一种多肽抗生素及其制备方法和用途与流程

本发明属于抗生素领域，涉及一种多肽抗生素及其制备方法和用途。

背景技术：

可植入的医疗设备，例如血管内导管，心脏瓣膜，起搏器，假肢关节，透析导管，牙科植入物，整形外科和创伤设备，可以为患者提供有益的医疗保健，治疗和康复。然而，医疗器械相关的感染已变得越来越重要，导致过度的患者痛苦。

抗菌肽(antimicrobialpeptides，amps)，又称抗微生物肽或肽抗生素，是由细菌特定基因编码产生的一类小分子多肽，具有广谱抗菌性。抗菌肽通常由12-50个氨基酸残基组成，分子量小于10kda，具有两亲性和阳离子性。抗菌肽主要生物学作用是其可杀灭包括革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌在内的多种细菌，具有抗菌谱广，杀菌速度快的特点。

cn104650208b公开了一种鸡源抗菌肽的衍生肽及其制备方法和应用。该发明截取鸡源avbd4前导肽的20个氨基酸，分别用带电荷氨基酸赖氨酸替代前导肽第5位的半胱氨酸，第6、7、12位的苯丙氨酸，同时将抗菌肽的羧基末端酰胺化，增加一个正电荷用以提高抗菌肽的稳定性。采用固相化学合成法获得mgw21粗品；使用反相高效液相色谱和电喷射质谱法对合成的多肽进行纯化和鉴定。该抗菌肽在制备治疗革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌感染性疾病药物中的应用。该抗菌肽两亲性好，与抗生素和melittin相比，其抑菌活性高，而细胞毒性低。

cn105777889a公开了一种杂合α螺旋型猪源抗菌肽及其制备方法和应用。该发明首先将猪源抗菌肽pmap-36中n末端前16个氨基酸残基经过改造，然后与fowlicidin-2前15个氨基酸杂合得到抗菌肽pr-fo，并将pr-fo的羧基末端酰胺化以提高一个正电荷并增加肽的稳定性。然后使用多肽合成仪，进行固相合成法合成抗菌肽pr-fo。该发明的抗菌肽具有更高的抗菌活性，低细胞毒性，大大提高了细胞选择性。

然而，可植入的医疗设备在体内的感染通常会使细菌形成生物膜，生物膜的形成可以保护细菌细胞免受抗微生物剂和免疫防御，导致持续感染并增加发病率和死亡率。生物膜是微生物的聚集体，其中细胞经常嵌入自身产生的细胞外聚合物质(eps)基质中，其通常粘附于医疗装置的表面。一旦形成生物膜，与其浮游对应部分相比，生物膜内的细菌细胞对抗微生物剂具有显着的抗性(高达1000倍)。鉴于生物膜在设备相关感染和有限治疗选择中发挥的关键作用，迫切需要制定有效的策略，因此，提供一种兼具杀灭细菌和根除生物膜的抗生素具有重要意义和广阔前景。

技术实现要素：

针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种多肽抗生素及其制备方法和用途，本发明的多肽抗生素将抗菌肽和一氧化氮供体相连，通过抗菌肽协同一氧化氮，驱散生物膜，增强杀菌作用，对形成生物膜的细菌进行有效杀伤。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种多肽抗生素，所述多肽抗生素包括抗菌肽和一氧化氮供体，所述抗菌肽和一氧化氮供体相连。

本发明的多肽抗生素通过抗菌肽和一氧化氮供体相连，打破细菌形成的生物膜屏障，阻断其产生耐药性的途径，抑制细菌的生长繁殖，有效提高抗生素的杀菌效果。

优选地，所述抗菌肽的通式如下所示：

thr-x1-x2-x3-phe-trp-x4-x5-val-leu-asn-gly-ala-leu-x6-ile-ala-pro-phe-leu-leu-gly；

其中，x1、x2、x3、x4、x5和x6为带正电的氨基酸。

优选地，所述带正电荷的氨基酸为赖氨酸和/或精氨酸。

本发明中，优选带有柔性链的赖氨酸或精氨酸组成抗菌肽，其侧链较长，使整个抗菌肽的结构更加稳定。

本发明中，所述抗菌肽的第2、3、4、7、8、15位为带正电荷的氨基酸可以更好地靶向细菌外壁，同时稳定抗菌多肽的构象。

优选地，所述抗菌肽的氨基酸序列如seqidno.1-64之一所示。

本发明中，所选用的抗菌肽为鳄鱼体内防御素的一段有效多肽序列，但单独使用该抗菌肽的抗菌效果不理想，对于形成生物膜的细菌的杀菌效果显著降低，通过抗菌肽与一氧化氮供体的连接，提高了抗菌肽的杀菌效率。

