具抗癌抗病毒抗发炎、促进成骨细胞增生促进肠道干细胞增生的多糖发酵组合物及制备方法与流程

本发明提供一种组合物含多糖蔬菜、菇类、藻类(如:莲藕、山药、芦荟、香菇、木耳、银耳、海木耳、石菜花、石莼、青丝藻、海葡萄、葛仙米藻)作为原料，经特殊发酵制备方法，将多糖分子(β葡聚糖、α葡聚糖)转化、分割形成小分子形态糖类，其为分子量约在300道尔顿的多糖发酵组合物，其结构不同于一般多糖分子，为有机形态，经发酵后支链上多余的葡萄糖结构被菌体利用代谢，去除多余葡萄糖分子，可使糖分子具有亲合力，成为包覆材料，具有抗癌、抗病毒、抗发炎、促进成骨细胞增生、促进肠道干细胞增生的功效。

背景技术：

多糖体即是葡萄糖以其特殊接合方式(1-3)-β键结连接的葡聚糖(glucan)，又称β-1,3.d葡聚糖，其他还有β-1,6.d葡聚糖。人体肠道中的消化酵素能切开淀粉的(1-4)-α键结链，将其水解成葡萄糖，以利肠道吸收利用；但是消化酵素对于β-1,3.d以及β-1,6.d葡聚糖键结起不了作用，因此庞大体积的多糖体并无法穿透肠壁细胞。

常见多糖研究如:灵芝(ganodermalucidum)：中国台湾以赤芝和松杉灵芝为主，除了含有多糖体外，还含有有机锗、三萜类、免疫调节蛋白、腺苷、油酸、亚麻油酸、次亚麻油酸、灵芝酸等物质，可以改善肝发炎状态；冬虫夏草(cordycepssinensis)：其内含有虫草酸、虫草素(cordycepin)、微量元素硒、锌、各类氨基酸、脂肪酸等。其内含的有机物质在抗肿瘤上都扮演着一定角色；牛樟芝(taiwanofunguscamphoratus)：又称为牛樟菇、神明菇，是一种台湾独特的药用真菌，含有三萜类、β葡聚糖、抗氧化酵素sod、多糖体等，具有调节免疫系统、抗癌等作用，可以促进癌细胞凋亡、提升自然杀手细胞活性、调降nf-κb、抗血管新生、增加化疗药物的敏感性，以及对于癌干细胞的促凋亡；藻类萃取物：如褐藻糖胶(fucoidan)或是藻褐素(fucoxanthin)皆是，具有增加自然杀手细胞活性、促进癌细胞凋亡、增加免疫力之功效、抑制血管新生、抗发炎等作用；巴西蘑菇(agaricusblazei)：在巴西又称之为神菇(godofmushroom)，其富含葡聚糖多糖体，对于许多癌症如子宫颈癌、骨肉瘤等具有促进癌细胞凋亡效果。

另依据文献extractsfromnewzealandundariapinnatifidacontainingfucoxanthinaspotentialfunctionalbiomaterialsagainstcancerinvitro，该研究在抗癌活性使用九种人类癌细胞系中测试含有岩藻黄素的新西兰海藻裙带菜的萃取物和纯的岩藻黄素，与纯的岩藻黄素相比，我们发现含有低水平岩藻黄质的萃取物可更有效地抑制肺癌、结肠腺癌和神经母细胞瘤的生长。该研究结果新西兰海藻裙带菜含有岩藻黄素，其对多种类型的癌细胞，特别是黑素瘤和子宫颈鳞状细胞癌具有生长抑制作用，在低浓度下，岩藻黄质对一种恶性黑素瘤细胞系显示出选择性细胞毒性，用于治疗或预防这两种类型的癌症，岩藻黄素也可以在与其他细胞毒性抗癌药物的联合化疗中以相对低的剂量使用，因为在低浓度下，它对癌细胞表现出选择性癌细胞生长抑制作用，但需要进一步的研究来鉴定这种化合物。

依目前研究证实菇类、藻类富含丰富多糖，该多糖成分具有许多抗癌、抗病毒、抗发炎等功效，但由萃取方式取得的多糖成分分子量约在6,000道尔顿，且根据文献指出多糖成分具有功效性，其分子量需大于6,000道尔顿，或小于500道尔顿，但对于癌症病患而言，化疗副作用会导致食欲不振、肠胃吸收率变差等副作用，若以大分子形态多糖作为辅助食品，是否能被患者吸收或肠道利用仍是个疑问。

