一种用于拯救腮腺炎病毒的系统及拯救方法与流程
本发明涉及反向遗传学应用领域，具体涉及一种用于拯救腮腺炎病毒的系统及拯救方法。
背景技术：
腮腺炎是一种急性呼吸道传染病，主要通过呼吸道飞沫传播，多见于5-15岁患者。由于腮腺炎病毒对腺体组织和神经组织具有高度亲和性，可使多种腺体(腮腺、舌下腺、胰腺、生殖腺等)发生炎症改变，一旦侵犯神经系统，可导致脑膜炎等严重病变。
腮腺炎病毒(mumpsvirus)是腮腺炎的病原体，属于副粘液病毒科，腮腺炎病毒属的单股负链rna病毒。腮腺炎病毒基因组结构为：n-p-m-f-sh-hn-l，分别编码以下蛋白：核壳蛋白(n)，磷酸化蛋白(p)，膜蛋白(m)，融合蛋白(f)，小疏水蛋白(sh)，血凝素神经氨酸酶蛋白(hn)及大蛋白(l)。
接种疫苗是预防和控制传染病最经济、有效的公共卫生干预措施，对于家庭来说也是减少成员疾病发生、减少医疗费用的有效手段。我国于1979年从美国引入jeryl-lynn毒株，在原代鸡胚细胞减毒传3代后生产s79毒株。1990年开始生产s79株的腮腺炎疫苗，至今已经超过1亿剂腮腺炎疫苗用于中国儿童预防腮腺炎，该毒株具有病毒滴度较高，免疫原性较好，而临床反应轻的特点，各地使用后的抗体阳转率达82.6％-88.6％。但是最初制备腮腺炎疫苗的工艺较为复杂，需要在不同的细胞系中传代许多次才能得到减毒的毒株，费时费力，不利于大规模生产。
疫苗的开发是一个漫长而复杂的过程，且成本很高。全病毒灭活疫苗、裂解腮腺炎疫苗和亚单位疫苗免疫保护效果远不及减毒疫苗，而利用传统方法制备的腮腺炎减毒疫苗又存在着毒力恢复等缺陷。
反向遗传学的发展使得对负链rna病毒进行遗传操作成为可能，1994年schnellmj等成功地从质粒dna获取了重组体狂犬病病毒，这是反向遗传学技术在负链rna病毒的首次应用(schellmj，mebatsiont，conzelmannkk.infectiousrabiesvirusfromclonecdna.emboj.1994，13：4195-4203)。利用反向遗传学系统拯救出的病毒使对病毒的分子特征、致病机理、病毒与宿主之间的相互作用以及活载体疫苗的构建和制备的研究更为方便、快捷、深入。不仅如此，通过此技术构建的rna病毒载体还可用于基因治疗，新型致弱活病毒嵌合疫苗的研制也得益于此。
尽管一些负链rna病毒的反向遗传学的系统已经成功拯救出来(clarkedk,sidhums,johnsonje,udemsa.rescueofmumpsvirusfromcdna.jvirol.2000；74(10):4831-4838)，但其所使用的载体质粒在拯救负链rna病毒方面存在一些不足，并且体系和方法较为复杂，拯救难度较大。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种用于拯救腮腺炎病毒的系统，利用反向遗传学技术将腮腺炎病毒疫苗株全基因组整合到载体中构建出重组质粒，并通过拯救系统拯救出病毒，从而弥补了用传统方法制备腮腺炎病毒疫苗过程中遇到的不足。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种用于拯救腮腺炎病毒的系统，包括以下组成：
包含腮腺炎病毒全基因组cdna的重组转录载体；
包含腮腺炎病毒np基因的辅助质粒ⅰ；
包含腮腺炎病毒p基因的辅助质粒ⅱ；
以及包含腮腺炎病毒l基因的辅助质粒ⅲ。
所述重组转录载体为采用同源重组方法，高效地将腮腺炎病毒全基因组cdna连入载体中制得。
作为优选，所述腮腺炎病毒为腮腺炎s79减毒疫苗株，基因登录号为mh426702.1，核苷酸序列如seqidno.1所示。s79疫苗株全长基因组的有8个dna片段，8个片段分别是np、p、m、f、sh、hn、l1和l2。
作为优选，所述的重组转录载体中腮腺炎病毒全基因组cdna的5’端和3’端分别包含具有自我剪切功能的核酶序列，病毒的基因组的长度对病毒的复制和转录非常重要，具有自我剪切功能的核酶能保证转录产物的正确性，有利于病毒的拯救。
作为优选，所述腮腺炎病毒全基因组cdna的3’端包含丁肝病毒核酶序列。
作为优选，所述的重组转录载体为包含核苷酸序列如seqidno.1所示的腮腺炎病毒全基因组cdna的pyes-muv质粒。
所述pyes-muv质粒的构建方法，包括：
(1)以s79疫苗株全长基因组cdna为模板，利用5对相互有重叠的引物分别进行pcr扩增获得涵盖s79疫苗株全长基因组的基因片段muv-np-p、muv-m-f、muv-sh-hn、muv-l1、muv-l2；
