本发明属于动物细胞培养技术领域，具体涉及一种cho细胞培养方法。
背景技术：
细胞培养技术是通过模拟细胞体内生长环境实现细胞体外培养。培养基为细胞体外培养提供营养并促进细胞生长和增殖。细胞培养基的发展经历了鸡胚汁、天然培养基、合成培养基，以及目前常用的低血清培养基、无血清培养基、无蛋白培养基和化学成分确定的培养基。
培养基是指可以维持动物细胞，微生物细胞，植物细胞等在体外生长的一种液体或者固体介质。目前用于动物细胞的培养基按照动物培养基的发展历程可以分为：含血清的培养基，低血清培养基，无血清培养基(含有一些植物水解物等成分不确定的培养基)，化学成分确定的培养基(化学成分确定，但可能含有一些重组蛋白)以及不含有重组蛋白的化学成分确定的培养基。通常，动物细胞的生长均有赖于血清的存在。在普通培养基中，如不加血清，绝大部分细胞将不能增殖。但使用血清的主要弊端是存在潜在的污染源，价格昂贵，批间差异大，对生产和科研带来诸多不便。此外，对于利用细胞生产基因工程蛋白产品来说，血清的存在将影响重组表达产物的纯化，降低产品纯度。因此，研发人员经过研究开发出各种各样不含血清的培养基，以便于经过基因工程改造的细胞可以在培养基中生长同时高效地分泌重组蛋白药物，从而实现高水平地表达抗体及其他重组蛋白。
多种细胞株可用来生产单克隆抗体或基因重组蛋白。通常宿主细胞的选择依赖于产物的特性。例如，高糖化的重组蛋白通常采用真核宿主细胞生产。常用的真核细胞株有中国仓鼠卵巢细胞(cho)，幼鼠肾细胞(bhk)，转化的人胚胎肾细胞(hek-293)和鼠杂交瘤细胞(如nso和sp2/o)。而细菌细胞如大肠杆菌和芽孢杆菌多用来生产非糖基化的多肽。
目前，最为广泛使用的细胞系为cho细胞，cho细胞来源于中国仓鼠卵巢上皮细胞和纤维细胞。cho细胞系始于中国仓鼠卵巢cho-k1以及杂交瘤细胞等。美国专利us5316938公开了一种适用于cho细胞悬浮培养的不含从动物源中分离的蛋白质、脂类和碳水化合物的培养基；us5122469公开了一种适用于cho细胞悬浮培养的无血清、不含蛋白的培养基；中国专利cn1696283a公开了一种适合中国仓鼠卵巢细胞培养的无血清培养基，它是在dmem/f12为基础培养基，并添加了转铁蛋白、胰岛素、乙醇胺等其他物质。cn103773732a公开了一种化学成分确定的无血清培养基，以dmem/f12配方为基础，调整各组分成分浓度，并在此基础上增减某些成分，开发适合于多种哺乳动物细胞的大规模生产。cn105985926a公开了一种用于cho细胞培养的无血清培养基，cn106635958公开了一种无血清培养基，包括dmem基础培养基，酵母抽提物，碳酸氢钠，氨基酸，维生素，无机盐，白蛋白，转铁蛋白和亚油酸等。cn107429227a公开了一种基础培养基和补料培养基，该培养基包含氨基酸及胆酸亚铁。cn107760651a公开了一种细胞培养基，在化学成分限定的培养基基础上，进行了氨基酸的优化。
哺乳动物细胞对营养的需求差别很大，不同类型的细胞通常需要不同的营养元素和生长因子，即使基于统一宿主细胞所构建的不同克隆，其代谢特点与营养需求也不尽相同。因此在培养基及培养工艺的开发过程应根据其代谢特点进行优化、定制。其工艺开发主要是优化各工艺参数，包括物理参数例如温度、气体流量和搅拌速度；化学参数，例如溶氧、ph、渗透压等，代谢水平，氨基酸和废物等。这些参数的改变直接影响表达量及产品的质量。现在发酵工艺常用的流加培养工艺操作简单，可线性放大，但培养过程中易出现营养物质消耗、代谢废物累积，以及产品质量不稳定等问题。
抗体生产过程中，形成的多聚体会影响最终产品的质量、安全性和功效，蛋白多聚体是免疫反应的强力诱导者，仅10％的多聚体含量就会引发人的免疫反应，甚至导致死亡。而作为生产过程上游的发酵培养通常决定聚体形成的速度。最高可达30％，其所处环境如温度、蛋白浓度、ph和离子强度均会影响聚体数量。研究发现当发酵液中聚体含量超过10％时，下游纯化工艺无论是离子层析还是疏水层析都难以达到理想效果。直接影响了目的蛋白的回收率。
