疾病治疗剂制备用试剂盒、疾病治疗剂和疾病治疗剂的制备方法与流程

本发明涉及疾病治疗剂制备用试剂盒、疾病治疗剂和疾病治疗剂的制备方法。

背景技术：

对于由缺血性心肌病导致的严重的心力衰竭的治疗，可认为心脏移植是最有效的方法，但供体不足的问题非常严重。另外，虽然采用人工心脏也是选项之一，但被指出有感染、脑血栓等并发症的问题。另一方面，作为目前新的治疗法，通过使用了自身的细胞的骨骼肌成肌细胞片进行的心肌再生治疗受到注目(参照专利文献1)。通过该骨骼肌成肌细胞片进行的心肌再生治疗是通过制作自患者自身的骨骼肌采集的成肌细胞的片并粘贴在患有心力衰竭的心脏表面来期待恢复心脏功能。通过该自身骨骼肌来源细胞片进行的心肌再生治疗由于使用患者自身的细胞而没有排斥反应，因而被认为是不易发生严重的室性心律失常等并发症。然而，存在如下缺陷：制备上花费成本和时间而无法应对紧急手术；由于使用自身组织来源的细胞而使制得的细胞片由于每个患者的差异而性状不同，得到的效果也不能说是恒定的；等。

另一方面，使用了生物体来源成分的纤维蛋白凝胶正用作止血剂、移植时的活体组织粘接剂、组织损伤涂膜剂等(参照专利文献2和3)。另外，还已知在纤维蛋白凝胶内含有有效成分的活体组织修复剂(参照专利文献4)。然而，该纤维蛋白凝胶是通过将作为前体的纤维蛋白原和凝血酶喷雾在患部表面上而在患部表面形成覆膜的物质，虽然可抑制浸润液自患部的泄漏、出血、可期待利用有效成分的组织损伤的治愈效果，但没有用于治疗由缺血性心肌病导致的严重的心力衰竭的例子。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2003-306434号公报

专利文献2：日本特开昭58-185162号公报

专利文献3：日本特开昭57-153645号公报

专利文献4：日本特开2004-161649号公报

技术实现要素：

发明要解决的问题

本发明是基于上述那样的情况而完成的，其目的在于提供在需要紧急手术的心力衰竭等疾病的治疗中发挥优异的效果，且对于大多数患者可以得到一定的效果的疾病治疗剂。

用于解决问题的方案

本发明人等为了解决上述课题而进行了深入研究，结果发现：对于心力衰竭等疾病，在对其进行手术时，通过将间充质干细胞悬浮于纤维蛋白原溶液或凝血酶溶液中，将得到的细胞悬浮液与在上述悬浮中未使用的纤维蛋白原溶液或凝血酶溶液实质上同时直接喷雾在疾病部位，从而能够显著改善心脏功能等。直接喷雾在疾病部位的溶液凝胶化并覆盖疾病部位，因此凝胶内的间充质干细胞能够充分地作用于疾病部位，发挥优异的治疗效果。本发明是基于这些见解而完成的。

即，为了解决上述课题而完成的发明如下：

[1]一种疾病治疗剂制备用试剂盒，其以各自独立的形态包含：a)纤维蛋白原溶液、b)凝血酶溶液和c)间充质干细胞。

[2]根据[1]所述的疾病治疗剂制备用试剂盒，其中，c)间充质干细胞相对于被检体为同种异体。

[3]根据[1]或[2]所述的疾病治疗剂制备用试剂盒，其在使用时，将c)间充质干细胞悬浮于a)纤维蛋白原溶液或b)凝血酶溶液中，将得到的细胞悬浮液与在上述悬浮中未使用的a)纤维蛋白原溶液或b)凝血酶溶液实质上同时直接喷雾在疾病部位而使用。

[4]根据[3]所述的疾病治疗剂制备用试剂盒，其中，上述直接喷雾的溶液在疾病部位上凝胶化而成为疾病治疗剂。

[5]根据[1]～[4]中任一项所述的疾病治疗剂制备用试剂盒，其中，c)间充质干细胞为经冷冻的细胞。

[6]根据[1]～[5]中任一项所述的疾病治疗剂制备用试剂盒，其中，上述疾病为内脏疾病或眼病。

[7]根据[1]～[6]中任一项所述的疾病治疗剂制备用试剂盒，其中，以在凝胶中包含1×10⁶～1×10⁹个细胞/ml的方式制备c)间充质干细胞。

[8]一种凝胶状的疾病治疗剂，其通过如下方式制备：将c)间充质干细胞悬浮于a)纤维蛋白原溶液或b)凝血酶溶液中，将得到的细胞悬浮液与在上述悬浮中未使用的a)纤维蛋白原溶液或b)凝血酶溶液实质上同时直接喷雾在疾病部位。

[9]一种凝胶状的疾病治疗剂的制备方法，其中，将c)间充质干细胞悬浮于a)纤维蛋白原溶液或b)凝血酶溶液中，再将得到的细胞悬浮液与在上述悬浮中未使用的a)纤维蛋白原溶液或b)凝血酶溶液实质上同时直接喷雾在疾病部位。

根据本发明的另一方案，提供一种心脏病等疾病的治疗方法，其将c)间充质干细胞悬浮于a)纤维蛋白原溶液或b)凝血酶溶液中，再将得到的细胞悬浮液与在上述悬浮中未使用的a)纤维蛋白原溶液或b)凝血酶溶液实质上同时直接喷雾在疾病部位。

发明的效果

根据本发明的疾病治疗剂制备用试剂盒，对于心力衰竭等疾病，在对其进行手术时，通过将间充质干细胞悬浮于a)纤维蛋白原溶液或b)凝血酶溶液中，再将得到的细胞悬浮液与在上述悬浮中未使用的a)纤维蛋白原溶液或b)凝血酶溶液实质上同时直接喷雾在疾病部位，从而能够显著地改善心脏等疾病部位的功能、结构等。由于上述间充质干细胞相对于同种异体的被检体也不易发生排斥反应，因此可以将对预先制备的供体的细胞进行扩大培养并冷冻保存的细胞作为本发明的疾病治疗剂制备用试剂盒中的间充质干细胞来使用。因此，与制备自身的间充质干细胞来使用的情况相比，还具有商品化也容易、且容易得到稳定的恒定效果这样的优点。

附图说明

图1是示出用于研究本发明的疾病治疗剂对于小型猪心肌梗塞模型的治疗效果的实验方案的图。

图2是示出用本发明的疾病治疗剂处理后的小型猪心肌梗塞模型的、通过超声心动进行的心脏功能评价的图。

图3是示出用本发明的疾病治疗剂处理后的小型猪心肌梗塞模型的、通过¹³n-nh3pet进行的心肌血流的评价的方案的图。

图4是示出用本发明的疾病治疗剂处理后的小型猪心肌梗塞模型的、冠状动脉血流储备的图。

图5是示出用本发明的疾病治疗剂处理后的小型猪心肌梗塞模型的、心肌固有的收缩功能(espvr)和舒张功能(edpvr)的图。

图6是示出用本发明的疾病治疗剂处理前和处理后的小型猪心肌梗塞模型的、mri的结果的图。

图7是示出凝胶中的源自细胞的hgf分泌量的图。

图8是示出凝胶中的源自细胞的vegf分泌量的图。

图9是示出凝胶中的源自细胞的sdf-1分泌量的图。

图10是示出凝胶中的细胞中的mrna表达量的图。

图11是示出使用了kn1输液的凝胶中的源自细胞的hgf、vegf分泌量的图。

图12是示出使用了乳酸林格氏液的凝胶中的、源自细胞的hgf、vegf分泌量的图。

图13是示出凝胶中的细胞和贴壁培养的细胞中的mrna表达量的图。

具体实施方式

以下对本发明的疾病治疗剂制备用试剂盒、疾病治疗剂、疾病治疗剂的制备方法等进行详细地说明。

＜疾病治疗剂制备用试剂盒＞

本发明的疾病治疗剂制备用试剂盒以各自独立的形态包含：a)纤维蛋白原溶液、b)凝血酶溶液和c)间充质干细胞。在使用时，将c)间充质干细胞悬浮于a)纤维蛋白原溶液或b)凝血酶溶液中，将得到的细胞悬浮液和在上述悬浮中未使用的a)纤维蛋白原溶液或b)凝血酶溶液实质上同时直接喷雾在疾病部位而使用。被喷雾的溶液在疾病部位上发生由凝血酶所致的纤维蛋白原的水解，产生纤维蛋白并形成纤维蛋白网而成为凝胶状。该成为凝胶状的疾病治疗剂覆盖疾病部位并通过其中包含的间充质干细胞的作用对各种疾病发挥优异的治疗效果。以下对构成本发明的各要件进行具体地说明。

