芽孢杆菌DL-2的全细胞在催化(±)-乙酸苏合香酯不对称水解中的应用的制作方法

本发明属于生物化工和生物技术领域，具体涉及一种从西太平洋深海沉积物样品中分离的芽孢杆菌bacillussp.dl-2的全细胞在催化(±)-乙酸苏合香酯不对称水解中的应用。

背景技术：

手性1-苯乙醇及其衍生物的制备在工业生产中占据着重要地位，因其光学纯的单体分子是合成许多药物和化学制品的关键中间体。传统化学合成1-苯乙醇及其衍生物，具有试剂昂贵、反应条件苛刻、成本高、污染大、费时等问题。与之相比，生物催化法具有特异性强、反应条件温和、操作简单、成本低、对环境友好等优点。使用微生物全细胞作为催化剂在工业化应用上具有独特的优势。一方面，将微生物直接参与催化反应，可以省去酶的分离、纯化、固定化等繁琐的步骤，大大降低了生产成本，同时也避免了在这些步骤中引起的酶活损失。另一方面，细胞是酶的天然载体，可以在非水介质中保护酶，减少非水介质对酶引起的活力损失，酶的稳定性将大大提高。此外，利用全细胞作为生物催化剂有利于多酶催化或需要辅酶的生物转化过程。

技术实现要素：

本发明的目的是克服现有技术中的缺陷，提供一种西太平洋深海沉积物样品中分离的芽孢杆菌bacillussp.dl-2的全细胞在催化(±)-乙酸苏合香酯不对称水解中的应用。

本发明的芽孢杆菌bacillussp.dl-2于2018年9月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为：gdmcc1.1556。该菌株为公开保藏，在广东省微生物菌种保藏中心是对外销售的。

本发明从西太平洋深海沉积物中分离到一株芽孢杆菌bacillussp.dl-2，利用bacillussp.dl-2的全细胞作为催化剂，能够催化(±)-乙酸苏合香酯不对称水解，用于制备手性(r)-1-苯乙醇和(s)-乙酸苏合香酯。

因此，本发明的目的是提供芽孢杆菌bacillussp.dl-2的全细胞在催化(±)-乙酸苏合香酯不对称水解中的应用。

优选，所述的芽孢杆菌bacillussp.dl-2的全细胞在催化拆分(±)-乙酸苏合香酯得到(r)-1-苯乙醇中的应用。

优选，所述的催化拆分(±)-乙酸苏合香酯得到(r)-1-苯乙醇是在金属离子、表面活性剂或有机溶剂存在环境下进行的。

所述的金属离子优选为na⁺、k⁺、co²⁺、cu²⁺、mg²⁺、mn²⁺或ni²⁺；所述的表面活性剂优选为十六烷基三甲基溴化铵或羧甲基纤维素钠；所述的有机溶剂优选为丙酮、乙醇、甲醇或n,n-二甲基甲酰胺。

所述的催化拆分(±)-乙酸苏合香酯得到(r)-1-苯乙醇的反应体系优选为：包括细胞浓度以细胞湿重计为32mg/ml的芽孢杆菌bacillussp.dl-2、5mm底物(±)-乙酸苏合香酯和体积分数5％的n,n-二甲基甲酰胺，其余为ph6.0的磷酸钠缓冲液；反应条件为：40℃反应4h。

优选，所述的芽孢杆菌bacillussp.dl-2的全细胞在催化拆分(±)-乙酸苏合香酯得到(s)-乙酸苏合香酯中的应用。

优选，所述的催化拆分(±)-乙酸苏合香酯得到(s)-乙酸苏合香酯是在金属离子、表面活性剂或有机溶剂存在环境下进行的。

所述的金属离子优选为k⁺、ca²⁺、co²⁺、mg²⁺、mn²⁺、zn²⁺、al³⁺或fe³⁺；所述的表面活性剂优选为tween-20、tritonx-100、span65、十六烷基三甲基溴化铵或羧甲基纤维素钠；所述的有机溶剂优选为二甲基亚砜。

