用于改善细胞、组织和器官的活力和功能的试剂、组合物和方法与流程
本申请要求2016年6月15日提交的美国临时序列号62/350,258的权益，将其全部内容通过引用并入本文。
本发明提供了用于体外、离体或体内调节细胞、细胞制剂、组织、移植物或器官状态的试剂、组合物和方法。本发明还涉及用于改善细胞活力和/或功能或者用于体外、离体或体内保护细胞、组织、移植物或器官免受各种损害的试剂、组合物和方法。这些试剂和组合物可以包括单独的或与助剂(例如nrf-2激活剂、抗氧化剂等)组合的hsp90辅因子抑制剂，例如雷公藤红素(celastrol)或雷公藤红素类似物。
本发明具体涉及对缺血性损伤和相关应激源(缺氧、氧化应激、炎症、休克等)的治疗或预防。本发明还具体涉及基于细胞和基于组织的疗法(例如，再生医学、移植、移植术等)。
背景技术：
尽管在过去几十年期间心脏病学有许多技术进步，但缺血性心脏病仍然是全世界发病和死亡的主要原因。发生心肌梗塞(mi)后，由于自由基产生、炎性细胞浸润和局部ph变化的大量增加，缺血性心脏的再灌注诱导了额外的应激。如果适当设置了心脏保护措施，可以显著减少最终梗塞面积。已经研究了心脏预调节和后调节，包括机械技术(通过冠状动脉夹紧的重复短周期性缺血/再灌注(i/r))，但最简单且临床上更加可转移的技术是药理学调节。在这种情况下，心脏保护作用将涉及i/r诱导的细胞死亡的减少，伴随线粒体通透性转换孔(mptp)开放的抑制和氧化应激的降低，导致梗塞面积减小和心室功能的保持。
申请人研究了雷公藤红素(一种植物三萜)对h9c2大鼠心肌成肌细胞的和mi大鼠模型中的缺氧培养物的影响，并通过超声心动图和组织学分析评估治疗功效。申请人发现，在h9c2细胞中，雷公藤红素在数分钟内触发活性氧类(ros)形成，并诱导转录因子热休克因子1(hsf1)的核转位，导致热休克反应(hsr)从而导致热休克蛋白(hsp)(包括hsp70以及hsp32(血红素加氧酶-1，ho-1))表达增加。雷公藤红素在缺氧应激下改善h9c2存活，并且功能分析揭示hsf1和ho-1是由雷公藤红素诱导的促进细胞和组织保护的关键效应物。在大鼠缺血心肌中，每日雷公藤红素治疗在第14天改善心脏功能并减少不利的左心室重塑。雷公藤红素触发心脏保护性ho-1的表达并抑制纤维化和梗塞面积扩大。在梗塞周围区域中，雷公藤红素减少肌成纤维细胞和巨噬细胞浸润，同时减弱tgf-β和胶原蛋白的上调。
申请人第一个报告了雷公藤红素治疗促进心肌细胞存活、减少损伤和不良重塑同时保持心脏功能，并得出结论，雷公藤红素可代表一种新型强效药理学心脏保护剂，其模仿缺血性调节，可对心肌梗塞的治疗产生有价值的影响(s.dersarkissian等人,britishj.pharmacol.[英国药理学杂志],2014,171:5265-5279)。
申请人还研究了雷公藤红素对干细胞的体外和离体保护以重建受损心肌的作用。实际上，已经提出将干细胞移植术作为用于针对各种疾病状态的组织工程和再生医学的新型治疗途径。基于干细胞的疗法已经在缺血性障碍或疾病的临床前动物模型中进行了探索，并且已经用于缺血性障碍(例如中风、mi和外周动脉疾病(pad))的早期临床试验。
继mi后炎症非常迅速地发生，并且通过检测驻留细胞和循环白细胞的高水平ros和坏死的细胞碎片来提示。这些细胞磨损受损组织并进一步释放ros、蛋白水解酶、促炎性和细胞毒性扩散性因子，并参与坏死细胞的吞噬作用和细胞外基质(ecm)组分的破坏。虽然清除受累细胞组织和碎片很重要，但过度或慢性炎症会导致梗塞扩大、不良重塑和患者效果不良1,2,3,4。
由于心肌通常仅具有非常有限的再生能力，因心肌细胞死亡而腾出的空间被纤维化瘢痕所替代，所述纤维化瘢痕对心脏功能产生不利影响。因此，使用基于细胞的治疗策略(例如干细胞移植术)促进心肌再生的研究让人高度感兴趣。到目前为止，干细胞的大多数积极作用显现是由于对现有组织的旁分泌作用而不是干细胞在病变部位内的分化、掺入或细胞融合。植入细胞的旁分泌信号传导可通过减少细胞凋亡、炎症和纤维化而起作用，并刺激血管生成和其他修复过程发生。1,2
干细胞疗法具有改善缺血性心脏愈合、重建受损心肌并恢复心脏功能的潜力。它提供超越常规治疗限制的治疗解决方案，具有治愈的前景。对于干细胞疗法的巨大希望和潜力已被充分理解，已经在动物模型和临床试验(例如impact-cabg和compare-ami)中证明了用于心力衰竭治疗的自体cd133+干细胞移植的可行性和安全性。5,6然而，最近涉及心血管疾病的细胞疗法的试验已经产生了混合的结果，不一致的数据再次引发了对促成干细胞治疗功效的机制中尚未解决的问题的兴趣。实际上，降低细胞疗法临床有效性的最大障碍是移植细胞(特别是在缺血组织中的移植细胞)的活力和保留性差。无论细胞类型如何，移植后数天，不到1％的移植细胞在缺血心肌中存活。7,8
申请人发现，雷公藤红素快速且强烈地激活内源性细胞保护特性并且增加干细胞存活率至模拟缺血性移植微环境的缺氧和氧化条件。申请人观察到pi3k/akt和p44/42mapk(erk1/2)途径的显著和快速激活，其中如下涉及细胞保护和存活的效应物和重要基因上调：
hif1a、ho-1(hsp32)、hsp27、hsp70和vegf，并且hsf1从细胞质向细胞核转位增加。申请人得出结论，用雷公藤红素预调节干细胞可以是一种安全有效的疗法，用于临床应用，如缺血性心血管疾病(dersarkissian等人,pre-conditioningofstemcellswithcelastroltoenhancetheirtherapeuticpotential[用雷公藤红素预调节干细胞以增强其治疗潜力],circulation[循环]2011；124:a14198)。
然而，仍然迫切需要通过在缺血部位或通过预调节的细胞给予所述化合物或组合物来改善在体外、离体或体内环境中细胞存活和功能的有效化合物、组合物和方法。
本发明说明书涉及多个文献，将这些文献的内容通过引用以其全文结合在此。
技术实现要素：
本发明在其第一方面提供了一种组合物或药物组合物，其包含一种或多种激活热休克反应和抗氧化反应的化合物；一种或多种激活热休克蛋白90(hsp90)抑制和kelch样ech相关蛋白1(keap-1)抑制的化合物；一种或多种激活热休克因子蛋白1(hsf1)途径和核因子(红细胞衍生的蛋白2)样2(nrf2)途径的化合物；一种或多种激活热休克蛋白(hsp)和抗氧化剂效应物的化合物。
在更具体的方面，本发明提供了一种组合物或药物组合物，其可包含一种或多种选自由以下组成的组的化合物：天然三萜、合成三萜类似物和/或助剂。
可用于支持本发明的化合物可包括例如，雷公藤红素、雷公藤红素类似物、睡茄素家族化合物或其类似物、柠檬苦素类家族化合物(例如葛杜宁)或其类似物、巴多索隆/cddo化合物或其类似物(例如cddo-甲基)、类姜黄素(例如姜黄素)或其类似物、鼠尾草酚或其类似物、叔丁基氢醌(tbhq)或其类似物、双(2-羟基亚苄基)丙酮(2hba)或其类似物、乙炔三环双(氰酮)(tbe-31)或其类似物、表没食子儿茶素没食子酸酯(egcg)或其类似物、藤黄酸或其类似物、新生霉素或其类似物、氯尼达明或其类似物、穿心莲内酯或其类似物、依达拉奉或其类似物、抗坏血酸或其类似物、或其任何组合。
更具体地，本发明可以通过使用一种或多种式i化合物来实施
其中r1可选自例如由以下组成的组：-h、-f、-cl、-br、-i、-cn、-芳基、烷基、咪唑、-ora、-nrbrc、-(ch2)noh、和-(ch2)nnh2；
其中ra可选自由以下组成的组：h、取代或未取代的具有1至6个碳原子的直链烷基基团、取代或未取代的具有3至6个碳原子的支链烷基基团、和保护基团；
其中rb和rc可独立地选自由以下组成的组：-h、-oh、-och3、取代(例如-ch2ch2oh等)或未取代的具有1至6个碳原子的直链烷基基团、取代或未取代的具有3至6个碳原子的支链烷基基团、和保护基团；
其中n可以是0、1、2、3或4；
其中r2和r3可独立地选自由以下组成的组：-h、-ord、＝o、-c(＝o)oh、-c(＝o)orx、和-c(＝o)rx；
其中rd可以是h或具有1至3个碳原子的低级烷基基团；
其中rx可以是h或具有1至3个碳原子的低级烷基基团；
其中r4可选自由以下组成的组：-h、-oh和具有1至3个碳原子的低级烷基基团。
根据本发明，该化合物可包括，例如，式ia化合物，其药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体或前药，
其中r1可选自例如由以下组成的组：-h、-f、-cl、-br、-i、-cn、-芳基、烷基、咪唑、-ora、-nrbrc、-(ch2)noh、和-(ch2)nnh2；
其中ra可选自由以下组成的组：h、取代或未取代的具有1至6个碳原子的直链烷基基团、取代或未取代的具有3至6个碳原子的支链烷基基团、和保护基团；
其中rb和rc可独立地选自由以下组成的组：-h、-oh、-och3、取代或未取代的具有1至6个碳原子的直链烷基基团、取代或未取代的具有3至6个碳原子的支链烷基基团、和保护基团；
其中n可以是0、1、2、3或4；
其中r2和r3可独立地选自由以下组成的组：-h、-ord、＝o、-c(＝o)oh、-c(＝o)orx、和-c(＝o)rx；
其中rd可以是h或具有1至3个碳原子的低级烷基基团；
其中rx可以是h或具有1至3个碳原子的低级烷基基团；
其中r4可选自由以下组成的组：-h、-oh和具有1至3个碳原子的低级烷基基团。
根据本发明，式i或ia化合物涵盖如下化合物，其中r1可以更具体地选自由-ora和-nrbrc组成的组；ra可选自由以下组成的组：h、取代或未取代的具有1至6个碳原子的直链烷基基团、取代或未取代的具有3至6个碳原子的支链烷基基团、和保护基团；rb和rc可独立地选自由以下组成的组：-h、-oh、-och3、取代或未取代的具有1至6个碳原子的直链烷基基团、取代或未取代的具有3至6个碳原子的支链烷基基团、和保护基团；r2和r3可独立地选自由以下组成的组：-h、-ord、和＝o，rd可以是h或具有1至3个碳原子的低级烷基基团；和/或r4可以是-h或ch3。
