重组谷氨酸棒杆菌、其构建方法及其生产四氢嘧啶的方法与流程

本发明属于基因工程和生物发酵
技术领域：
，具体的涉及一种重组谷氨酸棒杆菌、构建该重组谷氨酸棒杆菌的方法、以及利用该重组菌株生产四氢嘧啶的方法。
背景技术：
：四氢嘧啶(ectoine)是许多耐盐和嗜盐微生物为维持渗透压平衡而在细胞内产生的一种相容性溶质，能够为处于外界高温、冷冻、射线、干燥等极端条件刺激下的细胞、蛋白质、细胞膜和核酸等提供保护作用。此外四氢嘧啶对阿尔兹海默氏症、帕金森病等神经性疾病均有一定的疗效，并且最新研究发现四氢嘧啶能够提高皮肤的再生能力和延缓皮肤的老化。因此，四氢嘧啶在精细化工和生物医药等行业将具有广泛的应用前景。目前，四氢嘧啶的生产方法主要通过嗜盐微生物特别是盐单胞菌的高密度发酵来获得。这个过程通过采用被称为“细菌挤奶法”的方式进行生产，即高渗透压下培养细菌、然后低渗冲击释放溶质、再将菌体重新高渗培养、低渗冲击释放溶质，依次循环多至8-9次，获得产物。该方法对反应器材料的稳定性有较高要求，而且这种不连续的生产流程及高浓度的盐增加了下游纯化工艺的难度，另外高浓度的盐易对设备造成腐蚀，同时还会影响菌体的生长，影响四氢嘧啶的产量，导致生产成本的增加，影响了四氢嘧啶的大规模应用。目前现有的生产四氢嘧啶的菌株及方法严重制约了四氢嘧啶的工业化生产和大规模应用，因此开发一株新型的四氢嘧啶高产菌株从而简化生产工艺、提高合成效率、降低生产成本，对四氢嘧啶的应用有重要的实践意义。技术实现要素：目前现有的四氢嘧啶生产工艺复杂、合成效率低、生产成本高，严重制约了四氢嘧啶的工业化生产和大规模应用。本发明的目的是提供一种生物安全性高、四氢嘧啶产量高、发酵操作简便且生产成本低廉的利用重组谷氨酸棒杆菌生产四氢嘧啶的方法，以克服现有技术的不足。因此，第一方面，本发明提供了一种重组谷氨酸棒杆菌，所述重组谷氨酸棒杆菌以野生型谷氨酸棒杆菌为出发菌株，所述重组谷氨酸棒杆菌具有：相比所述出发菌株，表达水平降低的磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶、高丝氨酸脱氢酶和二氢嘧啶二羧酸合成酶；用于表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的基因表达盒；以及用于表达ecta酶、ectb酶和ectc酶的基因表达盒。在第二方面，本发明提供了构建第一方面所述的重组谷氨酸棒杆菌的方法，所述方法包括：以野生型谷氨酸棒杆菌为出发菌株，使其中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶、高丝氨酸脱氢酶和二氢嘧啶二羧酸合成酶的表达水平降低，同时向所述出发菌株中导入用于表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的基因表达盒和用于表达ecta酶、ectb酶和ectc酶的基因表达盒，从而得到所述重组谷氨酸棒杆菌。在第三方面，本发明提供了第一方面所述的重组谷氨酸棒杆菌或由第二方面所述的方法构建的重组谷氨酸棒杆菌在生产四氢嘧啶方面的应用。在第四方面，本发明还提供了一种生产四氢嘧啶的方法，所述方法包括：对第一方面所述的重组谷氨酸棒杆菌或由第二方面所述的方法构建的重组谷氨酸棒杆菌进行发酵，从而获得四氢嘧啶。本发明的有益效果如下：利用本发明的重组谷氨酸棒杆菌来生产四氢嘧啶，四氢嘧啶的产量可达25g/l，相比于现有技术中报道的其它可产四氢嘧啶的菌株(例如，cn107142234a中所公开的菌株)，具有明显的改善。谷氨酸棒杆菌是一种食品安全级的微生物，被广泛应用于氨基酸(例如，谷氨酸和赖氨酸)的生产，其不会分泌内毒素。因此，利用谷氨酸棒杆菌来发酵生产四氢嘧啶不仅解决了生物安全性问题，并且省去了后续工程中去除毒素分离提纯产物的繁琐步骤，极大地降低了生产成本，具有良好的工业应用前景。附图说明图1是示出了根据本发明的重组谷氨酸棒杆菌中的四氢嘧啶生物合成途径的示意图。图2是本发明实施例1的重组谷氨酸棒杆菌cg.ect-2根据时间的四氢嘧啶的产量。具体实施方式下文描述了本发明的示例性实施方式，本领域技术人员应该明了的是，以下实施方式并不限制本发明的特定实施方式，应理解为包括本发明的精神和范围内的所有变体、等同物或替代物。多种调整和其它实施方式在本领域普通技术人员的能力范围内，并预期落入本发明的范围内。除非另有说明，下文所使用的实验方法均为本领域技术人员所熟知的常规方法，例如可利用下列著作中描述的标准程序来实施：sambrook等，molecularcloning：alaboratorymanual(第3版)，coldspringharborlaboratorypress，coldspringharbor，n.y.，usa(2001)；davis等，basicmethodsinmolecularbiology，elseviersciencepublishing，inc.，newyork，usa(1995)；以及currentprotocolsincellbiology(cpcb)(juans.bonifacino等著，johnwileyandsons，inc.)。除非另有说明，本文中使用的术语“谷氨酸棒杆菌(corynebacteriumglutamicum)”或“野生型谷氨酸棒杆菌”是指未通过本发明第二方面所述的构建生产四氢嘧啶的重组谷氨酸棒杆菌的方法或其它本领域已知的方法来使其中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶、高丝氨酸脱氢酶和二氢嘧啶二羧酸合成酶的表达水平降低，同时向其中导入了用于表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的基因表达盒和用于表达ecta酶、ectb酶和ectc酶的基因表达盒的谷氨酸棒杆菌。相应地，本文中使用的术语“重组谷氨酸棒杆菌”则是其中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶、高丝氨酸脱氢酶和二氢嘧啶二羧酸合成酶的表达水平相对于野生型谷氨酸棒杆菌而言降低，同时具有用于表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的重组表达盒以及用于表达ecta酶、ectb酶和ectc酶的基因表达盒的谷氨酸棒杆菌。本文中使用的术语“中间重组菌”是指在构建本发明的重组谷氨酸棒杆菌过程中获得的部分酶的表达水平降低和/或导入了部分基因表达盒的重组菌。