同步检测火龙果CVX和ZyVX两种病毒的双重RT-PCR方法与流程

本发明属于生物技术领域，涉及一种同步检测火龙果cvx和zyvx两种病毒的双重rt-pcr方法。

背景技术：

仙人掌x病毒(cvx)是一种ssrna阳性链病毒，其全长为6614nt，不含poly(a)尾巴，包含7个开放阅读框(orf)，属于甲型病毒科(alphaflexiviridae)马铃薯x病毒属(potexvirus)。该病毒主要分布在中国台湾、韩国、美国以及欧洲等地，在自然界该病毒主要侵染仙人掌科植物，当然红花科、藜科以及石竹科的一些物种也可被浸染。可引起叶片斑驳黄化畸形，植株长势弱果实小。2001年liou等人在对中国台湾火龙果病害的调查中首次发现了cactusvirusx(cvx)的存在；2014年10月，peng等人在对中国海南岛一项关于火龙果病害的调查中又再次发现，大约44％的田间植物表现出类似病毒的症状，进一步确定为cvx的存在。

蟹爪兰x病毒(zyvx)也是一种ssrna阳性链病毒，属于甲型病毒科(alphaflexiviridae)马铃薯x病毒属(potexvirus)。但由于它的外壳蛋白和tgb3蛋白氨基酸序列与cvx相似性较低，因此认为它们属于不同的种，故命名为zygocactusvirusx(zyvx)。在2006至2008年期间，李勇赐等人再次对中国台湾火龙果病害调查中发现除cvx外，尚有在中国台湾未曾报道过的蟹爪兰x病毒(zygocactusvirusx,zyvx)。2016年郑迄明等人对贵州地区调查中发现火龙果被多种病毒(cvx-ntu、cvx、schvx和zyvx)浸染。

这些病毒可经多种途径传播，主要通过液体接种和嫁接传播，随着火龙果的引种，病毒可长距离传播到新的地区或国家，给当地农业生产带来很大的威胁。而目前我国内地部分地区出现的大量仙人掌病毒病，究其原因可能是在引种过程中从台湾传播过来的。因此，加强植物的病毒检测，建立cvx和zyvx两种病毒的双重rt-pcr体系，对于防止这些病毒进一步扩散、保护农业生产具有十分重要的意义。

目前已经报道的病毒检测方法主要包括生物学检测、电子显微镜检测和血清学检测。生物学检测耗时长效率低，易受外界环境等因素影响。电子显微镜检测结果直观、准确，但所需仪器设备昂贵，且制片和操作技术复杂不易掌握，对操作人员技术水平要求高，因此并没有得到广泛应用。血清学方法具有快速、直观等特点，但其结果的准确性往往依赖于抗血清的品质，且血清的制备时间较长，还可能会存在假阴性或假阳性现象，尤其是对于非常相关的病毒株会很难以正确区分。

反转录聚合酶链反应（rt-pcr）是目前发展起来的一种检测植物病毒的方法，该方法灵敏度高、取样量少、特异性强，可以弥补生物学检测耗时长效率低的不足，又不像血清学检测存在假阴性或假阳性现象，即使对含量较低的病毒也不会漏检，同时在对扩增产物进行测序时还能进一步确认检测结果的准确性。基于以上优势，rt-pcr技术已广泛应用于各种经济作物及园艺植物的病毒检测中。然而，国内关于同步检测火龙果cvx和zyvx两种病毒的双重rt-pcr方法尚未见报道，也未见相关专利公开。

技术实现要素：

为解决上述问题，本发明提供了一种同步检测cvx和zyvx两种病毒的双重rt-pcr方法。以pcr为基础，根据两种病毒外壳蛋白分别设计特异性引物，对反应条件进行优化，最终获得能稳定同步检测cvx和zyvx两种病毒的双重rt-pcr方法，为实现上述目的，本发明采取的技术方案包括如下步骤：

（1）采用rnasimpletotalrnakit提取试剂盒（tiangen生化科技有限公司，北京）提取总rna。

（2）以步骤（1）获得的总rna为模板，利用primescript™rtreagentkitwithgdnaeraser试剂盒（宝日医生物技术有限公司，北京）反转录合成第一链cdna。

（3）以步骤（2）中获得的cdna为模板，加入与待检测病毒的外壳蛋白基因对应的上下游引物，采用rt-pcr技术进行扩增靶标基因。

（4）将所得的产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳检测，电压150v，电泳35min，利用凝胶成像系统观察电泳结果并拍照记录。

（5）采用tiangen生化科技有限公司（北京）dna凝胶回收试剂盒（dp214）对扩增条带进行纯化。

（6）将纯化后的pcr产物连接到peay-t1载体上，并转化至trans1-t1感受态细胞，取100μl左右的菌液于lb固体（含100ug/mlamp）平板上，用涂布棒均匀涂开。待菌液被培养基充分吸收后，37℃密封倒置培养12~14h。挑取白色单菌落，以引物m13筛选阳性菌落。