(2)通过体外定点突变方式对muv-sh-hndna片段进行沉默突变引入基因标记，获得目的片段为muv-sh-hn-m1；所用引物为muv-8134-f：5’-tgcactgctaaactcaagcacaaccagg-3’，muv-8134-r：5’-cctggttgtgcttgagtttagcagtgca-3’；
(3)人工合成含有t7rna聚合酶启动序列，丁型肝炎病毒核酶序列和t7rna终止子序列的双链dna片段，通过双酶切的方式连接到pyes-2载体中，构建中间质粒pyes-trz；
(4)将muv-np-p、muv-m-f、muv-sh-hn-m1、muv-l1、muv-l2一次性连到线性化的pyes-trz载体中获得阳性质粒pyes-muv-s79。
病毒的n、p、l蛋白是病毒复制所必需，作为优选，所述的辅助质粒ⅰ为包含核苷酸序列如seqidno.2所示的基因片段muv-np-cds的pt7-muv-np质粒。
所述的辅助质粒ⅱ为包含核苷酸序列如seqidno.3所示的基因片段muv-p-cds的pt7-muv-p质粒。
所述的辅助质粒ⅲ为包含核苷酸序列如seqidno.4所示的基因片段muv-l-cds的pt7-muv-l质粒。
本发明还提供了一种拯救腮腺炎病毒的方法，包括以下步骤：
(1)将所述的用于拯救腮腺炎病毒系统中的重组转录载体和辅助质粒ⅰ、ⅱ、ⅲ共转染入辅助细胞中；
(2)培养后收集细胞与上清混合物感染vero细胞，传代，纯化拯救获得腮腺炎病毒疫苗株。
作为优选，步骤(1)中，重组转录载体、辅助质粒ⅰ、辅助质粒ⅱ和辅助质粒ⅲ的混合比例为5：1.5：1.5：0.5，经多次试验摸索该重组比例病毒能够保证高的拯救效率，以此比例拯救腮腺炎病毒的成功率为100％。
作为优选，所述辅助细胞为密度为60％-70％的bhk-t7-sr-19细胞。
本发明具备的优势：
本发明提供的3+1质粒拯救系统(表达muv-s79株n蛋白、p蛋白、l蛋白的辅助质粒和重组转录载体)能够有效地从体外拯救出腮腺炎病毒，重组腮腺炎病毒可用细胞培养的方法来大量扩增，且不需任何处理可直接用于疫苗的制造，克服了传统疫苗生产费时费力、工艺复杂等问题。另外，为以后运用插入、缺失、突变、移码等分子克隆技术改造腮腺炎病毒提供了基础，为候选腮腺炎疫苗的快速成型提供了解决方案，缩短了疫苗开发的时间与成本。
附图说明
图1为本发明实施例中腮腺炎病毒分段扩增示意图。
图2为本发明实施例中muv-np-p、muv-m-f、muv-sh-hn-m1、muv-l1和muv-l2核苷酸序列片段pcr扩增后琼脂糖凝胶电泳验证结果图。
图3为本发明实施例中辅助质粒pt7-muv-np、pt7-muv-p和pt7-muv-l构建过程流程示意图。
图4为本发明实施例中腮腺炎病毒s79疫苗株的全长基因组质粒构建过程流程示意图。
图5为本发明实施例中腮腺炎病毒s79疫苗株的全长基因组质粒琼脂糖凝胶电泳验证结果图。
图6为本发明实施例中拯救过程示意图。
图7为本发明实施例中腮腺炎病毒s79疫苗株拯救检测的cpe结果图。
图8为本发明实施例中腮腺炎病毒s79疫苗株拯救检测的测序结果图。
图9为本发明实施例中腮腺炎病毒s79疫苗株拯救检测的间接免疫荧光法检测结果图。
具体实施方式
以下将通过具体实施例对本发明作出详细的说明解释，但不限制本发明的范围。
实施例中用到的试剂和仪器如下：
细胞裂解液(trizoltmreagent)、反转录酶(
rna抽提试剂盒、质粒抽提试剂盒以及胶回收试剂盒皆购自qiagen公司。
随机引物(randomprimermix)、pcr高保真酶(
peasy-bluntcloningkit、感受态细胞(trans10chemicallycompetentcell)和trans2kplusdnamarker购于全式金公司。
羧苄青霉素钠购于索莱宝公司；实验用引物均由华大基因公司合成。
实施例1
1、提取病毒基因组rna
腮腺炎s79减毒疫苗株由浙江省疾病预防控制中心提供，根据trizoltmreagent细胞裂解液说明书提取该疫苗株基因组rna。
2、pcr扩增制备s79疫苗株全基因组的dna片段
以抽提的腮腺炎病毒rna为模板，根据
s79疫苗株全长基因组的有8个dna片段，8个片段分别是np、p、m、f、sh、hn、l1和l2，以cdna为模板，采用5对相互有重叠的引物扩增制备涵盖s79疫苗株的全长基因组，引物序列如表1所示。采用体外定点突变技术将原有片段muv-sh-hn突变为muv-sh-hn-m1，以与实验室原有毒株相区别。腮腺炎病毒的分段扩增示意图如图1所示。
表1
反应程序为：98℃预变性40s，98℃变性8s，58℃退火30s，72℃延伸2min，35个循环后，72℃延伸2min。