所述的催化拆分(±)-乙酸苏合香酯得到(s)-乙酸苏合香酯的反应体系优选为：包括细胞浓度以细胞湿重计为32mg/ml的芽孢杆菌bacillussp.dl-2、2.5mm底物(±)-乙酸苏合香酯和2mmal³⁺，其余为ph7.5的磷酸钠缓冲液；反应条件为：40℃反应4h。

本发明从西太平洋深海沉积物中分离到一株海洋微生物芽孢杆菌bacillussp.dl-2，利用芽孢杆菌bacillussp.dl-2的全细胞作为催化剂，能够催化(±)-乙酸苏合香酯不对称水解，可用于制备手性(r)-1-苯乙醇和(s)-乙酸苏合香酯。本发明利用芽孢杆菌bacillussp.dl-2的全细胞作为催化剂，对反应体系和反应条件进行优化，制备得到了光学纯度为96％的(r)-1-苯乙醇(转化率21％，产率41％)和光学纯度高达99.8％的(s)-乙酸苏合香酯(转化率68％，产率65％)。本发明的bacillussp.dl-2的全细胞作为生物催化剂具有生产工艺简单、环境友好、催化效率高的优点，在精细化学品的工业生长中具有较大的开发潜力。

附图说明：

图1是bacillussp.dl-2的生长曲线。

图2是ph对全细胞拆分(±)-乙酸苏合香酯制备(r)-1-苯乙醇的影响。

图3是温度对全细胞拆分(±)-乙酸苏合香酯制备(r)-1-苯乙醇的影响。

图4是e.e.p和c随细胞浓度的变化曲线。

图5是e.e.p和c随底物浓度的变化曲线。

图6是e.e.p和c随反应时间的变化曲线。

图7是ph对全细胞拆分(±)-乙酸苏合香酯制备(s)-乙酸苏合香酯的影响。

图8是温度对全细胞拆分(±)-乙酸苏合香酯制备(s)-乙酸苏合香酯的影响。

图9是e.e.s和c随细胞浓度的变化曲线。

图10是e.e.s和c随底物浓度的变化曲线。

图11是e.e.s和c随反应时间的变化曲线。

图12是(±)乙酸苏合香酯和(±)-1-苯乙醇的气相色谱图。

图13是最适反应条件下全细胞对(±)-乙酸苏合香酯的选择性水解生成高光学纯的(r)-1-苯乙醇的气相色谱图。

图14是最适反应条件下全细胞对(±)-乙酸苏合香酯的选择性水解得高光学纯的(s)-乙酸苏合香酯的气相色谱图。

图15是bacillussp.dl-2的全细胞水解拆分(±)-乙酸苏合香酯制备(r)-1-苯乙醇1)和(s)-乙酸苏合香酯2)。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

本发明的芽孢杆菌bacillussp.dl-2从西太平洋深海沉积物中筛选得来并保存在中国科学院南海海洋研究所热带海洋生物资源与生态重点实验室。

实施例1：芽孢杆菌菌种的鉴定

筛选纯化后的芽孢杆菌bacillussp.dl-2菌株利用其保守的16srrna基因序列对其菌种进行鉴定。用16srrna通用引物27f：5'-agagtttatcctggctcag-3'；和1492r：5'-ggttaccttgttacgactt-3'，以芽孢杆菌bacillussp.dl-2菌液为dna模板对其进行pcr扩增。建立如表1所示反应体系：

表1pcr反应体系

pcr扩增条件：94℃预变性10min，然后94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸2min30s，循环30次；最后72℃延伸10min，冷却到18℃。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，进行检测，然后送至美吉生物技术有限公司进行双向测序。得到该菌的16srrna基因序列拼接后(其核苷酸序列如seqidno.1所示)利用blast鉴定出该菌株为芽孢杆菌并命名为bacillussp.dl-2，该菌于2018年9月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为：gdmcc1.1556。该菌株为公开保藏，在广东省微生物菌种保藏中心是对外销售的。