进一步根据本发明，式i或ia化合物涵盖如下化合物，其中r1可以更具体地选自由-ora和-nrbrc组成的组；ra可选自由以下组成的组：h和具有1至3个碳原子的低级烷基基团；rb和rc可独立地选自由以下组成的组：-h、-oh、和-ch2ch2oh；r2和r3可独立地选自由以下组成的组：-h、-oh、-och3和＝o；和/或r4可以是-h或ch3。
又进一步根据本发明，式i或ia化合物涵盖如下化合物，其中r1可以更具体地选自由-ora和-nrbrc组成的组；ra可选自由以下组成的组：h和-ch3；rb和rc可独立地选自由以下组成的组：-h、-oh、和-ch2ch2oh；r2和r3可独立地选自由以下组成的组：-oh和＝o；和/或r4可以是-h。
本发明中涵盖的化合物的示例性实施例包括那些式i或ia化合物，其中r1是nrbrc。
化合物的示例性实施例提供于图23中，并且可包括例如鉴定为类似物1、类似物2、类似物3、类似物4、类似物5、类似物6或二氢雷公藤红素(dihydrocelastrol)的雷公藤红素类似物。
本发明特别考虑的雷公藤红素类似物包括类似物1、类似物2、类似物3、类似物4和二氢雷公藤红素。更特别地考虑了类似物1。
在一些情况下，可以特别地从本发明的一些方面排除雷公藤红素。例如，文献中已经公开了单独的雷公藤红素的组合物或雷公藤红素作为治疗心脏缺血或干细胞保护的方法中的唯一化合物的用途。(dersarkissian等人,pre-conditioningofstemcellswithcelastroltoenhancetheirtherapeuticpotential[用雷公藤红素预调节干细胞以增强其治疗潜力],circulation[循环]2011；124:a14198；s.dersarkissian等人,britishj.pharmacol.[英国药理学杂志],2014,171:5265-5279)。
因此，当组合物、方法和用途包含雷公藤红素时，它可优选地为除雷公藤红素之外的式i或式ia化合物或者与另一种化合物(即式i或式ia化合物和/或助剂)组合使用。
可替代地，本发明可以使用具有本文定义的r1、r2、r3或r4基团(这些基团不同于雷公藤红素的相应的r1、r2、r3或r4基团)的式i、式ia化合物，其药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体或前药来实施。
根据本发明的一个实施例，助剂可以是例如2hba、穿心莲内酯、抗坏血酸、咖啡醇、鼠尾草酚巴多索隆-咪唑(cddo-im)、查耳酮、n6-[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(1h-咪唑-2-基)-2-嘧啶基]氨基]乙基]-3-硝基-2,6-吡啶二胺(chir98014)、成球菌素(conglobatin)、姜黄素、环黄芪醇、1,2-二硫杂环戊烯-3-硫酮(d3t)、达马莫德、依达拉奉、egcg、藤黄酸、ganetespib、葛杜宁、iq-1、柠檬苦素、氯尼达明、褪黑激素、苯甲酰胺四氢吲哚酮、n886、烷基氨基联苯酰胺、新生霉素、5′-磷酸吡哆醛(p5'-p)、羟基吡啶硫酮、槲皮素、根赤壳菌素、白藜芦醇、n-(2-氰基-3,12-二氧代-28-降齐墩果烷-1,9(11)-二烯-17-基)-2,2-二氟-丙酰胺或omaveloxolone(rta-408)、4-(4-氟苯基)-2-(4-羟苯基)-5-(4-吡啶基)-1h-咪唑(sb202190)、3-(2,4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1h-吲哚-3-基)-1h-吡咯-2,5-二酮(sb216763)、snx-5422(pf-04929113)、丁酸钠、sulforane、四溴苯并三唑(tbb)、叔丁基氢醌(tbhq)、丙戊酸(valporicacid)、醉茄素a、睡茄素、麦角甾醇、羽扇烯酮、及任何此类助剂的类似物。
更具体地，助剂可包括例如tbhq、鼠尾草酚、姜黄素、2hba或egcg或其类似物。
在其另外的方面，本发明提供了一种组合物或药物组合物，其可包含例如a)一种或多种单独的或与一种或多种助剂组合的式i、式ia化合物，其药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体或前药，和b)载体或药学上可接受的载体或者赋形剂。
本发明提供了调节细胞(分离的细胞)、细胞制剂、组织(分离的组织)、移植物(分离的移植物)或器官(分离的器官)的状态的方法。可以进行这种调节以增加或保持活力、或者对死亡、损害和/或应激的抗性、以及功能性。这种调节可以以一种方式进行，使得对细胞死亡的恢复力特征增加，对氧化和/或缺氧应激源更具抗性，和/或蛋白质表达特征增强(其可由各种蛋白质(包括但不限于热休克蛋白、抗氧化蛋白、生长因子)的分泌增强和/或与细胞衰老相关的此类肽介导物的有害表达减少组成)。
该方法可包括使该细胞、细胞制剂、组织、移植物或器官与以下接触：a)可包含一种或多种式i、式ia化合物、其药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体或前药的组合物，b)可包含一种或多种式i、式ia化合物、其药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体或前药以及助剂的组合，c)与或已经与一种或多种式i、式ia化合物、其药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体或前药或者与其组合接触的不同细胞制剂，或d)已经与一种或多种式i、式ia化合物、其药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体或前药或者与其组合接触的不同细胞制剂的分泌蛋白质组或细胞培养基。
在另外的方面，本发明提供了一种保护细胞、组织、移植物或器官免受在各种病理状态(例如缺血、缺血/再灌注、休克、败血症)或操作过程(例如冷冻/解冻循环、细胞包封、扩增、富集和纯化步骤，移植物制备/制造等)中可能引起的损害或应激源(例如氧化性、缺氧性、炎性、热的、渗透性、机械性)的方法。
该方法可包括使细胞、组织、移植物或器官与如下组合物接触，该组合物包含一种或多种激活热休克反应和抗氧化反应的化合物、一种或多种激活hsp90抑制和keap-1抑制途径的化合物、一种或多种激活hsf1途径和nrf2途径的化合物、一种或多种激活hsp的化合物、和抗氧化剂。
该方法还可包括使细胞、组织、移植物或器官与如下组合物接触，该组合物包含一种或多种选自由以下组成的组的化合物：天然三萜、合成三萜类似物和/或助剂。
该方法可更具体包括使细胞、组织、移植物或器官与如下组合物接触，该组合物包含一种或多种式i、式ia化合物、其药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体或前药。
根据本发明，该方法可以在体外、离体或体内进行。
因此，根据本发明，该方法可以是在细胞制剂、组织或器官上进行的离体方法。因此调节的细胞制剂、组织或器官随后可以给予/移植到有需要的哺乳动物(例如人哺乳动物)中。该方法还可以是通过将组合物、组合、不同细胞制剂或分泌蛋白质组给予至有需要的哺乳动物(例如，患有或易患缺血性疾病、进行手术或医疗干预或患有退行性疾病并伴有细胞和组织缺失的哺乳动物)进行的体内方法。
退行性疾病可包括心肌病，肝病如非酒精性脂肪肝病、非酒精性脂肪性肝炎(nafld/nash)、肝硬化，肺病如慢性阻塞性肺病(copd)，骨关节炎，胰腺疾病如糖尿病，神经变性如阿尔茨海默病、帕金森病、痴呆症、肌萎缩侧索硬化症(als)等。
组合物、组合、不同细胞制剂或分泌蛋白质组可以在手术或医疗干预之前、期间或之后立即给予，并且可以例如全身或局部给予。
该方法还可以是在培养中的细胞上或在冷冻前进行的体外方法。
可以将细胞、细胞制剂、组织、移植物或器官在使用之前与该化合物、组合、不同细胞制剂或分泌蛋白质组接触，持续例如至少5至180分钟。
根据本发明的一个实施例，式i或式ia化合物可以以10-6m至10-10m的浓度使用。
该方法可包括局部或全身给予化合物、组合、细胞制剂或分泌蛋白质组。例如，当给予化合物、组合或分泌蛋白质组时，其可以全身(例如，静脉内)或局部(例如，在受损部位外用)给予。当给予细胞制剂时，其可优先局部给予(例如，在怀疑缺血的部位、在需要细胞保护的部位等)。
细胞可以是永生化的或原代细胞。细胞可以是例如干细胞、心肌细胞、心肌成肌细胞、肌细胞、肾细胞、胰腺细胞、肝细胞、神经元、内皮细胞、上皮细胞。
干细胞可以是胚胎多能(multipotent或pluripotent)干细胞。干细胞的示例性实施例可包括间充质干细胞、造血干细胞、诱导的多能干细胞。根据本发明，这些细胞是非癌细胞。
细胞优选来自哺乳动物，例如人。细胞可适用于同种异体干细胞移植术或自体干细胞移植术。细胞可以源自商业来源或可以从供体或宿主中分离。可以基于特定和期望的标记物选择细胞。
根据本发明，该方法可以包括另外地使细胞、组织、移植物或器官与一种或多种助剂接触。因此，细胞、组织、移植物或器官可以与如下组合物接触，该组合物包含混合在一起的a)式i或式ia化合物(或其药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体或前药)和b)助剂，或者可以一个接一个地添加化合物和助剂。
细胞、组织、移植物或器官也可以依次与式i、式ia化合物(或其药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体或前药)以及助剂接触。
在其一个方面，本发明进一步提供了预防或治疗缺血性疾病的方法，所述缺血性疾病包括例如缺血性心血管疾病、中风、心肌梗塞(mi)、外周动脉疾病(pad)、或发生细胞和组织缺失或退化的疾病(例如糖尿病、肝病、肺病等)。
该方法可包括向有需要的哺乳动物给予如下组合物，该组合物包含一种或多种激活热休克反应激活和抗氧化反应激活的化合物、一种或多种激活hsp90抑制和keap-1抑制途径的化合物、一种或多种激活hsf1激活和nrf2途径的化合物、一种或多种激活hsp的化合物、和抗氧化剂、或者用这种组合物调节的细胞制剂的分泌蛋白质组。