在融合蛋白的cho细胞培养使用市售的培养基例如ge公司的actipro，gibco公司的opticho，dynamis等培养基，在发酵罐培养时细胞生长异常、结团现象严重，蛋白易形成聚体，严重影响融合蛋白的表达及质量。我们采用现有技术公开的cn103773732a、cn105985926a、cn106635958a、cn107429227a等培养基时，依然不能解决细胞结团现象。因此需要提供一种解决细胞结团、蛋白聚集问题，且融合蛋白表达量和质量又好的cho细胞培养工艺。
技术实现要素：
鉴于现有技术存在的诸多缺陷，本发明提供一种简单可行的提高融合蛋白表达量和蛋白质量的cho细胞培养方法，进而逐级进行放大生产，解决目前现有技术中由于细胞生长异常、细胞结团、蛋白易产生聚体等因素影响目的蛋白表达的问题。
本发明的技术方案如下：
一种cho细胞培养方法，包括如下步骤：
a、将cho细胞在基础培养基中逐级放大培养，
b、转至发酵罐中进行高密度培养，在细胞处于对数生长期时流加补料培养基至发酵罐中直至培养结束。
优选地，步骤b所述补料培养基中含有锰离子，铜离子，半胱氨酸及氯化胆碱。
优选地，所述的补料培养基中，铜离子的浓度为150～200umol/l，锰离子的浓度为20～50umol/l，半胱氨酸的浓度为30～35mmol/l，氯化胆碱的浓度为5～10mmol/l。
更加优选地，所述的补料培养基中，铜离子浓度为180umol/l，锰离子浓度为40umol/l，半胱氨酸浓度为30mmol/l，氯化胆碱浓度为5mmol/l。
优选地，所述铜离子可由铜的无机盐提供，更加优选为五水硫酸铜；锰离子可由二价锰的无机盐，更加优选的为硫酸锰。
优选地，所述流加培养补料过程是当细胞密度达到5～7×106cells/ml时即为对数生长期，开始流加补料，流加方式为连续流加，每天流加量为培养物体积的2～5％；所述培养物体积是指发酵罐中发酵液的体积。
更加优选地，所述流加补料过程，第一天流加量为培养物体积的4％，以后每天流加培养物体积的5％。
优选地，流加补料培养过程中，当细胞密度达到13～18×106cells/ml时，调整培养温度为34±0.5℃，ph为6.90±0.05；ph通过co2气体和8％碳酸氢钠控制。
本发明还公开了所述cho细胞培养方法在生产融合蛋白中的应用。
优选地，所述融合蛋白为fc融合蛋白，更加优选为fgf21-fc融合蛋白或tnfr-fc融合蛋白。
优选地，本发明所用的补料培养基命名为n38feed，n38feed为cn104513805a中的n38基础培养基的5～10倍浓缩液，并在浓缩液基础上添加锰离子，控制铜离子、半胱氨酸及氯化胆碱的浓度。
优选地，n38基础培养基组分及含量如下所述。
本发明所述补料培养基用于细胞生产融合蛋白阶段，优选地，细胞培养过程中，细胞密度达到5～7×106cells/ml时，细胞培养进入细胞生产蛋白质阶段。
优选地，流加补料培养方法中，搅拌转速为180～250rpm，溶氧含量大于35％，更加优选地，溶氧含量为35～60％。
优选地，当细胞活力低于90％时，停止流加培养，培养结束。
本发明的另一方面，提供一种cho细胞生产融合蛋白的方法。
具体地，所述方法包括如下步骤：(1)提供包含编码目的融合蛋白的目的基因的cho细胞，(2)在基础培养基中逐级放大培养所述细胞，(3)转至发酵罐中进行高密度培养，生长至一定阶段将本发明所述的补料培养基定时流加进所述发酵罐中至培养结束，(4)通过离心及深层过滤去除培养基中的细胞，获得含目标蛋白的发酵液，通过下游纯化工艺即可获得融合蛋白的原液。步骤(4)所述纯化工艺可以是亲和层析-疏水层析-阴离子层析三步层析及超滤换液。
其中，步骤(3)发酵罐高密度培养步骤包括以下三个阶段：