实施例2：bacillussp.dl-2的生长曲线

将保存的芽孢杆菌bacillussp.dl-2划线到lb固体培养基(1％胰蛋白胨，0.5％酵母粉，1％nacl，1.5％琼脂粉)上，37℃培养16h，然后挑取单菌落接种到100ml的lb液体培养基(1％胰蛋白胨，0.5％酵母粉，1％nacl)中，200r/min，37℃培养12h，得到种子液，按1％的接种量接种于lb液体培养基中培养，200r/min，37℃培养，每隔2h测定其生物量od-600nm，结果如图1所示。

实施例3：bacillussp.dl-2全细胞的制备

将bacillussp.dl-2的种子液按1％的接种量接种于脱脂奶粉液体培养基进行发酵培养，200r/min，37℃培养24h(培养基变澄清)，得到发酵液，离心去上清液，细胞沉淀用ph＝7.2灭菌后的tris/hcl缓冲液洗涤三次，离心收集细胞沉淀即得bacillussp.dl-2全细胞。

实施例4：全细胞拆分(±)-乙酸苏合香酯制备(r)-1-苯乙醇

4.1ph对全细胞拆分(±)-乙酸苏合香酯的影响

在细胞浓度为32mg/ml(细胞湿重，wcw)的bacillussp.dl-2全细胞，50mm、ph为6.0－8.0的磷酸钠缓冲溶液中加入5mm的(±)-乙酸苏合香酯于40℃下以200rpm反应4h，用气相色谱手性柱检测，根据峰面积计算产物醇对映体过量值(e.e.p)和底物转化率(c)，结果见图2。

公式1：公式2：

rnol和snol分别表示(r)-1-苯乙醇和(s)-1-苯乙醇的峰面积。r0和s0分别表示反应前对应构型的底物浓度；r和s分别代表反应后对应构型的底物浓度。

从图2中可看出在50mm的磷酸钠缓冲液(pb)ph6.0时，产物的对映体过量值最高为95.4％，此时底物转化率为18.9％。故ph6.0的50mmpb适合细胞拆分5mm(±)-乙酸苏合香酯得到高光学纯度的(r)-1-苯乙醇。

4.2温度对全细胞拆分(±)-乙酸苏合香酯的影响

在细胞浓度为32mg/ml(wcw)的bacillussp.dl-2全细胞的ph6.0的pb(50mm)反应体系中加入5mm底物(±)-乙酸苏合香酯，于不同温度(20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃)下以200rpm反应4h，用气相色谱手性柱检测并计算e.e.p和c，结果见图3。表明温度为40℃时，全细胞对(±)-乙酸苏合香酯的拆分效果最佳，其产物醇的对映体过量值和底物转化率分别为95.2％和20.7％。高于或低于40℃时产物的对映体过量值降低。故温度为40℃时适合全细胞拆分(±)-乙酸苏合香酯得到高光学纯度的(r)-1-苯乙醇。

4.3细胞浓度对全细胞拆分(±)-乙酸苏合香酯的影响

在细胞浓度为8mg/ml(wcw)、16mg/ml(wcw)、24mg/ml(wcw)、32mg/ml(wcw)、40mg/ml(wcw)、48mg/ml(wcw)、56mg/ml(wcw)、64mg/ml(wcw)、72mg/ml(wcw)、80mg/ml(wcw)的bacillussp.dl-2全细胞的ph6.0，50mmpb反应体系中分别加入5mm底物(±)-乙酸苏合香酯，于40℃下以200rpm反应4h，用气相色谱手性柱检测并计算产物醇对映体过量值和底物转化率，结果见图4。底物转化率随细胞浓度增加而增加，产物醇对映体过量值先随细胞浓度的增加而增大，到细胞浓度为32mg/ml(wcw)时达到最大值，随后随细胞浓度增加而减小，表明细胞浓度为32mg/ml(wcw)时，对(±)-乙酸苏合香酯的拆分效果最佳，其产物醇对映体过量值和底物转化率分别为95.2％和25.6％。

4.4底物浓度对全细胞拆分(±)-乙酸苏合香酯的影响

在细胞浓度为32mg/ml(wcw)的bacillussp.dl-2全细胞的ph6.0、50mmpb反应体系中分别加入浓度为2.5mm、5mm、10mm、15mm、20mm、30mm、40mm、50mm的底物(±)-乙酸苏合香酯，于40℃下以200rpm反应4h，用气相色谱手性柱检测并计算e.e.p和c，结果见图5。表明底物浓度为5mm时，对(±)-乙酸苏合香酯的拆分效果最佳，其产物醇的对映体过量值和底物转化率分别为95.3％和21.4％。底物浓度低于5mm时e.e.p值下降，高于5mm时底物转化率明显降低。