所述反应体系中的引物对为：

cvx-f：cagttctgccgttactttgc

cvx-r：cagtctctccgcttcgttt

zyvx-f：ccacatctcaactctcagcg

zyvx-r：ggcaagtctttcagcctcat

所述反应体系总体积10μl：5.0μl2×taqpcrmastermix（0.1u/μltaqpolymerase、500μmdntp、20mmtris-hcl、100mmkcl、3mmmgcl2），病毒上、下游引物及cdna各0.5μl，用ddh2o补足后混合均匀。

所述反应程序为：94℃预变性5min；94℃反应30s，57℃反应30s，72℃反应1min，进行30个循环；72℃延伸5min；4℃最终保存。

本发明建立了一套同步检测火龙果cvx和zyvx两种病毒的双重rt-pcr方法，可用于脱毒苗及田间感病植株的早期鉴定，为无病毒苗木繁育及推广提供技术支撑，保障火龙果产业的持续、健康发展。与其它方法相比，本发明具有以下的技术优势：

1、操作简便快速，仅对样本进行rt-pcr扩增及电泳检测即可判断结果。

2、检测结果灵敏度高：对待检样品即使提供模板约0.1ng，也可准确鉴定。

3、结果高度准确、可靠：本发明通过对扩增产物回收、克隆和测序为检测结果提供了高度的可靠性。

附图说明

图1两种病毒的单一rt-pcr电泳结果：图中的m代表dl2000dnamarker,从上到下依次为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp。1-3泳道依次为无毒组培苗（阴性对照）检测结果、zyvx病毒材料检测结果和cvx病毒材料检测结果。

图2两种病毒特异性引物扩增的兼容性电泳结果：图中的m代表dl2000dnamarker，从上到下依次为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp。1泳道为无毒组培苗阴性对照，2泳道为2种病毒混合引物扩增产物的电泳结果，3泳道为cvx病毒引物扩增产物的电泳结果，4泳道为zyvx病毒特异引物扩增产物的电泳结果。

图3本发明方法退火温度优化图：图中的m代表dl2000dnamarker，从上到下依次为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp。1-5泳道退火温度依次为51℃、53℃、55℃、57℃、59℃。

图4本发明方法循环数优化图：图中的m代表dl2000dnamarker，从上到下依次为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp。1-4泳道依次为25、30、35、40个循环数。

图5rt-pcr体系灵敏度测定：图中的m代表dl2000dnamarker，从上到下依次为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp。1-6泳道依次为病毒样品cdna的6个浓度梯度（10⁰~10⁵）的电泳结果。

图6rt-pcr体系应用于感病火龙果样品的检测：图中的m代表dl2000dnamarker，从上到下依次为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp。1泳道为无毒火龙果组培苗阴性对照，泳道2-13为随机采集的贵州罗甸田间火龙果12个样品。

具体实施方式

为了使本发明的目的及优势更加明晰，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1：本发明供试材料采自于贵州省安顺市镇宁布依族苗族自治县火龙果种植基地，并以无病毒组培苗作为rt-pcr检测的阴性对照，提供了一种同步检测cvx和zyvx两种病毒的双重rt-pcr方法,包括如下步骤:

1.采用rnasimpletotalrnakit提取试剂盒提取总rna，具体步骤参照试剂盒说明书（dp419，天根生化科技有限公司）进行：

取0.1g左右感病火龙果茎样品加入1ml裂解液rz,用冷冻研磨仪研磨3~5min。充分混匀后室温放置5min，4℃，12000rpm离心5min，取上清，转入新管中。加入200μl氯仿，剧烈振荡15s，室温放置3min。4℃13000rpm离心10min，样品会分成三层，然后将水相转移到一个新的无rnase管中。缓慢加入0.5倍体积无水乙醇于水相中，均匀混合后将所得液体转入吸附柱cr3，4℃13000rpm离心30s，弃废液。加入500μl去蛋白液rd于吸附柱cr3，4℃加入200μl氯仿，剧烈振荡15sec，室温放置3min。加入500μl漂洗液rw于吸附柱cr3中，室温静置2min，4℃13000rpm离心30s，弃掉收集管中的废液。再次加入500μl漂洗液rw于吸附柱cr3中，室温静置2min，4℃13000rpm离心2min，弃掉残余液体。将吸附柱放入2ml收集管中，4℃13000rpm离心2min，去除残留液体。将吸附柱cr3转入一个新的离心管中，加30~100μlrnase-freeddh2o，室温放置2min，4℃13000rpm离心2min。利用1%琼脂糖凝胶电泳和酶标仪检测其质量和浓度。

2.使用宝日医生物技术有限公司（北京）反转录试剂盒（货号：rr047a）进行cdna第一链的合成，具体步骤如下：

首先依次加入2.0μl5×gdnaeraserbuffer、1.0μlgdnaerase、7.0μltotalrna混合成10.0µl体系预混液，短暂离心，42℃加热2min，去除基因组dna。然后再加入1.0μlprimescriptrtenzymemixi、4.0μlrtprimemix、4.0μl5×primescriptbuffer2和1.0μlrnasefreedh2o彻底混合成20µl，短暂离心后，37℃孵化15min，然后85℃加热5s，反应结束即得cdna第一链。