(a)细胞生长阶段：用基础培养基悬浮细胞培养，起始密度约为3～6×105cells/ml，起始培养温度为37±0.5℃，ph为7.2±0.1。
(b)细胞生产融合蛋白阶段：当细胞密度生长到5～7×106cells/ml时，细胞培养进入细胞生产蛋白质阶段，流加补料培养基促进细胞表达融合蛋白，每天流加量为培养物体积的4～5％；当细胞密度达到13～18×106cells/ml降低培养温度至34±0.5℃，ph为6.90±0.05。
(c)当细胞活力降低至90％以下时，停止流加补料培养基，结束培养。
优选地，本发明不限制基础培养基范围，可以是通过商业途径购买的基础培养基，或者是按照现有专利法方法现有的基础培养基。本发明所用的补料培养基命名为n38feed，n38feed为n38基础培养基的5～10倍浓缩液，并在浓缩液基础上添加锰离子、控制铜离子、锰离子、半胱氨酸及氯化胆碱的浓度。
优选地，所述的补料培养基中，铜离子的浓度为150～200umol/l，锰离子的浓度为20～50umol/l，半胱氨酸的浓度为30～35mmol/l，氯化胆碱的浓度为5～10mmol/l。
更加优选地，所述的补料培养基中，铜离子浓度为180umol/l，锰离子浓度为40umol/l，半胱氨酸浓度为30mmol/l，氯化胆碱浓度为5mmol/l。
优选地，所述的融合蛋白为fc融合蛋白，更加优选为fgf21-fc融合蛋白或tnfr-fc融合蛋白。
优选地，所述步骤(b)中，搅拌转速180～250rpm，溶氧含量大于35％，更加优选地，溶氧含量为35～60％。
优选地，步骤(b)中，补料培养基流加为连续流加，第一天流加量为培养物体积的4％，以后每天流加培养物体积的5％。
一个优选的实施方案，一种生产fgf21-fc融合蛋白的cho细胞培养方法，包括如下步骤：目标细胞株在初始基础培养基中进行逐级放大培养，每三天传代转瓶培养，长至对数生长期后将其转入发酵罐反应器中，初始加入反应器的细胞密度为6×105cells/ml，培养3～4天后当细胞密度达到5～7×106cell/ml时，开始流加补料培养基，补料培养基为连续流加方式，每天补料的流加量为4～5％培养物体积，当细胞密度达到13～18×106cells/ml降低培养温度至34±0.5℃，ph为6.9±0.05；至测得细胞活率低于90％时停止流加补料培养基，培养结束。
一个优选的实施方案，一种生产tnfr-fc融合蛋白的cho细胞培养方法，包括如下步骤：目标细胞株在初始基础培养基中进行逐级放大培养，每三天传代转瓶培养，长至对数生长期后将其转入发酵罐反应器中，初始加入反应器的细胞密度为6×105cells/ml，培养3～4天后当细胞密度达到5～7×106cell/ml时，开始流加补料培养基，补料培养基为连续流加方式，每天补料的流加量为4～5％培养物体积，当细胞密度达到13～18×106cells/ml降低培养温度至34±0.5℃，ph为6.9±0.05；至测得细胞活率低于90％时停止流加补料培养基，培养结束。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明提高铜离子的浓度，可减少自由巯基，降低抗体聚体含量，减少乳酸生成。半胱氨酸的加入可以攻击抗体铰链区的二硫键连接，加速二硫键的还原，促使多聚体变成单体。锰离子和氯化胆碱可影响糖基化修饰水平，本发明调整锰离子和氯化胆碱的用量，使得糖基化修饰中唾液酸含量较高，甘露聚糖含量较低，使得融合蛋白的稳定性较好。
(2)对培养ph进行调整，从而使单体间的静电排斥作用力得以增加，用于抵消“hotspots”间的强疏水作用力，抑制聚体的形成。
(3)培养温度降低至34℃，可以使细胞代谢减慢，产物大量合成，同时可长时间维持高的细胞密度和活力，减少目的产物中错配二硫键的形成，增加目的融合蛋白的表达量。
(4)细胞培养的补料培养基进行了优化，调整铜离子、锰离子、半胱氨酸和氯化胆碱的加入量后，有效解决了细胞培养过程中的结团现象，有效减少代谢产物及聚体的形成，提高了目的融合蛋白的表达量和蛋白质量。