且目前所知多糖成分的提取以水萃取或有机溶剂萃取为主，其功效性为天然拥有，并不能有效提升作用性，其分子量约在6,000道尔顿以上，对于患者存在吸收率差的问题，吸收前还需要水解酵素的作用，若在摄取前已将分子量缩小为500道尔顿以下，就能解决不易吸收的缺点。

且在另一藻类研究中藻类中的多糖及多酚物质具有抗氧化、抗癌、抗凝血、抗发炎、抗病毒、抗高脂血症等功效，为了取得这些活性物质，产业界通常使用热水、溶剂、酸水解、酵素水解等萃取法，但这些萃取方式通常伴随着一些限制因子，包括：高成本、流程复杂及溶剂残存毒性问题。另有研究发现藻类发酵过程能释放出更多的藻类活性成分，如：一般萃取法不易取得的特有海藻胜肽、氨基酸、多酚类化合物都可透过发酵过程充分释出，让产品中的营养素更丰富，且经长时间发酵作用，可将海藻中的营养素分解成小分子状态，更利于生物吸收利用。

因此发展出适合一般大众使用、更利于生物吸收和肠道利用的多糖发酵组合物，且具有抗癌、抗病毒、抗发炎、促进成骨细胞增生、促进肠道干细胞增生的功效是现阶段最重要急需解决的问题。

技术实现要素：

为解决上述的问题，本发明提供一种多糖组合物，含有蔬菜、菇类、藻类(如:莲藕、山药、芦荟、香菇、木耳、银耳、海木耳、石菜花、石莼、青丝藻、海葡萄、葛仙米藻)作为多糖原料，经特殊制备方法，将多糖分子(β葡聚糖、α葡聚糖)转化、分割形成小分子形态糖类的多糖发酵组合物。

本发明一实施例中一种多糖发酵组合物，包括:原料选自蔬菜、菇类或藻类中的一种或多种，经制备方法取得多糖分子，该多糖分子包含分子量小于等于500道尔顿的多糖，该多糖分子包含多糖支链上的葡萄糖被去除的多糖分子。

本发明一实施例中，所述的多糖发酵组合物，其中该多糖分子包含分子量小于等于300道尔顿的多糖。

本发明一实施例中，所述的多糖发酵组合物，其中该分子量小于等于300道尔顿的多糖占该多糖发酵组合物的总多糖干重80～99％。

本发明一实施例中，所述的多糖发酵组合物，其中该藻类是选自石菜花、石莼、青丝藻、海葡萄或葛仙米藻及其混合物中的一种或多种。

本发明一实施例中，所述的多糖发酵组合物，其中该蔬菜选自由菠萝、木瓜、苹果、莲藕、山药或芦荟及其混合物中的一种或多种。

本发明一实施例中，所述的多糖发酵组合物，其中该菇类选自由香菇、木耳、银耳或海木耳及其混合物中的一种或多种。

本发明一实施例中，所述的多糖发酵组合物，其中该多糖分子为β葡聚糖或α葡聚糖。

本发明一实施例中，所述的多糖发酵组合物，其中该多糖分子结构不同于一般多糖分子，为有机形态，经发酵过程透过微生物所产生的水解酵素，将该多糖分子支链上的部分葡萄糖去除，可使该多糖分子与多种物质(如蛋白质氨基酸、益菌菌体、植物化合物、病毒体、病原菌体、重金属污染物)具有亲合力，可做为包覆材料。

本发明一实施例中一种制备上述多糖发酵组合物的制备方法，包括:

(1)基质发酵步骤：将蔬菜、菇类和藻类其总质量占50～80％，加入蔬果液20％～50％和糖类0.2％～20％至发酵筒中，该发酵筒二氧化碳控制在1000ppm以下，温度设定为25～28℃，发酵30～60天，取得基质发酵液；

(2)乳酸菌发酵步骤：将步骤(1)取得的基质发酵液加入一乳酸菌和糖类0.2～20％，二氧化碳控制在1000ppm以下，温度设定为25～28℃，ph值调整至5～7之间，发酵30～60天，取得乳酸菌发酵液；

