一种IgG抗体亲和的小分子肽及其应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，涉及蛋白分离纯化领域，具体涉及一种小分子肽，特别涉及一种igg抗体亲和的小分子肽及其应用。

背景技术：

单克隆抗体药物(简称单抗)广泛用于疾病诊断、预防和治疗，是全球医药行业增长最迅猛的市场。目前，单抗药物制备的上游技术平台目前日趋成熟，表达水平已达到5g/l或更高的水平，培养规模已达到1-2万升的规模。与之相比，单抗的下游分离纯化技术渐成瓶颈，目前单抗下游纯化成本已占总生产成本的45％到70％，抗体药物开发约60％的资金投入在下游纯化工艺的建立。目前单抗下游分离纯化最广泛使用的是proteina亲和介质。

proteina是从自然界生物体内自有的生物分子亲和体系发展而来的蛋白配基，能选择性识别igg分子的fc片段上的一致性结合位点，对大部分igg分子有很高的亲和力。尽管proteina是与抗体亲和性最好的一种蛋白类配基，但作为蛋白类配基仍存在洗脱条件苛刻、成本高(配基高约1000$/g，介质高约20000$/l)、寿命短和配基易脱落造成免疫毒性等固有缺陷，是目前造成各类单抗药物纯化介质用量大、纯化周期长、纯化成本高居不下局面的主要原因。发展新型的高品质抗体亲和配基已成为单抗药物工业亟待突破的重点工程技术。

合成配基兼具蛋白的亲和性和生化稳定性，是研究者们试图取代proteina的主要思路。合成配基的搜索策略通常为以下两类：(一)从蛋白亲和层析中通用的亲和配基中搜索。如组氨酸配基在中性溶液中通过疏水作用和氢键结合igg(colloidssurfphysicochemengaspects,2007,301(1):490-497.)，但亲和力和选择性远逊于proteina；如以特异性结合糖分子的半刀豆球蛋白a为配基的亲和介质对igg的吸附容量可高达57.3mgigg/g介质(japplpolymsci,2005,97(3):1202-1208)，但同时吸附少量白蛋白和纤维蛋白原导致igg纯度仅82.5％。通用型配基没有针对抗体蛋白的特异性结构，选择性较proteina差，几乎没有在抗体工业得到推广。(二)从与proteina结合区域接近的仿生小肽配基序列中搜索。例如以igg的fc片段为受体进行分子对接筛选得到新的小肽类似物配基n-benzyloxycarbonyl-l-tyrosine(biomedchromatogr,2006,1115(2):1109-1115)。国内外研究者如天津大学孙彦、浙江大学姚善泾、林东强等也在此方面进行了大量的开拓性设计和优化(jphyschemb,2011,115(14),4168-4176；jphyschemb,2012,116(4),1393-400)。如，利用分子动力学模拟发现吡啶环可能是与抗体fc段的结合的关键基团；基于对抗体与配基proteina中参与结合的关键氨基酸残基的原子水平认知，促生了大批抗体纯化的proteina改进系列配基。一些商业公司也基于proteina上少数关键残基(phe132和tyr133)设计了仿生亲和配基(a2p，a2p)用于纯化igg(jchromatogra,2006,1122(2):144-152)。

分子模拟平台为原子水平设计开发新型配基提供了很好的范例，但以分子结构热力学数据为计算基础的分子模拟，局限在于计算与实验的巨大差距，无法提供真实的亲和力结合常数信息，筛选到真正与目标蛋白亲和的靶点必须经过最终的亲和实验确认。目前发现的多肽配基存在或者肽链太长因而免疫原性高或者选择性差、载量低等缺点，使得迄今为止并没有小肽配基被投入市场，因此仍需设计出价格更为低廉、结构更为简单的小分子小肽配基。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种igg抗体亲和的小分子肽及其应用，特别是由该小分子肽所衍生的亲和介质，不仅可以用于分离纯化，还可以用于药物偶联和血液透析。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种igg抗体亲和的小分子肽，所述肽的通式为：

fyx1x2x3x4

其中，f为苯丙氨酸，y为酪氨酸，x1为组氨酸h、谷氨酸e或苯丙氨酸f，x2为异亮氨酸i、亮氨酸l或缬氨酸t，x3为谷氨酸e、亮氨酸l或甘氨酸g，x4为脯氨酸p、苯丙氨酸f或组氨酸h。

本发明中，利用std–nmr(核磁共振)技术进行该区域筛选的设计方法筛选小分子肽，基于proteina与igg抗体结合区域来构建配基小分子肽库，筛选出具有最高亲和性和最小片段；