该方法还可包括向有需要的哺乳动物给予用如下组合物预调节的干细胞制剂，该组合物包含一种或多种激活热休克反应激活和抗氧化反应激活的化合物、一种或多种激活hsp90抑制和keap-1抑制途径的化合物、一种或多种激活hsf1和nrf2途径的化合物、一种或多种激活hsp的化合物、和抗氧化剂。
此外，该方法可包括向有需要的哺乳动物给予如下组合物，该组合物包含一种或多种选自由以下组成的组的化合物：天然三萜、合成三萜类似物和/或助剂。
该方法还可包括向有需要的哺乳动物给予用如下组合物预调节的干细胞制剂，该组合物包含一种或多种选自由以下组成的组的化合物：天然三萜、合成三萜类似物和/或助剂。
该方法还可以包括向有需要的哺乳动物给予用包含一种或多种本文所述化合物和/或助剂的组合物处理的干细胞制剂的分泌蛋白质组或培养基。
该方法可以更具体地包括向有需要的哺乳动物给予以下：a)包含一种或多种式i、式ia化合物，其药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体或前药的组合物，b)用一种或多种式i、式ia化合物，其药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体或前药预调节的干细胞制剂或c)用这种组合物调节的细胞制剂的分泌蛋白质组。
根据本发明，该方法涵盖给予包含a)式i、式ia化合物，其药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体或前药，和b)助剂的组合的组合物，给予用包含这种组合的组合物预调节的干细胞，或给予用这种组合调节的细胞制剂的分泌蛋白质组。
根据本发明的一个实施例，该干细胞制剂可以是从有需要的哺乳动物分离的自体干细胞制剂。根据本发明的另外实施例，该干细胞制剂可以是从哺乳动物供体分离的同种异体干细胞制剂。为了适合于向哺乳动物给予，同种异体干细胞制剂优选是hla型匹配的。干细胞制剂还可以是免疫豁免的、低免疫原性的或免疫逃逸的。
在其另外的方面，本发明还提供了用如下组合物或者用这种组合物调节的不同细胞制剂的分泌蛋白质组进行预调节的细胞制剂或者分离的细胞、组织、移植物或器官制剂，该组合物包含一种或多种激活热休克反应激活和抗氧化反应激活的化合物、一种或多种激活hsp90抑制和keap-1抑制途径的化合物、一种或多种激活hsf1激活和nrf2途径的化合物、一种或多种激活hsp激活和抗氧化反应激活的化合物。
在其另外的方面，本发明提供了用如下组合物预调节的分离的细胞、组织、移植物或器官制剂，该组合物包含一种或多种选自由以下组成的组的化合物：天然三萜、合成三萜类似物和/或助剂。
更具体地，在其又另外的方面，本发明提供了用如下组合物或者用这种组合物调节的不同细胞制剂的分泌蛋白质组进行预调节的细胞制剂或者分离的细胞、组织、移植物或器官制剂，该组合物包含一种或多种式i、式ia化合物，其药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体或前药。
根据本发明，分离的细胞、组织、移植物或器官制剂可以用包含a)式i、式ia化合物，其药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体或前药和b)助剂的组合的组合物预调节。
根据本发明，分离的细胞、组织、移植物或器官制剂可以用细胞的分泌蛋白质组调节，所述细胞用如下组合物预调节，该组合物包含a)式i、式ia化合物，其药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体或前药和b)助剂的组合。
根据本发明的一个实施例，组合物可以在使用前从制剂中洗涤出，或者可以作为制剂的一部分保留。
根据示例性实施例，细胞制剂可以是干细胞制剂，例如，体外处理的干细胞或从先前已全身接受治疗的供体收获的干细胞。
根据本发明的另一个实施例，细胞制剂可以是细胞悬浮液。根据本发明的另外的实施例，细胞制剂可以呈三维支架的形式。为了获得三维支架，细胞可以作为细胞聚集体，在微载体的存在下，在藻酸盐微胶囊上，在水凝胶(例如，热可逆水凝胶、基于壳聚糖的水凝胶等)中，在由自组装肽构成的纳米结构支架中培养(meng,x.等人,springerplus,2014,3:80)。
本发明进一步涉及一种降低干细胞、组织、移植物或器官的移植中细胞损害的方法，该方法可包括使干细胞、组织、移植物或器官与如下组合物或者用这种组合物调节的细胞制剂的分泌蛋白质组接触，该组合物包含一种或多种激活热休克反应激活和抗氧化反应激活的化合物、一种或多种激活hsp90抑制和keap-1抑制途径的化合物、一种或多种激活hsf1激活和nrf2途径的化合物、一种或多种激活hsp激活和抗氧化反应激活的化合物。
本发明进一步涉及一种降低干细胞、组织、移植物或器官移植中细胞损害的方法，该方法可包括使干细胞、组织、移植物或器官与如下组合物接触，该组合物包含一种或多种选自由以下组成的组的化合物：天然三萜、合成三萜类似物和/或助剂。
更具体地，本发明进一步提供了一种降低干细胞、组织、移植物或器官的移植中细胞损害的方法，该方法包括在移植之前和/或期间和/或之后使这些干细胞、组织、移植物或器官与如下组合物或者与用这种组合物调节的细胞制剂的分泌蛋白质组接触，该组合物包含至少一种式i、式ia化合物，其药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体或前药。
根据本发明的一个实施例，该方法可包括给予a)式i、式ia化合物，其药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体或前药和b)助剂的组合。
在另外的方面，本发明涉及一种或多种激活热休克反应激活和抗氧化反应激活的化合物、一种或多种激活hsp90抑制和keap-1抑制途径的化合物、一种或多种激活hsf1激活和nrf2途径的化合物、一种或多种激活hsp激活和抗氧化反应激活的化合物用于保护细胞、组织、移植物或器官免受应激或损害的用途。
在又另外的方面，本发明涉及一种或多种选自由以下组成的组的化合物用于保护细胞、组织、移植物或器官免受应激或损害的用途：天然三萜、合成三萜类似物和/或助剂。
在更具体的方面，本发明涉及一种或多种式i、式ia化合物，其药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体或前药用于保护细胞、组织、移植物或器官免受应激或损害的用途。
根据本发明另外的方面，本发明涉及a)式i、式ia化合物，其药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体或前药和b)助剂的组合的用途。
在又另外的方面，本发明提供了治疗需要手术或医疗干预或者易受细胞应激或损害影响的患者的方法。
根据本发明的一个实施例，该方法可包括给予包含一种或多种如本文定义的化合物的组合物。
根据本发明的一个更具体实施例，该方法可包括在手术或医疗干预之前和/或期间给予包含式i、式ia化合物，其药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体或前药的组合物。
在本发明另外的实施例中，该方法可包括给予a)式i、式ia化合物，其药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体或前药和b)助剂的组合。
根据本发明，组合物可以局部给予，例如，在手术或医疗干预的部位。根据本发明的另一个实施例，组合物可以全身给予。
根据本发明，化合物或组合物可以直接在易受细胞损害影响的部位给予至有需要的哺乳动物。因此可以给予化合物或组合物以预防或治疗细胞损害。
本发明还涉及一种试剂盒，该试剂盒可包括第一小瓶和第二小瓶，该第一小瓶包含式i、式ia化合物、其药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体或前药，该第二小瓶包含细胞。
根据本发明另外的实施例，试剂盒可包含含有助剂的第三小瓶。根据本发明的一个实施例，细胞可以是干细胞。
本发明还涉及预先混合不同组分的试剂盒。
本发明还提供了适合于向有需要的哺乳动物体内给予组合物、组合、不同细胞制剂或分泌蛋白质组的装置。该装置可以是例如预填充式注射器，或者具有可容纳组合物、组合、不同细胞制剂或分泌蛋白质组的隔室的注射器。
本发明还提供了适用于细胞、组织制剂的装置。该装置可以是例如细胞分选或细胞培养或扩增装置，例如生物反应器，其可以容纳组合物、组合、不同细胞制剂或分泌蛋白质组。
在以下条目1至31中还提供了本发明的其他方面：
1.一种改善细胞对细胞死亡的抗性的方法，所述方法包括使细胞与有效量的一种或多种激活hsf1途径和nrf2途径的化合物接触。
2.一种产生经调节的细胞群体的方法，所述细胞对细胞死亡的恢复力特征增加、对氧化和/或缺氧应激源更具抗性、和/或蛋白质表达特征增强(其包括热休克蛋白、抗氧化蛋白、和/或生长因子、抗炎性细胞因子、趋化因子中至少一种的分泌增强和/或有害肽介导物(例如衰老相关蛋白)表达减少)，所述方法包括使细胞与有效量的一种或多种激活hsf1途径和nrf2途径的化合物接触。
3.一种改善经移植或输注细胞的活力和保留性的方法，所述方法包括在移植或输注之前和/或之后使细胞与有效量的一种或多种激活hsf1途径和nrf2途径的化合物接触。
4.如本文所述条目所述的方法，其中所述方法包括在移植或输注之前离体或体外接触细胞。
如本文所述条目所述的方法，其中所述方法包括体内接触细胞。
5.如本文所述条目所述的方法，其中所述方法包括在移植或输注之前/之后体内接触细胞。
6.一种治疗需要细胞移植或输注的受试者的方法，所述方法包括(a)使待移植的细胞与有效量的一种或多种激活hsf1途径和nrf2途径的化合物接触；和(b)在所述受试者中移植或输注(a)的细胞。
7.如本文所述条目所述的方法，该方法还包括在移植后使经移植或输注的细胞与有效量的所述一种或多种化合物接触。
8.如本文所述条目所述的方法，其中所述受试者患有器官或组织缺血或者退化和/或其中所述器官或组织缺血是心肌缺血。退化包括胰腺细胞、心肌细胞、肌肉细胞、神经元、肾细胞、肝细胞等的损失。
10.如本文所述条目所述的方法，其中所述受试者患有心肌梗塞(mi)。