在某些实施方式中，所述“中间重组菌”也属于“野生型谷氨酸棒杆菌”的范围。本文中使用的术语“靶基因”是指编码本发明所述的磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶、高丝氨酸脱氢酶、二氢嘧啶二羧酸合成酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶以及ecta酶、ectb酶和ectc酶的基因。而本文中使用的术语“目标基因”是指为了将靶基因导入、表达、和/或使靶基因水平下降(例如敲除)而依据本领域已知的方法设计得到的基因。本文中使用的术语“下降”或“降低”通常都意味着统计学显著量的下降。然而，为避免疑义，术语“下降”或“降低”表示相比参比水平(例如在野生型谷氨酸棒杆菌中的表达水平)下降至少10％，例如下降至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或上至并包括下降100％(如，相比参比水平的缺失水平或不可检测水平)、或相比参比水平下降在10％到100％之间的任意量。在本文中使用的术语“基因/酶的表达水平下降”意指重组谷氨酸棒杆菌中基因/酶的表达水平相比野生型谷氨酸棒杆菌而言下降至少10％，例如下降至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或上至并包括下降100％(即，无基因表达或无可检测水平的基因表达)。在重组重组谷氨酸棒杆菌中基因的表达水平相比野生型谷氨酸棒杆菌中基因而言下降至少约90％的情况下，本文中也可将其称之为“基因失活”。在本文中，通过“敲除”可使基因失活，甚至使靶基因的基因表达水平下降至100％，进而使该基因编码的蛋白的表达水平降低至不可检测水平。四氢嘧啶的生物合成途径如图1所示。经过大量分析与实验，本发明人发现，在谷氨酸棒杆菌中，降低磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的表达水平，同时表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，可强化流向草酰乙酸的碳流量，能够为四氢嘧啶合成提供更多的前体物质；降低高丝氨酸脱氢酶的表达水平，可阻断流向l-苏氨酸的碳流量；降低二氢嘧啶二羧酸合成酶的表达水平，可阻断流向l-赖氨酸的碳流量；同时过表达四氢嘧啶合成途径的ecta酶、ectb酶和ectc酶，能够获得高表达四氢嘧啶的重组谷氨酸棒杆菌。将该重组菌株在发酵罐中进行发酵培养可获得较高产量的四氢嘧啶，并且不产生内毒素，解决了生物安全性问题，并且降低了生产成本。在本发明中，谷氨酸棒杆菌中编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的基因为磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶基因pck(ncbino.:cp025533.1)，其多核苷酸序列可如seqidno.:1所示；谷氨酸棒杆菌中编码高丝氨酸脱氢酶的基因为高丝氨酸脱氢酶基因hom(ncbino.:cp025533.1)，其多核苷酸序列可如seqidno.:3所示；以及，谷氨酸棒杆菌中的编码二氢嘧啶二羧酸合成酶的基因为二氢嘧啶二羧酸合成酶基因dapa(ncbino.:cp025533.1)，其多核苷酸序列可如seqidno.:4所示。根据本发明的第一方面，本发明提供了一种重组谷氨酸棒杆菌，所述重组谷氨酸棒杆菌以野生型谷氨酸棒杆菌为出发菌株，所述重组谷氨酸棒杆菌具有：相比所述出发菌株，表达水平降低的磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶、高丝氨酸脱氢酶和二氢嘧啶二羧酸合成酶；用于表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的基因表达盒；以及用于表达ecta酶、ectb酶和ectc酶的基因表达盒。在本发明的重组谷氨酸棒杆菌的一些实施方式中，通过敲除所述出发菌株中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶基因pck(也称为“pck基因”)、高丝氨酸脱氢酶基因hom(也称为“hom基因”)和二氢嘧啶二羧酸合成酶基因(也称为“dapa基因”)使磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶、高丝氨酸脱氢酶和二氢嘧啶二羧酸合成酶的表达水平降低。在本发明的重组谷氨酸棒杆菌的一些实施方式中，所述用于表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的基因表达盒具有由seqidno.:2所示的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc(也称为“ppc基因”，来源于谷氨酸棒杆菌菌株atcc13032(ncbino.:p025533.1))。在优选的实施方式中，可用ppc基因替换pck基因，获得所述用于表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的表达盒，同时使磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的表达水平降低。在本发明的重组谷氨酸棒杆菌的一些实施方式中，所述用于表达ecta酶、ectb酶和ectc酶的基因表达盒具有启动子tac，编码ecta酶、ectb酶和ectc酶的基因和终止子rrnb。在本发明的重组谷氨酸棒杆菌的优选实施方式中，所述编码ecta酶、ectb酶和ectc酶的基因为四氢嘧啶合成途径相关基因ectabc(也称为“ectabc基因”)。ectabc基因是含有编码四氢嘧啶生物合成途径中的ecta酶、ectb酶和ectc酶这三个酶的基因的基因簇，在生产四氢嘧啶的嗜盐菌(例如盐单胞菌，如伸长盐单胞菌(halomonaselongata))的基因组中存在。在本发明中，优选选用来自伸长盐单胞菌的ectabc基因(ncbino.:d88359.1)，例如，经密码子优化的如seqidno.:5所示的序列，其结合启动子tac和终止子rrnb构成基因表达盒来在谷氨酸棒杆菌中过表达ecta酶、ectb酶和ectc酶。