4.5反应时间对全细胞拆分(±)-乙酸苏合香酯的影响

在ph6.0(50mmpb)的缓冲液体系中加入细胞浓度为32mg/ml(wcw)的bacillussp.dl-2全细胞和5mm底物(±)-乙酸苏合香酯，于40℃下以200rpm分别反应1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h，然后用气相色谱检测并计算产物醇对映体过量值e.e.p和底物转化率c，结果见图6。显示反应时间为4h时，产物醇对映体过量值最大为95.4％，此时底物转化率为21.0％。反应时间过短反应不完全，底物转化率低，反应时间过长产物的对映体过量值降低。4.6金属离子和表面活性剂对全细胞拆分(±)-乙酸苏合香酯的影响

在ph6.0的50mmpb反应体系中加入细胞浓度为32mg/ml(wcw)的bacillussp.dl-2全细胞，5mm底物(±)-乙酸苏合香酯，2mm金属氯化盐或0.05％(w/v)的表面活性剂，以未加金属盐或表面活性剂为对照，在40℃下反应4h，用气相色谱手性柱检测，根据峰面积计算e.e.p和c，结果见表2。

表2金属离子与表面活性剂对全细胞拆分(±)-乙酸苏合香酯的影响

从表2可以看出与对照组相比绝大多数金属离子及表面活性剂的存在降低了全细胞的立体选择性或底物转化率，na⁺，k⁺，co²⁺，cu²⁺，mg²⁺，mn²⁺，ni²⁺、ctab(十六烷基三甲基溴化铵)和cmc-na(羧甲基纤维素钠)对全细胞拆分(±)-乙酸苏合香酯得到的(r)-1-苯乙醇的立体选择有稍微的促进作用，cu²⁺的存在使e.e.p提高到了95.8％，fe³⁺和表面活性剂sdbs(十二烷基苯磺酸钠)对拆分有非常明显的抑制作用。

4.7有机溶剂对全细胞拆分(±)-乙酸苏合香酯的影响

在细胞浓度为32mg/ml(wcw)的bacillussp.dl-2全细胞的ph6.0(50mmpb)的反应体系中加入5mm底物(±)-乙酸苏合香酯和5％(v/v)有机溶剂，以未加有机溶剂为对照，在40℃下200rpm反应4h，用气相色谱手性柱检测，根据峰面积计算e.e.p和c，结果见表3。

表3有机溶剂对全细胞拆分(±)-乙酸苏合香酯的影响

从表3可以看出绝大多数有机溶剂的存在降低了全细胞的立体选择性及底物转化率。丙酮、乙醇、甲醇和dmf(n,n-二甲基甲酰胺)的存在在一定程度上提高了产物的对映体过量值，尤其是dmf的添加使e.e.p提高到了95.8％。最适条件下(反应体系为：包括细胞浓度为32mg/ml(wcw)的bacillussp.dl-2全细胞、5mm底物(±)-乙酸苏合香酯和体积分数5％的dmf，其余为ph6.0的磷酸钠缓冲液(pb)；反应条件为：在40℃下200rpm反应4h)反应前后气相色谱图见图12、图13。最适条件下制备得到了光学纯度为96％的(r)-1-苯乙醇(转化率21％，产率41％)(见图15)。

实施例5：全细胞拆分(±)-乙酸苏合香酯制备(s)-乙酸苏合香酯

反应体系中加入不同的细胞浓度或底物浓度对拆分效果有较大的影响，此细胞优先水解(r)-乙酸苏合香酯生成(r)-1-苯乙醇，而当细胞浓度增加到一定值或底物浓度降低到一定值时(r)-乙酸苏合香酯被基本水解完全，再增加细胞浓度或降低底物浓度便开始水解(s)-乙酸苏合香酯。因此，为得到高光学纯度的(s)-乙酸苏合香酯，增加一定的细胞浓度或降低底物浓度，进行反应条件的优化。最终得到了底物的对映体过量值(e.e.s)高达99.8％的(s)-乙酸苏合香酯。