(3)酵母菌发酵步骤：将步骤(2)取得的乳酸菌发酵液加入一酵母菌和糖类0.2～20％，二氧化碳控制在1000ppm以下，温度设定为25～28℃，ph值调整至5～7之间，发酵30～60天，取得酵母菌发酵液；以及

(4)分离步骤：将步骤(3)取得的酵母菌发酵液经300da、1000da尺寸滤膜进行分离，取得分子量小于等于300da的多糖发酵组合物，该多糖发酵组合物用于制备抗癌、抗病毒、抗发炎、促进成骨细胞增生、促进肠道干细胞增生的药物的用途。

本发明一实施例中所述的制备方法，其中所述的蔬果液选自菠萝、木瓜或苹果中的一种或多种。

本发明一实施例中所述的制备方法，其中所述的糖类选自果糖、葡萄糖、乳糖、木糖或黑糖中的一种或多种。

本发明一实施例中所述的制备方法，其中所述的乳酸菌选自lactobacillusplantarum、lactobacillusdelbrueckii、lactococcuslactis、lactococcusacidophillus或bifidobacteriumbifidum中的一种或多种。

本发明一实施例中所述的制备方法，其中所述的乳酸菌的混合比例为lactobacillusplantarum菌种浓度范围3×10⁸cfu/g～5×10⁸cfu/g、lactobacillusdelbrueckii菌种浓度范围3×10⁸cfu/g～5×10⁸cfu/g、lactococcuslactis菌种浓度范围3×10⁸cfu/g～5×10⁸cfu/g、lactococcusacidophillus菌种浓度范围3×10⁸cfu/g～5×10⁸cfu/g和bifidobacteriumbifidum菌种浓度范围3×10⁸cfu/g～5×10⁸cfu/g，接种体积为1～3％，最佳条件为1×10⁷cfu/ml，添加比例为1.5％，发酵温度控制在26-32℃。

本发明一实施例中所述的制备方法，其中所述的酵母菌选自saccharomycopsisfibufigera、pichiamembramefaciens、schizosaccharomyespombe或saccharomycescerevisiae中的一种或多种。

本发明一实施例中所述的制备方法，其中所述的酵母菌的混合比例为saccharomycopsisfibufigera菌种浓度范围3×10⁸cfu/g～5×10⁸cfu/g、pichiamembramefaciens菌种浓度范围3×10⁸cfu/g～5×10⁸cfu/g、schizosaccharomyespombe菌种浓度范围3×10⁸cfu/g～5×10⁸cfu/g和saccharomycescerevisiae菌种浓度范围3×10⁸cfu/g～5×10⁸cfu/g，接种体积为1～3％，最佳条件为1×10⁷cfu/ml，添加比例为1.5％，发酵温度控制在26-32℃。

本发明一最佳实施例中将蔬菜、菇类和藻类(包括:莲藕、山药、芦荟、香菇、木耳、银耳、海木耳、石菜花、石莼、青丝藻、海葡萄、葛仙米藻)，加入蔬果液(以菠萝、木瓜、苹果为基质)和2株菌(如:酵母菌:saccharomycescerevisiae、乳酸菌:lactobacillusplantarum)至发酵筒中，经90-180天发酵生成，发酵液以等比例混合，以乙醇萃取糖类化合物，再将沉淀的糖类化合物冷冻干燥。

本发明一实施例中的多糖发酵组合物用于制备抗癌、抗病毒、抗发炎、促进成骨细胞增生、促进肠道干细胞增生的药物的用途。

附图说明

图1显示多糖发酵组合物，该多糖分子包覆特性可包覆蛋白氨基酸、益菌菌体、植物化合物、病毒体、病原菌体或重金属污染物。

图2显示多糖发酵组合物的抗病毒试验，24小时后的细胞保护能力，实验分成四组:(1)该多糖发酵组合物(polysacchridestructureextract)、(2)水萃取多糖组(polysacchrideextract)、(3)攻毒组(virus)和(4)未攻毒组(control)，数值表示为平均值±标准偏差，a.p<0.05表示与(3)病毒组相比，其24小时后的细胞保护能力有显著差异；b.p<0.05表示与(2)水萃取多糖组(polysacchrideextract)相比，其24小时后的细胞保护能力有显著差异。