根据本发明的第二方面，本发明提供了一种构建第一方面所述的生产四氢嘧啶的重组谷氨酸棒杆菌的方法，所述方法包括：以野生型谷氨酸棒杆菌为出发菌株，使所述出发菌株中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶、高丝氨酸脱氢酶和二氢嘧啶二羧酸合成酶的表达水平降低，同时向所述出发菌株中导入用于表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的基因表达盒和用于表达ecta酶、ectb酶和ectc酶的基因表达盒，从而得到所述重组谷氨酸棒杆菌。其中，可使用本领域技术人员已知的任何方法来使靶基因(例如pck基因、hom基因和dapa基因)的表达水平下降(包括使靶基因失活)进而使磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶、高丝氨酸脱氢酶和二氢嘧啶二羧酸合成酶的表达水平降低，例如降低至少约80％、或至少约90％、或降低100％。此类方法包括但不限于同源重组、crispr/cas9系统、cre/loxp系统、定点突变或rna干扰(rnai)。在本发明构建方法的一些实施方式中，可通过敲除的方法来使磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶、高丝氨酸脱氢酶和二氢嘧啶二羧酸合成酶的表达水平降低：例如敲除pck基因、hom基因和dapa基因的核糖体结合位点序列(rbs)、启动子序列或开放阅读框序列的部分或全长序列，从而导致靶基因的表达水平下降，进而导致其编码的各种酶的表达水平降低。在本发明构建方法的优选的实施方式中，可将靶基因(例如pck基因、hom基因和dapa基因)的开放阅读框序列的部分或全长序列敲除，从而导致靶基因的表达水平下降，进而使磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶、高丝氨酸脱氢酶和/或二氢嘧啶二羧酸合成酶的表达水平降低。在本发明的构建方法中，可使用本领域已知的任何方法来敲除pck基因、hom基因和dapa基因，例如但不限于同源重组、crispr/cas9系统、cre/loxp系统等。其中，可使用本领域技术人员已知的任何方法来向所述出发菌株中导入用于表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的基因表达盒和用于表达ecta酶、ectb酶和ectc酶的基因表达盒。在本发明的方法中，可使用本领域已知的任何方法来将靶基因(例如ppc基因)导入谷氨酸棒杆菌的基因组中，例如但不限于：同源重组、crispr/cas9系统、cre/loxp系统。在优选的实施方式中，可将待导入的靶基因(例如ppc基因)替换待敲除的靶基因(例如pck基因)来使待敲除的靶基因被敲除而同时引入待导入的靶基因，该待导入的靶基因与该待敲除的靶基因的上游启动子和下游终止子构成该待导入的靶基因的基因表达盒，从而表达由该靶基因编码的蛋白。在优选的具体实施方式中，用ppc基因替换pck基因。在本发明的构建方法中，用于表达ecta酶、ectb酶和ectc酶的基因表达盒具有表达ecta酶、ectb酶和ectc酶的基因簇，即四氢嘧啶合成途径相关基因ectabc。在优选的实施方式中，将ectabc基因连接至谷氨酸棒杆菌表达载体上获得重组表达载体，然后将该载体导入谷氨酸棒杆菌或中间重组菌获得过表达靶基因的中间重组菌或者本发明的生产四氢嘧啶的重组谷氨酸棒杆菌。在一个实施方式中，用于表达ecta酶、ectb酶和ectc酶的基因表达盒具有启动子tac，编码ecta酶、ectb酶和ectc酶的基因和终止子rrnb。在本发明的涉及同源重组的实施方式(例如通过同源重组来敲除和/或导入靶基因)中，同源敲除和/或导入中使用的同源序列片段可来源于：根据本领域公知的数据库(例如ncbi数据库)上公布的来源于谷氨酸棒杆菌的靶基因(例如ppc基因、pck基因、hom基因和/或dapa基因)或来源于产四氢嘧啶的菌株(如伸长盐单胞菌)的ectabc基因序列进行人工合成；或者利用pcr的方法从谷氨酸棒杆菌或伸长盐单胞菌的基因组上扩增靶基因，从而获得靶基因的初始同源序列片段。在此，靶基因的部分或全部初始同源序列是指含有上述靶基因(ppc基因、ectabc基因、pck基因、hom基因和/或dapa基因)的序列。同源重组的具体操作方法是本领域技术人员所熟知的，例如，可以参照“corynebacteriumglutamicum:biologyandbiotechnology”(yukawa等人，springer出版社，第51-106页，2012)来进行同源重组，在此不再进行赘述，通过引用的方式将其整体并入本文。本领域技术人员可以理解的是，可以独立地对不同靶基因(例如pck基因、hom基因和/或dapa基因)进行相同或不同的处理(例如，同源重组、crispr/cas9系统、cre/loxp系统、定点突变或rnai)，以实现使各靶基因的表达水平下降进而使各靶基因编码的蛋白的表达水平降低这一目的。例如，可仅通过同源重组技术使pck基因、hom基因和dapa基因的表达水平下降；或者，也可通过同源重组技术使pck基因的表达水平下降，并使用定点突变技术或rnai技术使任选的hom基因和/或dapa基因的表达水平下降。本领域技术人员还可以理解的是，在本发明的构建方法中，可单独地敲除靶基因(例如hom基因和dapa基因)，或单独地导入靶基因(例如ppc基因)；也可导入靶基因(例如ppc基因)的同时敲除靶基因(例如pck基因)；或者也可同时敲除多个靶基因(例如同时敲除hom基因和dapa基因)，或同时导入多个靶基因(例如ppc基因和ectabc基因)。在本发明的构建方法中，将构建的重组质粒或多核苷酸片段转化(导入)谷氨酸棒杆菌(包括野生型谷氨酸棒杆菌和中间重组菌)的方法可以为本领域常规的转化方法。例如，所述转化方法可包括以下步骤：制备谷氨酸棒杆菌的感受态细胞，然后用重组质粒转化感受态细胞，所述转化例如可选自电击转化或化学转化。其中，感受态细胞可以人工制备，也可以商购获得。在本发明的构建方法中，还进一步包括对重组菌进行筛选和鉴定的步骤，例如对重组菌进行菌落pcr分析，测序确定靶基因是否敲除或引入。在本发明的制备重组谷氨酸棒杆菌的方法中，野生型谷氨酸棒杆菌包括但不限于：谷氨酸棒杆菌野生型菌株atcc13032或谷氨酸棒杆菌野生型菌株s9114。