根据本发明，所述肽的氨基酸序列选自seqidno.1-81之一所示的氨基酸序列，具体序列如表1所示：

表1

第二方面，本发明还提供了编码如第一方面所述的igg抗体亲和的小分子肽的核酸。

第三方面，本发明还提供了一种表达载体，包括至少一个拷贝的编码氨基酸序列为通式所示小分子肽的本发明第二方面所述核酸。

作为优选技术方案，本发明的表达载体，包括至少一个拷贝的编码氨基酸序列为seqidno.1-seqidno.81之一所示小分子肽的本发明第二方面所述的dna片段。

第四方面，本发明还提供了一种原核或真核宿主细胞，该宿主细胞含有如本发明第三方面所述的表达载体。

第五方面，本发明还提供了一种亲和介质，其特征在于，包含如第一方面所述的igg抗体亲和的小分子肽。

根据本发明，所述小分子肽固定于亲水微球上。

优选地，所述固定为通过氨基、羧基或巯基偶联于亲水微球上，优选为采用定向氨基酸固定，更优选为采用半胱氨酸固定，进一步优选为在小分子肽上连接至少一个半胱氨酸进行固定。

本发明中，发明人发现通过在筛选得到的小分子肽右端添加一个半胱氨酸可进一步用于固定小分子肽到亲水微球上。

优选地，所述亲水微球为具有亲水表面和/或亲水改性的微球，优选为多糖微球和/或磁性微球。

第六方面，本发明公开了如第五方面所述的亲和介质的制备方法，包括如下步骤：活化微球，并偶联所述小分子肽，得到所述亲和介质。

根据本发明，所述活化微球的方式包括环氧活化、brcn活化或氨基活化中的任意一种或至少两种的组合。

根据本发明，所述偶联的方式包括环氧基和巯基偶联、氨基和羧基偶联或巯基和巯基偶联中的任意一种。

第七方面，本发明提供如第五方面所述的亲和介质用于纯化含有fc片段的蛋白。

根据本发明，所述含有fc片段的蛋白包括igg抗体及其衍生蛋白和片段。

第八方面，本发明还进一步提供了一种药物组合物，包括本发明第一方面的氨基酸序列为通式所述小分子肽、如seqidno.1-seqidno.81之一所述的小分子肽、如第三方面所述的表达载体、如第四方面所述的宿主细胞或如第五方面所述的亲和介质。

根据本发明，所述药物组合物还包括能杀伤癌细胞的制剂，所述的制剂为能杀伤癌细胞的化学药物、生物药物、纳米药物、放射性药物、光热治疗或光动力治疗药物或包裹这些药物的载体中的任意一种。

进一步优选地，所述的制剂为烷化剂、抗代谢药物、抗肿瘤天然药物、抗肿瘤抗生素、激素及金属络合物或肿瘤放射靶向标记物中的任意一种。

进一步优选地，所述载体为纳米材料，脂质体或油性化合物中的任意一种，或者由多种油性化合物所组成的混合物。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本申请小分子肽结构更简单、成本更低，最低可降至千元/升介质，同时兼具较高的抗体选择性和亲和性，血清纯化后的igg抗体纯度可达94％以上；

(2)本申请小分子肽配基在制备成亲和介质后，具有耐盐、耐酸碱、配基不易脱落再生容易等优势，上样和洗脱条件均温和，可避免过酸和过碱等洗脱条件对蛋白结构的破坏。

(3)本申请小分子肽适用范围广：不仅可用于抗体的低成本分离纯化，还可用于药物偶联、血液透析等领域。

附图说明

图1为以小分子肽为配基的亲和层析介质对人igg的吸附等温曲线；

图2为以小分子肽为配基的亲和介质对人血清中igg抗体的纯化结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本领域技术人员应该理解的是，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。本发明的范围由后附的权利要求具体限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1本发明小分子肽的设计、合成和筛选

根据proteina结合位点上domainb结构域的两个α螺旋进行定向设计，将结合区域切割成若干个多肽从而建立小分子肽库(肽库的合成委托上海吉尔生化有限公司生产，然后利用std-nmr的方法对小分子肽库与抗体的相互作用能力进行筛选，筛选出亲和作用能力最强的小分子肽，原子水平进一步利用std-nmr技术检测了小分子肽与抗体的结合位点，具体操作步骤如下：

在600兆核磁共振(5mmtripleinverse超低温探头)上进行，溶液环境为20mm磷酸盐缓冲液，脉冲程序为stddiffgp，根据获得的off谱和on谱的差谱std谱即可筛选出与抗体有结合力的小分子肽。小分子肽与抗体的相互作用能力由stdfactor来评价，即std谱中质子峰的峰面积与off谱的峰面积之比除以配基和抗体的浓度比，stdfactor越强，该肽段的结合力越强，得到的小分子肽的氨基酸序列如下表1所示：

表1

通过验证发现其结合机制与proteina不同，前者更倾向于静电相互作用，与现有技术相比，std-nmr技术进行筛选的优势为在真实的溶液环境中进行，反映的是真实的小肽与抗体相互作用，筛选结果更为精准和高效。

