert工程化tall-104细胞具有增加的增殖能力
用编码人tert基因和egfp报告基因的慢病毒载体转导tall-104细胞。通过facs选择成功地转导并稳定地整合了转基因的绿色荧光细胞作为egfp阳性细胞，并且根据标准培养程序允许其在补充有人il-2的tall-104培养基中扩增。允许细胞随时间扩增并继续扩增，然而未转导的细胞停止增殖(图5)。
实施例8：工程改造tall-104细胞以进行il-2非依赖性生长
用拥有具有c末端修饰(kdel(seqidno:68))的人il-2转基因的第二种慢病毒载体进一步转导htert转导的细胞，其将所编码的蛋白质保留在细胞的内质网中。在不存在外源性il-2的情况下培养这些转导细胞导致成功转导的细胞扩增，然而未转导的细胞停止扩增并死亡(图6)。
然后，通过将f11bcma靶向的carmrna瞬时电穿孔到p102细胞中来测试p102细胞的靶向杀伤。由图7可见，在不存在外源性il-2的情况下生长但稳定地表达er保留的il-2的p102细胞与在具有外源性il-2的情况下生长并表达相同的f11bcma靶向的car的野生型tall-104细胞一样有效地杀伤mm1s细胞。
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