3.cvx和zyvx的单一rt-pcr体系

（1）依据已经报道cvx和zyvx的外壳蛋白基因序列，采用软件primer5进行特异引物设计，由生工生物工程上海股份有限公司进行合成。引物序列如下：

cvx-f：cagttctgccgttactttgc

cvx-r：cagtctctccgcttcgttt

zyvx-f：ccacatctcaactctcagcg

zyvx-r：ggcaagtctttcagcctcat

（2）pcr反应体系：5.0μl2×taqpcrmastermix（0.1u/μltaqpolymerase、500μmdntp、20mmtris-hcl、100mmkcl、3mmmgcl2），病毒上、下游引物及cdna各0.5μl，用ddh2o补足后混合均匀。

（3）pcr反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，57℃复性30s，72℃延伸60s，循环30次；72℃延伸5min；4℃保存。

（4）pcr产物通过1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，电压150v,电泳35min，利用凝胶成像系统观察电泳结果并拍照记录。结果显示：用相应的特异性引物扩增zyvx和cvx分别获得了461bp和198bp的单一条带（图1）。

4.cvx和zyvx的双重rt-pcr体系的建立与优化

双重rt-pcr体系与单重rt-pcr体系的试剂成分相同，但是双重体系是在一个反应体系中检测两种病毒，因此双重体系中rna和引物为两种病毒特异性引物对的混合物，引物对的最佳比例为1：1。结果表明两对引物有良好的兼容性（图2）。为了优化双重rt-pcr体系，将不同的退火温度以及不同的循环数做为优化的因素，退火温度设置为51℃、53℃、55℃、57℃、59℃共5个温度梯度（图3）；循环数设置为25、30、35、40共4个循环梯度（图4）。引物对在53~57℃退火温度下均能扩增出较亮的条带；在循环数为25时即能达到很好的检测目的，可见引物设计效果好能节约一定的时间，为了兼顾检测效率与扩增效果，实际操作时宜中选择30个循环。确定最佳反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，57℃复性30s，72℃延伸1min，循环30次；72℃延伸5min；4℃保存。

5.双重rt-pcr产物的回收纯化

使用tiangen生化科技有限公司（北京）dna凝胶回收试剂盒（dp214）对琼脂糖凝胶电泳检测出的目的条带进行回收纯化，具体步骤如下：在紫外光下快速切下目的条带放入干净的1.5ml离心管中并称重。向胶块中加入等倍体积溶液pn（如果凝胶重为0.1g，其体积可视为100μl，则加入100μlpn溶液），50℃水浴放置至胶块充分溶解。并向吸附柱ca2中加入500μl平衡液bl以平衡柱子，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液。将之前完全溶解的溶液加入到吸附柱ca2中，室温放置2min，12000rpm离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱ca2放入收集管中。向吸附柱ca2中加入600μl漂洗液pw，静置2-5min，12000rpm离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱ca2放入收集管中，再重复操作一次。将吸附柱ca2放回收集管中，12000rpm(~13,400×g)离心2min，并置于室温放置数分钟，待其彻底地晾干。将吸附柱ca2放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液eb，室温放置2min。12000rpm(~13,400×g)离心2min收集dna溶液。

6.双重rt-pcr产物的克隆测序

将纯化后的pcr产物连接到peasy-t1载体上，25℃反应10min。在感受态细胞刚解冻时将连接产物加入50μltrans1-t1感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30min。42℃水浴锅中热激30s，立即置于冰上2min。向离心管中加入250μllb液体培养基，200rpm、37℃恒温振荡培养1小时。取100μl左右的菌液于lb固体（含100ug/mlamp）平板上，用涂布棒均匀涂开。待菌液被培养基充分吸收后，37℃密封倒置培养12~14h。挑取白色单菌落，以引物m13筛选阳性菌落，送阳性菌落菌液测序，将测序结果在ncbi数据库里进行blast分析同源性为95%~96%之间，可以确定扩增到的核酸片段就是cvx和zyvx基因序列的一部分，证明了本发明建立的双重rt-pcr检测的可靠性。

7.双重rt-pcr的灵敏度测定

为检验双重rt-pcr体系灵敏度，将cdna稀释10⁰、10¹、10²、10³、10⁴和10⁵倍（图5）。结果显示灵敏度很高，稀释10⁴倍（约0.1464ng/ul）时,还能扩增出较为清晰的目的片段。

实例2双重rt-pcr检测田间感病植株样品

2018年7月，本申请发明人调查贵州罗甸火龙果生产园病害情况，发现疑似植物病毒侵染植株。依据文献报道中对cvx、zyvx的症状描述，它们的症状极为相似，申请者只能猜测植株可能是受这些病毒侵染。故通过上述方法检测，结果见图6：12个测试样品均不同程度的感染了cvx，其中有9个样品复合感染了cvx和zyvx,其余为单一浸染cvx。由此可见，该方法可有效用于田间火龙果病毒病的检测。