11.如本文所述条目所述的方法，其中一种或多种化合物中的至少一种是hsp90抑制剂。
12.如本文所述条目所述的方法，其中hsp90抑制剂是hsp90n或c-末端抑制剂，并且更具体地是hsp90辅因子抑制剂。
13.如本文所述条目所述的方法，其中一种或多种化合物中的至少一种具有nrf2诱导活性或抗氧化活性。
14.如本文所述条目所述的方法，其中所述一种或多种化合物包含雷公藤红素或其类似物、睡茄素家族化合物或其类似物、柠檬苦素类家族化合物(例如葛杜宁)或其类似物、巴多索隆/cddo化合物或其类似物(例如cddo-甲基)、类姜黄素(例如姜黄素)或其类似物、鼠尾草酚或其类似物、叔丁基氢醌(tbhq)或其类似物、双(2-羟基亚苄基)丙酮(2hba)或其类似物、乙炔三环双(氰酮)(tbe-31)或其类似物、表没食子儿茶素没食子酸酯(egcg)或其类似物、藤黄酸或其类似物、新生霉素或其类似物、氯尼达明或其类似物、穿心莲内酯或其类似物、依达拉奉或其类似物、抗坏血酸或其类似物、gamendazole或其类似物、萝卜硫素或其类似物、硫酰氧硫代氨基甲酸酯炔(sulphoxythiocarbamatealkyne)(stca)或其类似物、或其任何组合。
15.如本文所述条目所述的方法，其中所述一种或多种化合物包含(i)(a)雷公藤红素或其类似物；和(b)egcg或其类似物；(ii)(a)雷公藤红素或其类似物；和(b)tbhq或其类似物；(iii)(a)雷公藤红素或其类似物；和(b)2hba或其类似物；(iv)(a)雷公藤红素或其类似物；和(b)姜黄素或其类似物；(v)(a)雷公藤红素或其类似物；和(b)鼠尾草酚或其类似物；(vi)(a)葛杜宁或其类似物；和(b)egcg或其类似物；或(vii)(a)葛杜宁或其类似物；和(b)tbhq或其类似物；(viii)(a)葛杜宁或其类似物；和(b)2hba或其类似物；(ix)(a)葛杜宁或其类似物；和(b)姜黄素或其类似物；(x)(a)葛杜宁或其类似物；和(b)鼠尾草酚或其类似物。。
16.如本文所述条目所述的方法，其中该细胞是干/多能/祖细胞或分化细胞。
17.如本文所述条目所述的方法，其中该干/多能/祖细胞是间充质干细胞、cd34+细胞或cd133+细胞。
18.如本文所述条目所述的方法，其中所述细胞是分化细胞。
19.如本文所述条目所述的方法，其中所述细胞存在于组织或器官中。
20.如本文所述条目所述的方法，其中所述接触包括在培养基中添加单剂量或多剂量的一种或多种化合物。
21.如本文所述条目所述的方法，其中所述接触包括向受试者给予单剂量或多剂量的一种或多种化合物。
22.一种鉴定一种或多种化合物的方法，所述化合物可用于改善细胞对细胞死亡的抗性和/或改善经移植或输注细胞的活力和保留性，所述方法包括(i)使细胞与所述一种或多种化合物接触；(ii)确定hsf1途径和nrf2途径是否在所述细胞中被激活，其中所述途径的激活指示所述一种或多种化合物可用于改善细胞对细胞死亡的抗性和/或改善被接触细胞的活力和保留性，和/或所述一种或多种化合物可用于改善细胞功能性和/或改善被接触细胞的旁分泌蛋白质组。
23.如本文所述条目所述的方法，其中所述细胞是干/祖细胞或分化细胞。
24.如本文所述条目所述的方法，其中所述干/祖细胞是间充质干细胞、cd34+细胞或cd133+细胞。
25.如本文所述条目所述的方法，其中所述细胞是分化细胞。
26.如本文所述条目所述的方法，其中所述细胞存在于组织或器官中。
27.如本文所述条目所述的方法，其中确定hsf1途径和nrf2途径是否在所述细胞中被激活的步骤包括测量在hsf1和/或nrf2的转录控制下一种或多种基因的表达，其中所述一种或多种基因的表达增加指示hsf1和/或nrf2途径被激活。
28.如本文所述条目所述的方法，其中所述一种或多种在hsf1或nrf2激活后表达的基因是热休克蛋白(hsp)(例如hsp90、hsp70)、谷胱甘肽s-转移酶、nadph-醌氧化还原酶1(nqo1)、生长因子(如vegf、fgf2、hgf、igf)、血红素加氧酶1(ho1)、超氧化物歧化酶1-3(sod1-3)、硫氧还蛋白(trx)、过氧化氢酶(cat)和/或谷胱甘肽过氧化物酶(gpx)。
29.如本文所述条目所述的方法，其中确定nrf2途径是否在所述细胞中被激活的步骤包括测量一种或多种促炎性基因的表达，其中所述一种或多种基因的表达下降指示hsf1和/或nrf2途径被激活。
30.如本文所述条目所述的方法，其中所述一种或多种炎性基因是il-1β和/或tnfα。
31.如本文所述条目所述的方法，其中所述方法包括在缺氧和/或氧化、缺氧/再氧化应激条件下测量所述细胞的死亡。
根据本发明，hsp90抑制剂的代表性实施例可包括例如雷公藤红素或式i类似物。
另一方面，本发明涉及包含与一种或多种保护性化合物组合的雷公藤红素或式i类似物的组合物。
根据本发明，一种或多种保护性化合物可以是助剂，例如nrf2激活剂或抗氧化剂，并且可以包括例如，
雷公藤红素、2hba、穿心莲内酯、抗坏血酸、咖啡醇、鼠尾草酚巴多索隆-咪唑(cddo-im)、查耳酮、n6-[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(1h-咪唑-2-基)-2-嘧啶基]氨基]乙基]-3-硝基-2,6-吡啶二胺(chir98014)、成球菌素、姜黄素、环黄芪醇、1,2-二硫杂环戊烯-3-硫酮(d3t)、达马莫德、依达拉奉、egcg、藤黄酸、ganetespib、葛杜宁、iq-1、柠檬苦素、氯尼达明、褪黑激素、苯甲酰胺四氢吲哚酮、n886、烷基氨基联苯酰胺、新生霉素、5′-磷酸吡哆醛(p5'-p)、羟基吡啶硫酮、槲皮素、根赤壳菌素、白藜芦醇、n-(2-氰基-3,12-二氧代-28-降齐墩果烷-1,9(11)-二烯-17-基)-2,2-二氟-丙酰胺或omaveloxolone(rta-408)、4-(4-氟苯基)-2-(4-羟苯基)-5-(4-吡啶基)-1h-咪唑(sb202190)、3-(2,4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1h-吲哚-3-基)-1h-吡咯-2,5-二酮(sb216763)、snx-5422(pf-04929113)、丁酸钠、sulforane、四溴苯并三唑(tbb)、叔丁基氢醌(tbhq)、丙戊酸(valporicacid)、醉茄素a、睡茄素、麦角甾醇、羽扇烯酮、及任何此类助剂的类似物。
在另外的方面，本发明涉及含有活细胞的细胞制剂，所述活细胞在与本文所述的组合物接触后可具有改善的特征。所述改善的特征可包括改善的功能、增加的与细胞保护相关的基因表达、增加的活力、增加的存活率、增加的对来自在各种病理状态(例如缺血、缺血/再灌注、败血症、休克)或操作过程(例如冷冻/解冻循环、细胞包封、扩增、富集和纯化步骤，移植物制备/制造等)中可能引起的应激源(例如氧化性、缺氧性、炎性、热的、渗透性、机械性)的细胞损害的抗性。
细胞制剂可包含干细胞，例如适于预防或修复由缺血引起的损害的干细胞。干细胞可以来自商业来源、从需要治疗的个体中分离(即，自体的)或从相容的供体中分离(即，同种异体的)。
根据本发明的一个实施例，细胞或组织制剂可以用本文所述的组合物或试剂预调节。根据本发明的另外的实施例，细胞制剂可包含含有本文所述组合物或试剂的培养基。
通过阅读以下的仅通过具有参照附图的实例给出的具体实施例的非限制性描述，本发明的其他目的、优点和特征将变得更加清楚。
附图说明
在附图中：
图1显示了各种hsp90抑制剂和雷公藤红素样化合物的活力(a，b)和基于报告物的筛选(c)的实例。perkinelmer
图2a和2b显示了雷公藤红素预调节增加了msc的体内活力/保留性。用调节化合物或媒剂处理msc60分钟。然后洗涤细胞，用荧光细胞追踪物标记，并在大鼠左侧缺血后肢处在t＝0时注射。使用
图3显示了雷公藤红素预调节增强干细胞治疗效果。如通过激光多普勒扫描所见，雷公藤红素预调节的msc在后肢缺血模型中更有效地重建血流。
图4显示了在雷公藤红素(10-6m)处理一小时后由人间充质干细胞(hmsc)释放的细胞保护性蛋白、生长/存活因子和抗氧化蛋白。将调节的细胞培养基收集、浓缩，通过凝胶电泳分离蛋白质并通过质谱分析并通过数据库搜索鉴定。
图5显示了在本文所述实验中使用的一些化合物(图6-22)。
图6显示了用hsp90抑制剂(雷公藤红素、葛杜宁、根赤壳菌素)(而不是单独的nrf2激活剂(egcg、tbhq))处理大鼠间充质干细胞(rmsc)1小时保护rmsc免于48小时缺氧诱导的细胞死亡。egcg增强了雷公藤红素介导的保护作用。
图7显示了用来自rmsc的培养基(其用hsp90辅因子抑制剂(雷公藤红素；葛杜宁高剂量)处理)对h9c2进行48小时预调节保护h9c2免于48小时缺氧诱导的细胞死亡。
图8a显示了用nrf2激活化合物(雷公藤红素、egcg)(但基本上不是hsf1激活剂(格尔德霉素、根赤壳菌素))处理rmsc1小时保护rmsc免于氧化应激诱导的死亡。egcg增强了雷公藤红素诱导的保护作用。
图8b显示了用与2hba、tbhq或egcg组合的雷公藤红素处理h9c2心肌成肌细胞1小时导致氧化激发(在1mmh2o2中孵育1小时)后细胞活力的协同增加。
图9显示了用来自rmsc的培养基(其用nrf2激活剂(葛杜宁、egcg、tbhq)处理)进行24小时预调节保护h9c2细胞免于氧化应激诱导的死亡。单独的强效hsf1激活剂(根赤壳菌素、雷公藤红素)没有显示出保护作用。
图10显示了在1小时处理和3小时清除后rmsc中的hsp70mrna表达。egcg和tbhq产生雷公藤红素诱导的hsp70表达的协同增加。
图11显示了在1小时处理和3小时清除后rmsc中的hsp32(ho-1)mrna表达。egcg和tbhq产生雷公藤红素诱导的hsp32表达的协同增加。
图12显示了在1小时处理和3小时清除后msc(hmsc)中的hsp70mrna表达。egcg产生雷公藤红素诱导的hsp70表达的协同增加。
图13显示了在1小时处理和3小时清除后msc(hmsc)中的hsp32(ho-1)mrna表达。egcg产生雷公藤红素诱导的hsp32表达的协同增加。