图3显示多糖发酵组合物的抗病毒试验，24小时后抗病毒能力，实验分成四组:(1)该多糖发酵组合物(polysacchridestructureextract)、(2)水萃取多糖组(polysacchrideextract)、(3)攻毒组(virus)和(4)未攻毒组(control)，数值表示为平均值±标准偏差，a.p<0.05表示与(3)病毒组相比，其24小时后的抗病毒能力有显著差异；b.p<0.05表示与(2)水萃取多糖组(polysacchrideextract)相比，其24小时后的抗病毒能力有显著差异。

图4显示多糖发酵组合物的抑制肺腺癌细胞能力试验，24小时的抑制肺癌细胞(lcc-1)能力，实验分成三组样本，分别为:(1)该多糖发酵组合物(polysacchridestructureextract)、(2)水萃取多糖组(polysacchrideextract)和(3)对照组(control)。数值表示为平均值±标准偏差，a.p<0.05表示与(3)对照组(control)相比，其24小时的抑制lcc-1肺癌能力有显著差异；b.p<0.05表示与(2)水萃取多糖组(polysacchrideextract)相比，其24小时的抑制肺癌细胞(lcc-1)能力有显著差异。

图5显示多糖发酵组合物的抑制肺腺癌细胞能力试验，48小时的抑制肺癌细胞(lcc-1)能力，实验分成三组样本，分别为:(1)该多糖发酵组合物(polysacchridestructureextract)、(2)水萃取多糖组(polysacchrideextract)和(3)对照组(control)。数值表示为平均值±标准偏差，a.p<0.05表示与(3)对照组(control)相比，其48小时的抑制lcc-1肺癌能力有显著差异；b.p<0.05表示与(2)水萃取多糖组(polysacchrideextract)相比，其48小时的抑制肺癌细胞(lcc-1)能力有显著差异。

图6显示多糖发酵组合物的抑制结肠癌细胞能力试验，24小时的抑制结肠癌细胞(widr)能力，实验分成三组样本，分别为:(1)该多糖发酵组合物(polysacchridestructureextract)、(2)水萃取多糖组(polysacchrideextract)和(3)对照组(control)。数值表示为平均值±标准偏差，a.p<0.05表示与(3)对照组(control)相比，其24小时的抑制widr结肠癌能力有显著差异；b.p<0.05表示与(2)水萃取多糖组(polysacchrideextract)相比，其24小时的抑制结肠癌细胞(widr)能力有显著差异。

图7显示多糖发酵组合物的抑制结肠癌细胞能力试验，48小时的抑制结肠癌细胞(widr)能力，实验分成三组样本，分别为:(1)该多糖发酵组合物(polysacchridestructureextract)、(2)水萃取多糖组(polysacchrideextract)和(3)对照组(control)。数值表示为平均值±标准偏差，a.p<0.05表示与(3)对照组(control)相比，其48小时的抑制widr结肠癌能力有显著差异；b.p<0.05表示与(2)水萃取多糖组(polysacchrideextract)相比，其48小时的抑制结肠癌细胞(widr)能力有显著差异。

图8显示多糖发酵组合物的抑制乳癌细胞能力试验，24小时的抑制乳腺癌细胞(mcf-7)能力，实验分成三组样本，分别为:(1)该多糖发酵组合物(polysacchridestructureextract)、(2)水萃取多糖组(polysacchrideextract)和(3)对照组(control)。数值表示为平均值±标准偏差，a.p<0.05表示与(3)对照组(control)相比，其24小时的抑制乳腺癌细胞(mcf-7)能力有显著差异；b.p<0.05表示与(2)水萃取多糖组(polysacchrideextract)相比，其24小时的抑制乳腺癌细胞(mcf-7)能力有显著差异。

图9显示多糖发酵组合物的抑制乳癌细胞能力试验，48小时的抑制乳腺癌细胞(mcf-7)能力，实验分成三组样本，分别为:(1)该多糖发酵组合物(polysacchridestructureextract)、(2)水萃取多糖组(polysacchrideextract)和(3)对照组(control)。数值表示为平均值±标准偏差，a.p<0.05表示与(3)对照组(control)相比，其48小时的抑制乳腺癌细胞(mcf-7)能力有显著差异；b.p<0.05表示与(2)水萃取多糖组(polysacchrideextract)相比，其48小时的抑制乳腺癌细胞(mcf-7)能力有显著差异。

