本发明属于医学分子生物学领域，具体涉及一种携带cytochromec基因慢病毒表达质粒的构建及应用方法。
背景技术：
基因治疗是将目的基因通过基因转移技术导入靶细胞，利用其调节靶细胞发挥正常功能；相比于传统治疗方式，基因治疗极大的减轻了病人的痛苦，尤其在肿瘤基因治疗领域显示出了显著性的优势，是近年来肿瘤治疗领域的研究热点之一。从1989年美国批准了世界上首例基因治疗临床试验以来，全球共批准了1384项肿瘤基因治疗方案进入临床试验阶段。2004年1月，我国自主研发的用于头颈部肿瘤的基因治疗药物gendicine被批准上市，它是全球第一个上市的基因治疗产品。此外，我国还有13个针对恶性肿瘤的基因治疗产品进入了临床试验，显示出肿瘤基因治疗是当前最热点、最重要的研究领域之一，将对传统制药业和疾病治疗模式产生深远的影响和冲击。
目前应用于肿瘤基因治疗中的载体主要分为病毒载体和非病毒载体，非病毒载体的疗效和靶向性都较低。病毒载体中应用较多的主要有腺病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒载体等。腺病毒载体存在基因表达持续时间较短，重复给药易产生耐药性，且容纳外源基因片段较小等缺点；单纯疱疹病毒载体则具有高免疫原性等不足。与上述载体相比，慢病毒载体具有转染效率更高、外源基因可在宿主细胞内稳定存在和避免宿主细胞对外源基因的切割修饰等优点，也是基因治疗临床试验中广泛使用的载体，故本发明选择慢病毒载体作为介导外源基因转导靶细胞的“携带工具”。
cytochromec是由核基因编码，位于线粒体内外膜之间，是进化上最保守的蛋白质之一，在外界凋亡刺激因素的作用下，线粒体膜通透性改变，释放cytochromec等进入细胞浆，在datp存在时能够与凋亡相关因子-1(apaf-1)相结合，从而形成多聚体，并促使pro-caspase-9与其结合形成凋亡复合体，激活caspase-9，进而通过级联反应激活下游的caspase-3，导致细胞凋亡。可见，cytochromec从线粒体释放到细胞浆是触发细胞凋亡信号通路的关键步骤，而细胞凋亡的紊乱又是肿瘤发生和发展的关键过程，因此，通过导入cytochromec诱导细胞凋亡可能是肿瘤治疗的途径之一。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种携带cytochromec基因慢病毒表达质粒的构建及应用方法，利用pcr及质粒酶切、连接、转化、提取技术构建一种携带cytochromec基因的慢病毒表达质粒，该质粒的构建有利于进一步研究cytochromec基因的生物学功能。
为实现上述目的，本发明提供一种携带cytochromec基因慢病毒表达质粒的构建及应用方法，包括如下步骤：
(1)设计引物，进行cytochromec基因的pcr扩增；
(2)将plenti-mcherry-puro载体用noti和bamhi酶切，电泳，回收目的条带凝胶。
(3)将cytochromec基因与上述回收的载体plenti-mcherry-puro目的条带凝胶连接，构建重组慢病毒表达质粒plenti-cytochromec-emcherry-puro；
(4)将重组慢病毒表达质粒plenti-cytochromec-emcherry-puro转染乳腺癌mda-mb-453细胞，对转染成功的阳性细胞株进行细胞免疫荧光鉴定。
上述构建方法中，所述的步骤1)，以cytochromec-f和cytochromec-r为特异性引物，添加酶切位点noti和bamhi，以质粒pemcherry-n1-cytochromec为模板，进行pcr扩增；所述的特异性引物cytochromec-f的序列详见序列表seqid1，cytochromec-r的序列详见序列表seqid2。
上述构建方法中，pcr扩增体系为：
pcr反应程序：94℃变性2min，56℃复性1min，72℃延伸2min，共循环30次，最后72℃再延伸10min，pcr结束后，取2μl扩增产物在琼脂糖凝胶上电泳，分离、回收纯化。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
1.本发明以hiv-1为骨架的重组慢病毒为载体，所构建的质粒可高效地转染分裂和不分裂的细胞，同时，该质粒含红色荧光蛋白mcherry，便于在荧光显微镜下观察阳性细胞。
2.本发明构建一种带有嘌呤霉素抗性基因、氨苄西林抗性基因标签的过表达cytochromec蛋白的细胞株，可在原核表达时或真核表达时加入氨苄西林或嘌呤霉素进行筛选。
3.本发明构建了携带cytochromec基因的慢病毒表达质粒，该质粒为进一步深入研究cytochromec基因的生物学特性、功能及为研发抗肿瘤药物奠定了坚实基础。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步说明，具体如下：
实施例
(一)cytochromec基因扩增
1、cytochromec基因pcr扩增