图14显示了在1小时处理和3小时清除后rmsc中的fgf2mrna表达。egcg和tbhq产生雷公藤红素诱导的fgf2表达的协同增加。tbhq和葛杜宁的组合也增加了fgf2mrna表达。
图15显示了在1小时处理和3小时清除后rmsc中的vegfαmrna表达。egcg产生雷公藤红素诱导的vegf表达的协同增加。
图16显示了在1小时处理和3小时清除后rmsc中的过氧化氢酶(cat)mrna表达。egcg和tbhq产生雷公藤红素诱导的cat表达的协同增加。
图17显示了在1小时处理和3小时清除后rmsc中的谷胱甘肽过氧化物酶(gpx)mrna表达。egcg和tbhq产生雷公藤红素诱导的gpx表达的协同增加。
图18显示了在1小时处理和3小时清除后rmsc中的谷胱甘肽还原酶(gr)mrna表达。egcg产生雷公藤红素诱导的gr表达的协同增加。tbhq仅在低剂量时显示出协同效应。
图19显示了在1小时处理和3小时清除后rmsc中的超氧化物歧化酶1(sod1)mrna表达。egcg产生雷公藤红素诱导的sod1表达的协同增加。
图20显示了在1小时处理和3小时清除后rmsc中的il-1βmrna表达。雷公藤红素和葛杜宁下调由egcg和tbhq诱导的il-1β表达。
图21显示了在1小时处理和3小时清除后rmsc中的tnfαmrna表达。egcg和tbhq协同增强了雷公藤红素和葛杜宁诱导的tnfα下调。
图22a显示了rmsc活力和表达结果的汇编图(校验标记表示激活水平；x表示抑制作用的水平；≠表示无作用；空格表示未进行实验)。
图22b显示了h9c2细胞旁分泌活力的汇编图(校验标记表示激活水平；x表示抑制作用的水平；≠表示无作用；空格表示未进行实验)。
图23显示了测试的雷公藤红素类似物。
图24显示了测试的潜在助剂的列表。
图25a是表示在用单独的或与选择的助剂组合的雷公藤红素调节的人间充质干细胞(hmsc)中通过实时pcr测量的所选基因的mrna表达的表格。结果表示为相对于媒剂处理的细胞的倍数变化。
图25b是表示在用单独的或与选择的助剂组合的所选雷公藤红素类似物调节的人间充质干细胞(hmsc)中通过实时pcr测量的所选基因的mrna表达的表格。结果表示为相对于媒剂处理的细胞的倍数变化。
图26a至26c显示了用雷公藤红素或雷公藤红素类似物和选择的辅助nrf2激活剂共处理、通过实时pcr测量的人间充质干细胞(hmsc)中细胞保护性基因的mrna表达的结果。仅保留了与媒剂处理的细胞相比，vegf、fgf2、ho1和sdf1基因表达增加≥1.5倍的处理组合。结果表示为相对于媒剂处理的细胞的倍数变化。(任意血管生成指数：(vegfa+fgf2+sdf1)*2)(a＝累加效应；s＝协同效应)。
图26d显示了用单独的或与2hba(1um)组合的雷公藤红素(1um)处理人间充质干细胞(hmsc)一小时后，然后在如可在梗塞微环境中观察到的常氧或缺氧(<1％o2)和低血清(0.2％fbs)条件下孵育24小时，抗氧化剂、生长因子和基质重塑mrna基因表达的taqman组(赛默飞世尔科技公司(thermofisher))。结果表示为相对于媒剂处理的hmsc的倍数变化。
图26e显示了用单独的或与辅助处理(2hba1um；egcg10um或姜黄素5um)组合的雷公藤红素(1um)处理h9c2心肌成肌细胞一小时后，然后在如可在梗塞微环境中观察到的常氧或缺氧(<1％o2)和低血清(0.2％fbs)和低葡萄糖条件下孵育3小时，ho-1(上图)和vegfa(下图)基因mrna的实时pcr表达。结果表示为相对于媒剂处理的h9c2的倍数变化。
图26f显示了在雷公藤红素(1um)和选择的辅助化合物(1um)共同处理一小时后，然后在如可在梗塞微环境中观察到的常氧或缺氧(<1％o2)和低血清(1％fbs)条件下孵育48小时，由培养基中的人间充质干细胞(hmsc)分泌的测量(赛默飞世尔科技公司；bioplex200，biorad)的vegfa蛋白含量结果。
图27a显示了在冷冻保存之前用雷公藤红素进行1小时预调节增加了细胞解冻后的rmsc活力。
图27b显示了体内雷公藤红素处理以剂量依赖性方式调节rmsc以抵抗氧化应激诱导的死亡。
图28是从共聚焦显微镜(olympus，fv1000mpe/bk61wf)实验获得的图片，其显示了在没有雷公藤红素(a)或具有(b)雷公藤红素(1um)的hbss培养基中过夜调节的猪小动脉。使用liive/dead试剂盒对血管切片进行染色。箭头指向含有媒剂的培养基中死细胞和降解的内皮层区域，而代表性血管图像显示补充有雷公藤红素的培养基中内皮细胞层活力和完整性得以维持。
图29a和29b是蛋白质印迹，显示了在由雷公藤红素(1um)刺激5至120分钟，然后恢复0至24小时，不同细胞类型中的总细胞提取物或核和细胞质级分中的蛋白质表达。
图29c是直方图，其表示在6小时缺氧激发后，用浓度为0.25um或0.50um的雷公藤红素或根赤壳菌素预调节30分钟的胰岛素分泌ins-1细胞的活力指数。将结果与媒剂处理的细胞进行比较。
图30是显示雷公藤红素1mg/kg防止接受10mg/kg剂量的lps的大鼠的致死性血压下降的图。
图31是蛋白质印迹的照片，显示了单次注射雷公藤红素(1mg/kg)在60分钟内诱导大鼠肾脏中hsp32(ho-1)的表达(参见a)。雷公藤红素增加了经历肾缺血的大鼠的非结扎对照肾中hsp70的表达，表明全身敏感性和细胞保护性反应增加(参见b)。
图32是总结雷公藤红素(雷公藤红素1c：从商业来源购买；雷公藤红素2和3用于产生合成类似物)和雷公藤红素类似物对缺氧应激、氧化应激和缺氧/再氧化应激期间h9c2细胞活力的影响的表格。
图33a至33h指示，与暖性全身心肌缺血再灌注后的媒剂(dmso)处理相比较，雷公藤红素(10-7mol/l，最佳剂量)和类似物1(10-8mol/l剂量)保护心脏免于i/r诱导的收缩功能障碍，如通过a,b)+/-dp/dt、c)产生的压力(最大-最小压力)、d)舒张末期压力(edp)、和e)收缩指数变化所示。f)冠状动脉储备血流(crf)随着处理保留，g)高敏感性肌钙蛋白t(tnt-hs)释放和h)与i/r损伤后媒剂(dmso)处理的心脏相比，雷公藤红素和类似物治疗组中通过ttc染色测量的梗塞面积显著减小。
图34a至34d指示，与媒剂(dmso)处理的动物相比，通过保留a)射血分数(ef)、b)心输出量(co)、c)缩短分数(fs)和d)每搏输出量(sv)，雷公藤红素(1mg/kg)和类似物1(1mg/kg)保护i/r损伤后的心脏功能。
图35是总结雷公藤红素(雷公藤红素1c：从商业来源购买；雷公藤红素2和3用于产生合成类似物)和雷公藤红素类似物对通过荧光素酶报告测定法测量的热休克反应(hsr)和抗氧化反应(ar)的影响的表格。报道了ec50、最大倍数诱导和1um固定剂量下的反应激活。根据hsr和ar途径刺激中的功效和效价的汇编对化合物进行分级。
图36是显示提出的雷公藤红素诱导hsr和ar机制的示意图，其导致细胞保护性基因上调。
发明内容
在本申请中，申请人表明，雷公藤红素可用于保护细胞和组织免受不同类型的损害，并可增加作为复合组织(例如移植物和器官)一部分的细胞的存活率。例如，用单独的或与助剂组合的雷公藤红素预调节的干细胞保护细胞免受应激和/或损害，并刺激增强细胞的治疗特性的旁分泌介导物和生长因子的分泌。
申请人还鉴定了具有相似或增加的细胞保护作用的雷公藤红素类似物，并鉴定了几种与雷公藤红素和/或雷公藤红素类似物具有协同或累加细胞保护作用的治疗组合。
导致细胞保护性hps上调的雷公藤红素诱导hsr和抗氧化反应的机制如图37所示。
更具体地，雷公藤红素作用机制包括1)激活快速和瞬时的细胞防御机制。更具体地，雷公藤红素调节keap1的活性，keap1是转录因子核因子红细胞2相关因子2(nrf2)的阻遏物，从而允许nrf2转位至细胞核并结合至are(抗氧化反应元件)，所述are激活保护性抗氧化介导物和酶(包括ho1(hsp32))的转录。
雷公藤红素作用机制还包括2)细胞途径的激活，确保延长保护和存活：雷公藤红素拮抗hsp90的必需共分子伴侣，即cdc37，其导致hsf1与其分子伴侣阻遏物hsp90解离。这导致hsf1磷酸化、三聚化、核转位和与hse(热休克元件)结合，从而诱导包括hsp27、hsp32和hsp70的细胞保护性热休克蛋白(hsp)的重新转录。
雷公藤红素作用机制可进一步包括3)保护性信号传导的诱导/扩增：通过刺激ros产生的雷公藤红素可以激活上述机制，从而导致保护性信号传导途径的激活。
除非在此另外指示或与上下文明显矛盾，否则在描述本发明的上下文中(尤其是在权利要求书的上下文中)，术语“一个/种”和“该”以及类似指称对象的使用应解释为包括单数和复数二者。
除非另有说明，否则术语“包含”、“具有”，“包括”和“含有”应被解释为开放式术语(即，意味着“包括但不限于”)。
在本文引证数值的范围仅旨在用作单独地提及每个单独的数值落在该范围内的速记的方法，除非本文另外说明，并且每个单独的数值被结合到本说明书中就像它被单独地在本文引证一样。范围内的所有值的子集也被并入说明书中，如同在本文中单独引用一样。
类似地，本文中具有各种取代基和针对这些取代基列举的各种基团的一般化学结构旨在用作单独提及通过任何取代基的任何基团的组合获得的每个分子的简捷方法。将每个单独的分子并入说明书中，如同在本文中单独引用一样。此外，将一般化学结构内的所有分子子集和属于相同化合物家族的所有结构/分子也并入说明书中，如同在本文中单独引用一样。
本文公开的实施例和特征的任何和所有组合和亚组合都包括在本发明中。
这里，术语“约”具有其普通含义。术语“约”用于表示值包括用于确定值的装置或方法的固有误差变化，或包含接近所述值的值，例如在所述值(或值的范围)的10％或5％内。
在本文描述的所有方法能够以任何适合顺序进行，除非本文另外说明或另外与上下文明显矛盾。
本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如“例如”)的应用仅旨在更好地说明本发明，而不对另外要求保护的本发明范围做出限制。
除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。