优选地，所述一氧化氮供体包括苯磺酰基呋咱氮氧化物、硝酸酯类或偶氮鎓二醇盐类中的任一种或至少两种的组合，优选为苯磺酰基呋咱氮氧化物。

本发明中，优选苯磺酰基呋咱氮氧化物为一氧化氮供体，化学性质和结构更为稳定，便于修饰基团进行点击化学反应。

优选地，所述硝酸酯类包括单硝酸异山梨酯。

优选地，所述偶氮鎓二醇盐类包括脯氨酸偶氮鎓二醇盐。

第二方面，本发明提供一种制备如第一方面所述的多肽抗生素的方法，所述方法包括以下步骤：将一氧化氮供体和抗菌肽通过化学键键合相连得到多肽抗生素。

优选地，所述一氧化氮供体为偶联氨基酸的一氧化氮供体。

优选地，所述氨基酸带有羟基。

优选地，所述氨基酸包括酪氨酸和/或丝氨酸。

本发明中，一氧化氮供体在碱性条件下与酪氨酸和/或丝氨酸的酚羟基反应进行偶联。

本发明中，一氧化氮供体先与带有羟基的氨基酸进行偶联反应，进而再与抗菌肽进行相连，所得多肽抗生素的稳定性更高，抗菌效果更显著。

优选地，所述偶联氨基酸的一氧化氮供体与抗菌肽通过点击化学反应相连。

本发明中，偶联氨基酸的一氧化氮供体直接与抗菌肽进行反应的效率低，而通过点击化学的反应可以显著提高反应产率，合成过程高效。

优选地，所述点击化学反应包括叠氮-炔的反应和/或巯基-双键的反应，优选为叠氮-炔的反应。

优选地，所述抗菌肽的n端修饰叠氮基团，一氧化氮供体修饰炔基。

优选地，所述叠氮基团来源包括叠氮乙酸或叠氮化钠，优选为叠氮乙酸。

优选地，所述炔基来源包括己炔酸或己炔氨，优选为己炔酸。

本发明中，抗菌肽的氨基酸个数为22个，通过将抗菌肽修饰叠氮基团和带有炔基的一氧化氮供体相连，实现一氧化氮供体与长肽链的连接，解决传统连接方式效率不高的问题。

优选地，所述抗菌肽由fmoc固相合成法制备得到。

第三方面，本发明提供一种如第一方面所述的多肽抗生素用于制备治疗皮下植入物形成的感染或杀灭细菌的药物和/或制剂中的用途。

优选地，所述皮下植入物包括血管内导管、心脏瓣膜、起搏器、假肢关节或透析导管中的任一种或至少两种的组合。

优选地，所述细菌包括金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，绿脓杆菌或牙龈卟啉单胞菌中的任一种或至少两种的组合，优选为金黄色葡萄球菌或大肠杆菌。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明通过抗菌肽与一氧化氮供体的连接，二者协同增效，有效对抗形成生物膜的细菌，阻断其产生耐药性的途径，提高抗生素的杀菌效果；

(2)本发明通过抗菌肽的设计，增加带正电荷的氨基酸，使得抗菌肽结构稳定，抗菌效果显著提高；

(3)本发明的多肽抗生素抗菌效果显著，能有效杀灭多种细菌，具有光谱性，应用广泛。

附图说明

图1a是实施例2中金黄色葡萄球菌的电镜图；图1b是施加多肽抗生素后金黄色葡萄球菌的电镜图，其中fotyr-amp表示多肽抗生素；图1c是大肠杆菌的电镜图；图1d是施加多肽抗生素后大肠杆菌的电镜图，其中fotyr-amp表示多肽抗生素；