[纤维蛋白原]

本发明中纤维蛋白原是共通体系凝血因子之一，是在血液凝固的最终阶段被凝血酶水解而转化为纤维蛋白而形成凝固性血栓的糖蛋白。在止血机构中起着重要的作用。例如，对于人而言是指凝血因子i。

本发明中的纤维蛋白原的取得方法没有特别限定，例如可列举出以下那样的方法。依据常规方法从血液或骨髓中分离血浆，并在中性附近、0℃左右的低温下以最终浓度为8％的方式添加乙醇而产生沉淀。通过采集产生的沉淀并溶解于ph6.4的0.05m磷酸缓冲液等中，用0.25m硫酸铵等进行再次沉淀而得到。另外，为了得到凝固性能更高的纤维蛋白原溶液而需要进一步添加其它凝血因子，因此从成本面、操作性的观点出发，作为优选的例子还可列举出：使血浆迅速冷冻、在5℃左右的低温下缓慢融解时得到出现的白色沉淀物(冷沉淀物)的方法。进而，作为本发明中的纤维蛋白原，还可以使用重组型纤维蛋白原。

[凝血酶]

本发明中凝血酶是指：与将纤维蛋白原转化为纤维蛋白的血液凝固相关的内切蛋白酶，例如对于人而言是指活化凝血因子ii这样的物质。

本发明中凝血酶的获得方法没有特别限定，例如可列举出以下那样的方法。利用如下方法得到凝血酶原：依据常规方法从血液或骨髓分离血浆，使硫酸钡、磷酸钙、氢氧化镁、氢氧化铝等盐类发挥作用后，用盐水、柠檬酸进行提取的方法；通过高压二氧化碳的作用使其游离的方法等。通过使活化第x因子和/或钙离子、磷脂质、活化第v因子作用于得到的凝血酶原而可以得到凝血酶。进而，作为本发明中的凝血酶，还可以使用重组型凝血酶。

[纤维蛋白原溶液和凝血酶溶液]

本发明中纤维蛋白原溶液是至少包含纤维蛋白原的溶液，在不损害本发明的效果的范围内还可以包含输液、培养基、缓冲液或其它成分。另外，本发明中凝血酶溶液是指至少使凝血酶溶解于适合的溶剂、优选为使其溶解于包含钙离子的溶剂中而成的溶液，在不损害本发明的效果的范围内，还可以包含输液、培养基、缓冲液或其它成分。另外，作为更简便地制备凝血酶溶液的方法，可列举出：在玻璃、陶瓷等的具有负电荷的表面的存在下，利用使钙离子和乙醇作用于血浆并去除析出的纤维蛋白块的方法，而得到含有钙离子的凝血酶溶液的方法。

为了使用本发明的疾病治疗剂制备用试剂盒来制备疾病治疗剂，且稳定地固定于疾病部位表面并充分地发挥治疗效果，而需要使纤维蛋白原溶液与凝血酶溶液在规定的浓度范围内接触。各浓度过低时，在疾病部位表面的固定化(凝胶化)花费长时间而不优选。为了喷雾后能够迅速凝胶化，例如，在将纤维蛋白原溶液和凝血酶溶液以等量喷雾时，作为纤维蛋白原的浓度，为0.1mg/ml～10g/ml、优选为0.5mg/ml～2.0g/ml、更优选为1mg/ml～500mg/ml、进一步优选为2mg/ml～200mg/ml、特别优选为5mg/ml～100mg/ml。作为凝血酶溶液的浓度(单位/ml)，为0.1单位/ml～10000单位/ml、优选为1单位/ml～2000单位/ml、更优选为5单位/ml～1000单位/ml、进一步优选为10单位/ml～500单位/ml。上述凝血酶的比活性的单位是日本药典中规定的单位。

[间充质干细胞]

本发明中间充质干细胞是指：具有分化为属于间充质系统的细胞(骨细胞、心肌细胞、软骨细胞、肌腱细胞、脂肪细胞等)的能力，并在维持该能力的同时能够增殖的细胞。本发明中使用的成为间充质干细胞的术语是指与基质细胞相同的细胞，不对两者进行特别区分。作为包含间充质干细胞的组织，例如可列举出：脂肪组织、脐带、骨髓、脐带血、子宫内膜、胎盘、真皮、骨骼肌、骨膜、牙囊、牙周组织、牙髓、牙胚等。因此，例如脂肪组织来源间充质干细胞是指脂肪组织中含有的间充质干细胞，还可称为脂肪组织来源基质细胞。这些当中，从通过本发明的疾病治疗剂的内脏疾病改善等作用效果的观点、及获得容易性的观点等出发，优选脂肪组织来源间充质干细胞、脐带来源间充质干细胞、骨髓来源间充质干细胞、胎盘来源间充质干细胞、牙髄来源间充质干细胞，更优选脂肪组织来源间充质干细胞、脐带来源间充质干细胞。

本发明中的间充质干细胞优选相对于被检体为同种同体或同种异体。由于间充质干细胞对于同种异体的被检体也不易发生排斥反应，因此可以将对预先制备的供体的细胞进行扩大培养并冷冻保存后的细胞作为本发明的疾病治疗剂制备用试剂盒中的间充质干细胞来使用。因此，从与制备自身的间充质干细胞来使用的情况相比商品化也容易且容易稳定地得到恒定效果这样的观点出发，本发明中的间充质干细胞更优选为同种异体。

另外，本发明中，间充质干细胞是指：包含间充质干细胞的任意的细胞群体。该细胞群体的至少20％以上、优选30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、93％、96％、97％、98％或99％为间充质干细胞。

本发明中脂肪组织是指：含有脂肪细胞和包含微血管细胞等的基质细胞的组织，例如，是将哺乳动物的皮下脂肪外科切除或吸引哺乳动物的皮下脂肪而得到的组织。脂肪组织可以由皮下脂肪获得。优选从与后述的脂肪组织来源间充质干细胞的给药对象为同种的动物获得、考虑到对人给药，更优选为人的皮下脂肪。皮下脂肪的供给个体可以是存活或死亡的，但本发明中使用的脂肪组织优选为从存活个体采集的组织。从个体采集时，吸脂例如可示例出：pal(动力辅助)吸脂、elconi激光吸脂或body-jet吸脂等，从维持细胞的状态这样的观点出发，优选不使用超声波。

本发明中脐带是连接胎儿和胎盘的白色的管状组织，由脐带静脉、脐带动脉、胶状组织(华顿氏胶；wharton’sjelly)、脐带基质本身等构成，富含间充质干细胞。脐带优选从与使用本发明的疾病治疗剂的被检体(给药对象)为同种的动物获得，考虑到将本发明的疾病治疗剂对人给药，更优选为人的脐带。

本发明中骨髓是指填充骨的内腔的实质组织(parenchyma)，为造血器官。骨髓中存在骨髓液，将存在于其中的细胞称为骨髓细胞。骨髓细胞中除了红细胞、粒细胞、巨核细胞、淋巴细胞、脂肪细胞等之外，包含间充质干细胞、造血干细胞、血管内皮祖细胞等。骨髓细胞例如可以由人髂骨、长骨或其它骨采集。

