鉴别猕猴桃品种的DNA条带及基于其的快速鉴定方法与流程

本发明属于分子鉴定技术领域，涉及鉴别猕猴桃品种的dna条带及基于其的快速鉴定方法。

背景技术：

猕猴桃被称为水果之王和维生素c之冠，具有较高的经济效益，国内的主要种植区有四川、陕西和贵州等地。对于猕猴桃品种的检测、防控，是提高其经济价值，促进地区猕猴桃行业经济发展的必要手段。目前市场上的猕猴桃价格与品种的品质和口感直接相关。由于普通消费者对猕猴桃的分类知之甚少，市场上常出现不法商贩“以次充好”欺诈消费者的现象，对猕猴桃食品质量安全和消费者权益造成损害，出现相关民事纠纷。因此，亟需能够快速准确鉴定猕猴桃品种的方法，为科学解决此类司法纠纷和法律审判提供有效证据。

dna条形码是一种分子鉴定新技术，该技术能够利用标准的、具有足够变异、易扩增且相对较短的dna片段实现物种鉴定。该技术可用于发现新种和保护生物多样性，可有效监控珍稀濒危物种进、出口贸易，可实现有害生物及入侵种的快速查验，对我国生物资源保护具有重大意义。dna条形码的概念2003年由加拿大分类学家paμlhebert首次提出后就在世界范围内受到了广泛关注。2005年前后，dna条形码被引入植物研究中。2009年，国际生命条形码联盟植物工作组(cbolplantworkinggroup)初步推荐使用叶绿体基因rbcl和matk片段。我国学者陈士林等对dna条形码在药用植物中的研究进行了详细的论述，并建议建立以its2为核心以trnh-psba为辅的植物类药材dna条形码鉴定体系。laurajaakola等利用dna条形码技术结合高分辨率溶解曲线成功的鉴别了蓝莓品种northcountry和northblue，为以dna条形码鉴别猕猴桃品种的不同资源的可行性提供了参考。线粒体coi基因的序列作为dna条形码在大部分动物中十分有效。在植物分类学研究中，dna条形码的进展相对缓慢，目前尚处于对所提议的叶绿体dna片段rpob、rpoc1、matk和rbcl等进行有效性比较和评价的阶段。dna条形码是传统物种鉴定的补充。

中国专利cn107326081a公布了东北地区软枣猕猴桃，狗枣猕猴桃和葛枣猕猴桃的鉴定方法。但对其他品种的鉴定尚未发现快速准确的分子鉴定手段。

技术实现要素：

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种鉴别猕猴桃品种的dna条带及基于其的快速鉴定方法。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明公开了用于鉴别猕猴桃品种的dna条带，所述dna条带的核苷酸序列如seq.id.no.1或seq.id.no.2所示。

优选地，核苷酸序列如seq.id.no.1所示的dna条带能够区分红阳、黄金果、川黄金这三种品种与海沃德、徐香、金艳、华优、秦美、翠玉、翠香、亚特和凤仙楼其他九种品种。

进一步优选地，若扩增产物115bp，132bp和310bp为c且206bp和215bp为g则为黄金果、川黄金和红阳中的一种；若115bp，132bp和310bp为t且206bp和215bp为a，则为其他九个市售品种。

优选地，核苷酸序列如seq.id.no.2所示的dna条带能够区分金艳与红阳、黄金果、川黄金、海沃德、徐香、华优、秦美、翠玉、翠香、亚特和凤仙楼；

或者，能够区分翠玉和与红阳、黄金果、川黄金、海沃德、徐香、华优、秦美、金艳、翠香、亚特和凤仙楼。

进一步优选地，若扩增产物534bp为g则为金艳，若534bp为a则为其他十一个市售品种；若扩增产物777bp为c则为翠玉，若777bp为a则为其他十一个市售品种。

本发明还公开了基于上述鉴别猕猴桃品种的dna条带的引物对，核苷酸序列如seq.id.no.1所示的dna条带在扩增时以seq01和seq02作为引物对，seq01具有如seq.id.no.3所示的核苷酸序列，seq02具有如seq.id.no.4所示的核苷酸序列；

核苷酸序列如seq.id.no.2所示的dna条带在扩增时以seq03和seq04作为引物对，seq03具有如seq.id.no.5所示的核苷酸序列，seq04具有如seq.id.no.6所示的核苷酸序列。

