一种卡马西平人工抗原的合成方法与流程

本发明涉及一种卡马西平人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。

背景技术：

卡马西平作为《世界卫生组织基本药物标准清单》和《中国国家基本药物目录》在列药物，属于广谱抗惊厥药的一种，主要用于治疗癫痫和三叉神经痛等精神疾病。同时具有治疗心律失常和抗利尿的作用，但随着该类药物的广泛使用，其毒副作用也日益受到重视。较常见的不良反应有视力模糊或复视、惊厥，剧烈眩晕或嗜睡，诱发的刺激抗利尿激素释放，可引起水钠潴留。水钠潴留可造成组织水肿，体重异常增加。这为不法分子向动物体内非法注水，并通过药物保水抗利尿功能，以达到增重增收的目的提供了可能。同时新版兽药典并未收录卡马西平及其代谢物，因此检测动物组织中卡马西平及其代谢物异常含量，对打击非法药物添加和注水具有重要意义。

酶联免疫法（elisa）是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，然而得到高亲和力和高特异性的单克隆抗体是免疫学检测的前提，人工抗原的合成是其中重要的一步。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种卡马西平人工抗原的合成方法，所制备的产品用于卡马西平免疫分析方法研究，为今后人们的研究提供了必需的人工抗原。

本发明的技术方案，一种卡马西平人工抗原的合成方法，由亚氨基芪甲酰氯与4-氨基丁酸甲酯盐酸盐反应得到具有羧基的产物，即半抗原cbz，用碳二亚胺法将半抗原cbz与载体蛋白偶联，即得到卡马西平人工抗原。

具体步骤如下：

（1）半抗原cbz的合成：

合成路线如下：

将化合物122.20mmol溶于四氢呋喃（thf）50.0ml溶液，加入4-氨基丁酸甲酯盐酸盐22.20mol和三乙胺（tea）66.83mmol，将反应在室温下搅拌并回流过夜；用乙酸乙酯萃取混合物，得到化合物2；

将化合物25.95mmol溶于thf/h2o10.0ml溶液中，加入lioh15.0mmol，在室温下反应过夜；将混合物用1n盐酸调节ph至3，过滤并浓缩，得到目标化合物半抗原cbz；

（2）完全抗原的制备：将步骤（1）制备所得半抗原cbz与bsa偶联得到偶联物完全抗原cbz-bsa；或与klh偶联得到偶联物完全抗原cbz-klh；cbz-bsa和cbz-klh即为卡马西平人工抗原。

所述完全抗原cbz-bsa制备方法如下：

a、称取8.9mgcbz，1-乙基碳二亚胺盐酸盐16.23mg，n-羟基琥珀酰亚胺8.8mg，用600μl无水n,n-二甲基甲酰胺溶解，得到a液，室温搅拌反4-6h；称取牛血清蛋白bsa10mg，加入等体积硼酸缓冲溶液，得到b液；

在室温条件下逐滴将a液加入到b液中，室温反应过夜，即得偶联物cbz-bsa混合液；

b、透析：取8cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；将步骤a所得偶联物cbz-bsa混合液放入透析袋于0.01mol/l的pbs中透析3天，每天三次换液，即得完全抗原cbz-bsa。

步骤a所述cbz与bsa摩尔比为30:1。

卡马西平人工抗原的鉴定

（1）采用核磁共振和液质联用技术鉴定半抗原。

（2）人工抗原采用紫外法鉴定其偶联结果，利用偶联物中小分子与蛋白的浓度，计算其偶联比。

偶联比测定：估算偶联物中被偶联的两种分子的比率（偶联比率）的方法，虽然测定方法种类很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量（或相对含量）的原理建立起来的。紫外法是依据合成的人工抗原中的小分子浓度与蛋白浓度的比确定偶联比的。

用pbs配制0.5mg/ml的蛋白溶液与完全抗原溶液，以pbs建立基线，在波长200~500nm间扫描，得到蛋白溶液与完全抗原溶液在半抗原的紫外吸收特征峰处的吸光值分别为a1，a2；用甲醇配制5~50μg/ml的半抗原浓度即为xμg/ml，以甲醇建立基线，在波长200~500nm间扫描，得到半抗原紫外吸收特征峰处的吸光值a3，半抗原的相对分子质量为m1，蛋白的相对分子质量为m2，则偶联比=[(a2-a1)(x/m1)/a3]/(0.5/m2)。

本发明的有益效果：本发明成功合成了卡马西平人工抗原，合成步骤简洁，有效，完全可用于免疫分析中，为以后人们的研究提供了方便的途径。

附图说明

图1半抗原cbz的nmr鉴定图。

图2半抗原cbz的lc-ms鉴定图。

图3cbz-bsa人工抗原的免疫原紫外鉴定图。

具体实施方式

实施例1半抗原cbz的合成合成路线如下：

将化合物1（5.0g，22.20mmol）溶于thf（50.0ml）溶液，加入4-氨基丁酸甲酯盐酸盐（3.4g，22.20mmol）和tea（6.75g，66.83mmol）。将反应在室温下搅拌并回流过夜。用乙酸乙酯萃取混合物，得到化合物2（7.3g），为黄色油状物，收率：97％。

将化合物2（2.0g，5.95mmol）溶于thf/h2o（10.0ml）溶液中加入lioh（0.6g，15.0mmol）。在室温下反应过夜。将混合物用1n盐酸调节至ph=3，过滤并浓缩，得到目标化合物（1.1g），为白色固体，产率：57％,制备得半抗原cbz。

半抗原cbz的nmr鉴定图如图1所示，lc-ms鉴定图如图2所示。

实施例2完全抗原cbz-bsa的制备方法如下：

a、称取步骤（1）所得8.9mgcbz，1-乙基碳二亚胺盐酸盐16.23mg，n-羟基琥珀酰亚胺8.8mg，用600μl无水n,n-二甲基甲酰胺溶解(称为a液)，室温搅拌反应4-6h。称取牛血清蛋白bsa10mg(cbz与bsa摩尔比为30:1),加入等体积硼酸缓冲溶液（称为b液），在室温条件，逐滴将a液加入到b液中，室温反应过夜，即得偶联物cbz-bsa混合液；

b、透析：取8cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；将偶联物cbz-bsa混合液放入透析袋于0.01mol/l的pbs中透析3天，每天三次换液，即得完全抗原cbz-bsa。所述cbz-bsa免疫原的紫外鉴定图如图3所示。

实施例3卡马西平人工抗原的鉴定

（1）采用核磁共振和液质联用技术鉴定半抗原。

（2）人工抗原采用紫外法鉴定其偶联结果，利用偶联物中小分子与蛋白的浓度，计算其偶联比。

偶联比测定：估算偶联物中被偶联的两种分子的比率（偶联比率）的方法，虽然测定方法种类很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量（或相对含量）的原理建立起来的。紫外法是依据合成的人工抗原中的小分子浓度与蛋白浓度的比确定偶联比的。

偶联物蛋白浓度测定：将反应前蛋白的质量除以透析后偶联物的体积即可得到偶联中蛋白的含量。

根据偶联比公式：

偶联物cbz-bsa的特征吸收峰在286nm处，此处的吸光值a2=1.351234512，bsa在此处的吸光值a1=0.384311231，cbz的特征吸收峰a3=0.752127821，cbz的相对分子质量m1=322.4，bsa的相对分子质量m2=67000，x为10μg/ml，则根据公式：

偶联比=[(a2-a1)(x/m1)/a3]/(0.5/m2)，cbz-bsa中半抗原cbz与蛋白bsa的偶联比为12:1。