图10显示多糖发酵组合物的成骨细胞增生试验，24小时的成骨细胞(7f2)的增生能力，实验分成三组样本，分别为:(1)该多糖发酵组合物(polysacchridestructureextract)、(2)水萃取多糖组(polysacchrideextract)和(3)对照组(control)。数值表示为平均值±标准偏差，a.p<0.05表示与(3)对照组(control)相比，其24小时的成骨细胞(7f2)的增生能力有显著差异；b.p<0.05表示与(2)水萃取多糖组(polysacchrideextract)相比，其24小时的成骨细胞(7f2)的增生能力有显著差异。

图11显示多糖发酵组合物的成骨细胞增生试验，48小时的成骨细胞(7f2)的增生能力，实验分成三组样本，分别为:(1)该多糖发酵组合物(polysacchridestructureextract)、(2)水萃取多糖组(polysacchrideextract)和(3)对照组(control)。数值表示为平均值±标准偏差，a.p<0.05表示与(3)对照组(control)相比，其48小时的成骨细胞(7f2)的增生能力有显著差异；b.p<0.05表示与(2)水萃取多糖组(polysacchrideextract)相比，其48小时的成骨细胞(7f2)的增生能力有显著差异。

图12显示多糖发酵组合物的肠道干细胞增生试验，24小时的肠干细胞(iscs)的增生能力，实验分成三组样本，分别为:(1)该多糖发酵组合物(polysacchridestructureextract)、(2)水萃取多糖组(polysacchrideextract)和(3)对照组(control)。数值表示为平均值±标准偏差，a.p<0.05表示与(3)对照组(control)相比，其24小时的肠干细胞(iscs)的增生能力有显著差异；b.p<0.05表示与(2)水萃取多糖组(polysacchrideextract)相比，其24小时的iscs(肠干细胞)的增生能力有显著差异。

图13显示多糖发酵组合物的肠道干细胞增生试验，48小时的肠干细胞(iscs)的增生能力，实验分成三组样本，分别为:(1)该多糖发酵组合物(polysacchridestructureextract)、(2)水萃取多糖组(polysacchrideextract)和(3)对照组(control)。数值表示为平均值±标准偏差，a.p<0.05表示与(3)对照组(control)相比，其48小时的肠干细胞(iscs)的增生能力有显著差异；b.p<0.05表示与(2)水萃取多糖组(polysacchrideextract)相比，其48小时的肠干细胞(iscs)的增生能力有显著差异。

图14显示多糖发酵组合物的抗发炎能力试验，il-6抗发炎能力，实验分成三组样本，分别为:(1)该多糖发酵组合物(polysacchridestructureextract)、(2)水萃取多糖组(polysacchrideextract)和(3)对照组(lps)。数值表示为平均值±标准偏差，a.p<0.05表示与(3)对照组(lps)相比，其il-6抗发炎能力有显著差异；b.p<0.05表示与(2)水萃取多糖组(polysacchrideextract)相比，其il-6抗发炎能力有显著差异。

图15显示多糖发酵组合物的抗发炎能力试验，tnf-α抗发炎能力，实验分成三组样本，分别为:(1)该多糖发酵组合物(polysacchridestructureextract)、(2)水萃取多糖组(polysacchrideextract)和(3)对照组(lps)。数值表示为平均值±标准偏差，a.p<0.05表示与(3)对照组(lps)相比，其tnf-α抗发炎能力有显著差异；b.p<0.05表示与(2)水萃取多糖组(polysacchrideextract)相比，其tnf-α抗发炎能力有显著差异。

实施方式

实施例1：多糖发酵组合物的制备方法

以一种或多种含多糖蔬菜、菇类、藻类作为原料(莲藕、山药、芦荟、香菇、木耳、银耳、海木耳、石菜花、石莼、青丝藻、海葡萄、葛仙米藻)，经特殊发酵技术，将多糖分子(β葡聚糖、α葡聚糖)转化、分割形成小分子形态糖类化合物，分子量约在300道尔顿，其结构不同于一般多糖分子，为有机形态，经发酵后支链上多余的葡萄糖结构被菌体利用代谢，去除多余葡萄糖分子，可使糖分子具有亲合力，成为可包覆的多糖发酵组合物，并具有强抗癌特性、抗病毒特性、抗发炎特性、对成骨细胞、肠道干细胞具有增生效果；多糖发酵组合物的发酵制程为：