实验例2制备亲和介质

将实施例1中得到的小分子肽制备成亲和介质，具体步骤如下：

(1)介质活化：可选择性的选用环氧活化方法对含有羟基的多糖介质活化，即，取抽干琼脂糖凝胶4ff微球36g，将其与100ml丙酮在三口烧瓶中充分混合，再加入100ml环氧氯丙烷，在30℃，120rpm条件下反应20分钟，然后将100ml含0.3％硼氢化钠的4m氢氧化钠加入到恒压滴定管中，将滴定管插入三口烧瓶，1小时内将氢氧化钠滴加完毕后，在30℃和120rpm条件下继续反应2小时，反应完成后，将环氧活化后的琼脂糖4ff微球利用g3砂芯漏斗抽干，然后用20％的丙酮洗涤4次，除去反应剩余的naoh，再用超纯水洗涤至无丙酮气味，然后将环氧活化好的琼脂糖4ff微球用异丙醇洗1次，保存在异丙醇中，得到环氧密度为31μm/ml的活化介质，置于-20℃的冰箱中；

(2)小分子肽配基偶联：将步骤(1)筛选得到的小分子肽可选择性的采用在末端偶联半胱氨酸的序号7多肽，然后将步骤(1)中的活化介质用过量去离子水和偶联缓冲液(0.5mmol/ledta，0.2mol/lph10磷酸盐缓冲液)进行充分清洗，之后用g3漏斗进行抽滤。然后将抽干空白介质转移离心管中，小分子肽用交联缓冲液溶解为0.5mg/ml后，加入少量的还原剂tcep充分溶解后，将1mg/ml的小肽溶液转移至抽干的空白介质中，然后通氮气将离心管中的空气尽量排除，小分子肽偶联反应在20℃，100rpm恒温摇床中反应12小时，反应完成抽滤收集反应混合液，测定紫外吸光度值，介质依次用超纯水，10％乙醇洗涤，抽干，然后保存在10％的乙醇中，得到配基密度为7.0μm/ml的亲和介质，置于4℃冰箱中保存。

实验例3亲和介质的吸附性能评价

将实施例2制备的亲和介质进行吸附性能评价，具体通过静态吸附等温实验来评价，具体步骤如下：

(1)将介质与igg抗体共混于离心管中，溶液环境为ph为6.0的20mm磷酸盐缓冲液，25℃及120rpm转速下吸附3小时；

(2)将混合悬浮液离心5分钟，取离心上清液并利用紫外分管光度计在280吸收光处检测igg抗体浓度，最后通过质量衡算和langmuir吸附模型拟合吸附常数，结果如图1所示。

从图1可以看出，该介质对igg抗体的解离常数kd为1.4μm，抗体吸附量为46mg/ml。

实验例4亲和介质对血清中抗体的分离纯化

(1)将实施例2制备得到的亲和介质进行抗体的分离纯化，具体步骤如下：介质经平衡缓冲液ph6.0的20mm磷酸钠盐充分平衡，然后用上样环进样500μl的稀释后的人血清，用平衡缓冲液充分淋洗至基线，ph6.0的0.5m氯化钠缓冲液洗脱，分别收集穿透峰和洗脱峰，结果如图2所示，从图2可以看出，分离介质能够很好的分离血清中的igg抗体。

(2)纯化抗体的纯度检测，具体如下：将步骤(1)洗脱后的抗体由sds-page检测，使用10％的分离胶，4.5％的浓缩胶，上样浓度0.5mg/ml左右，上样量5-20μl均可，20μl样品加5μl非还原性的上样缓冲液，在100℃中煮样6分钟，煮样完成后进行上样，上样体积是15μl，上样完成后，进行电泳，浓缩胶一般在电压在90mv条件下跑10分钟，然后将电压调节到180mv进行电泳，电泳完成后，用考马斯亮蓝染料染色30分钟，然后用脱色液(水：乙醇：乙酸＝7：2：1)进行脱色过夜，脱色完成后用凝胶成像仪进行条带的灰度检测，根据目标条带的灰度占同一泳道中所有条带灰度之和的比例，即可确定抗体的纯度为94.1％。

实验例5配基的稳定性实验

亲和介质进行分离纯化测定后，先用1个柱体积的纯水清洗层析柱，然后用5个柱体积的1mnaoh缓冲液淋洗柱子，再用2个柱体积的20mmol/lpb缓冲溶液，最后用5个柱体积的平衡液平衡，重复测定和介质清洗过程5次，5次层析操作的层析谱重复性良好，介质载量无明显变化。

综上所述，本申请小分子肽配基在制备成亲和介质后，具有耐盐、耐酸碱、配基不易脱落再生容易等优势，上样和洗脱条件均温和，可避免过酸和过碱等洗脱条件对蛋白结构的破坏，且具较高的抗体选择性和亲和性，血清纯化后的igg抗体纯度可达94％以上。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。