本发明公开了一种快速鉴别市售猕猴桃品种的方法，包括以下步骤：

1)以待测猕猴桃dna为模板，对待测猕猴桃的不同dna分子标记进行聚合酶链式反应扩增，对扩增产物进行电泳检测；

此处，dna分子标记指的是dna条形码its2和dna条形码matk；

2)若电泳结果中存在与dna分子标记对应的dna条带，则对扩增产物进行测序，对测序结果比对分析后，通过碱基序列的差异进行鉴定。

优选地，若测序结果为seq.id.no.1所示的dna碱基序列中115bp，132bp和310bp为c且206bp和215bp为g则为黄金果、川黄金和红阳中的一种；若115bp，132bp和310bp为t且206bp和215bp为a，则为海沃德、徐香、金艳、华优、秦美、翠玉、翠香、亚特或凤仙楼。

若测序结果为seq.id.no.2所示的dna碱基序列中534bp为g则为金艳，若534bp为a则为红阳、黄金果、川黄金、海沃德、徐香、华优、秦美、翠玉、翠香、亚特或凤仙楼；若扩增产物777bp为c则为翠玉，若777bp为a则为其他红阳、黄金果、川黄金、海沃德、徐香、华优、秦美、金艳、翠香、亚特或凤仙楼。

本发明公开的另一种快速鉴别市售猕猴桃品种的方法，包括以下步骤：

1)对待测猕猴桃的大小、首尾形态、表皮毛以及横纵切面形态进行鉴定；若根据形态能够区分品种，则直接获得鉴定结果；若根据形态无法判断，则进行步骤2)；

2)以待测猕猴桃dna为模板，对待测猕猴桃的不同dna分子标记进行聚合酶链式反应扩增，对扩增产物进行电泳检测；

3)若电泳结果中存在与dna分子标记对应的dna条带，则对扩增产物进行测序，对测序结果比对分析后，通过碱基序列的差异进行鉴定；

若测序结果为seq.id.no.1所示的dna碱基序列中115bp，132bp和310bp为c且206bp和215bp为g则为黄金果、川黄金和红阳中的一种；若115bp，132bp和310bp为t且206bp和215bp为a，则为海沃德、徐香、金艳、华优、秦美、翠玉、翠香、亚特或凤仙楼。

若测序结果为seq.id.no.2所示的dna碱基序列中534bp为g则为金艳，若534bp为a则为红阳、黄金果、川黄金、海沃德、徐香、华优、秦美、翠玉、翠香、亚特或凤仙楼；若扩增产物777bp为c则为翠玉，若777bp为a则为其他红阳、黄金果、川黄金、海沃德、徐香、华优、秦美、金艳、翠香、亚特或凤仙楼。

优选地，步骤1)中，区分红阳、黄金果、川黄金、海沃德、徐香、金艳、华优、秦美、翠玉、翠香、亚特和凤仙楼的形态如下：

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明公开的猕猴桃品种的鉴定方法，可以采用分子鉴定法，或者形态与分子鉴定相结合的鉴定方法。形态鉴定是通过对待测猕猴桃的大小，首尾形态，表皮毛以及横纵切面形态进行鉴定；分子鉴定是以待检测的猕猴桃dna为模板，对猕猴桃的dna条形码进行聚合酶链式反应扩增，对扩增获得的产物进行电泳检测，电泳结果中存在与所述dna条形码对应的dna条带，进一步对扩增产物进行测序，对扩增产物序列的比对分析，通过dna条形码的碱基序列差异进行鉴定。本发明由于采用的是dna的聚合酶链式反应扩增，且dna条形码碱基序列长度较短，仅需1到2小时即可获得扩增条带，扩增条带测序过程仅需1小时左右，因此可以用于市售猕猴桃品种的快速鉴定；又因为在dna水平的检测结果对于该物种是唯一且不变的，因此可以实现准确鉴定。从而为猕猴桃的食品质量安全监督和此类司法案件的科学审判提供实验和法律依据。

附图说明

图1a为被检测的十二种市售猕猴桃dna条形码its2序列比对结果；

图1b为被检测的十二种市售猕猴桃dna条形码matk序列比对结果；

图2为被检测的十二种市售猕猴桃的系统发育分析结果；其中，a为matk序列片段；b为its2序列片段；

图3为十二种市售被检测猕猴桃样本的外部及内部形态照片，比例尺：6mm。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