1.基质发酵步骤：

蔬果液(如菠萝、木瓜、苹果液)当中含有消化酵素或消化物质(如菠萝酵素、木瓜酵素、果酸)，利用消化酵素作用将植株进行初步分解，破坏细胞壁，使细胞内营养物质释放。

制成时以独立发酵筒，取用莲藕、山药、芦荟、香菇、木耳、银耳、海木耳、石菜花、石莼、青丝藻、海葡萄、葛仙米藻共12种植株，以等比例混合。取完整植株质量至少占50～80％，加入特定蔬果液至少占20～50％，糖类(如:果糖、葡萄糖、乳糖、木糖、黑糖)0.2～20％，二氧化碳控制在1000ppm以下，温度设定25～28℃，发酵天数30～60天，取得基质发酵液。

2.乳酸菌发酵步骤：

对初步分解的发酵液营养物质进行小分子化，利用消化酵素或水解酵素，同时对营养物质结构进行修饰，乳酸菌发酵过程中，分解营养物质结构上多余的单糖分子进行利用，修饰后营养物质可具有较高的黏附特性，利于后续进阶修饰(如糖基化)。

制成时以独立发酵筒，将完整植株质量至少占50～80％，加入乳酸菌1～5株(lactobacillusplantarum、lactobacillusdelbrueckii、lactococcuslactis、lactococcusacidophillus、bifidobacteriumbifidum)，糖类(如:果糖、葡萄糖、乳糖、木糖)0.2～20％，二氧化碳控制在1000ppm以下，温度设定25～28℃，ph值调整至5～7之间，发酵天数30～60天，取得乳酸菌发酵液。

3.酵母菌发酵步骤：

对乳酸菌发酵的发酵液营养物质进行小分子化，利用消化酵素或水解酵素，同时对营养物质结构进行修饰，酵母菌发酵过程中，分解营养物质结构上多余的单糖分子进行利用，修饰后营养物质可具有较高的黏附特性，利于后续进阶修饰(如糖基化)。

制成时以独立发酵筒，将完整植株质量至少占50～80％，加入酵母菌1～4株(saccharomycopsisfibufigera、pichiamembramefaciens、schizosaccharomyespombe、saccharomycescerevisiae)，糖类(如:果糖、葡萄糖、乳糖、木糖、黑糖)0.2～20％，二氧化碳控制在1000ppm以下，温度设定25～28℃，ph值调整至5～7之间，发酵天数30～60天，取得酵母菌发酵液。

分离沉淀步骤：

将该酵母菌发酵液经过300道尔顿、1000道尔顿尺寸滤膜进行分离，取得发酵液分子量小于等于300道尔顿，再以乙醇沉淀进行多糖分子萃取。

实施例2：多糖发酵组合物与多糖水萃取液成分比较

本发明原料取用莲藕、山药、芦荟、香菇、木耳、银耳、海木耳、石菜花、石莼、青丝藻、海葡萄、葛仙米藻共12种植株，各项原料以独立发酵方式，再以等比例混合，各项原料以独立发酵方式，与菠萝、木瓜、苹果作为基质，经90～180天发酵，共2株菌(酵母菌:saccharomycescerevisiae；乳酸菌:lactobacillusplantarum)发酵生成，发酵液以等比例混合，以乙醇萃取糖类化合物，再将沉淀的糖类化合物冷冻干燥。

以下实验分为2组:

(1)多糖发酵组合物(polysacchridefermentedliquid)

(2)多糖水萃取液(polysacchrideextract)：取用莲藕、山药、芦荟、香菇、木耳、银耳、海木耳、石菜花、石莼、青丝藻、海葡萄、葛仙米藻共12种植株，以等比例混合，各项原料以样本:水＝1:60比例混合，加热至90℃，持续4小时，冷却后过滤取得各项原料热水萃取液，萃取时为不同种类蔬菜独立萃取，等比例混合萃取液后，以乙醇萃取糖类化合物，再将沉淀的糖类化合物冷冻干燥。

