一种用于检测糖尿病的试剂盒的制作方法

本发明属于检测领域，特别涉及一种糖尿病的检测试剂盒。

背景技术：

丙酮酸脱氢酶激酶(也称为丙酮酸脱氢酶复合物激酶，pdc激酶，或i3dhk)是通过使用atp使丙酮酸脱氢酶磷酸化而使其失活的激酶。

线粒体中的丙酮酸脱氢酶复合体(pyruvatedehydrogenasecomplex，pdc)能够催化丙酮酸氧化脱羧生成nadh和乙酰辅酶a，并把糖酵解与三羧酸循环以及atp的生成紧密地联系在一起。这一重要反应对于需要大量atp的组织(如大脑、肌肉)来说至关重要。通过pdc产生的乙酰辅酶a对于肝脏、脂肪这样能够产生脂肪的组织来说也是非常重要的，因为线粒体中的乙酰辅酶a可以通过形成柠檬酸(胞体乙酰辅酶a前体)进入到脂肪酸的合成过程。正是因为葡萄糖和脂肪酸之间存在这种底物竞争，所以高活性的pdc能够通过抑制肉毒碱棕榈酰基转移酶i来限制线粒体脂肪酸的摄取。由于在哺乳动物中不存在由乙酰辅酶a逆转生成葡萄糖的通路，因此在葡萄糖缺乏的时候抑制pdc的活性对于葡萄糖的转化至关重要。在肝糖元耗竭时，pdc反应的底物——丙酮酸作为葡萄糖合成的前体是肝脏和肾糖异生所必须的。这就使得血糖维持在一个稳定的水平，以保证不能够使用其他底物的组织获得atp。除了脂肪酸氧化的产物(乙酰辅酶a和nadh)对pdc的异构抑制外，丙酮酸脱氢酶激酶(pyruvatedehydrogenaseki—nase，pdk)通过磷酸化pdc也可以抑制其活性.

pdc是含有3个组分的复合体。这3个组分能够催化丙酮酸生成乙酰辅酶a：丙酮酸脱氢酶(pyruvatedehydrogenase，e1)、二氢硫辛酰胺乙酰基转移酶(dihydrolipoamideacetyhransferase，e2)以及二氢硫辛酰胺脱氢酶(dihydrolipoamidedehydrogen-e，e3)。el催化生理可逆的步骤：pdk以及丙酮酸脱氢酶磷酸酶(pyruvatedehydrogenasephosphatephosphatases，pdp)调节的正是这一活性。pdk和pdp催化可逆的磷酸化(失活)和去磷酸化(激活)循环反应。el的磷酸化主要发生在3个特异的位点：264位丝氨酸(位点1)、271位丝氨酸(位点2)、203位丝氨酸(位点3)。位点1的磷酸化速度最快，而位点3的磷酸化速度最慢。因此，位点l的磷酸化是根据代谢需要快速调节活性pdc比例的主要位点.

在人类和啮齿类动物中目前鉴定出有4种pdk同工酶：pdki、pdk2、pdk3以及pdk4。其中pdkl在心脏、胰岛和骨骼肌中被检测到。而pdk2分布最广，在心脏、肝脏和肾脏中高水平表达。pdk3组织表达相对较局限(睾丸、肾脏和脑)。pdk4在心脏、氧化型肌肉、肝脏和肾脏等具有高度的脂肪酸氧化能力和高水平表达脂质氧化转录因子ppard或者ppar^y的组织中高丰度表达.

e1磷酸化位点突变分析表明，4种pdk都可以磷酸化位点1和位点2；而位点3只能被pdkl磷酸化…。对于位点2，pdk4比pdki、pdk2和pdk3展现出更高的活性。pdk2可能通过磷酸化位点1来短期抑制pdc，而pdkl与pdk4对于多点磷酸化显得更为重要。如果pdk对于pdc的这种磷酸化调节异常，通常会引起一些人类疾病.

cn1443575a中公开了肉毒碱类与降糖类药一样都是生理、生化活性比较强的物质，作用机理虽不同，但两种药在疾病的治疗中，具有协同作用，治疗效果较好。肉毒碱类通过增加丙酮酸脱氢酶的活性，降低乳酸水平，促进组织对葡萄糖的摄取和经非氧化途径的利用，并增强胰岛素的作用，降糖类药通过激活丙酮酸脱氢酶磷酸酶来激活丙酮酸脱氢酶复合物，促进丙酮酸向乙酰辅酶a的转化，二者协同作用，治疗糖尿病。降糖类药通过激活丙酮酸脱氢酶磷酸酶来激活丙酮酸脱氢酶复合物，促进丙酮酸向乙酰辅酶a的转化，二者协同作用，治疗糖尿病。