本发明中，所谓脂肪组织来源间充质干细胞、脐带来源间充质干细胞、骨髓来源间充质干细胞的各组织来源间充质干细胞是指：分别包含所谓脂肪组织来源间充质干细胞、脐带来源间充质干细胞、骨髓来源间充质干细胞的各组织来源间充质干细胞的任意的细胞群体。该细胞群体的至少20％以上、优选30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、93％、96％、97％、98％或99％为所谓脂肪组织来源间充质干细胞、脐带来源间充质干细胞、骨髓来源间充质干细胞的各组织来源间充质干细胞。

(间充质干细胞的制备方法)

该间充质干细胞可以通过本领域技术人员利用公知的方法来制备。以下作为一个例子对脂肪组织来源间充质干细胞的制备方法进行说明。脂肪组织来源间充质干细胞可以利用例如美国专利第6,777,231号中记载的制造方法得到，例如，可以利用包括以下的工序(i)～(iii)的方法来制造：

(i)通过酶消化脂肪组织而得到细胞悬浮物的工序；

(ii)使细胞沉淀，将细胞再悬浮于适合的培养基的工序；以及

(iii)在固体表面培养细胞，去除不显示出与固体表面结合的细胞的工序。

工序(i)中使用的脂肪组织优选使用经清洗的脂肪组织。清洗可以通过使用生理学允许的生理盐水溶液(例如磷酸缓冲盐水(pbs))，并剧烈地搅拌使其沉淀来进行。其原因在于，从组织中去除脂肪组织中包含的杂质(也称为残骸(debris)，例如损伤组织、血液、红细胞等)。因此，通常重复进行清洗和沉淀直至从上清液中整体上去除了残骸。残留的细胞以各种各样的尺寸的块的形式存在，因此为了将细胞本身的损伤抑制在最小限度并且使其解离，而优选用使细胞间结合变弱或破坏细胞间结合的酶(例如，胶原酶、分散酶或胰蛋白酶等)对清洗后的细胞块进行处理。这样的酶的量和处理期间依赖于所使用的条件而变化，在本技术领域中是已知的。可以替代这样的酶处理或组合地利用机械的搅拌、超声波能量、热能等其它处理法将细胞块分解，但为了将细胞的损伤抑制在最小限度而优选仅通过酶处理进行。使用了酶的情况，为了将对细胞的有害作用抑制在最小限度，期望的是在经过适合的期间后使用培养基等使酶失活。

通过工序(i)而得到的细胞悬浮物包含聚集状的细胞的浆料或悬浮物、以及各种夹杂细胞、例如红细胞、平滑肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞。接着，还可以分离、去除聚集状态的细胞和这些夹杂细胞，但由于通过后述的工序(iii)中的粘接和清洗来去除，因此可以省略该分离、去除。在分离、去除夹杂细胞时，可以通过将细胞强制分成上清液和沉淀的离心分离来实现。将包含得到的夹杂细胞的沉淀悬浮于生理学允许的溶剂中。虽然有悬浮状的细胞中包含红细胞的担心，但由于红细胞会通过后述的粘附于个体表面的选择而被排除，因此未必一定需要溶解的工序。作为选择性地溶解红细胞的方法，例如可以使用通过用氯化铵溶解在高渗培养基或低渗培养基中进行孵育等本技术领域中公知的方法。溶解后，还可以通过例如过滤、离心沉淀或密度分级从期望的细胞中分离溶解物。

工序(ii)中，对于悬浮状的细胞，为了提高间充质干细胞的纯度，还可以进行1次或连续多次清洗、离心分离，并再悬浮于培养基中。此外，还可以基于细胞表面标记物曲线或基于细胞的尺寸和颗粒性对细胞进行分离。

再悬浮时使用的培养基只要是能培养间充质干细胞的培养基就没有特别限定，这样的培养基还可以通过如下方式制作：在基础培养基中添加血清的和/或添加白蛋白、运铁蛋白、脂肪酸、胰岛素、亚硒酸钠、胆固醇、胶原蛋白前体、微量元素、2-巯基乙醇、3’-硫代甘油等中的1种以上的血清替代物。这些培养基还可以根据需要进一步添加脂质、氨基酸、蛋白质、多糖、维生素、生长因子、低分子化合物、抗生素、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂、无机盐类等物质。基础培养基例如可列举出：imdm培养基、medium199培养基、eagle’sminimumessentialmedium(emem)培养基、αmem培养基、dulbecco’smodifiedeagle’smedium(dmem)培养基、ham’sf12培养基、rpmi1640培养基、fischer’s培养基、mcdb201培养基和它们的混合培养基等。血清例如有人血清、胎牛血清(fbs)、牛血清、小牛血清、山羊血清、马血清、猪血清、绵羊血清、兔子血清、大鼠血清等，但不限定于这些。使用血清时，可以相对于基础培养基添加5v/v％～15v/v％、优选添加10v/v％。脂肪酸可示例出：亚油酸、油酸、亚麻酸、花生四烯酸、肉豆蔻酸、棕榈酸(palmitoylicacid)、棕榈酸(palmiticacid)和硬脂酸等，但不限定于这些。脂质可示例出：磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱等，但不限定于这些。氨基酸例如包括：l-丙氨酸、l-精氨酸、l-天冬氨酸、l-天冬酰胺、l-半胱氨酸、l-胱氨酸、l-谷氨酸、l-谷氨酰胺、l-甘氨酸等，但不限定于这些。蛋白质例如可示例出：大肠杆菌素、还原型谷胱甘肽、纤维连接蛋白和β2-微球蛋白等，但不限定于这些。多糖可示例出糖胺聚糖，糖胺聚糖中尤其可示例出透明质酸、硫酸乙酰肝素等，但不限定于这些。生长因子例如可示例出：血小板来源生长因子(pdgf)、碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)、转化生长因子β(tgf-β)、肝细胞生长因子(hgf)、表皮生长因子(egf)、结缔组织生长因子(ctgf)、血管内皮细胞生长因子(vegf)等，但不限定于这些。从将本发明中得到的脂肪来源间充质干细胞用于细胞移植这样的观点出发，优选使用血清等不包含异种来源成分(无异源，xeno-free)的培养基。这样的培养基例如以由promocell公司、lonza公司、biologicalindustries公司、veritas公司、r&dsystems公司、corning公司和rohto公司等作为间充质干细胞(基质细胞)用预先制备的培养基的形式提供。

接着，工序(iii)中，对于工序(ii)中得到的细胞悬浮液中的细胞，不使之分化而在固体表面上、在适合的细胞密度和培养条件下使用上述的适合的细胞培养基对其进行培养。本发明中，“固体表面”是指：能够结合本发明中的脂肪组织来源间充质干细胞的任意的材料。在特定的方式中，这样的材料是为了促进哺乳类细胞与该表面的结合而经处理的塑料材料。具有固体表面的培养容器的形状没有特别限定，可适宜地使用培养皿、烧瓶等。为了去除非结合状态的细胞和细胞的碎片，在孵育后清洗细胞。

本发明中，可以选择最终以与固体表面结合的状态滞留的细胞作为脂肪组织来源间充质干细胞的细胞群体。

对于所选择的细胞，为了确认为本发明中的脂肪组织来源间充质干细胞，还可以使用流式细胞术等利用现有的方法对表面抗原进行解析。进而，还可以对分化为各细胞系列的能力进行检测，这样的分化可以利用现有的方法进行。

本发明中的间充质干细胞可以如上所述进行制备，但还可以定义为具有以下特性的细胞；

(1)在标准培养基中的培养条件下，对塑料显示出粘接性、

(2)表面抗原cd44、cd73、cd90为阳性，cd31、cd45为阴性、和

(3)在培养条件下能分化为骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞。

(冷冻保存)

本发明中的间充质干细胞只要具备疾病治疗效果就可以是适宜重复进行了冷冻保存和融解的细胞。本发明中，冷冻保存可以通过如下方式进行：本领域技术人员将间充质干细胞悬浮于公知的冷冻保存液中进行冷却。悬浮可以通过如下方式进行：利用胰蛋白酶等剥离剂使细胞剥离，转移至冷冻保存容器中进行适宜处理后，加入冷冻保存液。