(a)总糖含量测定：量取1000ml发酵液/萃取液，加入3000ml乙醇，沉淀24小时后离心，将沉淀总糖冷冻干燥后秤重。

(b)糖类组成分析：将萃取液及发酵液经300道尔顿、1000道尔顿尺寸滤膜进行分离，取得三种不同区间的多糖水萃取液或多糖发酵组合物，再以乙醇沉淀进行多糖萃取，冷冻干燥后秤重。下表1显示多糖发酵组合物组成以300道尔顿以下的多糖分子为主，占总糖约80％；多糖水萃取液则皆为1,000道尔顿以上的大分子多糖，占总糖80％。

表1.多糖水萃取液和多糖发酵组合物的多糖分子量组成比例

实施例3：多糖发酵组合物的抗病毒试验

将以下实验分为4组:

(1)多糖发酵组合物(polysacchridestructureextract):以萃取后300道尔顿以下糖构物为样本进行试验。

(2)水萃取多糖(polysacchrideextract):以萃取后300道尔顿以下糖类为样本进行试验。

(3)攻毒组(virus)：未加入任何样本。

(4)未攻毒(control)：未加入任何样本。

分为两种途径进行试验:1.对细胞的保护作用：veto细胞(vero)与各样品共培养4小时后，加入肠病毒71型病毒培养24小时；2.对病毒的抵抗作用：病毒与样品混合后4小时后，加入细胞培养24小时。后续以mttassay进行细胞存活率检验。浓度为5×10⁴cell/well。

1.对细胞的保护作用结果：结果(如图2所示)显示水萃取多糖保护细胞能力约50％，且保护细胞及抵抗病毒能力ic50≈1μg/ml；多糖发酵组合物保护细胞能力将近90％，可保护细胞免受病毒感染造成死亡，且保护细胞能力ic50≈0.425μg/ml，使用量为55μl/70kg人。

2.对病毒的抵抗作用结果：结果(如图3所示)显示水萃取多糖抵抗病毒能力约50％；多糖发酵组合物抵抗病毒能力约70％且其抵抗病毒能力ic50≈0.55μg/ml，使用量为70μl/70kg人。

实施例4：多糖发酵组合物的抑制癌细胞能力试验

将以下实验分为3组:

(1)多糖发酵组合物(polysacchridestructureextract):以萃取后300道尔顿以下糖构物为样本进行试验。

(2)水萃取多糖(polysacchrideextract):以萃取后300道尔顿以下糖类为样本进行试验。

(3)控制组(control)：未加入任何样本。

1.抑制肺腺癌细胞(lcc-1)能力试验：

以肺腺癌细胞(lcc-1)作为模型，肺腺癌细胞(lcc-1)的细胞数为5×10⁴cell/well，与(1)多糖发酵组合物、(2)水萃取多糖和(3)控制组的样品浓度各为1、5、10、15、20μm(此为换算含有糖构物浓度)，分别培养24与48小时，肺腺癌细胞(lcc-1)与样品共培养后以mttassay检验抑制癌细胞生长能力，检验结果如图4、5。

抑制肺腺癌细胞(lcc-1)能力结果：结果(如图5所示)显示水萃取多糖在48小时，肺腺癌细胞(lcc-1)存活率仍高于70％，另根据文献研究指出，水萃取多糖抑制肺腺癌细胞(lcc-1)的ic50≈44.7μm。多糖发酵组合物在48小时，抑制肺腺癌细胞的生长抑制率达到约80％，且多糖发酵组合物抑制肺腺癌细胞(lcc-1)的ic50≈7.85μm，使用量为0.335ml/70kg人。

2.抑制结肠癌细胞(widr)能力试验：

以结肠癌细胞(widr)作为模型，结肠癌细胞(widr)的细胞数为5×10⁴cell/well，与(1)多糖发酵组合物、(2)水萃取多糖和(3)控制组的样品浓度各为1、5、10、15、20μm(此为换算含有糖构物浓度)，分别培养24与48小时，结肠癌细胞(widr)与样品共培养后以mttassay检验抑制癌细胞生长能力，检验结果如图6、7。