本发明提供了一种改善细胞对细胞死亡的抗性(例如，对氧化和/或缺氧应激诱导的死亡；其他物理或化学或机械应激源，包括热、氧化、h2o2、缺氧、包封等的抗性)的方法，所述方法包括使细胞与有效量的一种或多种激活hsf1途径和nrf2途径的化合物接触。本发明提供了一种或多种激活hsf1途径和nrf2途径的化合物用于改善细胞对细胞死亡的抗性和改善细胞功能性的用途。
本发明还提供了一种改善经移植或输注细胞的活力和保留性的方法，所述方法包括在移植或输注之前和/或之后使细胞与有效量的一种或多种激活hsf1途径和nrf2途径的化合物接触。
本发明还提供了一种改善干细胞的治疗特征和功能性的方法(激活有益蛋白质，包括生长因子、抗氧化酶、热休克蛋白、趋化因子和抗炎性细胞因子，用于移植微环境的旁分泌改善)，所述方法包括使干细胞与有效量的一种或多种激活hsf1途径和nrf2途径的化合物接触。
本发明还提供了一种鉴定一种或多种化合物的方法，所述化合物可用于改善细胞对细胞死亡(例如，缺氧和/或氧化和/或缺氧/再氧化应激诱导的细胞死亡)的抗性和/或改善经移植或输注细胞的活力和保留性，所述方法包括(i)使细胞与所述一种或多种化合物接触；(ii)确定hsf1途径和nrf2途径是否在所述细胞中被激活，其中所述途径的激活指示所述一种或多种化合物可用于改善细胞对细胞死亡的抗性和/或改善经移植或输注细胞的活力和保留性。
本发明还提供了一种治疗需要细胞移植或输注的受试者的方法，所述方法包括(a)使待移植的细胞与有效量的一种或多种激活hsf1途径和nrf2途径的化合物接触；和(b)在所述受试者中移植或输注(a)的细胞。
表述“激活热休克因子蛋白1(hsf1)途径的化合物”是指能够直接或间接增加分子伴侣阻遏物hsp90复合物中hsf1释放和/或激活其向细胞核转位或增加其细胞含量，从而增加hsf1介导的转录的任何药剂(小分子、肽、蛋白质、抗体、寡聚体等)。它包括拮抗hsp90的一种或多种共分子伴侣(例如cdc37和p23)的试剂，其导致hsf1或hsf1蛋白本身的解离/激活。
表述“激活核因子(红细胞衍生的蛋白2)样2(nrf2)途径的化合物”是指能够直接或间接增加阻遏物kelch样ech相关蛋白1(keap1)中nrf2释放和/或激活其向细胞核转位或增加其细胞含量，从而增加nrf2介导的转录的任何药剂(小分子、肽、抗体、寡聚体等)。keap1包含六个kelch重复序列(残基327-372、373-423、424-470、471-517、518-564和565-611)，其介导与nrf2的相互作用。nrf2的残基69-84，并且更具体地是残基76-84(其包含保守的etge基序)参与与keap1的相互作用。激活nrf2途径的化合物的实例包括雷公藤红素、tbhq、cddo、鼠尾草酚、穿心莲内酯、咖啡醇、萝卜硫素、姜黄素、egcg、羟基吡啶硫酮、白藜芦醇、葛杜宁、槲皮素、双(2-羟基亚苄基)丙酮(2-hba)或hbb2、1,2-二硫杂环戊烯-3-硫酮(d3t)、乙炔三环双(氰酮)(tbe31)、anthothecol、睡茄素及其类似物，或生物碱、醌和醌甲基化物、藤黄酸、柠檬苦素类、鱼藤酮类、萜类化合物、呋喃型化合物、cathechins、烯基类、碳水化合物、类黄酮或芳香族的成员。
在一个实施例中，该方法包括使用一种激活hsf1途径和nrf2途径的化合物。在另一个实施例中，该方法包括使用两种或更多种激活hsf1途径和nrf2途径的分子，例如激活hsf1途径的第一化合物和激活nrf2途径的第二化合物，或者激活hsf1和nrf2途径的第一化合物和仅激活nrf2途径的第二化合物等。
在一个实施例中，所述一种或多种化合物包含雷公藤红素或其类似物、睡茄素家族化合物(例如睡茄素a、醉茄素a)或其类似物、柠檬苦素类家族化合物(例如葛杜宁)或其类似物、类姜黄素(例如姜黄素)或其类似物、萝卜硫素或其类似物、硫酰氧硫代氨基甲酸酯炔(sulphoxythiocarbamatealkyne)(stca)或其类似物、新生霉素或其类似物、氯尼达明或其类似物、gamendazole或其类似物、巴多索隆/cddo化合物(例如cddo-im)或其类似物、叔丁基氢醌(tbhq)或其类似物、(1e,4e)-1,5-双(2-羟苯基)-1,4-戊二烯-3-酮(hbb2)或其类似物、乙炔三环双(氰酮)(tbe-31)或其类似物、表没食子儿茶素没食子酸酯(egcg)或其类似物、或其任何组合。如本文所用的术语“类似物”是指具有参考化合物的基本或骨架结构但包含一个或多个修饰(例如，键序、不存在或存在一个或多个原子和/或原子团、及其组合)的化合物，所述修饰不会消除hsf1途径和/或nrf2途径上的生物活性。例如，雷公藤红素类似物(五环三萜化合物)描述于klaic等人,acschembiol.[acs化学生物学]2012年5月18日；7(5):928-937和pct公开号wo2015/148802中。
在一个实施例中，一种或多种化合物中的至少一种是hsp90抑制剂、hsp90n-或c-末端抑制剂，优选hsp90辅因子抑制剂。
在一个实施例中，一种或多种化合物中的至少一种具有nrf2诱导活性。
在一个实施例中，使用相对于单独使用的化合物的活性具有改善(例如协同)活性的化合物的组合。化合物组合的实例包括(i)(a)雷公藤红素或其类似物；和(b)egcg或其类似物；(ii)(a)雷公藤红素或其类似物；和(b)tbhq或其类似物；(iii)(a)葛杜宁或其类似物；和(b)egcg或其类似物；(iv)(a)葛杜宁或其类似物；和(b)tbhq或其类似物；(v)(a)雷公藤红素或其类似物；和(b)2hba或其类似物；(vi)(a)雷公藤红素或其类似物；和(b)姜黄素或其类似物；或(vii)(a)雷公藤红素或其类似物；和(b)鼠尾草酚或其类似物。
如本文所用，术语“助剂”是指可以增加细胞存活率、活力或者对应激或损害的抗性的试剂。“助剂”可以能够调节例如细胞表型，并且可以包括抗氧化剂和nrf2激活剂。助剂包括例如2hba、穿心莲内酯、抗坏血酸、咖啡醇、鼠尾草酚巴多索隆-咪唑(cddo-im)、查耳酮、n6-[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(1h-咪唑-2-基)-2-嘧啶基]氨基]乙基]-3-硝基-2,6-吡啶二胺(chir98014)、成球菌素、姜黄素、环黄芪醇、1,2-二硫杂环戊烯-3-硫酮(d3t)、达马莫德、依达拉奉、egcg、藤黄酸、ganetespib、葛杜宁、iq-1、柠檬苦素、氯尼达酰胺(lonidamide)、褪黑激素、苯甲酰胺四氢吲哚酮、n886、烷基氨基联苯酰胺、新生霉素、5′-磷酸吡哆醛(p5'-p)、羟基吡啶硫酮、槲皮素、根赤壳菌素、白藜芦醇、n-(2-氰基-3,12-二氧代-28-降齐墩果烷-1,9(11)-二烯-17-基)-2,2-二氟-丙酰胺或omaveloxolone(rta-408)、4-(4-氟苯基)-2-(4-羟苯基)-5-(4-吡啶基)-1h-咪唑(sb202190)、3-(2,4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1h-吲哚-3-基)-1h-吡咯-2,5-二酮(sb216763)、snx-5422(pf-04929113)、丁酸钠、sulforane、四溴苯并三唑(tbb)、叔丁基氢醌(tbhq)、丙戊酸、醉茄素a、麦角甾醇、羽扇烯酮、及任何此类助剂的类似物。
如本文所用，术语“分泌蛋白质组”是指由生物细胞、组织、器官和生物体分泌的有机分子和/或无机元素。
如本文所用，表述“调节细胞状态”是指细胞表型、某些基因的表达模式或某些蛋白质的分泌模式的改变。
如本文所用的表述，具有1至6个碳原子的直链烷基(即，c1-c6烷基)是指具有直链或支链部分且含有1至6个碳原子的饱和一价烃基。术语“支链烷基基团”是指包含一个或多个叔碳原子或季碳原子的烷基基团。烷基基团可以是取代的(oh、nh2、i、f、cl、br、cn)未取代的。这类基团的实例包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基和叔丁基。
如本文所用，术语“取代的”是指如下基团，其中该基团中的一个或多个氢原子独立地被选自以下的取代基替代：甲基、乙基、正丙基、异丙基、羟基、甲氧基、乙氧基、氟、氯、溴、碘、氰基、硝基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、羧基、氯甲基、三氯甲基、三氟甲基、甲氧基乙基等。
如本文所用，术语“具有1至3个碳原子的低级烷基基团”是指甲基、乙基、丙基。
在一个实施例中，所述一种或多种化合物存在于药物组合物中，所述药物组合物还包含一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。如本文所用，“药学上可接受的”(或“生物学上可接受的”)是指特征在于体内不存在(或有限的)毒性或不良生物学效应的材料。它是指在正确医学判断的范围内适用于与受试者(例如人、动物)的生物体液和/或组织和/或器官接触而无过多毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，与合理益处/风险比相称的那些化合物、组合物和/或剂型。
术语“药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂”是指通常用于制备药物组合物的添加剂，并且包括例如溶剂、分散介质、盐水溶液、表面活性剂、增溶剂、润滑剂、乳化剂、涂料、抗菌和抗真菌剂、螯合剂、ph调节剂、安抚剂、缓冲剂、还原剂、抗氧化剂、等渗剂、吸收延迟剂等(参见例如rowe等人,handbookofpharmaceuticalexcipients[药用赋形剂手册],医药出版社(pharmaceuticalpress)；第6版,2009)。
在一个实施例中，所述一种或多种化合物可以与用于细胞移植/组织工程的支架材料(例如通常用作干细胞支架的生物材料、聚合物和/或基质)组合/混合。
可以配制一种或多种化合物用于通过任何常规途径给予，例如静脉内、经口、透皮、腹膜内、皮下、粘膜、肌肉内、鼻内、肺内、肠胃外或局部给予。这种配制品的制备是本领域熟知的(参见，例如remington:thescienceandpracticeofpharmacy[雷明顿：制药科学与实践],利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司(lippincottwilliams&wilkins)；第21版,2005)。