(5)利用本发明的方法，融合蛋白的表达量可提高1倍以上，蛋白纯度达到96％以上。
具体实施方式
下面结合具体实施案例对本发明进行阐述，应该理解的是，以下实施例仅用于例证的目的，并不限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所做出的任何修改、等同的替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
以下实施例中所用的试剂，原料除有特殊说明外，均可通过商业途径获得。
以下实施例所用的基础培养基是按照专利cn104513805a中表1所公开的组分配制的n38基础培养基。
实施例1：
提供包含编码fgf21-fc融合蛋白的目的基因的cho细胞；在n38基础培养基(专利cn104513805a中实施例1所述培养基)中逐级放大培养所述细胞，每三天传代转瓶培养，经过90ml、300ml、900ml转瓶的细胞扩增后，当细胞密度达到2×106cells/ml转至5l发酵罐中；在5l发酵罐中进行高密度培养阶段，搅拌速度180～250rpm，溶氧含量35～60％，温度为37±0.5℃，ph为7.2±0.1，培养3～4天后当细胞密度达到7×106cell/ml时，开始流加补料培养基(补料培养基为n38feed，是n38基础培养基的10倍浓缩液，其中n38基础培养基是专利cn104513805a中实施例1所述培养基；控制硫酸铜150umol/l，硫酸锰40umol/l，半胱氨酸30mmol/l，氯化胆碱8mmol/l)，补料培养基为连续流加方式，第一天流加量为培养物体积的4％，以后每天流加培养物体积的5％，流加过程中当细胞密度达到13～18×106cells/ml时降温至34±0.5℃，调整ph至6.90±0.05培养，流加培养过程中每天取样检测细胞密度与活力，流加培养第9天，细胞活力低于90％，停止流加补料培养基，培养结束。取样经亲和层析纯化后测定fgf21-fc融合蛋白的表达量、蛋白纯度、聚体含量、糖型(唾液酸、甘露醇糖)。结果见表1。
表1实施例1检测结果
实施例2：
提供包含编码tnfr-fc融合蛋白的目的基因的cho细胞；在n38基础培养基(专利cn104513805a中实施例2所述培养基)中逐级放大培养所述细胞，每三天传代转瓶培养，经过90ml、300ml、900ml转瓶的细胞扩增后，当细胞密度达到2×106cells/ml转至5l发酵罐中；在5l发酵罐中进行高密度培养阶段，搅拌速度180～250rpm，溶氧含量35～60％，温度为37±0.5℃，ph为7.2±0.1，培养3～4天后当细胞密度达到5×106cell/ml时，开始流加补料培养基(补料培养基为n38feed，是n38基础培养基的5倍浓缩液，其中n38基础培养基是专利cn104513805a中实施例2所述培养基；控制硫酸铜200umol/l，硫酸锰20umol/l，半胱氨酸35mmol/l，氯化胆碱5mmol/l)，补料培养基为连续流加方式，每天流加量为培养物体积的2％，流加过程中当细胞密度达到13～18×106cells/ml时降温至34±0.5℃，调整ph至6.90±0.05培养，流加培养过程中每天取样检测细胞密度与活力，流加培养第8天，细胞活力低于90％，停止流加补料培养基，培养结束。取样经亲和层析纯化后测定tnfr-fc融合蛋白的表达量、蛋白纯度、聚体含量、糖型(唾液酸、甘露醇糖)。结果见表2。
表2实施例2检测结果
实施例3：