5.1ph对全细胞拆分(±)-乙酸苏合香酯的影响

在ph为6.0、6.5、7.0、7.5和8.0的50mm的磷酸钠缓冲液反应体系中分别加入细胞浓度为32mg/ml(wcw)的bacillussp.dl-2全细胞和2.5mm底物(±)-乙酸苏合香酯，在40℃下以200rpm反应4h，用气相色谱手性柱检测，根据峰面积计算底物酯对映体过量值e.e.s和底物转化率c，结果见图7。

公式3：

sac和rac分别表示(s)-乙酸苏合香酯和(r)-乙酸苏合香酯的峰面积。

从图7中可看出底物的对映体过量值先随ph的增大而增大，到ph为7.5时达到最大值99.1％，并有较好的转化率64.7％，当ph继续增大底物转化率继续增大便不利于拆分反应。故ph7.5的pb适合全细胞拆分2.5mm(±)-乙酸苏合香酯得到高光学纯度的(s)-乙酸苏合香酯。

5.2温度对全细胞拆分(±)-乙酸苏合香酯的影响

在ph7.5的50mmpb反应体系中加入细胞浓度为32mg/ml(wcw)的bacillussp.dl-2全细胞和2.5mm底物(±)-乙酸苏合香酯，于不同温度(20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃)下以200rpm反应4h，用气相色谱手性柱检测并计算e.e.s和c，结果见图8。结果表明随着反应温度的升高底物对映体过量值逐渐增大，到40℃时达到最高，此时底物酯的对映体过量值和底物转化率分别为98.9％和67.5％，温度再升高e.e.s便逐渐减小。故温度为40℃时适合全细胞拆分(±)-乙酸苏合香酯得到高光学纯度的(s)-乙酸苏合香酯。

5.3细胞浓度对全细胞拆分(±)-乙酸苏合香酯的影响

在ph7.5的50mmpb反应体系中分别加入细胞浓度为8mg/ml(wcw)、16mg/ml(wcw)、24mg/ml(wcw)、32mg/ml(wcw)、40mg/ml(wcw)、48mg/ml(wcw)、56mg/ml(wcw)、64mg/ml(wcw)、72mg/ml(wcw)、80mg/ml(wcw)的bacillussp.dl-2全细胞和2.5mm底物(±)-乙酸苏合香酯，于40℃下以200rpm反应4h，用气相色谱手性柱检测并计算e.e.s和c，结果见图9。表明细胞浓度为32mg/ml(wcw)时，对(±)-乙酸苏合香酯的拆分效果最佳，其底物酯的对映体过量值和底物转化率分别为99.7％和61.8％。细胞浓度过高或过低都会降低拆分效果。

5.4底物浓度对全细胞拆分(±)-乙酸苏合香酯的影响

在加有细胞浓度为32mg/ml(wcw)的bacillussp.dl-2全细胞的ph7.5(50mmpb)的反应体系中分别加入浓度为2.5mm、5mm、10mm、15mm、20mm、30mm、40mm、50mm的底物(±)-乙酸苏合香酯，于40℃下以200rpm反应4h，用气相色谱手性柱检测并计算e.e.s和c，结果见图10。随着底物浓度的增大e.e.s逐渐降低，表明底物浓度为2.5mm时，对(±)-乙酸苏合香酯的拆分效果最佳，此时底物酯的对映体过量值和转化率分别为99.2％和69.0％。

5.5反应时间对全细胞拆分(±)-乙酸苏合香酯的影响

在ph7.5(50mmpb)的反应体系中加入细胞浓度为32mg/ml(wcw)的bacillussp.dl-2全细胞和2.5mm底物(±)-乙酸苏合香酯，于40℃下以200rpm分别反应1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h，然后用气相色谱检测并计算e.e.s和c，结果见图11。显示反应时间为4h时，对(±)-乙酸苏合香酯的拆分效果最佳，其底物酯的对映体过量值和转化率分别为99.2％和66.7％。随着反应时间的延长，底物e.e.s值逐渐升高，4h时达到最大，时间再增加，底物转化率继续增大，不利于拆分反应。