此外，如以下实例中所示，来自用一种或多种化合物处理的细胞的培养基(例如分泌蛋白质组)能够赋予针对死亡的保护，并且因此，在一个实施例中，本文所述的方法包括在一种或多种化合物的存在下培养细胞(例如间充质干细胞、cd133+细胞、胰腺细胞、肾细胞、上皮细胞和内皮细胞)群，从所述培养物中收集培养基或上清液；并且在所述培养基或上清液的存在下接触细胞。
在一个实施例中，细胞是干/多能/祖细胞或分化细胞，例如造血干细胞(hsc)、造血祖细胞(hpc)、多能祖细胞(mpp)、淋巴样祖细胞、髓样祖细胞、间充质干细胞(msc)、脂肪源性干细胞(adsc)等。在另一个实施例中，细胞是分化细胞。
起始细胞群可以从含有合适细胞的机体或机体器官获得。收集的细胞可以以本领域技术人员已知的方式(例如基于某些标记物(例如cd34+、cd133+)的表达)富集为具有某些特征的细胞。此外，起始细胞群可以直接使用或冷冻并储存以供稍后时间点使用。因此，可首先对细胞群进行富集或纯化步骤，包括基于特定细胞标记物对塑料器具的粘附或细胞的阴性和/或阳性选择，以提供起始细胞群，例如提供富含msc的起始细胞群。基于特定细胞标记物分离所述起始细胞群的方法可以使用荧光激活细胞分选(facs)技术或固体或不溶性底物，所述底物结合与特定细胞表面标记物相互作用的抗体或配体。例如，可以使细胞与含有抗体的固体底物(例如珠粒柱、烧瓶、磁性颗粒)接触，并除去任何未结合的细胞。当使用包含磁珠粒或顺磁珠粒的固体底物时，可以通过磁分离器(例如，由miltenyi
细胞可以在适于细胞维持、生长或增殖的培养基中培养，或者在生物反应器的正常培养条件下培养，例如用于大规模生产。细胞群的培养条件将根据不同因素而变化，特别是起始细胞群。合适的培养基和条件是本领域熟知的。本发明的方法可以在天然培养基、半合成培养基或合成培养基(就组成而言)中进行，并且可以是固体培养基、半固体培养基或液体培养基(就形状而言)以及用于细胞培养的任何营养培养基或确定的培养基，其可以补充有一种或多种合适的因子。这种培养基通常包含钠、钾、钙、镁、磷、氯、氨基酸、维生素、细胞因子、激素、抗生素、血清、脂肪酸、糖类等。在培养物中，根据需要，可以单独或组合掺入其他化学组分或生物组分。掺入培养基中的此类组分可以是胎牛血清、人血清、马血清、胰岛素、转铁蛋白、乳铁蛋白、胆固醇、乙醇胺、亚硒酸钠、硫代甘油、2-巯基乙醇、牛血清白蛋白、丙酮酸钠、聚乙二醇、各种维生素、各种氨基酸、琼脂、琼脂糖、胶原、甲基纤维素、各种细胞因子、各种生长因子等。培养基可以是化学成分确定的、无血清的和/或无异源体系的。
在用一种或多种化合物处理期间或之后，可以在适于维持、生长和/或增殖的条件下培养细胞。
用于介导上述效果的一种或多种化合物的量可以由技术人员确定。在一个实施例中，浓度为约1nm至约1mm、约10nm至100μm、或约100nm至约10μm。本发明还包括10-5m至10-10m(单独地包括从1um至10um、从5um至10mm)的浓度。
在一个实施例中，上述接触包括在培养基中添加单剂量或多剂量的一种或多种化合物。
用化合物处理可以在患者和细胞、组织、器官中体内给予，并且然后可以如上所述收集。
然后可洗涤细胞群以除去细胞培养物中的一种或多种化合物和/或任何其他组分，并重悬于适当的细胞悬浮培养基中，洗掉或保持接触用于短期使用或处于长期存储培养基(例如适于冷冻保存的培养基)中。
可能受益于移植/输注细胞，并且特别是干细胞的受试者包括患有以下疾病的受试者：心力衰竭、心绞痛、心肌梗塞(例如心脏/心肌缺血)、心律失常、心脏瓣膜病、心肌/心包疾病、先天性心脏病(例如心房间隔缺损、室间隔缺损、动脉导管开放症、法洛四联症)、动脉疾病(例如动脉硬化、动脉瘤等)、静脉疾病(例如静脉曲张)、严重肢体或器官缺血(肝缺血等)、退行性关节病、骨关节炎、类风湿性关节炎、骨病(例如骨炎、骨质疏松症、骨关节炎、骨肉瘤)、皮肤病(例如牛皮癣、湿疹、皮肤癌)、角膜疾病(例如圆锥角膜、角膜炎)、肝脏疾病(例如急性和慢性肝衰竭、肝炎、包括尿素循环障碍在内的遗传缺陷)、肺部疾病(例如copd、ards、肺炎)、肾脏疾病(例如ckd)、肌肉骨骼损伤、肌腱炎、全身性疾病(例如败血症)、癌症、障碍、退行性疾病(包括cns疾病，如阿尔茨海默病、帕金森病、痴呆、als)和脊髓损伤。
上述一种或多种化合物可以与用于治疗上述疾病/障碍/病症的其他疗法/药物组合使用。上述一种或多种化合物可以以任何常规剂型给予或共同给予(例如连续地、同时地、在不同时间给予)。本发明的上下文中的共同给予是指在协调处理过程中给予多于一种的治疗剂以实现改善的临床结果。这种共同给予也可以是共同延伸的，即在重叠的时间段内发生。例如，可以在给予另外的活性剂或疗法之前、同时、之前和之后、或之后将上述一种或多种化合物给予至受试者。在一个实施例中，活性剂(例如一种或多种化合物和另外的活性剂)可以组合/配制在单一组合物中，并且从而同时给予。
可将任何合适量的一种或多种化合物或包含其的药物组合物给予至受试者。给予的剂量和频率取决于许多因素，包括给予方式。为了预防、治疗或降低给定疾病或病症的严重程度，一种或多种化合物/组合物的适当剂量将取决于待治疗的疾病或病症的类型、疾病或病症的严重程度和病程、给予化合物/组合物是用于预防还是治疗目的、既往治疗、患者的临床病史和对化合物/组合物的反应、以及主治医生的裁量。化合物/组合物适合一次或经一系列治疗给予至患者。优选地，期望的是在体外，并且然后在人中测试之前在有用的动物模型中测定剂量-反应曲线。本发明提供了化合物和包含其的组合物的剂量。例如，取决于疾病的类型和严重程度，每天约1μg/kg至1000mg/kg(mg/kg体重)。此外，有效剂量可以是约0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、50mg/kg、55mg/kg、60mg/kg、70mg/kg、75mg/kg、80mg/kg、90mg/kg、100mg/kg、125mg/kg、150mg/kg、175mg/kg或200mg/kg，并且可以以25mg/kg增量增加至1000mg/kg，或者范围可以在任何两个前述值之间。取决于上述因素，典型的日剂量范围可以为从约1μg/kg至100mg/kg或更高。对于经数天或更长时间的重复给予，取决于病症，持续治疗直至发生所需的疾病症状抑制或临床终点。上述一种或多种化合物可以以适当的频率给予，例如一次、每天一次、每周两次、每周一次、每两周一次、每月一次。然而，其他剂量方案也可能是有用的。通过常规技术和测定可以容易地监测该疗法的进展。这些仅仅是指导原则，因为实际剂量必须由主治医师根据每位患者特有的临床因素仔细选择和滴定。最佳剂量将通过本领域已知的方法确定，并且将受例如患者年龄和其他临床相关因素等因素的影响。此外，患者可能正在服用治疗其他疾病或病症的药物。
类似地，当向患者给予预调节细胞时，输入细胞的数量将考虑例如性别、年龄、体重、疾病或病症的类型、病症的阶段、所需细胞占细胞群的百分比和产生治疗益处所需的细胞数量等因素。在一个具体实施例中，组合物通过静脉内输注给予，并且包含至少约1×104个细胞/kg或至少约1×105个细胞/kg，例如从约1×104个细胞/kg至约1x108个细胞/kg或从约1×104个细胞/kg至约1×107个细胞/kg。
可以使用本文描述的方法治疗的受试者是哺乳动物，包括但不限于牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、豚鼠、大鼠、猴，或其他牛类、绵羊类、马类、犬类、猫科、啮齿类或鼠类物种，灵长类动物(并且优选是人类)，雄性或雌性。
本文描述的方法的其他应用包括例如组织、移植物(例如血管移植物)的保存和离体器官灌注(例如肺灌注(evlp))。
具体实施方式
通过以下非限制性实例来更具体说明本发明。
实例1：hsp90-共分子伴侣抑制剂作为细胞调节剂
为了鉴定能够确保体内细胞活力的调节性化合物，基于使用雷公藤红素的初步证据，筛选了通过文献和sigma-
b)和如通过基于报告物的测定所见，它们诱导hsp表达的能力的可变功效(图1c)。对于一些与雷公藤红素具有结构相似性的得分最高化合物(包括睡茄素和葛杜宁)，新出现的证据表明，许多这些有效的调节性化合物属于靶向hsp90共伴侣分子相互作用的hsp90调节物家族。101112
实例2：雷公藤红素增强体内移植细胞的保留性并增强旁分泌
下面描述的结果显示，雷公藤红素增加了移植细胞的体内活力和保留性。简言之，将大鼠msc用调节性化合物在悬浮液中处理60分钟。然后洗涤细胞，用荧光细胞追踪物标记，并在大鼠左侧缺血后肢处在t＝0时注射。使用来自art的optixtmmx3分子成像系统将移植的细胞体内成像直至第9天(图2：a、b)。结果显示预处理干细胞的改善的体内活力和保留性，这转化为如通过激光多普勒扫描观察到的改善的血流重建的趋势(图3)。蛋白质组学分析表明，雷公藤红素处理人msc保持和增强干细胞功能性，如培养基中热休克蛋白(hsp90a增加了7.0倍；hsp90b增加了2.2倍；ho1增加了2.2倍；hsp70增加了1.8倍)、生长因子和细胞因子(mcsf增加了24.4倍，hgf增加了2.1倍)和抗氧化反应相关基因(gsh增加了2.8倍、trx增加了2.5倍、cat增加了1.7倍)水平增加所示(图4)。
简而言之，将大鼠msc与含有雷公藤红素(10e-6m-10e-8m)或媒剂(二甲基亚砜(dmso))的低血清培养基(αmem1x、1％胎牛血清(fbs)、1％青霉素-链霉素(p-s))一起孵育一小时。然后吸出培养基，用3种不同培养基(αmem1x、1％fbs、1％p-s)洗涤细胞。将细胞用胰蛋白酶消化并根据制造商的方案用vybrantcfda(赛默飞世尔科技公司)染色，该方案允许在荧光成像中检测(optixmx2)。然后使用countessiifl自动细胞计数器(赛默飞世尔科技公司)对细胞进行计数，并使用26g针头和注射器在200ul
总体积中的5个不同点在缺血大鼠后肢模型中注射300万可存活的msc。