在一些实施方式中，当采用的野生型谷氨酸棒杆菌本身含有ppc基因时，例如以菌株atcc13032为出发菌株，则可省略向所述出发菌株中导入用于表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的基因表达盒这一步骤。在一些实施方式中，当采用的野生型谷氨酸棒杆菌本身的磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶、高丝氨酸脱氢酶和/或二氢嘧啶二羧酸合成酶的表达水平较低时，则可省略使相应的酶的表达水平降低的步骤。在本发明构建方法的一些实施方式中，靶基因(例如ppc基因、pck基因、hom基因和dapa基因)的敲除和/或导入可通过整合载体进行。在本发明中，所述整合载体是指将目标基因整合至目标菌株的染色体基因组中的载体，例如整合质粒，如自杀性质粒pk18mobsacb。在本发明构建方法的一些实施方式中，可使用可用于谷氨酸棒杆菌的表达载体对靶基因(ectabc基因)实施过表达。在本发明中，所述表达载体是指使目标基因在目标菌株中表达的载体，例如谷氨酸棒杆菌过表达质粒pxmj19。在本发明构建方法的一些实施方式中，可通过如下步骤构建本发明所述的生产四氢嘧啶的重组谷氨酸棒杆菌：1)将用于使ppc基因替换pck基因的多核苷酸序列连接至谷氨酸棒杆菌自杀性质粒上，获得重组质粒，将该重组质粒导入谷氨酸棒杆菌中，获得重组菌c.glutamicum-δpck-ppc；2)将用于敲除hom基因的多核苷酸序列连接至谷氨酸棒杆菌自杀性质粒上，获得重组质粒，将该重组质粒导入步骤1)中得到的重组菌c.glutamicum-δpck-ppc中，获得重组菌c.glutamicum-δhom-δpck-ppc；3)将用于敲除dapa基因的多核苷酸序列连接至谷氨酸棒杆菌自杀性质粒上，获得重组质粒，将该重组质粒导入步骤2)中得到的重组菌c.glutamicum-δhom-δpck-ppc中，获得重组菌c.glutamicum-δdapa-δhom-δpck-ppc；以及4)根据谷氨酸棒杆菌密码子偏好性，将经优化的表达ectabc基因的多核苷酸序列连接至谷氨酸棒杆菌表达质粒上，获得重组质粒，将该重组质粒导入步骤3)中得到的重组菌c.glutamicum-δdapa-δhom-δpck-ppc中，获得所述重组谷氨酸棒杆菌c.glutamicum-δdapa-δhom-δpck-ppc-ectabc。其中，在步骤1)中，用于使ppc基因替换pck基因的多核苷酸序列由seqidno.:6所示，其中seqidno.:6包含pck基因上游1001bp、seqidno.:2的ppc基因和pck基因下游999bp；在步骤2)中，用于敲除hom基因的多核苷酸序列由seqidno.:7所示，其中seqidno.:7包含谷氨酸棒杆菌基因组的hom基因的上游1000bp和其下游1000bp；在步骤3)中，用于敲除dapa基因的多核苷酸序列由seqidno.:8所示，其中seqidno.:8包含谷氨酸棒杆菌基因组的dapa基因的上游1000bp和其下游1000bp；在步骤4)中，用于表达ectabc基因的多核苷酸序列由seqidno.:5所示。在步骤1)-3)中所述自杀性质粒为可商购的谷氨酸棒杆菌自杀性质粒，即适用于谷氨酸棒杆菌的自杀性质粒，如pk18mobsacb。在步骤4)中所述表达质粒为可商购的谷氨酸棒杆菌表达质粒，即适用于在谷氨酸棒杆菌中表达靶基因的表达质粒，如pxmj19。其中，在步骤1)-步骤4)中，将目标基因连接至自杀性载体或表达载体的方法是本领域技术人员已知的，例如平末端连接法、粘性末端连接法。在本发明构建方法的优选的实施方式中，采用对人工合成的目标基因的多核苷酸序列进行双酶切后利用dna连接酶连接至质粒上，双酶切和连接的反应体系和反应程序可以根据生产商提供的说明书进行。在本发明的具体实施方式中，在步骤1)中，采用smai/sali限制性内切酶双酶切以及连接将由seqidno.:6所示的多核苷酸序列连接至自杀性质粒pk18mobsacb；在步骤2)中，采用xbai/hindiii限制性内切酶双酶切以及连接，将由seqidno.:7所示的多核苷酸序列连接至自杀性质粒pk18mobsacb上；在步骤3)中，采用smai/sali限制性内切酶双酶切以及连接，将由seqidno.:8所示的多核苷酸序列连接至自杀性质粒pk18mobsacb上；在步骤4)中，采用ndei/ecori限制性内切酶双酶切以及连接，将由seqidno.:5所示的多核苷酸序列连接至表达质粒pxmj19上。其中，在步骤1)-步骤4)中，将重组质粒导入谷氨酸棒杆菌或中间重组菌的方法是本领域技术人员已知的，例如本领域常规的转化方法，如电击转化或化学转化。在本发明构建方法的优选的实施方式中，在步骤1)-步骤4)中，将重组质粒导入谷氨酸棒杆菌或中间重组菌，例如使用电穿孔仪，在电压2.5kv，电阻200ω，电容25μf，电击时间5ms的电击条件下将重组质粒导入中间重组菌中。其中，在步骤1)-步骤4)中，还包括对重组菌进行筛选和鉴定。所述筛选方法可为本领域技术人员熟知的各种筛选转化子的方法，例如通过抗生素抗性筛选(如卡那霉素抗性筛选)和/或蔗糖筛选。所述鉴定方法可为本领域技术人员熟知的各种鉴定转化子的方法，例如检测基因组中dna序列，例如菌落pcr分析。在优选的实施方式中，在步骤1)-步骤3)中，结合卡那霉素抗性筛选和蔗糖筛选(100g/l蔗糖)进行两次筛选。在优选的实施方式中，在步骤4)中，仅进行卡那霉素抗性筛选。在优选的实施方式中，使用序列由seqidnos.:9-16的引物对对步骤1)-步骤4)中获得的重组菌进行菌落pcr，然后对pcr扩增片段进行测序，筛选阳性重组菌。根据本发明的第三方面，本发明提供了本发明第一方面所述的重组谷氨酸棒杆菌或由第二方面所述的方法构建的重组谷氨酸棒杆菌在生产四氢嘧啶方面的应用。根据本发明的第四方面，本发明还提供了一种生产四氢嘧啶的方法，所述方法包括：对本发明第一方面所述的重组谷氨酸棒杆菌或由第二方面所述的方法构建的重组谷氨酸棒杆菌进行发酵，从而获得四氢嘧啶。本发明所述的重组谷氨酸棒杆菌的发酵方法可为本领域常规的利用重组谷氨酸棒杆菌生产四氢嘧啶的发酵方法。