根据ncbi中cytochromec基因序列(geneid:54205)，利用软件lsprimer(http://ccsipb.lnu.edu.cn/primer/)设计cytochromec基因的特异性引物cytochromec-f和cytochromec-r，添加酶切位点noti和bamhi，引入的酶切位点noti序列详见序列表seqid5(限制性内切酶noti酶切识别位点序列)，引入的酶切位点bamhi序列详见序列表seqid6(限制性内切酶bamhi酶切识别位点序列)，所述的特异性引物cytochromec-f的序列详见序列表seqid1(扩增人(homosapiens)细胞色素c(cytochromec)基因的特异性引物1序列)，cytochromec-r的序列详见序列表seqid2(扩增人(homosapiens)细胞色素c(cytochromec)基因的特异性引物2序列)。
以pemcherry-n1-cytochromec质粒为模板，进行pcr扩增，pcr反应体系为：
pcr反应程序：94℃变性2min，56℃复性1min，72℃延伸2min，共循环30次，最后72℃再延伸10min。pcr结束后，取2μl扩增产物在琼脂糖凝胶上电泳，分离、回收纯化。
2、dna琼脂糖凝胶电泳
配置1％的琼脂糖，微波炉加热使琼脂糖颗粒完全溶解；将洗净、干燥的制胶板水平放置在工作台上；混匀，灌胶，插入梳子，避免产生气泡；待凝胶凝固后，小心拔去梳子；将胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液；将pcr产物上样，经100v电泳40min。
3、pcr产物凝胶回收
按照康为世纪公司的琼脂糖凝胶dna回收试剂盒说明书进行dna回收。
(二)构建重组慢病毒表达质粒plenti-cytochromec-emcherry-puro
1、plenti-mcherry-puro载体酶切
将plenti-mcherry-puro载体用noti和bamhi酶切，酶切体系于37℃水浴过夜，电泳，将正确的目的条带进行凝胶回收。酶切体系如下：(ddh2o:11ul；noti:1.5ul；bamhi:1.5ul；dna:1ul(1ug/ul)；enzymebuffer:5ul；总体系：20ul，温度37℃，反应时间：30min)
2、cytochromec基因与plenti-mcherry-puro载体连接
将(一)中凝胶回收后的cytochromec基因与酶切后的载体plenti-mcherry-puro，在16℃反应24h，构建重组慢病毒表达质粒plenti-cytochromec-emcherry-puro。
3、质粒转化感受态大肠杆菌e.colidh5α
取e.colidh5α感受态细胞于冰上放置10min溶解；取5ul构建好的重组慢病毒表达质粒plenti-cytochromec-emcherry-puro加入50ul感受态细胞，混匀，冰浴30min；于42℃水浴中热休克大肠杆菌45s，移入冰中，静置2min；加入500ul已37℃预热无抗生素的soc培养液，于37℃恒温箱摇床培养1h(300rpm)。取120ul感受态细胞涂于含ampicillin(100μg/ml)的lb琼脂平板上，于37℃的培养箱中培养，12h后检查培养皿中是否出现菌落。挑选琼脂平板上的单菌落接种到8ml氨苄抗性的lb培养基中，37℃摇床培养12h(1500rpm)。
4、plenti-cytochromec-emcherry-puro重组菌株的质粒提取
对测序正确的重组菌株进行质粒小提与大提，得到plenti-cytochromec-emcherry-puro重组慢病毒表达质粒。用nanodrop测定od260及od280，计算质粒纯度及浓度。
(三)稳定转染细胞株的筛选
1、稳定转染细胞株筛选
胰酶消化mda-mb-453细胞，接种于24孔细胞培养板中，3×104个/孔。
每孔500μl。24h后转染质粒，质粒浓度0.1ug/ul。转染12h后换培养基：弃去旧培养基，每孔加入1ml新鲜的培养基。在转染细胞72h后，通过加入并维持2ug/ml的嘌呤霉素杀死未被有效转染的细胞；每隔2-3天换一次新鲜培养基；倒置荧光显微镜下观察，进行亚克隆筛选，挑选出正常生长细胞群传代，逐步放大培养；从而在嘌呤霉素的维持下筛选阳性细胞株。
3、阳性细胞株的检测
用荧光显微镜对阳性细胞进行免疫荧光鉴定。最后获得稳定转染cytochromec基因的mda-mb-453细胞株。
重组慢病毒表达质粒plenti-cytochromec-emcherry-puro的测序序列详见序列表seqid3(携带人(homosapiens)细胞色素c(cytochromec)基因的重组慢病毒表达质粒plenti-cytochromec-emcherry-puro序列)，测序序列的目的基因片段的序列详见序列表seqid4(人(homosapiens)细胞色素c(cytochromec)基因序列)。
序列表
<110>贵州大学
<120>一种携带cytochromec基因慢病毒表达质粒的构建及应用方法
<160>6
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说明书核苷酸和氨基酸序列表
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