冷冻保存液作为冷冻保护剂还可以含有二甲基亚砜(dmso：dimethylsulfoxide)，但dmso除了细胞毒性之外还具有分化诱导间充质干细胞的特性，因此优选减少dmso含量。作为dmso的替代物，可示例出：丙三醇、丙二醇或多糖类。使用dmso时，含有5v/v％～20v/v％、优选含有5v/v％～10v/v％、更优选含有10v/v％。此外还可以包含wo2007/058308中记载的添加剂。作为这样的冷冻保存液，例如还可以使用由bioverdeinc.、nippongeneticsco,ltd.、reprocellinc.、zenoaq公司、cosmobioco.,ltd.、kohjinbioco.,ltd.、thermofisherscientificinc.等提供的冷冻保存液。

冷冻保存上述悬浮的细胞时，在-80℃～-100℃之间的温度(例如，-80℃)下保管为宜，可以使用能达到该温度的任意的冷冻仪来进行。没有特别限定，为了避免急剧的温度变化，还可以使用程序冷冻仪来适宜控制冷却速度。冷却速度可以根据冷冻保存液的成分进行适宜选择，可以依据冷冻保存液的制造者指示来进行。

保存期间只要在上述条件下经冷冻保存的细胞融解后保持与冷冻前同等性质就没有特别限定，例如可列举出：1周以上、2周以上、3周以上、4周以上、2个月以上、3个月以上、4个月以上、5个月以上、6个月以上、1年以上或更长时间。通过在更低的温度下保存而能够抑制细胞毒性，因此还可以移至液氮上的气相(从-150℃以下至-180℃以下)中进行保存。在液氮上的气相中保存时，可以使用本领域技术人员公知的保存容器来进行。没有特别限定，例如保存2周以上时，优选在液氮上的气相中进行保存。

融解的间充质干细胞还可以适宜培养至接下来的冷冻保存。间充质干细胞的培养使用能培养上述的间充质干细胞的培养基进行，没有特别限定，还可以在30～40℃、优选为在约37℃的培养温度下、在含有co2的空气气氛下进行。co2浓度为2～5％、优选为约5％。在培养时，在相对于培养容器到达适合的汇合(例如可列举出相对于培养容器，细胞占50％至80％的情况)后，还可以通过胰蛋白酶等剥离剂使细胞剥离，以适合的细胞密度接种于另行准备的培养容器中继续进行培养。在接种细胞时，作为典型的细胞密度，可示例出：100细胞/cm²～100000细胞/cm²、500细胞/cm²～50000细胞/cm²、1000～10000细胞/cm²、2000～10000细胞/cm²等。在特定的方式中，细胞密度为2000～10000细胞/cm²。优选以到达适合的汇合为止的期间为3天～7天的方式进行调节。在培养时，还可以根据需要适宜更换培养基。

经冷冻保存的细胞的融解可以通过本领域技术人员利用公知的方法来进行。例如可示例出通过在37℃的恒温槽内或热水浴中静置或振荡来进行的方法。

本发明的c)间充质干细胞可以是任意状态的细胞，例如可以是将培养中的细胞剥离并回收的细胞，还可以是在冷冻保存液中已冷冻的状态的细胞。使用将扩大培养而得到的相同批次的细胞分成小部分进行冷冻保存后的细胞时，在得到稳定的作用效果方面、操作性优异方面等是优选的。冷冻保存状态的间充质干细胞可以在即将使用之前进行融解并悬浮于冷冻保存液的状态下直接混合在上述纤维蛋白原溶液或凝血酶溶液中，或还可以悬浮于输液或培养基后，混合在上述纤维蛋白原溶液或凝血酶溶液中。另外，可以利用离心分离等方法去除冷冻保存液后直接混合在上述a)纤维蛋白原溶液或b)凝血酶溶液中，或还可以悬浮于输液或培养基中后，混合在上述a)纤维蛋白原溶液或b)凝血酶溶液中。此处，本发明中的“输液”是指：对人进行治疗时所使用的溶液，没有特别限定，例如可列举出：生理盐水、日本药典生理盐水、5％葡萄糖液、日本药典葡萄糖注射液、林格氏液、日本药典林格溶液、乳酸林格氏液、乙酸林格氏液、1号液(初始溶液)、2号液(脱水补充剂)、3号液(维持液)、4号液(术后恢复液)等。

使间充质干细胞悬浮可以在a)纤维蛋白原溶液中或在b)凝血酶溶液中进行。作为此时的细胞浓度，从对疾病的治疗效果、制备的容易度等的观点出发，为1×10⁵个/ml～5×10⁹个/ml、优选为5×10⁵个/ml～1×10⁹个/ml、更优选为1×10⁶个/ml～5×10⁸个/ml。

本发明的疾病治疗剂制备用试剂盒中，c)间充质干细胞的用量(给药量)可以根据患者的状态(体重、年龄、症状、身体状况等)、及本发明的内脏疾病治疗剂等而不同，从发挥充分的内脏疾病治疗效果的观点出发，有其量优选大量的倾向，另一方面，从抑制副作用的表现的观点出发，有其量优选小量的倾向。通常，在对成人给药时，为1×10³～1×10¹²个/次、优选为1×10⁴～1×10¹¹个/次、更优选为1×10⁵～1×10¹⁰个/次、进一步优选为5×10⁵～1×10⁹个/次、特别优选为1×10⁶个/次～5×10⁸个/次。需要说明的是，可以将本用量作为1次量来进行多次给药，还可以将本用量分成多次进行给药。

本发明的疾病治疗剂制备用试剂盒可以与1种或2种以上的其它药剂一同给药。作为其它药剂，可列举出可以用作心脏疾病的治疗药的任意药剂，例如可列举出：ace抑制药、血管紧张素ii受体拮抗剂、β阻滞剂、抗血小板药物、华法林、钙拮抗剂、硝酸药、利尿剂、hmg-coa还原酶抑制药、盐酸胺碘酮等。

本发明的疾病治疗剂制备用试剂盒只要在不损害本发明的效果的范围内就可以根据其用途、形态，按照常规方法含有药学上可接受的载体、添加物。作为这样的载体、添加物，例如可列举出：等渗剂、增稠剂、糖类、糖醇类、防腐剂(保存剂)、杀菌剂或抗菌剂、ph调节剂、稳定化剂、螯合剂、油性基质、凝胶基质、表面活性剂、悬浮化剂、结合剂、赋形剂、润滑剂、崩解剂、发泡剂、流动化剂、分散剂、乳化剂、缓冲剂、助溶剂、抗氧化剂、甜味剂、酸味剂、着色剂、呈味剂、香料或清涼化剂等，但不限定于这些。

(喷雾用器具)

本发明的疾病治疗剂制备用试剂盒还可以包含：在将包含间充质干细胞的a)纤维蛋白原溶液或b)凝血酶溶液与上述悬浮中未使用的a)纤维蛋白原溶液或b)凝血酶溶液与喷雾在疾病部位时使用的喷雾器具。作为上述喷雾器具，没有特别限定，可以使用例如在市售的注射用注射器上带有12g～24g左右的注射针的器具。另外，还可以使用：在本发明的疾病治疗剂制备用试剂盒中组合2根注射器并在即将喷雾之前混合两种溶液的方式而制成的喷雾器具。

(疾病治疗剂制备用试剂盒的制作方法)

可以分别将封入各自的容器中的纤维蛋白原溶液、凝血酶溶液和封入内旋盖冻存管等冷冻用管中的间充质干细胞悬浮液、喷雾用器具等组合而制成疾病治疗剂制备用试剂盒。纤维蛋白原溶液、凝血酶溶液优选冷藏保存，间充质干细胞悬浮液优选冷冻保存。需要说明的是，还可以在不损害本发明的效果的范围内组合使用其它添加剂等。进而，本试剂盒中还可以包含说明书。

(疾病治疗剂制备用试剂盒的使用方法)