抑制结肠癌细胞(widr)能力结果：结果(如图7所示)显示水萃取多糖在48小时，结肠癌细胞存活率仍高于80％，另根据文献研究指出，水萃取多糖抑制结肠癌细胞(widr)的ic50≈39.6μm。多糖发酵组合物在48小时，抑制结肠癌细胞(widr)的生长，抑制率达到约80％，且多糖发酵组合物抑制结肠癌细胞(widr)的ic50≈9.55μm，使用量为0.408ml/70kg人。

3.抑制乳癌细胞(mcf-7)能力试验：

以乳癌细胞(mcf-7)作为模型，乳癌细胞(mcf-7)的细胞数为5×10⁴cell/well，与(1)多糖发酵组合物、(2)水萃取多糖和(3)控制组的样品浓度各为1、5、10、15、20μm(此为换算含有糖构物浓度)，分别培养24与48小时，乳癌细胞(mcf-7)与样品共培养后以mttassay检验抑制癌细胞生长能力，检验结果如图8、9。

抑制乳癌细胞(mcf-7)能力结果：结果(如图9所示)显示水萃取多糖在48小时，乳癌细胞(mcf-7)存活率仍高于80％，另根据文献研究指出，水萃取多糖抑制乳癌细胞(mcf-7)的ic50≈44μm。多糖发酵组合物在48小时，抑制乳癌细胞(mcf-7)的生长，抑制率达到约80％，且多糖发酵组合物抑制乳癌细胞(mcf-7)的ic50≈9.4μm，使用量为0.4ml/70kg人。

4.成骨细胞(7f2)增生试验：

以成骨细胞(7f2)作为模型，成骨细胞(7f2)的细胞数为5×10⁴cell/well，与(1)多糖发酵组合物、(2)水萃取多糖和(3)控制组的样品浓度各为10、20、30、40、50μm(此为换算含有糖构物浓度)，分别培养24与48小时，成骨细胞(7f2)与样品共培养后以mttassay检验成骨细胞增生能力，检验结果如图10、11。

成骨细胞(7f2)增生能力结果：结果(如图11所示)显示水萃取多糖在48小时，成骨细胞(7f2)存活率约120％，具有20％增生率，另根据文献研究指出，水萃取多糖增生成骨细胞(7f2)的ec50≈2000μg/ml。多糖发酵组合物在48小时，成骨细胞(7f2)存活率超过180％，增生率达到80％，且多糖发酵组合物对成骨细胞(7f2)增生能力ec50≈9.4μg/ml；使用量为1.329ml/70kg人。

5.肠道干细胞(iscs)增生试验：

以肠干细胞(iscs)作为模型，肠干细胞(iscs)的细胞数为5×10⁴cell/well，与(1)多糖发酵组合物、(2)水萃取多糖和(3)控制组的样品浓度各为10、20、30、40、50μm(此为换算含有糖构物浓度)，分别培养24与48小时，肠干细胞(iscs)与样品共培养后以mttassay检验肠干细胞(iscs)能力，检验结果如图12、13。

肠干细胞(iscs)增生能力结果：结果(如图13所示)显示水萃取多糖在48小时后，肠干细胞(iscs)存活率约120％，具有20％增生率。而多糖发酵组合物在48小时后，肠干细胞(iscs)存活率超过180％，增生率达到80％。

6.抗发炎能力试验：

以raw264.7(小鼠巨噬细胞)作为模型，raw264.7(小鼠巨噬细胞)细胞数为5×10⁴cell/well，与(1)多糖发酵组合物、(2)水萃取多糖和(3)控制组的样品浓度各为10、20、30、40、50μm(此为换算含有糖构物浓度)，先以1μg/mllps诱导巨噬细胞产生发炎反应，培养24小时后加入样品，样品浓度分别为10、20、30、40、50μm，培养24小时以elisakit检验il-6与tnf-α，检验样本是否能降低发炎因子的产生。

抗发炎能力结果：结果(如图14和图15所示)显示发炎巨噬细胞经(2)水萃取多糖培养后，可降低约20％之il-6与tnf-α发炎因子的表达。而发炎巨噬细胞经(1)多糖发酵组合物培养后，能大幅降低发炎因子表达，具有极显著差异，可改善发炎反应。

本专利能有效减少使用剂量，达到良好功效，下表2汇整预估达到各功效需要的浓度和剂量

表2.预估达到各功效需要的浓度和剂量