例如，所述发酵方法可包括如下步骤：将新鲜制备的重组谷氨酸棒杆菌或在甘油冻存管中冻存的重组谷氨酸棒杆菌在谷氨酸棒杆菌液体培养基中进行活化，然后在28℃-32℃下培养12h-24h，得到经活化的种子液；以5-15v/v％的接种量将上述种子液接种至装有2l谷氨酸棒杆菌液体培养基的5l全自动发酵罐中进行发酵，控制发酵罐起始培养温度为30℃-33℃，初始通气量为1-2vvm；初始搅拌速度为350-500rpm，其中，发酵过程中的相关参数可设置如下：温度：控制为32℃；溶氧：通过调节搅拌速度来控制发酵液中的溶氧浓度，使发酵过程中的溶氧浓度保持为10％以上；ph值：发酵过程中自动流加13％的氨水，以将发酵液的ph控制在7.0-7.2，根据实际需要添加或不添加诱导剂，例如可在发酵3h时添加iptg。应当指出的是，发酵条件只要适用于用重组谷氨酸棒杆菌生产四氢嘧啶的发酵条件即可，本领域技术人员可根据实际需要对培养条件和培养基进行修改或优化，这些修改和/或优化也在本发明的范围内。在本发明的优选实施方式中，所述谷氨酸棒杆菌液体培养基含有可发酵糖，包括但不限于糖蜜、蔗糖、葡萄糖、淀粉水解液、玉米浆、木糖、甘露糖或甘油，或它们的任意混合物；以及硫胺素和生物素。在发酵过程中流加可发酵糖。在本发明优选的实施方式中，在发酵生产四氢嘧啶过程中，控制发酵温度为30-33℃、优选32℃，控制ph值为7.0-7.2，在发酵3-5h、优选3h时添加终浓度为0.01-2mm、优选1mm的iptg。出于说明的目的，本发明可通过如下段落来表示：1.一种重组谷氨酸棒杆菌，所述重组谷氨酸棒杆菌以野生型谷氨酸棒杆菌为出发菌株，所述重组谷氨酸棒杆菌具有：相比所述出发菌株，表达水平降低的磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶、高丝氨酸脱氢酶和二氢嘧啶二羧酸合成酶；用于表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的基因表达盒；以及用于表达ecta酶、ectb酶和ectc酶的基因表达盒。2.如段落1所述的重组谷氨酸棒杆菌，其中，通过敲除所述出发菌株中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶基因pck、高丝氨酸脱氢酶基因hom和二氢嘧啶二羧酸合成酶基因dapa使所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶、所述高丝氨酸脱氢酶和所述二氢嘧啶二羧酸合成酶的表达水平降低。3.如段落1或2所述的重组谷氨酸棒杆菌，其中，所述用于表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的基因表达盒具有由seqidno.:2所示的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc。4.如段落3所述的重组谷氨酸棒杆菌，其中，用所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc替换所述出发菌株中的所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶基因pck。5.如段落1-4中任一段所述的重组谷氨酸棒杆菌，其中，所述用于表达ecta酶、ectb酶和ectc酶的基因表达盒具有启动子tac，编码ecta酶、ectb酶和ectc酶的基因，和终止子rrnb。6.如段落5所述的重组谷氨酸棒杆菌，其中，所述编码ecta酶、ectb酶和ectc酶的基因为ectabc基因。7.如段落6所述的重组谷氨酸棒杆菌，其中，所述ectabc基因由seqidno.:5所示。8.如段落1-7中任一段所述的所述的重组谷氨酸棒杆菌，其中，所述出发菌株选自谷氨酸棒杆菌野生型菌株atcc13032或谷氨酸棒杆菌野生型菌株s9114。9.一种构建如段落1-8中任一段所述的重组谷氨酸棒杆菌的方法，所述方法包括：以野生型谷氨酸棒杆菌为出发菌株，使其中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶、高丝氨酸脱氢酶和二氢嘧啶二羧酸合成酶的表达水平降低，同时向所述出发菌株中导入用于表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的基因表达盒和用于表达ecta酶、ectb酶和ectc酶的基因表达盒，从而得到所述重组谷氨酸棒杆菌。10.如段落9所述的方法，其中，通过敲除所述出发菌株中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶基因pck、高丝氨酸脱氢酶基因hom和二氢嘧啶二羧酸合成酶基因dapa使所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶、所述高丝氨酸脱氢酶和所述二氢嘧啶二羧酸合成酶的表达水平降低。11.如段落9或10所述的方法，其中，所述用于表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的基因表达盒具有由seqidno.:2所示的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc。12.如段落11所述的方法，其中，用所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc替换所述出发菌株中的所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶基因pck。13.如段落9-11中任一段所述的方法，其中，所述用于表达ecta酶、ectb酶和ectc酶的基因表达盒具有启动子tac，编码ecta酶、ectb酶和ectc酶的基因和终止子rrnb。14.如段落13所述的方法，其中，所述编码ecta酶、ectb酶和ectc酶的基因为ectabc基因。15.如段落14所述的方法，其中，所述ectabc基因由seqidno.:5所示。16.如段落9-15中任一段所述的方法，其中，所述方法包括如下步骤：1)将用于使ppc基因替换pck基因的多核苷酸序列连接至谷氨酸棒杆菌自杀性质粒上，获得重组质粒，将该重组质粒导入谷氨酸棒杆菌中，获得重组菌c.glutamicum-δpck-ppc；2)将用于敲除hom基因的多核苷酸序列连接至谷氨酸棒杆菌自杀性质粒上，获得重组质粒，将该重组质粒导入步骤1)中得到的重组菌c.glutamicum-δpck-ppc中，获得重组菌c.glutamicum-δhom-δpck-ppc；3)将用于敲除dapa基因的多核苷酸序列连接至谷氨酸棒杆菌自杀性质粒上，获得重组质粒，将该重组质粒导入步骤2)中得到的重组菌c.glutamicum-δhom-δpck-ppc中，获得重组菌c.glutamicum-δdapa-δhom-δpck-ppc；以及4)根据谷氨酸棒杆菌密码子偏好性，将经优化的表达ectabc基因的多核苷酸序列连接至谷氨酸棒杆菌表达质粒上，获得重组质粒，将该重组质粒导入步骤3)中得到的重组菌c.glutamicum-δdapa-δhom-δpck-ppc中，获得所述重组谷氨酸棒杆菌c.glutamicum-δdapa-δhom-δpck-ppc-ectabc。