本发明的疾病治疗剂制备用试剂盒的使用方法不限定于特定的方法，例如可以如下那样来使用。以下的制备需要在即将进行手术等使用之前进行。

将冷冻状态的间充质干细胞在4～50℃、优选在室温～40℃、更优选在室温～37℃下加热并融解，可以得到悬浮于冷冻保存液中的状态的间充质干细胞。在其中添加并混合适量纤维蛋白原溶液。另外，称取适量的凝血酶的高浓度溶液并添加至包含钙的溶剂中。作为溶剂，优选输液、培养基或缓冲液。纤维蛋白原与凝血酶的比率相对于凝血酶10单位，纤维蛋白原为0.01～500mg、优选为0.1～50mg、更优选为0.3～30mg、进一步优选为0.5～10mg、特别优选为1～3.5mg。将各自的溶液填充至喷雾用的注射器中，将两种溶液实质上同时喷雾在疾病部位并使其凝胶化。此处，“实质上同时喷雾”除了从各自的注射器将各自的溶液同时喷雾在疾病部位的情况之外，还包括：错开任意的时间进行喷雾的情况；在即将喷雾之前混合两种溶液，进行凝胶化之前喷雾在疾病部位的情况。

上述得到的凝胶需要进行配方调整以显示出适合的强度。作为本发明的疾病治疗剂的凝胶(组合物)的强度为10²～10⁸达因/cm²、更优选为10³～10⁷达因/cm²、进一步优选为10⁴～10⁶达因/cm²。另外，凝胶(组合物)的粘度为优选为0～100厘泊、更优选为0～50厘泊、进一步优选为25～40厘泊。另一方面，优选的凝胶化时间为低于60秒、更优选为低于30秒、进一步优选为低于15秒、特别优选为低于5秒。

上述直接喷雾在疾病部位时的压力为0.005～1.0mpa、优选为0.01～0.7mpa、更优选为0.02～0.5mpa。直接喷雾在疾病部位时的喷雾速度为0.01～10ml/秒、优选为0.05～5.0ml/秒、更优选为0.5～1.0ml/秒。直接喷雾在疾病部位时的喷雾形状可以是任何形状，没有特别限定，从容易覆盖疾病部位这样的观点出发，期望的是圆形，从安全性和能够制备均匀的凝胶这样的观点出发，其范围为直径7cm、优选为直径5cm、更优选为直径3cm。需要说明的是，从凝胶中分泌2天以上、优选为3天以上、更优选为4天以上体液因子。作为上述体液因子，可示例出：hgf、vegf、sdf-1、hif-1、cxcl-12等。另外，可以确认凝胶中的细胞存活3天以上、优选5天以上、更优选7天以上。

使用本发明的疾病治疗剂制备用试剂盒制备的凝胶状的疾病治疗剂包含间充质干细胞，因此可以适宜地用于各种疾病的治疗。例如优选对于内脏疾病具体而言：心脏病、胃/十二指肠疾病、小肠/大肠疾病、肝疾病、胆道疾病、胰脏疾病、肾疾病、肺疾病、纵隔胸膜疾病、横隔胸膜疾病、胸膜疾病、腹膜疾病和眼病来使用。

作为具体的疾病，例如可列举出：心肌梗塞、心力衰竭、心律不齐、心悸、心肌病、缺血性心肌病、心绞痛、先天性心脏病、心脏瓣膜病、心肌炎、家族性肥厚型心肌病、舒张型心肌症、急性冠脉综合征、动脉粥样硬化血栓形成、再狭窄等心脏病；急性胃炎、慢性胃炎、胃/十二指肠溃疡、胃癌、十二指肠癌等胃/十二指肠疾病；缺血性肠炎、溃疡性大肠炎、crohn病、单纯性溃疡、肠白塞病、小肠癌、大肠癌等小肠/大肠疾病；重型肝炎、慢性肝炎、病毒性肝炎、酒精性肝炎、肝纤维化、肝硬化、肝癌、自身免疫性肝炎、脂肪肝、药剂过敏性肝损伤、血色沉着病、含铁血黄素沉着症、血铜蓝蛋白缺乏症、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、胆道闭锁、肝脓疡溃、慢性活动性肝炎、慢性持续性肝炎等肝疾病；急性胆嚢炎、急性胆管炎、慢性胆嚢炎、胆管癌、胆嚢癌等胆道疾病；急性胰腺炎、慢性胰腺炎、胰腺癌等胰脏疾病；急性肾炎、慢性肾炎、急性肾功能衰竭、慢性肾功能衰竭等肾疾病；肺炎、肺气肿、肺纤维化、间质性肺炎、肺动脉高压、肺结核、肺结核后遗症、急性呼吸窘迫综合征、囊肿性纤维化、肺慢性阻塞性疾病、尘肺、吞咽性肺炎肺纤维化、急性上呼吸道感染、慢性下呼吸道感染、气胸、肺胞上皮细胞中发现损伤的疾病等肺疾病等；纵隔肿瘤、纵隔囊性疾病、纵隔炎等纵隔胸膜疾病；膈疝等横隔胸膜疾病；胸膜炎、脓胸、胸膜肿瘤、癌性胸膜炎、胸膜间皮瘤等胸膜疾病；腹膜炎、腹膜肿瘤等腹膜疾病；stevens-johnson综合征、眼天疱疮、热化学创伤、中毒性表皮坏死(ten)、翼状胬肉、眶蜂窝组织炎、视网膜脱离等眼病。这些当中，优选确认得到了充分的治疗效果的心脏病，其中，可以更适宜地用于心肌梗塞、心力衰竭的治疗。

使用了本发明的疾病治疗剂制备用试剂盒的给药对象可列举出浆膜、黏膜、结膜、角膜上皮等，优选浆膜和黏膜、更优选浆膜。使用了本发明的疾病治疗剂制备用试剂盒的给药途径可列举出：向脏器表面的直接给药、黏膜面给药、浆膜面给药、脏器内给药、经口给药、皮下给药、肌肉内给药、静脉内给药、动脉内给药、髓腔内给药、舌下给药、经直肠给药、经腟给药、眼内给药、经鼻给药、吸入、经皮给药等，从本发明的疾病治疗剂的有效性的观点出发，优选为向脏器表面的直接给药、黏膜面给药、浆膜面给药、脏器内给药，从减轻对象者的负担的观点出发，更优选为向脏器表面的直接给药。

使用疾病治疗剂制备用试剂盒制备的凝胶状的疾病治疗剂的给药量是：与未给药的被检者相比，向被检者给药的情况下能够得到对疾病治疗效果的量。具体的给药量可以根据被检者的年龄、体重、疾病的程度、症状等进行适宜确定，作为一个例子，以脂肪组织来源间充质干细胞数计、在手术时优选向疾病部位的每1部位给药(喷雾)1×10⁶～1×10⁹个，还可以将其给药(喷雾)在多个部位，还可以进行多次给药(喷雾)。

＜疾病治疗剂＞

使用上述的疾病治疗剂制备用试剂盒制备的疾病治疗剂也包含于本发明中。即，本发明的疾病治疗剂是通过如下方式制备的凝胶状的疾病治疗剂：将间充质干细胞悬浮于纤维蛋白原溶液中，再将得到的细胞悬浮液与凝血酶溶液实质上同时直接喷雾在疾病部位，或者将间充质干细胞悬浮于凝血酶溶液中，再将得到的细胞悬浮液与纤维蛋白原溶液实质上同时直接喷雾在疾病部位。对于本发明的疾病治疗剂的具体的内容，可以适用上述的疾病治疗剂制备用试剂盒的项目中的说明。

＜疾病治疗剂的制备方法＞

使用上述的疾病治疗剂制备用试剂盒来制备疾病治疗剂的方法也包含在本发明中。即，本发明的疾病治疗剂的制备方法是通过如下方式制备的凝胶状的疾病治疗剂的制备方法：将间充质干细胞悬浮于纤维蛋白原溶液中，再将得到的细胞悬浮液与凝血酶溶液实质上同时直接喷雾在疾病部位，或者将间充质干细胞悬浮于凝血酶溶液中，再将得到的细胞悬浮液与纤维蛋白原溶液实质上同时直接喷雾在疾病部位。对于本发明的疾病治疗剂的制备方法的具体的内容，可以适用上述的疾病治疗剂制备用试剂盒使用方法的项目中的说明。