图2是实施例2的多肽抗生素的驱散生物膜效果，其中从上至下的第一行为多肽抗生素对金黄色葡萄球菌生物膜形成的影响，从左至右依次为对照组细菌成膜情况的电镜图，施加一氧化氮供体后细菌成膜状况的电镜图，施加抗菌肽后细菌成膜状况的电镜图，施加多肽抗生素后细菌成膜状况的电镜图；第二行为多肽抗生素对大肠杆菌生物膜形成的影响，从左至右依次为对照组细菌成膜情况的电镜图，施加一氧化氮供体后细菌成膜状况的电镜图，施加抗菌肽后细菌成膜状况的电镜图，施加多肽抗生素后细菌成膜状况的电镜图，其中fotyr表示修饰酪氨酸的一氧化氮供体，amp表示抗菌肽，fotyr-amp表示多肽抗生素；

图3是多肽抗生素的动物注射效果，其中control为不作任何处理的对照组，amp为抗菌肽，fotyr为修饰酪氨酸的一氧化氮供体，fotyr-amp为多肽抗生素，fotyr-amp+ptio为多肽抗生素复合一氧化氮清除剂，cpc为头孢菌素c。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

实施例1抗菌肽的制备

(1)采用fmoc固相合成法，选用wang树脂的修饰密度为0.35，在树脂上合成所述多肽，用六氢吡啶的dmf溶液脱去氨基端的fmoc保护，将下一个氨基酸的羧基用4-甲基吗啉和苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯的dmf溶液进行活化，然后与脱保护的第一个氨基酸进行缩合反应，重复上述步骤，直到完成所有氨基酸的缩合；

(2)将所述合成的多肽用含有2.5％水和2.5％三异丙基硅烷的三氟乙酸溶液将合成好的多肽从树脂上脱除，同时脱除氨基酸的侧链保护；将三氟乙酸用旋转蒸发法去除，然后多肽的粗产物用无水乙醚沉淀，洗涤并干燥；最后选用反相制备液相色谱，将多肽纯化，所得抗菌肽的氨基酸序列如表1所示。

表1

实施例2多肽抗生素的制备

(1)采用fmoc固相合成法，选用wang树脂的修饰密度为0.35，在树脂上合成所述seqidno.61多肽，用六氢吡啶的dmf溶液脱去氨基端的fmoc保护，将下一个氨基酸的羧基用4-甲基吗啉和苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯的dmf溶液进行活化，然后与脱保护的第一个氨基酸进行缩合反应，重复上述步骤，直到完成所有氨基酸的缩合；

(2)其中接上叠氮乙酸的合成步骤与步骤(1)中的氨基酸链接方法一致；

(3)将所述合成的多肽用含有2.5％水和2.5％三异丙基硅烷的三氟乙酸溶液将合成好的多肽从树脂上脱除，同时脱除氨基酸的侧链保护；将三氟乙酸用旋转蒸发法去除，然后多肽的粗产物用无水乙醚沉淀，洗涤并干燥；最后选用反相制备液相色谱，将多肽纯化；

(4)将修饰有炔基的fotyr和修饰叠氮乙酸的多肽在硫酸铜和抗坏血酸钠的作用下合成目标分子，如式i所示，fotyr为偶联酪氨酸的一氧化氮供体，其中f代表一氧化氮供体，o代表一氧化氮供体与酪氨酸羟基形成的醚键，tyr为酪氨酸。

杀菌效果检测

1、在正常状态下的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌中分别加入终浓度200μm多肽抗生素，不加多肽抗生素的作为对照组，采用扫描电子显微镜(sem)进行观测，结果见图1a-1d.

由图1a-1d可知，正常状态下的金黄色葡萄菌和大肠杆菌对比加入多肽抗生素的金黄色葡萄菌和大肠杆菌，可以看出，正常状态下的金黄色葡萄菌和大肠杆菌形态饱满，加入多肽抗生素的金黄色葡萄菌和大肠杆菌外壁被破坏，内容物溢出。这说明多肽抗生素的杀菌效果。

2、分别在tsb培养基中培养金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，至形成生物膜，分别在两种细菌培养基中加入一氧化氮供体、抗菌肽和多肽抗生素，以不添加任何组分的菌体培养基做对照，用扫描电子显微镜(sem)观测，结果见图2.