17.如段落16所述的方法，其中，在步骤1)中，用于使ppc基因替换pck基因的多核苷酸序列由seqidno.:6所示，其中seqidno.:6由pck基因上游1001bp、seqidno.:2的ppc基因和pck基因下游999bp构成；在步骤2)中，用于敲除hom基因的多核苷酸序列由seqidno.:7所示，其中，seqidno.:7由谷氨酸棒杆菌基因组的hom基因的上游1000bp和其下游1000bp构成；在步骤3)中，用于敲除dapa基因的多核苷酸序列由seqidno.:8所示，其中，seqidno.:8由谷氨酸棒杆菌基因组dapa基因的上游1000bp和其下游1000bp构成；和/或在步骤4)中，用于表达ectabc基因的多核苷酸序列由seqidno.:5所示。18.如段落16或17所述的方法，其中，在步骤1-步骤3)中，所述自杀性质粒为pk18mobsacb。19.如段落16-18中任一段所述的方法，其中，在步骤4)中，所述表达质粒为pxmj19。20.如段落16-19中任一段所述的方法，其中，步骤1)中，所述谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌野生型菌株s9114。21.如段落1-8中任一段所述的重组谷氨酸棒杆菌或由如段落9-20中任一段所述的方法构建的重组谷氨酸棒杆菌在生产四氢嘧啶方面的应用。22.一种生产四氢嘧啶的方法，其中，所述方法包括：对如段落1-8中任一段所述的重组谷氨酸棒杆菌或由段落9-20中任一段所述的方法构建的重组谷氨酸棒杆菌进行发酵，从而获得四氢嘧啶。23.如段落22所述的方法，其中，将所述重组谷氨酸棒杆菌在谷氨酸棒杆菌培养基中，于30-33℃下进行发酵，在发酵过程中维持ph为7.0-7.2，溶氧为10％以上。24.如段落23所述的方法，其中，将所述重组谷氨酸棒杆菌于32℃下进行发酵。25.如段落23或24所述的方法，其中，所述谷氨酸棒杆菌培养基含有可发酵糖以及硫胺素和生物素。26.如段落25所述的方法，其中，所述可发酵糖选自糖蜜、蔗糖、葡萄糖、淀粉水解液、玉米浆、木糖、甘露糖或甘油，或它们的任意混合物。27.如段落23-26中任一项所述的方法，其中，在发酵过程中流加所述可发酵糖。28.如段落23-27中任一项所述的方法，其中，在发酵3h-5h时，向发酵液中添加终浓度为0.01-2mm的iptg。29.如段落28所述的方法，其中，在发酵3h时，向发酵液中添加终浓度为0.01-2mm的iptg。30.如段落28或29所述的方法，其中，在发酵3h时，向发酵液中添加终浓度为1mm的iptg。实施例为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚，以下结合附图及具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施方式仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。下述实施例中所述实验方法和设备，如无特殊说明，均为常规方法和设备。下述实施例中所用的实验材料，如无特别说明，全部试剂购自oxoid、neb、tiangen、invitrogen等公司。实施例中所用的试剂：lb固体培养基(lb平板)：胰蛋白胨10g/l；酵母浸粉5g/l；琼脂15g/l；氯化钠20-100g/l；余量为水；ph7.0，121℃灭菌15min。种子培养基：葡萄糖40g/l；(nh4)2so45.0g/l；k2hpo41.5g/l；mgso41.0g/l；mnso40.005g/l；feso40.005g/l；玉米浆30g/l；余量为水。发酵培养基：葡萄糖80g/l；(nh4)2so430.0g/l；k2hpo42.5g/l；mgso41.0g/l；mnso40.010g/l；feso40.010g/l；玉米浆15g/l；生物素0.0005g/l；盐酸硫胺素0.005g/l；余量为水。在以下实施例中，pk18mobsacb质粒和谷氨酸棒杆菌s9114购自ntcc；双酶切试剂和连接反应试剂购自neb。所用基因序列和引物均由金唯智公司合成；测序由上海生工生物工程有限公司完成。实施例中使用的引物序列如下：表1.引物序列引物名称序列(5’-3’)序列编号p1ctgcgacgactggaaaaccaseqidno.:9p2ggctggaccctagaattcggseqidno.:10p3ttaagaagtcgaccgcgtgaseqidno.:11p4aataattgctgcactaataaseqidno.:12p5tcatttcagcagcgggtggaseqidno.:13p6tcgtcaccgaaacgggacaaseqidno.:14p7atgaacgctaccaccgagccseqidno.:15p8ttacagtggcttctggtcgtseqidno.:16实施例中使用的双酶切反应体系和反应条件如下表2-表4所示：表2.smai/sali双酶切反应体系和反应条件表3.xbai/hindiii双酶切反应体系和反应条件表4.ndei/ecori双酶切反应体系和反应条件实施例中使用的连接反应体系和反应条件如下表5所示：表5.t4dna连接酶连接体系和反应条件实施例中进行菌落pcr的反应体系和反应程序如下表6所示：表6.菌落pcr的反应体系和反应程序实施例1重组谷氨酸棒杆菌的构建(1)敲除pck基因同时导入ppc基因以谷氨酸棒杆菌野生型菌株s9114为出发菌株，将该野生型谷氨酸棒杆菌基因组上的pck基因替换成ppc基因，实现pck基因的敲除同时实现ppc基因的导入。人工合成由seqidno.:6所示的用于使ppc基因替换pck基因的多核苷酸序列。seqidno.:6由pck基因上游1001bp、seqidno.:2(ppc基因)和pck基因下游999bp构成。