＜疾病治疗方法＞

根据本发明的另一方案，可提供一种内脏疾病等疾病的治疗方法，其将c)间充质干细胞悬浮于a)纤维蛋白原溶液中，再将得到的细胞悬浮液与b)凝血酶溶液实质上同时直接喷雾在疾病部位；或者将c)间充质干细胞悬浮于b)凝血酶溶液中，再将得到的细胞悬浮液与a)纤维蛋白原溶液实质上同时直接喷雾在疾病部位。根据本发明的治疗方法，对于内脏疾病，在进行其手术时，通过将c)间充质干细胞悬浮于a)纤维蛋白原溶液中，将得到的细胞悬浮液和b)凝血酶溶液或c)间充质干细胞悬浮于b)凝血酶溶液中，将得到的细胞悬浮液和a)纤维蛋白原溶液实质上同时直接喷雾在疾病部位，从而能够显著地改善内脏等疾病部位的功能等。对于本发明的治疗方法，由于具有内脏疾病等的患者的术后恢复快、以及可进行仅通过局部麻醉的手术，因此从将患者的切口抑制得较小的观点出发，优选使用了导管的给药。

实施例

通过以下的实施例对本发明进行具体地说明，但本发明不限定于实施例。

[1]本发明的疾病治疗剂的制备

脂肪组织来源间充质干细胞的制备

获得人供体的同意后，用生理盐水清洗利用吸脂法得到的皮下脂肪组织。为了实现细胞外基质的破坏和细胞的分离，添加胶原酶(roche公司)(溶剂为生理盐水)，在37℃下振荡90分钟使其分散。接着，将该上述悬浮液以800g进行5分钟离心分离而得到间质血管细胞群的沉淀。在上述细胞的沉淀中加入间充质干细胞用无血清培养基(rohto公司)，将该细胞悬浮液以400g进行5分钟离心分离，去除上清液后再悬浮于间充质干细胞用无血清培养基(rohto公司)中，将细胞接种于烧瓶中。将细胞在37℃下5％co2中培养数天。数天后用pbs清洗培养物来去除培养液中包含的血球、脂肪组织的残留等，得到贴壁于塑料容器中的间充质干细胞。

脂肪组织来源间充质干细胞的冷冻保存

使用胰蛋白酶将得到的脂肪组织来源间充质干细胞剥离，转移至离心管中，以400g进行5分钟离心分离而得到细胞的沉淀。去除上清液后加入适量细胞冷冻保存液(stem-cellbanker(zenoaq公司))使其悬浮。将该细胞悬浮溶液分注于内旋盖冻存管中后，在冷冻仪内以-80度保存，然后转移至液氮上的气相中继续进行保存。

细胞表面标记物的解析(流式细胞术)

脂肪组织来源间充质干细胞上的各种表面标记物的评价通过流式细胞术来实施。将脂肪组织来源间充质干细胞再悬浮于facs染色用缓冲剂中。用于facs分析的抗体为fitc(异硫氰酸荧光素)或pe(藻红蛋白)标识的小鼠抗人抗体cd11b、cd45、cd73、cd90和相当的小鼠igg1同型对照抗体。对细胞在室温下进行30分钟染色，接着进行清洗，使用bdfacscantoii(bdbiosciences、sanjose、ca)进行解析。数据使用facsdivasoftware(bdbiosciences)进行分析。其结果，脂肪组织来源间充质干细胞的cd45为阴性，cd73、cd90为阳性。

喷雾用治疗剂的制备

喷雾用的纤维蛋白原溶液和凝血酶溶液使用pcombi-settissueadhesion(cslbehringco,ltd.)来制备。纤维蛋白原溶液(beriplasta液)包含纤维蛋白原80mg/ml、凝血因子xiii60iu和牛抑肽酶5000kie。凝血酶溶液(beriplastb液)包含凝血酶300单位/ml。具体而言，脂肪组织来源间充质干细胞在即将喷雾之前进行解冻，悬浮于下述表1所示的量的hbss(x1)中，然后添加beriplasta液而制备了溶液a。另外，在下述表1所示的量的hbss(x1)中添加beriplastb而制备了溶液b。分别将这些溶液封入不同的注射器内进行准备，用于下述的移植试验。

[表1]

[2]移植试验

移植试验的方案

将ameroid缩窄器(ameroidconstrictor)导入12只雌小型猪(20-25kg重量)的冠状动脉左前降支，使其出现心肌梗塞。将小型猪随机分为2个处置组(各n＝6)：脂肪组织来源间充质干细胞移植用(adsc组)或伪手术用(对照)中的任一者。导入ameroid缩窄器4周后实施了上述喷雾用治疗剂的给药(脂肪组织来源间充质干细胞的移植)或伪手术中的任一者。

将adsc组的小型猪开胸后，将分别封入至不同的注射器内的上述表1所示的组成的溶液a和b同时直接喷雾在患有心肌梗塞的部位的表面(心脏表面)来覆盖疾病部位。所喷雾的混合溶液在被喷雾后立即凝胶化。伪手术中，仅进行开胸，未进行上述喷雾用治疗剂的给药(脂肪组织来源间充质干细胞的移植)。

在移植前(基线)、移植后4周、8周，实施了超声的心动描记法(ultrasoniccardiography)、mri、nh3-pet和心导管插入术。在该项研究的最末期，为了对动物进行心脏组织的组织学和生化学分析而在细胞移植8周后进行了人道主义处死。所有的动物均未被免疫抑制。以下对移植试验进行详细地说明。

心肌梗塞模型猪的制作和脂肪来源间充质干细胞移植实验

用盐酸氯胺酮(20mg/kg；daiichisankyo、tokyo、japаn)和赛拉嗪(2mg/kg；bayerheаlthcаre、leverkusen、germаny)对12只雌小型猪(20-25kg重量)进行预麻醉，进行气管内插管，通过丙泊酚(6mg/kg/h；astra-zenecak.k.,osаkаjapаn)和维库溴铵(0.05mg/kg/h；daiichisankyo)的连续回流来维持全身麻醉。通过第4肋间并利用左开胸术使心包腔露出。将ameroid缩窄器(cor-2.50-ss；researchinstrumentssw，escondido，ca)配置在左冠状动脉回旋支的分支点附近的冠状动脉左前降支(lad)的周围，将肌肉和皮肤层状地缝合。然后，在控制了温度的笼中使小型猪恢复。

导入ameroid缩窄器4周后，在全身麻醉下进行胸骨正中切口，实施了脂肪组织来源间充质干细胞移植或伪手术中的任一者。基于表面的瘢痕和异常的壁运动能够在视觉上确认患有心肌梗塞的部位。具体而言，对于adsc组，将分别封入在不同的注射器内的上述表1所示的组成(包含1×10⁸个脂肪组织来源间充质干细胞)的溶液a和b同时直接喷雾在患有心肌梗塞的部位的表面(心脏表面)来覆盖疾病部位。将喷雾的混合溶液喷雾后立即凝胶化。在控制了温度的笼中使小型猪恢复。

脂肪组织来源间充质干细胞移植的效果

利用超声的心动描记法、mri、nh3-pet和心导管插入术评价了上述喷雾用治疗剂(脂肪组织来源间充质干细胞的移植)对心肌梗塞模型猪的效果。以下对各自的评价方法进行说明。

(超声的心动描记法)

如上所述对小型猪进行了麻醉。超声波心脏检测使用市售的超声机器(hitachi:prosoundf75premiercv)来实施。将8.0-mhz的环形阵列换能器用于心脏评价。小型猪以左侧卧位进行检测。测定了lv舒张末期和收缩末期直径(分别为lvdd和lvds)。另一方面，基于teichholz公式计算出lv舒张末期和收缩终末期容积(lvedv和lvesv)。基于下述的式计算出左室射血分数(lvef)。将结果示于图2。

lvef(％)＝100×(lvedv-lvesv)/(lvedv)