需要说明的是，此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

下面结合附图对本发明做进一步详细描述：

首先，形态鉴定是通过对待测猕猴桃的大小，首尾形态，表皮毛以及横纵切面形态进行鉴定；然后，分子鉴定是基于dna条形码技术，以本发明提供的寡聚脱氧核苷酸序列seq01，seq02，seq03和seq04作为两个dna条形码引物对，以待检测的猕猴桃dna为模板，对猕猴桃中特定的dna条形码片段进行聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,pcr)扩增，对扩增获得的产物进行电泳检测，筛选出了大小约为491bp(seq.id.no.1)和889bp(seq.id.no.2)的特定dna条带(品种间长度无差异)。

进一步对扩增产物进行dna序列测序，通过对扩增产物序列的比对，分析dna条形码的碱基序列有无差异进行鉴定。

本发明提供一种用于商品猕猴桃的快速鉴定方法的具体步骤如下：

(1)对待检测的猕猴桃样本先进行外部形态的检查，初步判断可能的品种，具体根据图3中所给的外部及内部形状、色泽、表皮毛和首尾形状进行判断；以常见的十二种商品猕猴桃为例，其外部形态结果如表1所示：

表1十二种商品猕猴桃的形态描述

(2)采用常规ctab法提取待检测猕猴桃果肉部位的基因组dna(即样品dna)，提取步骤如下：

①0.5g左右果肉组织经液氮速冻后快速研磨成粉末状，转入2ml离心管中；

②立即加入65℃预热的ctab提取缓冲液700μl以及β-巯基乙醇20μl，剧烈震荡至充分混匀，置65℃水浴中保温20min，期间不断取出上下颠倒混匀，后冷却至室温；

③加等体积的氯仿/异戊醇＝24:1，轻轻地颠倒混匀，于室温下12000rpm离心10min，转移上清液至新的1.5ml离心管中；

④向上述上清液中加入等体积经-20℃预冷的异丙醇，轻轻地颠倒混匀至有白色絮状沉淀出现后，静置于-20℃15min使沉淀生成,于4℃12000rpm离心10min，倒掉上清液，保留沉淀物(dna)；

⑤加入700μl预冷的70％乙醇洗涤沉淀物，上下颠倒混匀之后(13000rpm离心1min)，倒掉上清液，保留沉淀，并重复本步骤一次；

⑥加入500μl预冷的无水乙醇洗涤沉淀(13000rpm离心1min)，倒掉上清液，沉淀静置风干后溶于50μlddh2o中4℃过夜；

⑦取溶解后的样品dna1μl用核酸浓度测定仪测定dna浓度、纯度。经检测样品dna的od260/280介于1.8-2.0之间、经0.8％的琼脂糖核酸电泳检测dna样品无杂质、无明显降解的条件下，将各待检测猕猴桃dna加水稀释至终浓度为100ng/μl待用；

(3)按照本发明提供的寡聚脱氧核苷酸序列seq01、seq02、seq03和seq04合成的单链寡聚dna，分别加水稀释成10μmol/l水溶液，序列分别为：

seq01:5’-atgcgatacttggtgtg-3’

seq02:5’-gacgcttctccagacta-3’

seq03:5’-cgtacagtacttttgtgtttac-3’

seq04:5’-acccagtccatctggaaatc-3’

(4)在0.2mlpcr管中加入：4μl2.5mmol/l的dntp,1.5μl25mmol/l的mgcl2,5μl10*rtaq缓冲液，步骤(3)配制的seq01和seq02引物溶液各1.0μl,步骤(2)配制的待测样品dna溶液1.5μl，加入taq聚合酶1个单位，加水至总体积50μl，轻微震荡混匀，瞬时离心；重复以上步骤，在0.2mlpcr管中加入：4μl2.5mmol/l的dntp,1.5μl25mmol/l的mgcl2，5μl10*rtaq缓冲液，步骤(3)配制的seq03和seq04引物溶液各1.0μl，步骤(1)配制的待测样品dna溶液1.5μl,加入taq聚合酶1个单位，加水至总体积50μl，轻微震荡混匀，瞬时离心；

(5)把上述pcr管置于pcr仪上，分别执行下述程序：

①94℃5min；[94℃30s,55℃30s,72℃35s]*35cycles；72℃10min；4℃10min；

②94℃5min；[94℃30s,56℃30s,72℃46s]*35cycles；72℃10min；4℃10min；

(6)把pcr管中的产物6μl进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳，检查不同待测样品dnapcr反应中产生的dna条带；