使用smai/sali限制性内切酶依据表2的酶切反应体系和反应条件对谷氨酸棒杆菌自杀性质粒pk18mobsacb和上述多核苷酸序列进行双酶切。分别回收酶切后的片段，然后使用t4dna连接酶依据表5的连接体系和条件将酶切片段连接到pk18mobsacb上，获得重组质粒。将获得的重组质粒命名为pk18mobsacb-δpck-ppc。利用电穿孔仪(艾本德)通过电转化将pk18mobsacb-δpck-ppc导入谷氨酸棒杆菌s9114中，电击条件为：电压2.5kv，电阻200ω，电容25μf，电击时间5ms。经过如下两次筛选获得重组菌：a)将电转后的重组菌涂抹在含15mg/l卡那霉素的lb平板上，于32℃下静置培养48h筛选阳性克隆；b)挑取单菌落，在含有100g/l蔗糖的lb平板上划线培养，于32℃下静置培养16h，进行二次筛选阳性克隆。根据表6的pcr反应条件和反应程序利用引物对p1-p2对二次阳性克隆进行菌落pcr，将得到的扩增片段送去测序。得到pcr产物大小在4.7kb左右且序列与seqidno.:6所示一致的菌株，即为阳性重组菌，将其命名为c.glutamicums9114-δpck-ppc。(2)敲除c.glutamicums9114-δpck-ppc中的hom基因从c.glutamicums9114-δpck-ppc的基因组上将hom基因敲除。人工合成由seqidno.:7所示的用于敲除hom基因的多核苷酸序列，其中，seqidno.:7由谷氨酸棒杆菌s9114基因组的hom基因上游1000bp和其下游1000bp构成。使用xbai/hindiii限制性内切酶依据表3的酶切反应体系和反应条件对谷氨酸棒杆菌自杀性质粒pk18mobsacb和上述多核苷酸序列进行双酶切。分别回收酶切后的片段后，使用t4dna连接酶依据表5的连接体系和条件将酶切片段连接到pk18mobsacb上，获得重组质粒。将获得的重组质粒命名为pk18mobsacb-δhom。利用电穿孔仪通过电转化将重组质粒pk18mobsacb-δhom导入谷氨酸棒杆菌s9114-δpck-ppc中，电击条件为电压2.5kv，电阻200ω，电容25μf，电击时间5ms。经过如下两次筛选获得重组菌：a)将电转后的重组菌涂抹在含15mg/l卡那霉素的lb平板上，于32℃下静置培养48h，筛选阳性克隆；b)挑取单菌落，在含有100g/l蔗糖的lb平板上划线培养，于32℃下静置培养16h，进行二次筛选阳性克隆。利用引物对p3-p4对二次阳性克隆进行菌落pcr，将得到的扩增片段送去测序。得到pcr产物大小在2.0kb左右且序列与seqidno.:7所示一致的菌株，即为阳性重组菌，将其命名为c.glutamicums9114-δhom-δpck-ppc。(3)敲除c.glutamicums9114-δhom-δpck-ppc中的dapa基因从c.glutamicums9114-δhom-δpck-ppc的基因组上将dapa基因敲除。人工合成由seqidno.:8所示的用于敲除dapa基因的多核苷酸序列，其中，seqidno.:8由谷氨酸棒杆菌s9114基因组dapa基因的上游1000bp和其下游1000bp构成。使用smai/sali限制性内切酶依据表2的酶切反应体系和反应条件对谷氨酸棒杆菌自杀性质粒pk18mobsacb和上述多核苷酸序列进行双酶切。分别回收酶切后的片段后，依据表5的连接体系和反应条件使用t4dna连接酶将酶切片段连接到pk18mobsacb上，获得重组质粒。将获得的重组质粒命名为pk18mobsacb-δdapa。利用电穿孔仪通过电转化将重组质粒pk18mobsacb-δdapa导入谷氨酸棒杆菌c.glutamicums9114-δhom-δpck-ppc中，电击条件为电压2.5kv，电阻200ω，电容25μf，电击时间5ms。经过如下两次筛选获得重组菌：a)将电转后的重组菌涂抹在含15mg/l卡那霉素的lb平板上，于32℃下静置培养48h，筛选阳性克隆；b)挑取单菌落，在含有100g/l蔗糖的lb平板上划线培养，于32℃下静置培养16h，进行二次筛选阳性克隆。利用引物对p5-p6对二次阳性克隆进行菌落pcr，将得到的扩增片段送去测序。得到pcr产物大小在2.0kb左右且序列与seqidno.:8所示一致的菌株，即为阳性重组菌，将其命名为c.glutamicums9114-δdapa-δhom-δpck-ppc。(4)在c.glutamicums9114-δdapa-δhom-δpck-ppc中过表达ectabc基因根据谷氨酸棒杆菌密码子使用的偏好性，基于ncbino.:d88359.1优化得到由seqidno.:5所述的ectabc基因的多核苷酸序列，人工合成该多核苷酸序列。使用ndei/ecori限制性内切酶依据表4的酶切反应体系和反应条件对谷氨酸棒杆菌表达质粒pxmj19和上述多核苷酸序列进行双酶切。分别回收酶切后的片段后，使用t4dna连接酶依据表5的连接体系和条件将酶切片段连接到pxmj19上，获得重组质粒。将获得的重组质粒命名为19-ectabc。利用电穿孔仪通过电转化将重组质粒196-ectabc导入谷氨酸棒杆菌c.glutamicums9114-δdapa-δhom-δpck-ppc中，电击条件为电压2.5kv，电阻200ω，电容25μf，电击时间5ms。在含15mg/l卡那霉素的lb平板上，于32℃下静置培养48h，筛选阳性克隆。利用引物对p7-p8对阳性克隆进行菌落pcr，将得到的扩增片段送去测序。得到pcr产物大小在2.2kb左右且序列与seqidno.:5所示一致的菌株，即为阳性重组菌，将其命名为c.glutamicums9114-δdapa-δhom-δpck-ppc-19-ectabc(也称为：cg.ect-2)。实施例2使用cg.ect-2发酵生产四氢嘧啶将由实施例1获得的重组谷氨酸棒杆菌cg.ect-2在lb平板上，30℃下培养过夜。次日，从平板上挑取单菌落接种到含有30ml种子培养基(含15mg/l卡那霉素)的250ml带档板摇瓶中，于32℃、200rpm下培养12小时得到种子液。以10v/v％的接种量将种子液接种到2l发酵培养基(含15mg/l卡那霉素)中，发酵采用5l发酵罐，控制温度为32℃，通气量为1vvm，初始转速为350-500rpm，在发酵过程中调整转速使得溶氧水平保持在10％以上，通过流加13％的氨水控制ph值稳定在7.0左右。在发酵3h时添加1mm的iptg。在不同发酵时间点采样并检测发酵液中的四氢嘧啶产量。