但是针对丙酮酸脱氢酶磷酸酶的研究较少。其功能定位也不是非常清楚。

技术实现要素：

本发明在前期通过大数据比对分析创造性的提出了丙酮酸脱氢酶磷酸酶中特定的snp突变与ii型糖尿病的关联性。

具体的，通过检测pdp1中是否存在seqidno：1中的g/c突变，来检测受试者ii型糖尿病患病风险以及预后风险。

所述序列如下，具体的突变为pdp1第166(g/c)突变

另外，本发明提供如下技术方案，一种用于检测与ii糖尿病性状相关的snp位点的探针及分型引物，其特征在于，所述的探针的核苷酸序列为seqidno:2,引物的序列分别为seqidno:3和seqidno:4；其中所述的snp位点为核苷酸序列为seqidno:1的pdp1基因的166位，其碱基为g或c。

另外，本发明提供如下技术方案，一种分子标记，其序列如seqidno:1所示，其中第166位，其碱基为g或c。

此外，本发明提供如下技术方案，将探针和引物在制备检测ii型糖尿病的试剂盒中的用途。

其次，本发明将所述的分子标记作为检测靶标在制备用于检测ii型糖尿病的试剂盒中的用途。

最后，本发明提供的试剂盒中还含有dna提取试剂。

相对于现有技术，本发明的优点如下，

本发明提供糖尿病的检测方法，以pdp1中的特定snp分子标记为检测靶标，通过设计一对特异性的引物和探针，实现了快速的突变位点的鉴定或鉴别。本发明还提供一种与ii型糖尿病性状相关的snp位点，所述的位点为核苷酸序列为seqidno:1的pdp1第166位，其碱基为g或c；本发明还提供用于检测上述snp位点的探针及分型引物。本发明运用高分辨率熔解曲线技术在人糖尿病潜在群体中检测位点多态性，并分析位点基因型频率与糖尿病性状间的相关性。该位点可以作为快速检测的指标，用于大规模的潜在患病筛查。

附图说明

图1是snppcr的溶解曲线图；其中(a)表示检测样本中snp为gg表型；(b)表示检测样本中snp为cc表型；(c)表示检测样本中snp为cg表型。

具体实施方式

实施例1样本选择以及dna的提取

1.1对象

收集2016年1月至2017年12月在宜春市人民医院进行ii型糖尿病治疗的患者120人为实验组；选择同期体检的正常人群120人为对照组.两组受检者均为中国汉族，男女各半，且年龄间差异无统计学意义(p＞0.05).所有受检者均无无其它遗传病家族史及肿瘤史.研究对象间不存在亲缘关系，且均知情同意.

1.2标本来源

两组受检者均留取外周血2ml，柠檬酸钠抗凝置于-70℃低温冰箱中保存.

从全血中提取基因组dna，基因组dna的提取方法与步骤如下：

吸取100μl解冻的dna保存液保存的血样品100μl到含300μl试剂x的、1.5ml离心管中；用移液枪反复垂悬，直到使原血样变为澄清的液体状；4000rpm离心5min，弃掉上清液；加入1ml的试剂y,轻轻悬浮上一步离心后的沉淀物；加入10μl的rnasea,混匀后，37℃温浴30min；加入250的5mol/l高氯酸钠，手动振荡混合1omin；55℃水浴20min,期间每隔5min手工晃动一次；加入300μl预冷的三氯甲烷,混合5min；12000r/min离心5min，吸取上清到另一离心管中；加入等体积的异丙醇，缓慢摇动，即可见絮状dna；用预冷的75％(v：v)乙醇洗涤2次，晾干，用100-200μl的te溶解，4℃存放一周，转至-20℃长期保存。

其中试剂x配制：将lmol/ltris-cl(ph8.0)，lmol/lmgcl2,10％(体积百分比)的tritonx-100按比例混合,再加入一定量的固体蔗糖(sucrose),使混合液中各成分的终浓度为:10mmol/ltris-cl；0.32mol/lsucrose5mmol/lmgcl2；1％tritonx-1oo然后用naoh调整ph值至8.0，高压灭菌。