(7)把pcr管中剩下产物送华大基因进行序列测定，检查不同待测样品dna条形码的碱基序列。

具体地，选取陕和四川地区共计12种常见市售猕猴桃(黄金果、翠香、秦美、徐香、华优、凤仙楼、亚特、海沃德、翠玉、川黄金、红阳和金艳)进行实验，2每种至少重复6-8个单独样本，以上材料均采集于当地猕猴桃市场。具体实验材料如表2所示：

表2实验材料编号及名称

将测序结果进行序列比对分析和系统进化分析，获得待测样本的种属信息。根据测序结果可以确定。

1.所述dna条带的大小分别为共长491bp，如图1a中序列比对图所示：

1)its2-fatgcgatacttggtgtg

2)its2-rgacgcttctccagacta

有5处不一样：

黄金果，川黄金和红阳这三个品种的115bp,132bp和310bp的3处为c其他品种为t；黄金果，川黄金和红阳这三个品种的206bp和215bp的2处为g其他品种为a。

2.所述dna条带的大小分别为共长889bp，如图1b中序列比对图所示：

1)matk-fcgtacagtacttttgtgtttac

2)matk-racccagtccatctggaaatc

有2处不一样：

在金艳的534bp为g其他种类为a；在翠玉的777bp为c其他种类为a。

与此同时，对被检测的十二种市售猕猴桃的两个dna条形码测序结果进行系统发育分析也说明了上述结果。具体地，系统发育树构建步骤如下：

1.将所扩增的对应dna条形码的测序结果格式改为fasta格式，并放在一个txt文件中；

2.在mega5.0软件中，点击align，按照默认选项进行序列比对；

3.将比对好序列文件进行保存，此处保存为meg格式；

4.点击phylogeny构建进化树，用neighbor-joining法构建进化树，其中用bootstrapmethod重复1000次，所获得的系统进化分析结果如图2所示，其中，a为its2序列片段；b为matk序列片段；从图2可以看出，通过系统分析所获得的进化树结果与本发明的技术方案结果一致，鉴定结果吻合，进一步说明了本发明的准确性和可靠性。

采用猕猴桃果实在任何季节提取dna进行检测，取样部位不影响检测结果的一致性，取样部位和取样时间不影响检测结果。本发明可以用于市售猕猴桃品种的快速准确鉴定，从而为猕猴桃的食品质量安全监督和此类司法案件的科学审判提供实验和法律依据。

以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。

序列表

<120>鉴别猕猴桃品种的dna条带及基于其的快速鉴定方法

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>491

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

atgcgatacttggtgtgaattgcagaatcccgtgaaccatcgagtttttgaacgcaagtt60

gcgcctgaagccattaggccgagggcacgtctgcctgggcgtcacgcattgtgtcgccca120

cccaactcaagccttaccaaggattgggtgtgggtgggcggatattggccccccgtgcac180

attagtgaacggtcggcctaaaaatgaagtccttggcaatggacgtcacaacaagtggtg240

gttgacaaaccgttgcgtcctgttgtgcttgcccccattgctaatggtttacttttgacc300

ctaatgtgccgttatcacggcttcgatcgcgaccccaggtcaggcgggattacccgctga360

gtttaagcatatcaataagcggaggaaaagaaacttacaaggattcccttagtaacggcg420

agcgaaccgggaatagcccagcttgaaaatcgggcgatctcgttgtccgaattgtagtct480

ggagaagcgtc491

<210>2

<211>889

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

cgtacagtacttttgtgtttacgagccaaagttctagcacaagaaagtcgaagtatatac60

tttattcgatacaaactcgttttttttaaggatccgctatgataatgagaaagatttcta120

tatatacgcccgaatcggtcaataatatcagaatcggataaatcggcccagactggctta180

ctaacgggatgtcctaagacgttacaaaatttcgctttatacaaggatccaatcagagga240

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ccatagaaatagattcgttcaagaaaggttccagaagatattgatcgtaaatgagaagat660

tggttgcggagaaaaacgaagatagattcggattcacatacatgaaaattatataggaac720

aagaaaaatctttgatttctttttgaaaaagaaaaactagatttctttggagtaatacga780

gtattccaattacgatactcgtgaagaaaaaatcgtaataaatgcaaagaagaagcatct840

tttacccaatagcgaagagtttgaaccaagatttccagatggactgggt889

<210>3

<211>17

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

atgcgatacttggtgtg17

<210>4

<211>17

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

gacgcttctccagacta17

<210>5

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

cgtacagtacttttgtgtttac22

<210>6

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

acccagtccatctggaaatc20