5.6金属离子和表面活性剂对全细胞拆分(±)-乙酸苏合香酯的影响

在ph7.5(50mmpb)的反应体系加入细胞浓度为32mg/ml(wcw)的bacillussp.dl-2全细胞、2.5mm底物(±)-乙酸苏合香酯和2mm金属氯化盐或0.05％(w/v)的表面活性剂，以未加金属盐或表面活性剂为对照，在40℃下200rpm反应4h，用气相色谱手性柱检测，根据峰面积计算e.e.s和c，结果见表4。

表4金属离子与表面活性剂对全细胞拆分(±)-乙酸苏合香酯的影响

从表4可以看出，与对照组相比绝大多数金属离子及表面活性剂的存在在一定程度上增加了细胞的立体选择性，其中金属离子k⁺，ca²⁺，co²⁺，mg²⁺，mn²⁺，zn²⁺，al³⁺，fe³⁺和表面活性剂tween-20，tritonx-100，span65，ctab，cmc-na使全细胞拆分(±)-乙酸苏合香酯得到的(s)-乙酸苏合香酯的e.e.s提高到99％以上，尤其是al³⁺和tritonx-100对拆分反应的立体选择性有较大的促进作用e.e.s>99.5％；cu²⁺，ni²⁺和表面活性剂sdbs对细胞拆分有非常明显的抑制作用。

5.7有机溶剂对全细胞拆分(±)-乙酸苏合香酯的影响

在ph7.5(50mmpb)的反应体系中加入细胞浓度为32mg/ml(wcw)的bacillussp.dl-2全细胞、2.5mm底物(±)-乙酸苏合香酯和5％(v/v)有机溶剂，以未加有机溶剂为对照，在40℃下200rpm反应4h，用气相色谱手性柱检测，根据峰面积计算e.e.s和c，结果见表5。

表5有机溶剂对全细胞拆分(±)-乙酸苏合香酯的影响

从表5可以看出有机溶剂的存在基本都降低了e.e.s，甲醇的存在对拆分效果影响不大，dmso促进了拆分制备(s)-乙酸苏合香酯的立体选择性。最适条件下(反应体系为：包括细胞浓度为32mg/ml(wcw)的bacillussp.dl-2全细胞、2.5mm底物(±)-乙酸苏合香酯和2mmal³⁺，其余为ph7.5的磷酸钠缓冲液(pb)；反应条件为：40℃反应4h)反应前后气相色谱图见图12、图14。最适条件下制备得到了光学纯度高达99.8％的(s)-乙酸苏合香酯(转化率68％，产率65％)(见图15)。

序列表

<110>中国科学院南海海洋研究所

<120>芽孢杆菌dl-2的全细胞在催化(±)-乙酸苏合香酯不对称水解中的应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1450

<212>dna

<213>芽孢杆菌dl-2(bacillussp.dl-2)

<400>1

tttggtccaccttaggcggctagctccttacggttactccaccgacttcgggtgttacaa60

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accatgcaccacctgtcactctgtcccccgaaggggaacgctctatctctagagttgtca480

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cgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcagtcttgcgaccgtactccccagg600

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gcctcagcgtcagttacagaccaaaaagccgccttcgccactggtgttcctccacatctc780

tacgcatttcaccgctacacgtggaattccgcttttctcttctgcactcaagttccccag840

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gcgcgcgctttacgcccaataattccggataacgcttgccacctacgtattaccgcggct960

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ctcgtacttgttcttccctaacaacagagttttacgacccgaaagccttcatcactcacg1080

cggcgttgctccgtcagactttcgtccattgcggaagattccctactgctgcctcccgta1140

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tcgttgccttggtgagccgttacctcaccaactagctaatgcaccgcgggcccatctgta1260

agtgatagccgaaaccatctttcaatcatctcccatgaaggagaagatcctatccggtat1320

tagcttcggtttcccgaagttatcccagtcttacaggcaggttgcccacgtgttactcac1380

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cacccgccac1450