由图2可知，在已经形成生物膜的不同细菌中分别加入一氧化氮供体和多肽抗生素均破坏细菌已形成的生物膜，而多肽抗生素能进一步破坏细菌的细胞壁，提高杀菌效果；而添加抗菌肽的细菌生物膜结构完整，抵御抗菌肽的杀菌作用，产生耐药性。

3、通过在小鼠皮下植入带有金黄色葡萄球菌的生物膜的聚二甲基硅氧烷片，建立生物膜感染模型。在原位分别注射抗菌肽、修饰酪氨酸的一氧化氮供体、多肽抗生素、一氧化氮清除剂(ptio)和多肽抗生素的复合剂、以及传统的抗生素头孢菌素c，注射剂量均为(0.25μm/kg)，每12h注射一次，给药三天。通过菌落培养计数的方法评价其治疗效果，如图3所示，其中control为不作任何处理的对照组，amp为抗菌肽，fotyr为修饰酪氨酸的一氧化氮供体，fotyr-amp为多肽抗生素，fotyr-amp+ptio为多肽抗生素复合一氧化氮清除剂，cpc为头孢菌素c；与头孢菌素c相比，多肽抗生素效果提升了2.7倍。

综上所述，本发明提供的多肽抗生素通过释放no驱散细菌形成的生物膜，联合抗菌肽的杀菌作用，提高了对形成生物膜的感染治疗效果，改善了患者的生活质量。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

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thrlyslyslysphetrparglysvalleuasnglyalaleulysile

151015

alapropheleuleugly

20

<210>49

<211>22

<212>prt

<213>人工合成序列

<400>49

thrargargargphetrplysargvalleuasnglyalaleulysile

151015

alapropheleuleugly

20

<210>50

<211>22

<212>prt

<213>人工合成序列

<400>50

thrlysargargphetrplysargvalleuasnglyalaleulysile

151015

alapropheleuleugly

20

<210>51

<211>22

<212>prt

<213>人工合成序列

<400>51

thrarglysargphetrplysargvalleuasnglyalaleulysile

151015

alapropheleuleugly

20

<210>52

<211>22

<212>prt

<213>人工合成序列

<400>52

thrlyslysargphetrplysargvalleuasnglyalaleulysile

151015

alapropheleuleugly

20

<210>53

<211>22

<212>prt

<213>人工合成序列

<400>53

thrargarglysphetrplysargvalleuasnglyalaleulysile

151015

alapropheleuleugly

20

<210>54

<211>22

<212>prt

<213>人工合成序列

<400>54

thrlysarglysphetrplysargvalleuasnglyalaleulysile

151015

alapropheleuleugly

20

<210>55

<211>22

<212>prt

<213>人工合成序列

<400>55

thrarglyslysphetrplysargvalleuasnglyalaleulysile

151015

alapropheleuleugly

20

<210>56

<211>22

<212>prt

<213>人工合成序列

<400>56

thrlyslyslysphetrplysargvalleuasnglyalaleulysile

151015

alapropheleuleugly

20

<210>57

<211>22

<212>prt

<213>人工合成序列

<400>57

thrargargargphetrplyslysvalleuasnglyalaleulysile

151015

alapropheleuleugly

20

<210>58

<211>22

<212>prt

<213>人工合成序列

<400>58

thrlysargargphetrplyslysvalleuasnglyalaleulysile

151015

alapropheleuleugly

20

<210>59

<211>22

<212>prt

<213>人工合成序列

<400>59

thrarglysargphetrplyslysvalleuasnglyalaleulysile

151015

alapropheleuleugly

20

<210>60

<211>22

<212>prt

<213>人工合成序列

<400>60

thrlyslysargphetrplyslysvalleuasnglyalaleulysile

151015

alapropheleuleugly

20

<210>61

<211>22

<212>prt

<213>人工合成序列

<400>61

thrargarglysphetrplyslysvalleuasnglyalaleulysile

151015

alapropheleuleugly

20

<210>62

<211>22

<212>prt

<213>人工合成序列

<400>62

thrlysarglysphetrplyslysvalleuasnglyalaleulysile

151015

alapropheleuleugly

20

<210>63

<211>22

<212>prt

<213>人工合成序列

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151015

alapropheleuleugly

20

<210>64

<211>22

<212>prt

<213>人工合成序列

<400>64

thrlyslyslysphetrplyslysvalleuasnglyalaleulysile

151015

alapropheleuleugly

20