提供包含编码fgf21-fc融合蛋白的目的基因的cho细胞；在n38基础培养基(专利cn104513805a中实施例4所述培养基)中逐级放大培养所述细胞，每三天传代转瓶培养，经过90ml、300ml、900ml转瓶的细胞扩增后，当细胞密度达到2×106cells/ml转至5l发酵罐中；在5l发酵罐中进行高密度培养阶段，搅拌速度180～250rpm，溶氧含量35～60％，温度为37±0.5℃，ph为7.2±0.1，培养3～4天后当细胞密度达到6×106cell/ml时，开始流加补料培养基(补料培养基为n38feed，是n38基础培养基的8倍浓缩液，其中n38基础培养基是专利cn104513805a中实施例4所述培养基；控制硫酸铜180umol/l，硫酸锰50umol/l，半胱氨酸30mmol/l，氯化胆碱10mmol/l)，补料培养基为连续流加方式，第一天流加量为培养物体积的4％，以后每天流加培养物体积的5％，流加过程中当细胞密度达到13～18×106cells/ml时降温至34±0.5℃，调整ph至6.90±0.05培养，流加培养过程中每天取样检测细胞密度与活力，流加培养第8天，细胞活力低于90％，停止流加补料培养基，培养结束。取样经亲和层析纯化后测定fgf21-fc融合蛋白的表达量、蛋白纯度、聚体含量、糖型(唾液酸、甘露醇糖)。结果见表3。
表3实施例3检测结果
实施例4：
提供包含编码fgf21-fc融合蛋白的目的基因的cho细胞；在n38基础培养基(专利cn104513805a中实施例1所述培养基)中逐级放大培养所述细胞，每三天传代转瓶培养，经过90ml、300ml、900ml转瓶的细胞扩增后，当细胞密度达到2×106cells/ml转至5l发酵罐中；在5l发酵罐中进行高密度培养阶段，搅拌速度180～250rpm，溶氧含量35～60％，温度为37±0.5℃，ph为7.2±0.1，培养3～4天后当细胞密度达到7×106cell/ml时，开始流加补料培养基(补料培养基为n38feed，是n38基础培养基的10倍浓缩液，其中n38基础培养基是专利cn104513805a中实施例1所述培养基；控制硫酸铜180umol/l，硫酸锰40umol/l，半胱氨酸30mmol/l，氯化胆碱5mmol/l)，补料培养基为连续流加方式，第一天流加量为培养物体积的4％，以后每天流加培养物体积的5％，流加过程中当细胞密度达到13～18×106cells/ml时降温至34±0.5℃，调整ph至6.90±0.05培养，流加培养过程中每天取样检测细胞密度与活力，流加培养第9天，细胞活力低于90％，停止流加补料培养基，培养结束。取样经亲和层析纯化后测定fgf21-fc融合蛋白的表达量、蛋白纯度、聚体含量、糖型(唾液酸、甘露醇糖)。结果见表4。
表4实施例4检测结果
实施例5：
提供包含编码fgf21-fc融合蛋白的目的基因的cho细胞；在actipro基础培养基中逐级放大培养所述细胞，每三天传代转瓶培养，经过90ml、300ml、900ml转瓶的细胞扩增后，当细胞密度达到2×106cells/ml转至5l发酵罐中；在5l发酵罐中进行高密度培养阶段，搅拌速度180～250rpm，溶氧含量35～60％，温度为37±0.5℃，ph为7.2±0.1，培养3～4天后当细胞密度达到7×106cell/ml时，开始流加补料培养基(补料培养基为n38feed，是n38基础培养基的10倍浓缩液，其中n38基础培养基是专利cn104513805a中实施例4所述培养基；控制硫酸铜60umol/l，硫酸锰15umol/l，半胱氨酸50mmol/l，氯化胆碱20mmol/l)，补料培养基为连续流加方式，第一天流加量为培养物体积的4％，以后每天流加培养物体积的5％，流加过程中当细胞密度达到13～18×106cells/ml时降温至34±0.5℃，调整ph至6.90±0.05培养，流加培养过程中每天取样检测细胞密度与活力，流加培养第8天，细胞活力低于90％，停止流加补料培养基，培养结束。取样经亲和层析纯化后测定fgf21-fc融合蛋白的表达量、蛋白纯度、聚体含量、糖型(唾液酸、甘露醇糖)。结果见表5。
表5实施例5检测结果
实施例6：