通过液相色谱(hplc)检测发酵液中的四氢嘧啶含量，hplc条件：色谱仪：agilenttechnologies1260infinityii；检出器紫外检测器；色谱柱：zorbaxsb-c18柱，250*4.6mm*5um，80a；柱温：40℃；流动相：10mm磷酸二氢钠缓冲液(ph＝2.6)：乙腈＝70:30；流量：1ml/min；进样量：10μl；采用外标法计算目标产物生成量，四氢嘧啶标品购自bitop公司。结果如图2所示，发酵70h时，四氢嘧啶的产量可达约25g/l。由此可见，相比于现有技术中报道的其它可产四氢嘧啶的菌株(例如cn107142234a)，使用本发明实施例1制备的重组谷氨酸棒杆菌cg.ect-2生产四氢嘧啶具有明显的改善；并且本发明的重组菌谷氨酸棒杆菌cg.ect-2不会产生内毒素，省去了在后续工程去除毒素分离提纯产物的繁琐步骤，不仅提高了产品的安全性，同时极大地降低了生产成本，具有良好的工业应用前景。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。序列表<110>北京百奥茵诺生物科技有限公司<120>重组谷氨酸棒杆菌、其构建方法及其生产四氢嘧啶的方法<160>16<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1833<212>dna<213>谷氨酸棒杆菌(corynebacteriumglutamicum)<400>1atgactactgctgcaatcaggggccttcagggcgaggcgccgaccaagaataaggaactg60ctgaactggatcgcagacgccgtcgagctcttccagcctgaggctgttgtgttcgttgat120ggatcccaggctgagtgggatcgcatggcggaggatcttgttgaagccggtaccctcatc180aagctcaacgaggaaaagcgtccgaacagctacctagctcgttccaacccatctgacgtt240gcgcgcgttgagtcccgcaccttcatctgctccgagaaggaagaagatgctggcccaacc300aacaactgggctccaccacaggcaatgaaggacgaaatgtccaagcattacgctggttcc360atgaaggggcgcaccatgtacgtcgtgcctttctgcatgggtccaatcagcgatccggac420cctaagcttggtgtgcagctcactgactccgagtacgttgtcatgtccatgcgcatcatg480acccgcatgggtattgaagcgctggacaagatcggcgcgaacggcagcttcgtcaggtgc540ctccactccgttggtgctcctttggagccaggccaggaagacgttgcatggccttgcaac600gacaccaagtacatcacccagttcccagagaccaaggaaatttggtcctacggttccggc660tacggcggaaacgcaatcctggcaaagaagtgctacgcactgcgtatcgcatctgtcatg720gctcgcgaagaaggatggatggctgagcacatgctcatcctgaagctgatcaacccagag780ggcaaggcgtaccacatcgcagcagcattcccatctgcttgtggcaagaccaacctcgcc840atgatcactccaaccatcccaggctggaccgctcaggttgttggcgacgacatcgcttgg900ctgaagctgcgcgaggacggcctctacgcagttaacccagaaaatggtttcttcggtgtt960gctccaggcaccaactacgcatccaacccaatcgcgatgaagaccatggaaccaggcaac1020accctgttcaccaacgtggcactcaccgacgacggcgacatctggtgggaaggcatggac1080ggcgacgccccagctcacctcattgactggatgggcaacgactggaccccagagtccgac1140gaaaacgctgctcaccctaactcccgttactgcgtagcaatcgaccagtccccagcagca1200gcacctgagttcaacgactgggaaggcgtcaagatcgacgcaatcctcttcggtggacgt1260cgcgcagacaccgtcccactggttacccagacctacgactgggagcacggcaccatggtt1320ggtgcactgctcgcatccggtcagaccgcagcttccgcagaagcaaaggtcggcacactc1380cgccacgacccaatggcaatgctcccattcattggctacaacgctggtgaatacctgcag1440aactggattgacatgggtaacaagggtggcgacaagatgccatccatcttcctggtcaac1500tggttccgccgtggcgaagatggacgcttcctgtggcctggcttcggcgacaactctcgc1560gttctgaagtgggtcatcgaccgcatcgaaggccacgttggcgcagacgagaccgttgtt1620ggacacaccgctaaggccgaagacctcgacctcgacggcctcgacaccccaattgaggat1680gtcaaggaagcactgaccgctcctgcagagcagtgggcaaacgacgttgaagacaacgcc1740gagtacctcactttcctcggaccacgtgttcctgcagaggttcacagccagttcgatgct1800ctgaaggcccgcatttcagcagctcacgcttaa1833<210>2<211>2760<212>dna<213>谷氨酸棒杆菌(corynebacteriumglutamicum)<400>2atgactgattttttacgcgatgacatcaggttcctcggtcaaatcctcggtgaggtaatt60gcggaacaagaaggccaggaggttt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