dna片段大小通过琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图2所示，5个目标dna片段位于正确的位置，切胶并根据qiaquickgelextractionkit说明书对上述dna片段进行纯化与回收。
3、重组质粒的构建
使用peasy-bluntcloningkit将5个目的dna片段muv-np-p、muv-m-f、muv-sh-hn、muv-l1和muv-l2片段分别与peasy-bluntcloning克隆载体相连接，获得peasy-muv-np-p、peasy-muv-m-f、peasy-muv-sh-hn、peasy-muv-l1和peasy-muv-l2。
4、辅助质粒的构建
将dna片段muv-np-cds、muv-p-cds、muv-l1-cds和muv-l2-cds分别连到表达载体pt7中，构建过程流程示意图如图3所示。具体步骤如下：
以peasy-muv-np-p、peasy-muv-l1、peasy-muv-l2分别为模板，利用引物分别扩增病毒s79疫苗株的muv-np-cds、muv-p-cds、muv-l-cds1、mv-l-cds2，引物序列如表2所示。
表2
pt7载体质粒用pcr引物扩增获得线性片段。利用genearttmseamlesscloningandassemblykit将muv-np-cds与pt7线性化载体片段、muv-p-cds与pt7线性化载体片段、muv-l-cds1与muv-l-cds2与t7线性化载体片段分别进行连接并转化，表达获得np、p、l的3种辅助质粒，分别为pt7-muv-np、pt7-muv-p、pt7-muv-l。
5、腮腺炎病毒s79疫苗株的全长质粒的构建
含有t7rna聚合酶启动序列，丁型肝炎病毒核酶序列和t7rna终止子序列的双链dna片段的中间质粒pyes-trz由本实验构建保存。
使用genearttmhigh-ordergeneticassemblysystem试剂盒将涵盖腮腺炎病毒s79疫苗株全基因组序列的5个dna片段muv-np-p、muv-m-f、muv-sh-hn-m1、muv-l1、muv-l2一次性连到线性化的pyes-trz载体中获得阳性质粒pyes-muv-s79。构建流程示意图如图4所示，构出的质粒分别利用表1的引物进行pcr扩增，并经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，结果如图5所示。其中片段muv-sh-hn-m1是使用引物进行定点突变的。
6、腮腺炎病毒s79疫苗株拯救及检测
(1)腮腺炎病毒s79疫苗株的拯救
重组腮腺病毒疫苗株全长质粒pyes-muv-s795μg，以及其辅助质粒pt7-muv-np1.5μg、pt7-muv-p1.5μg和pt7-muv-l0.5μg共转染密度为60％-70％的bhk-t7细胞。转染3天后收集细胞上清混合物感染vero细胞，培养4-5天后，利用电子显微镜观察细胞病变情况，反复冻融细胞3次，离心后收集上清，继续传至新的vero细胞中并观察细胞病变情况，重复拯救过程8次，拯救效率为100％，反复冻融细胞3次后收集上清，部分提取病毒rna，剩余部分置于负80度冰箱备用，拯救示意图如图6所示。
(2)观察病毒产生的特异性的细胞病变
腮腺炎病毒能够感染vero细胞并使其形成合胞体，从而产生特异性的合胞体样细胞病变(cpe)，上述质粒混合物转染bhk-t7细胞3天后，刮下细胞接到vero细胞中若拯救成功可观察到明显的cpe。显微镜观察下结果如图7所示。
(3)测序验证
抽提病毒rna，测序检测hn8134位置的突变情况，排除实验室原毒株污染，结果如图8所示，表明腮腺炎病毒质粒构建和拯救成功。
(4)间接免疫荧光发验证
使用间接免疫荧光法进一步对上述拯救出来的重组腮腺炎病毒s79疫苗株进行鉴定，结果如图9所示，通过在荧光显微镜下观察，结果可见感染腮腺炎病毒的vero细胞可见阳性的红色荧光信号，而未感染病毒的vero未观察到红色荧光信号。
序列表
<110>浙江大学
<120>一种用于拯救腮腺炎病毒的系统及拯救方法
<160>4
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>15384
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
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