提供包含编码tnfr-fc融合蛋白的目的基因的cho细胞；在n38基础培养基(专利cn104513805a中实施例3所述培养基)中逐级放大培养所述细胞，每三天传代转瓶培养，经过90ml、300ml、900ml转瓶的细胞扩增后，当细胞密度达到2×106cells/ml转至5l发酵罐中；在5l发酵罐中进行高密度培养阶段，搅拌速度180～250rpm，溶氧含量35～60％，温度为37±0.5℃，ph为7.2±0.1，培养3～4天后当细胞密度达到7×106cell/ml时，开始流加补料培养基(补料培养基为n38feed，是n38基础培养基的10倍浓缩液，其中n38基础培养基是专利cn104513805a中实施例3所述培养基；控制硫酸铜180umol/l，硫酸锰40umol/l，半胱氨酸30mmol/l，氯化胆碱5mmol/l)，补料培养基为连续流加方式，第一天流加量为培养物体积的4％，以后每天流加培养物体积的5％，流加过程中当细胞密度达到13～18×106cells/ml时降温至34±0.5℃，调整ph至6.90±0.05培养，流加培养过程中每天取样检测细胞密度与活力，流加培养第9天，细胞活力低于90％，停止流加补料培养基，培养结束。取样经亲和层析纯化后测定tnfr-fc融合蛋白的表达量、蛋白纯度、聚体含量、糖型(唾液酸、甘露醇糖)。结果见表6。
表6实施例6检测结果
实施例7：
提供包含编码tnfr-fc融合蛋白的目的基因的cho细胞；在n38基础培养基(专利cn104513805a中实施例1所述培养基)中逐级放大培养所述细胞，每三天传代转瓶培养，经过90ml、300ml、900ml转瓶的细胞扩增后，当细胞密度达到2×106cells/ml转至5l发酵罐中；在5l发酵罐中进行高密度培养阶段，搅拌速度180～250rpm，溶氧含量35～60％，温度为37±0.5℃，ph为7.2±0.1，培养3～4天后当细胞密度达到7×106cell/ml时，开始流加补料培养基(补料培养基为n38feed，是n38基础培养基的10倍浓缩液，其中n38基础培养基是专利cn104513805a中实施例1所述培养基；控制硫酸铜180umol/l，硫酸锰40umol/l，半胱氨酸30mmol/l，氯化胆碱5mmol/l)，补料培养基为连续流加方式，第一天流加量为培养物体积的4％，以后每天流加培养物体积的5％，流加培养过程中每天取样检测细胞密度与活力，流加培养第8天，细胞活力低于90％，停止流加补料培养基，培养结束。取样经亲和层析纯化后测定tnfr-fc融合蛋白的表达量、蛋白纯度、聚体含量、糖型(唾液酸、甘露醇糖)。结果见表7。
表7实施例7检测结果
对比实施例1：
提供包含编码fgf21-fc融合蛋白的目的基因的cho细胞；在n38基础培养基(专利cn104513805a中实施例1所述培养基)中逐级放大培养所述细胞，每三天传代转瓶培养，经过90ml、300ml、900ml转瓶的细胞扩增后，当细胞密度达到2×106cells/ml转至5l发酵罐中；在5l发酵罐中进行高密度培养阶段，搅拌速度180～250rpm，溶氧含量35～60％，温度为37±0.5℃，ph为7.2±0.1，培养3～4天后当细胞密度达到6×106cell/ml时，开始流加补料培养基(补料培养基是n38基础培养基的10倍浓缩液，其中n38基础培养基是专利cn104513805a中实施例1所述培养基；控制硫酸铜180umol/l，半胱氨酸30mmol/l，氯化胆碱5mmol/l；不含锰离子)，补料培养基为连续流加方式，第一天流加量为培养物体积的4％，以后每天流加培养物体积的5％，流加过程中当细胞密度达到13～18×106cells/ml时降温至34±0.5℃，调整ph至6.90±0.05培养，流加培养过程中每天取样检测细胞密度与活力，流加培养第8天，细胞活力低于90％，停止流加补料培养基，培养结束。取样经亲和层析纯化后测定fgf21-fc融合蛋白的表达量、蛋白纯度、聚体含量、糖型(唾液酸、甘露醇糖)。结果见表8。