试剂y配制：将lmol/ltriscl(ph8.0)，0.5mol/lna2edta按比例混合，再加入一定量的nacl固体和水，使混合液中各成分的终浓度为：400mmol/ltris-cl；60mmol/lna2edta；150mmol/lnacl。然后高压灭菌。再加入一定量的10％sds，使sds在试剂y混合液中的质量百分比浓度为1％。

5mol/l高氯酸钠(naclo4):70.24gnaclo4·h2o溶解于1ooml水中。

10mg/mlrnasea：1oomgrnasea加水到10ml,分装后保存-20℃冰箱中。

te(ph8.0)：2ml1.0mol/ltris-cl(ph8.0)和400μl0.5mol/lna2edta(ph8.0)混合，加水定容至200ml。高压灭菌。

实施例2pcr扩增检测

1.1引物的设计与合成

引物为通过无数设计以及优化获得的能够针对该snp位点检测的特异性引物和探针：

上游引物序列：5'-atacatttattttagcctaa-3'，

下游引物序列：5'-gatctccttattttaaacta-3'，

探针：5'-gtaattgaaagattttctatttt-3'；探针的3'末端阻断，避免反应过程中延伸，引物由上海生工公司合成。

1.2以定量pcr为基础的hrm分型

反应体系中，上下游引物浓度比为1:10，即10μl反应体系中，上游引物终浓度为0.3pmol，

下游引物终浓度为3pmol，探针浓度为3pmol.扩增长度300bp，探针特异与g互补.pcr反应总体积10μl：引物与探针各0.3μl，toyobo公司的realtimepcrmastermix(qpk-101)5μl，lcgreenplus1μl，模版3.1μl.循环参数为：95℃预变性2min→95℃变性15s→60℃复性20s→72℃延伸10s，55个循环；之后进入熔解曲线阶段，从55℃一直做到95℃，根据荧光定量pcr仪rochelightcycleryr480软件分析熔解曲线，得出基因型。

1.3snp位点分析

pdp1第166位，其碱基为g或c，位点纯合子用cc、gg表示，杂合子用cg表示。

1.4统计学处理

用直接计数法计算各组基因型频率分布.遗传平衡吻合度χ2检验群体基因型频率分布是否符

合hardy-weinberg平衡定律.两组之间基因型频率、等位基因频率比较用χ2检验，用比数比(oddsratio，or)及95％可信区间(confidenceinterval，ci)表示相对危险度.数据均用统计软件spss13.0处理.

1.5根据hrm检测snp分型

根据熔解曲线荧光和峰值的差异来有效区分不同标本pdp1第166位点snp，结果由荧光定量pcr仪rochelightcycleryr480软件分析输出，该位点的基因型明显的分为cc、cg、gg3种类型。

通过检测分析，在120例糖尿病患者中cg突变为115例，cc突变为3例，无突变为2例。在正常120例人群检测结果发现，gg为118例，cg为2例，cc没有。从以上结果可以看出，由g向c的突变是在糖尿病标准上较为明显的。

1.6hardy-weinberg平衡检验

经吻合度检验，pdp1第166位g/c在糖尿病组及对照组中的基因频率分布均符合hardy-weinberg遗传平衡定律，说明纳入的样本具有人群代表性.

糖尿病组和对照组中各基因型频率比较差异无统计学意义(p＞0.05)。等位基因型频率比较差异也无统计学意义(p＞0.05)。其or值为1.307(95％ci:0.914～1.718)。

表1实验组和对照组位点多态性比较(n(％))

实施例3试剂盒制备及实际检测

将本发明的探针和引物按照本领域常规的引物和探针贮存浓度制备成为试剂盒。取糖尿病血样5个，正常人群血样6个，按照之前相同的方法，进行dna提取和pcr检测，11例样本的曲线如图1的溶解曲线图所示；其中检测样本中snp为gg表型共6个，snp为cc表型的共1个，样本中snp为cg表型共有4例，也就是说cc表型加上cg表型共5例，其pcr检测结果与样本是糖尿病结果也对应，说明本检测方法具有较好的准确性。

需要说明的是上述实施例仅仅是本发明的较佳实施例，并没有用来限定本发明的保护范围，在上述基础上做出的等同替换或者替代均属于本发明的保护范围。

序列表

<110>宜春莲泽生物科技发展有限公司

<120>一种用于检测糖尿病的试剂盒

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>300

<212>dna

<213>人(homosapiens)

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