如图2所示，使用了上述喷雾用治疗剂的(脂肪组织来源间充质干细胞的移植)小型猪观察到心输出量的改善。

(¹³n-nh3-pet)

依据图3所示的方案，通过¹³n-nh3-pet进行了心肌血流的评价。¹³n-nh3-pet数据依据1-d单次测试的应激-静息的方案来进行。即，进行对外周静脉的腺苷刺激和700～900mbq的¹³n-nh3的静脉内给药，为了进行高级pet扫描仪(headtomev/set2400w；岛津株式会社制)的衰减校正，进行了透射扫描。用10分钟以180ug/kg/分钟注入腺苷，在进行该刺激的过程中开始进行扫描。

数据分析

源自¹³n-nh3-pet图像的心肌血流量值(mbf)的计算使用市售的pmod软件包进行(版本3.4、pmodtechnologiesllc.、瑞士苏黎世)。与垂直方向和水平方向的长轴的方向同样地、在短轴上也进行再切片(slice)并再次构建图像。对右心室腔、左心室腔和左心室的心肌所需的区域进行自动解析，为了避免源自外部的污染，由心脏解剖学经验丰富的技术人员根据需要进行了最小限度的修改。局部的¹³n-nh3摄取使用美国心脏协会17段模型进行了评价。使由动态帧生成的心肌和血池的时间-活性曲线适于示踪动力学模型。采用了以不存在代谢阱为前提的degrado1室模型。在各段和区域表达静息mbf和应激mbf，以应激mbf与静息mbf之比的形式计算出心肌血流储备分数(mfr)。可认为：mfr若为2.5以上则为正常，若为2.0至2.5则为灰区、若为低于2.0则为降低。对治疗前和治疗后的mfr进行了比较。

如图4所示，使用了上述喷雾用治疗剂的(脂肪组织来源间充质干细胞的移植)小型猪中，在lad区域观察到约50％的冠状动脉血流储备的改善。

(心导管插入术)

在预处置和处置后8周，将小型猪麻醉并进行换气。将止血带设置于下大静脉下而改变了lv前负载。通过预处置使电导和压力顶端导管(pv组合导管：ca-41063-pn，4fr)经过右心动脉，移植后8周朝向主动脉瓣经过lv心尖部插入左心室内。安装了电导系统和压力传感器控制器(conductntsigma5dfplusanalysissystem：cfl-m)。电导、压力和心腔内心电图信号通过inca软件(cdleycom，neth)进行分析。对于基线，在最初稳定的血流状态下测定的、接着在下大静脉闭塞期间拉动压力-容积环来进行分析。计算出以下的指数：dp/dtmax、dp/dtmin、等容舒张的时间常数(τ)、舒张期末压-容积关系(edpvr)和收缩期末压-容积关系(espvr)。将结果示于图5。

*pv组合导管(ca-41063-pn，4fr)

*conductntsigma5dfplusanalysissystem(cfl-m)

*cdleycomneth。

如图5所示，使用了上述喷雾用治疗剂的(脂肪组织来源间充质干细胞的移植)小型猪与对照组相比，收缩功能和舒张功能得以维持。

(核磁共振图像诊断法：mri)

对猪进行肌肉内注射氯胺酮10mg/kg+赛拉嗪2mg/kg和阿托品1a使其镇静化。镇静化后剃掉猪的毛，并插入气管。在将猪设置于核磁共振图像诊断(mri)室的检测台之前插入外周静脉线。以仰卧位位置连接麻醉机器的分配管和气管，然后使心电图电线与胸部连接。使用异氟醚作为麻醉剂，并将浓度维持在1-2％。将线圈安装在胸部区域上方并将猪移动至mri装置(sigmaexcitexitwinspeed1.5tver.11.1、gehealthcare)的隧道中。

实施了表示心脏的活动的cinemri以及使用钆强化的延迟造影mri这两种类型的图像拍摄。cinemri中，心脏区域的图像通过使用2维fiesa成像沿着轴截面片段地来获得。基于上述收集的数据，使用2dfiesa成像从左心室的心尖部起沿着基底获得每次心跳的20个片段。基于收集的数据选择舒张期相，并使用从心尖部覆盖二尖瓣区域的主轴片段，得到使用2dfiesa成像的图像。基于纵片段的数据，选择在舒张期得到的片段，然后使用与左心室的长轴垂直的片段。使用2dfiesa成像以6～8mm的间隔由心脏的心尖部得到10～12片(短轴片)。延迟造影mri中，使用了fastgre的图像在给药强化剂(欧乃影静脉注射32％、0.25ml/kg)后5～15分钟得到。以高信号强度示出梗塞区域和纤维形成区域；这些区域应与正常区域在视觉上有所不同。对于每只猪，基于数据库检索对基线和随访的四个腔室图像、两个腔室图像、短轴图像和在乳头肌水平上的长轴图像以供进一步分析。进行通过舒张末期帧的心内膜轮廓的人工追踪后，献呈的软件(tomtec公司)自动追踪图像回放的其它帧上的内、外膜轮廓。实时地证实了适合的追踪，调整对象的区域来校正轮廓或者主动地校正轮廓。通过这些调整，2d-strain软件最终追踪了所有猪中lv心肌的16个划分。在所有的图像中在收缩末期对峰的收缩期的经度、辐射状和周边的应变进行测定并平均化。

如图6所示，使用了上述喷雾用治疗剂的(脂肪组织来源间充质干细胞的移植)小型猪与对照组相比，ef(％)值、纵向应变，均得以维持。

[3]由脂肪组织来源间充质干细胞分泌的分泌因子1

与体内实验同样地将脂肪组织来源间充质干细胞用纤维蛋白原和凝血酶加工成接枝状(凝胶状)。具体而言，将包含beriplast(注册商标)p组合套装组织粘接用3ml制剂(cslbearing株式会社)a液(纤维蛋白原)14μl、hbss(gibco、cat.no：14174-103、lot：1776567)6μl和脂肪组织来源间充质干细胞1×10⁶个细胞的a液制备液滴加在疏水性6孔板的各孔((thermoscientific、140675)上，边混合边向成为水滴的a液制备液中加入包含beriplast(注册商标)p组合套装组织粘接用3ml制剂(cslbearing株式会社)b液(凝血酶)14μl和hbss(gibco、cat.no：14174-103、lot：1776567)6μl的b液制备液，制备了凝胶。将凝胶设置于6孔clearmultiple孔板(corning(注册商标)cellbind(注册商标)、3335)中，加入5ml的培养基(mscgmbulletkit(mscgmmesenchymalstemcellgrowthmediumbulletkit)、lonza公司制、cat.no：pt-3001)，在co2孵化器内(37℃、5％co2)中进行培养，72小时后收集了该上清液。利用elisa法(elisa试剂盒(quantikineelisahumanhgf(r&dsystem、cat.no：dhg00)、quantikineelisahumanvegf(r&dsystem、cat.no：dhe00))测定采集的培养上清液中的细胞因子。确认了脂肪组织来源间充质干细胞在上述凝胶中分泌了vegf、hgf。

[4]由脂肪组织来源间充质干细胞分泌的分泌因子2

与上述同样地使用包含beriplast(注册商标)p组合套装组织粘接用3ml制剂(cslbearing株式会社)a液(纤维蛋白原)140μl、hbss(gibco、cat.no：14174-103、lot：1776567)60μl和脂肪组织来源间充质干细胞5×10⁶个细胞的a液制备液以及包含beriplast(注册商标)p组合套装组织粘接用3ml制剂(cslbearing株式会社)b液(凝血酶)140μl和hbss(gibco、cat.no：14174-103、lot：1776567)60μl的b液制备液，制备凝胶后，在5ml的培养基中培养6小时、24小时、48小时、72小时，然后收集了该上清液。利用elisa法(elisa试剂盒(quantikineelisahumanhgf(r&dsystem、cat.no：dhg00)、quantikineelisahumanvegf(r&dsystem、cat.no：dhe00))测定了采集的培养上清液中的细胞因子。确认了脂肪组织来源间充质干细胞在上述凝胶中，从6小时～72小时后持续分泌了vegf、hgf。