表8对比实施例1检测结果
对比实施例2：
提供包含编码fgf21-fc融合蛋白的目的基因的cho细胞；在n38基础培养基(专利cn104513805a中实施例1所述培养基)中逐级放大培养所述细胞，每三天传代转瓶培养，经过90ml、300ml、900ml转瓶的细胞扩增后，当细胞密度达到2×106cells/ml转至5l发酵罐中；在5l发酵罐中进行高密度培养阶段，搅拌速度250rpm，溶氧含量60％，温度为37±0.5℃，ph为7.2±0.1，培养3～4天后当细胞密度达到7×106cell/ml时，降低培养温度至34±0.5℃，ph为6.9±0.05，开始流加补料培养基(补料培养基是n38基础培养基的10倍浓缩液并添加锰离子，其中n38基础培养基是专利cn104513805a中实施例1所述培养基；硫酸锰40umol/l，不控制铜离子，半胱氨酸和氯化胆碱的浓度)，补料培养基为连续流加方式，第一天流加量为培养物体积的4％，以后每天流加培养物体积的5％，流加过程中当细胞密度达到13～18×106cells/ml时降温至34±0.5℃，调整ph至6.90±0.05培养，流加培养过程中每天取样检测细胞密度与活力，流加培养第5天，细胞活力低于90％，停止流加补料培养基，培养结束。取样经亲和层析纯化后测定fgf21-fc融合蛋白的表达量、蛋白纯度、聚体含量、糖型(唾液酸、甘露醇糖)。测定结果见表9。
表9对比实施例2检测结果
对比实施例3：
提供包含编码tnfr-fc融合蛋白的目的基因的cho细胞；在n38基础培养基(专利cn104513805a中实施例3所述培养基)中逐级放大培养所述细胞，每三天传代转瓶培养，经过90ml、300ml、900ml转瓶的细胞扩增后，当细胞密度达到2×106cells/ml转至5l发酵罐中；在5l发酵罐中进行高密度培养阶段，搅拌速度180～250rpm，溶氧含量35～60％，温度为37±0.5℃，ph为7.2±0.1，培养3～4天后当细胞密度达到7×106cell/ml时，开始流加补料培养基(补料培养基是n38基础培养基的10倍浓缩液，其中n38基础培养基是专利cn104513805a中实施例3所述培养基；不含锰离子，不控制铜离子、半胱氨酸和氯化胆碱的浓度)，补料培养基为连续流加方式，第一天流加量为培养物体积的4％，以后每天流加培养物体积的5％，流加过程中当细胞密度达到13～18×106cells/ml时降温至34±0.5℃，调整ph至6.90±0.05培养，流加培养过程中每天取样检测细胞密度与活力，流加培养第8天，细胞活力低于90％，停止流加补料培养基，培养结束。取样经亲和层析纯化后测定tnfr-fc融合蛋白的表达量、蛋白纯度、聚体含量、糖型(唾液酸、甘露醇糖)。结果见表10。
表10对比实施例3检测结果
对比实施例4
提供包含编码fgf21-fc融合蛋白的目的基因的cho细胞；在actipro基础培养基中逐级放大培养所述细胞，每三天传代转瓶培养，经过90ml、300ml、900ml转瓶的细胞扩增后，当细胞密度达到2×106cells/ml转至5l发酵罐中；在5l发酵罐中进行高密度培养阶段，搅拌速度180～250rpm，溶氧含量35～60％，温度为37±0.5℃，ph为7.2±0.1，培养3～4天后当细胞密度达到7×106cell/ml时，开始流加补料培养基(补料培养基为cb7a和cb7b)，补料培养基为连续流加方式，第一天流加量为培养物体积的4％，以后每天流加培养物体积的5％，流加过程中当细胞密度达到13～18×106cells/ml时降温至34±0.5℃，调整ph至6.90±0.05培养，流加培养过程中每天取样检测细胞密度与活力，流加培养第8天，细胞活力低于90％，停止流加补料培养基，培养结束。取样经亲和层析纯化后测定fgf21-fc融合蛋白的表达量、蛋白纯度、聚体含量、糖型(唾液酸、甘露醇糖)。结果见表11。
表11对比实施例4检测结果