[5]由脂肪组织来源间充质干细胞分泌的分泌因子3

使用包含beriplast(注册商标)p组合套装组织粘接用3ml制剂(cslbearing株式会社)a液(纤维蛋白原、以下称为“a液”)6μl、hbss(gibco、cat.no：14174-103、lot：1776567、以下称为“hbss”)14μl和脂肪组织来源间充质干细胞1×10⁶个细胞的a液制备液以及包含beriplast(注册商标)p组合套装组织粘接用3ml制剂(cslbearing株式会社)b液(凝血酶、以下称为“b液”)6μl和hbss14μl的b液制备液，制备凝胶(凝胶样品1)。同样地，使用包含a液20μl和脂肪组织来源间充质干细胞1×10⁶个细胞的a1液制备液和包含b液2μl和hbss18μl的b1液制备液，制备了凝胶样品2；使用包含a液4.5μl、hbss15.5μl和脂肪组织来源间充质干细胞1×10⁶个细胞的a2液制备液以及包含b液6.5μl和hbss11.5μl的b液制备液，制备了凝胶样品3。在5ml的培养基中培养凝胶样品1～3，在72小时后收集该上清液，利用elisa法(elisa试剂盒(quantikineelisahumanhgf(r&dsystem、cat.no：dhg00)、quantikineelisahumanvegf(r&dsystem、cat.no：dhe00))、humancxcl12/sdf-1alphaquantikineelisakit(r&dsystem、cat.no：dsa00)测定了采集的培养上清液中的细胞因子。确认了脂肪组织来源间充质干细胞在上述凝胶中分泌了vegf、hgf和sdf-1(图7～9)。

[6]脂肪组织来源间充质干细胞的mrna表达量

与[5]同样地，使用包含beriplast(注册商标)p组合套装组织粘接用3ml制剂(cslbearing株式会社)a液(纤维蛋白原、以下称为“a液”)6μl、hbss(gibco、cat.no：14174-103、lot：1776567、以下称为“hbss”)14μl和脂肪组织来源间充质干细胞1×10⁶个细胞的a液制备液以及包含beriplast(注册商标)p组合套装组织粘接用3ml制剂(cslbearing株式会社)b液(凝血酶、以下称为“b液”)6μl和hbss14μl的b液制备液，制备凝胶(凝胶样品1)。同样地，使用包含a液20μl和脂肪组织来源间充质干细胞1×10⁶个细胞的a1液制备液和包含b液2μl和hbss18μl的b1液制备液，制备了凝胶样品2；使用包含a液4.5μl、hbss15.5μl和脂肪组织来源间充质干细胞1×10⁶个细胞的a2液制备液以及包含b液6.5μl和hbss11.5μl的b液制备液，制备了凝胶样品3。在1ml的培养基中培养凝胶样品1～3，24小时后使用rneasyfibroustissueminikit(qiagen、cat.no：74704)回收了mrna。使用primescript(商标)rtmastermix(takara、cat.no：rr036a)由回收的mrna制作了cdna。将混合了制得的cdna和probeqpcrmix(takara、cat.no：rr391a)、一览表所示的taqman(注册商标)geneexpressionassays(appliedbiosystems)的primer/probe的液体分注于96孔板中，通过viia(商标)7实时pcr系统(appliedbiosystems)的fast方案进行qpcr，确认了表达了图10所示的mrna。需要说明的是，将内源性对照作为ywhaz利用comparativect法进行解析。需要说明的是，将使用的引物示于下述表2。

[表2]

[7]由脂肪组织来源间充质干细胞分泌的分泌因子4

与[5]同样地使用包含beriplasta液(纤维蛋白原、以下称为“a液”)6μl、hbss(gibco、cat.no：14174-103、lot：1776567、以下称为“hbss”)14μl和脂肪组织来源间充质干细胞1×10⁶个细胞的a液制备液以及包含beriplast(注册商标)p组合套装组织粘接用3ml制剂(cslbearing株式会社)b液(凝血酶、以下称为“b液”)6μl和hbss14μl的b液制备液，制备凝胶(凝胶样品1)。同样地使用包含a液6μl、kn1输液(大冢制药工场、cat.no：1964、lot：k6f77、以下称为“kn1输液”)14μl和脂肪组织来源间充质干细胞1×10⁶个细胞的a’液制备液以及包含b液6μl和kn1输液14μl的b1液制备液，制备了凝胶样品2；使用包含a液6μl、乳酸林格氏液(i’rompharmaceuticalco.,ltd.、cat.no：a1a82、lot：1aa3a、以下称为“乳酸林格氏液”)14μl和脂肪组织来源间充质干细胞1×10⁶个细胞的a2液制备液以及包含b液6μl和乳酸林格氏液14μl的b2液制备液，制备了凝胶样品3。在5ml的培养基中培养凝胶样品1～3，72小时后收集了该上清液，利用elisa法(elisa试剂盒(quantikineelisahumanhgf(r&dsystem、cat.no：dhg00)、quantikineelisahumanvegf(r&dsystem、cat.no：dhe00))测定了采集的培养上清液中的细胞因子。确认了脂肪组织来源间充质干细胞在使用了kn1输液和乳酸林格氏液的凝胶中也分泌了vegf和hgf(图11和12)。

[8]脂肪组织来源间充质干细胞的mrna表达量

与[5]同样地使用包含beriplast(注册商标)p组合套装组织粘接用3ml制剂(cslbearing株式会社)a液(纤维蛋白原、以下称为“a液”)6μl和hbss(gibco、cat.no：14174-103、lot：1776567、以下称为“hbss”)14μl的a液制备液以及包含beriplast(注册商标)p组合套装组织粘接用3ml制剂(cslbearing株式会社)b液(凝血酶、以下称为“b液”)6μl、hbss14μl和脂肪组织来源间充质干细胞1×10⁶个细胞的b液制备液，制备了凝胶。在1ml的培养基(lonza公司、cat.no：pt-3001)中培养制备的凝胶，24小时后使用rneasyfibroustissueminikit(qiagen、cat.no：74704)回收了mrna。作为贴壁培养细胞，用24孔板(corning、cat.no：3337)、1ml的培养基(lonza公司、cat.no：pt-3001)中将脂肪来源间充质干细胞4.75×10⁴个细胞培养24小时后使用rneasyfibroustissueminikit(qiagen、cat.no：74106)回收了mrna。使用primescript(商标)rtmastermix(takara、cat.no：rr036a)由回收的2种mrna制作了cdna。混合制得的cdna和probeqpcrmix(takara、cat.no：rr391a)、表3所示的primer/probe(taqman(注册商标)geneexpressionassays(appliedbiosystems))并分注于96孔板中，viia(商标)7实时pcr系统(appliedbiosystems)的fast方案通过进行了qpcr。如图13所示，确认到凝胶中的细胞与贴壁培养的细胞相比，大量表达了vegf、hgf的mrna。需要说明的是，将内源性对照作为ywhaz利用comparativect法进行了解析。

[表3]

产业上的可利用性

根据本发明的疾病治疗剂制备用试剂盒，对于心力衰竭等疾病，在进行其手术时，通过将间充质干细胞悬浮于纤维蛋白原溶液或凝血酶溶液中，再将得到的细胞悬浮液与在上述悬浮中未使用的纤维蛋白原溶液或凝血酶溶液实质上同时直接喷雾在疾病部位，从而能够显著地改善心脏等疾病部位的功能等。由于上述间充质干细胞对于同种异体的被检体也不易发生排斥反应，因此能将对预先确认了治疗效果的供体细胞进行扩大培养并冷冻保存后的细胞作为本发明的疾病治疗剂制备用试剂盒中的间充质干细胞来使用。因此，与制备自身的间充质干细胞来使用的情况相比，具有容易商品化，且容易得到恒定效果这样的优点。