将斯普拉格-杜勒(sprague-dawley)大鼠(cdcrl：查尔斯河实验室)麻醉(异氟烷2.5％-3.0％(雅培实验室(abbottlaboratories)，雅培科技园，伊利诺州)，1l/min氧气)并将布比卡因在切口部位注射到大腿(2mg/kgscqd)中。清除左侧股总动脉，并切除隐动脉的远端部分和所有旁支和静脉。切除腹股沟韧带和膝盖之间的动脉的近端和远端部分。因此，股动脉的任何分支都不能形成侧支。将每只动物的右下肢保持完整并用作对照。使用vicryl5-0封闭伤口。动物接受盐酸丁丙诺啡(0.05mg/kgs.c.bid3天)并将其置于diamond软垫上的笼中。手术后第二天，注射用媒剂或实验化合物预处理的pbs或msc。将动物麻醉(异氟烷2.5％-3.0％(雅培实验室，雅培科技园，伊利诺州)，1l/min氧气)并用26g针头和注射器在5个不同点将细胞直接注射到股四头肌中。
使用来自art的optixtmmx3分子成像系统将移植的细胞体内成像直至第9天同时，对大鼠进行后肢多普勒扫描(moor仪器)，所述扫描使得可以研究移植调节的rmsc后大鼠下肢(n＝3)缺血模型中血流恢复(膝盖以下)。
与媒剂处理的细胞相比，雷公藤红素调节的细胞增加了植入大鼠缺血后肢中的干细胞的活力和保留性，并且改善受累肢的血流逐渐恢复(如对数模式所示)。
实例3：鉴定干细胞药物优化剂
鉴定干细胞药物优化剂的标准
用于鉴定干细胞药物优化剂的标准依赖于处理优选满足两个主要条件的能力：
1.细胞的处理优选赋予增加的体内活力和保留特性，特别是在如缺血组织中观察到的缺氧和/或氧化微环境中的干细胞移植的背景中；和
2.细胞的处理优选地允许尽可能地维持正常的细胞表型和/或功能性。然而，非常期望的药物优化剂也可以增强细胞功能以有助于有益或治疗表型。在涉及旁分泌活性的干细胞、组织修复的情况下，药物优化剂可以优选地增强有益蛋白质的分泌和/或减少有害蛋白质的产生，从而对移植环境具有有利的平衡和影响。
测试候选干细胞药物优化剂的方法
为了测试第一主要条件，将msc(源自大鼠或人)用候选药物优化剂处理、洗涤、并使其经受缺氧/血清饥饿(在低血清培养基中在缺氧室<1％o2中持续48-72小时)或氧化应激(在掺入0-2mmh2o2的培养基中孵育1小时)，其模拟缺血移植微环境中存在的主要致死应激源。使用live/dead活力/细胞毒性试剂盒(lifetechnologiestm)评估细胞的活力状态，并通过配备有harmony自动分析软件(perkinelmertm)的operetta高内涵筛选(hcs)装置定量结果。
为了测试第二主要条件，用候选药物优化剂处理msc1小时，然后清除3小时。提取细胞mrna并通过实时pcr定量目的基因的表达。在另外的msc培养物中，将细胞处理一小时，洗涤并在低血清培养基中培养24小时。然后将含有msc分泌的旁分泌因子的培养基与h9c2心肌成肌细胞系接触。然后使h9c2细胞经受缺氧/血清饥饿(在低血清培养基中在缺氧室<1％o2中持续48小时)或氧化应激(在掺入0-1mmh2o2的培养基中孵育1小时)。如上详述使用live/dead测定评估h9c2细胞的存活状态。
为了鉴定负责保护调节的msc以及当与调节的msc培养基一起孵育时通过旁分泌机制对h9c2提供的保护的机制，选择各种分子作为靶向两种主要细胞途径的调节剂，所述两种主要细胞途径即通过hsp90靶向(hsf1激活)的热休克途径和/或核因子(红细胞衍生的蛋白2)样2(nrf2)途径。
经测试的化合物(图5)：
·雷公藤红素：强效hsf1激活剂(hsp90-辅因子抑制)；nrf2激活剂
·葛杜宁：hsf1激活剂(hsp90-辅因子抑制)；nrf2激活剂
·根赤壳菌素：hsf1激活剂(hsp90经典atp抑制剂)；没有报告nrf2活性
·egcg：没有报告hsf1激活(hsp90-ct抑制)；nrf2激活剂
·tbhq：没有报告的hsf1激活；nrf2激活剂
这些实验的结果，如图6至图9中所报告的，可归纳如下：
·能够诱导hsf1的化合物(雷公藤红素、葛杜宁、根赤壳菌素)保护细胞免于缺氧诱导的死亡(图6)；
·hsp90辅因子抑制剂(雷公藤红素、葛杜宁)产生旁分泌功效的介导物(图6、7)；
·hsp90nt抑制剂(根赤壳菌素)不产生旁分泌功效的介导物(图7)；
·hsp90ct抑制剂(egcg)不能保护经处理的细胞免受缺氧的影响，但会对雷公藤红素诱导的保护产生累加效应(图6)；
·nrf2激活剂(egcg、葛杜宁、雷公藤红素)保护经处理的细胞免于氧化应激诱导的死亡。egcg对雷公藤红素诱导的保护产生累加效应(图8)；以及
·除雷公藤红素外，nrf2激活剂(egcg、tbhq、葛杜宁)产生防止氧化应激诱导的死亡的旁分泌介导物(图9)。
总之，这些结果证明了用于增强细胞活力的最佳药物调节性处理结合了能够诱导hsf1的hsp90辅因子抑制剂的活性(通过直接和旁分泌效应对缺氧诱导的死亡的恢复力)和抗氧化剂nrf2途径诱导剂的活性(通过直接和旁分泌效应对氧化应激诱导的死亡的恢复力)。发现egcg增强了雷公藤红素刺激的细胞保护作用。
除了活力增强(干细胞药物优化剂选择的第一标准)，通过量化与炎症有关的hsp、生长因子(gf)、抗氧化蛋白/酶和细胞因子的mrna表达来评估表达谱的增强(干细胞药物优化剂选择的第二标准)。测试单一和组合处理。
测试的组合处理-第一次实验：
雷公藤红素(1μm)或葛杜宁(1μm)+egcg(1μm，10μm)或tbhq(1μm，5μm)
这些实验的结果，如图10至图21中所报告的，可归纳如下：
hsp的表达
·egcg和tbhq产生雷公藤红素诱导的hsp70和hsp32表达的协同增加(图10、11)。在另外两种rmsc细胞系中，egcg也产生了雷公藤红素诱导的hsp70表达的协同增加，而tbhq对雷公藤红素诱导的变化没有影响。
·egcg在人msc中产生雷公藤红素诱导的hsp70和hsp32表达的协同剂量依赖性增加(图12、13)；
生长因子(gf)的表达
·egcg协同增强雷公藤红素刺激的fgf2和vegf的表达，而tbhq分别增加和减少fgf2和vegf的雷公藤红素和葛杜宁表达(图14、15)。
抗氧化因子的表达
·egcg协同增强雷公藤红素刺激的cat、gpx、gr和sod1的表达(图16、17、18、19)。
·tbhq协同增强雷公藤红素刺激的cat、gpx、gr的表达(以低剂量tbhq)，并且对sod1表达没有影响。
炎性细胞因子的表达
·雷公藤红素和葛杜宁通过egcg和tbhq下调il1β诱导的表达(图20)；
·egcg和tbhq增强了雷公藤红素和葛杜宁诱导的tnfα下调(图21)。
总之，这些结果表明egcg协同增强了雷公藤红素刺激的干细胞功能有利因子的表达。不希望受理论束缚，这可能是由于egcg抑制未知的雷公藤红素功能性阻遏物或稳定化hsp90构象以增强雷公藤红素效应。不能排除协同效应也可以至少部分仅次于nrf2介体物的激活和/或细胞氧化还原平衡的正常化。实际上，不具有hsp90抑制活性的tbhq在至少一种msc大鼠系中对雷公藤红素刺激的表达显示出某些协同或累加效应。最后，egcg和tbhq与雷公藤红素或葛杜宁的共同处理进一步下调炎性细胞因子。
活力和表达结果的汇编在图22a和22b中给出。这些结果提供了证据，证明了提供合适的移植微环境的最佳药物调节性处理结合了：
1.hsp90抑制剂作用(能够诱导hsf1的hsp90辅因子抑制)，其被证明可增强细胞对缺氧诱导的死亡的活力，并促进各种有益旁分泌因子(hsp、gf、抗氧化剂分子)的表达增加和炎症介导物的表达减少；和
2.nrf2活性(具有潜在的hsp90ct抑制)，其显示增强对氧化应激诱导的死亡的抗性，并且增强(累加或协同地)某些有益的旁分泌因子的表达和/或进一步下调炎性细胞因子介导物。
有趣的是，申请人发现，当与雷公藤红素组合以增加由氧化应激(在1mmh2o2中孵育1小时)所激发的h9c2心肌成肌细胞的活力时，2hba、tbhq和egcg也产生协同增加(图8b)。
实例4：鉴定雷公藤红素类似物为干细胞药物优化剂
使用与实例3中所述类似的途径，申请人测试了几种雷公藤红素类似物，包括图23中举例说明的那些，并鉴定了几种能够充当干细胞药物优化剂的类似物(图24、25a、25b、26a-26d)。
申请人还测试了雷公藤红素或雷公藤红素类似物与潜在助剂(例如，nrf-2激活剂和/或抗氧化剂，图24)的几种组合处理，并鉴定了几种对hsp、生长因子(gf)、抗氧化蛋白/酶、细胞因子、基质重塑蛋白(图25a、25b和图26a至26d)的表达具有协同效应(s)或累加效应(a)的组合。从这些数据可以看出，类似物3、类似物1、二氢雷公藤红素和雷公藤红素是最好的hsp90抑制剂，并且2hba、egcg、姜黄素、tbhq和鼠尾草酚是鉴定的最佳助剂。
此外，在正常培养48小时后，用雷公藤红素组合2hba、egcg、tbhq或姜黄素处理人间充质干细胞(hmsc)1小时产生vegf蛋白的协同增加，而在如在梗塞微环境中遇到的缺氧条件下培养相同细胞48小时产生甚至更高的vegf蛋白表达(图26f)。基本上观察到相同的观察结果，即在用雷公藤红素组合2hba和egcg助剂处理1小时、然后在常氧或缺氧条件下清除3小时的h9c2心肌成肌细胞中ho-1抗氧化剂和vegfa血管生成因子的mrna表达增加(图26e)。
实例5：雷公藤红素增加冷冻保存后的rmsc活力
适当的冷冻保存是细胞处理实验室的一个重要方面，需要所述实验室证明其冷冻保存方案在移植前产生可接受的解冻后活力(≥70％)。例如，研究已经证明冷冻保存诱导解冻的肝细胞的显著改变并损害它们的活力、附着和功能。图27a中给出的结果显示在冷冻保存之前用雷公藤红素对rmsc进行一小时预调节增加了解冻后的rmsc活力。
从雄性大鼠(175-200g)后肢骨髓中分离间充质干细胞(msc)，并如所述进行扩增。简言之，通过ficoll-paque(安玛西亚公司(amersham))梯度离心分离骨髓单核细胞(bmnc)，并在含有10％fbs(gibco公司)和1％青霉素-链霉素(p-s：安杰公司(invitrogen)15140)的极限必需培养基(minimumessentialmediuma)α1x(αmem1x：gibco公司12571)中培养。48小时后，弃去非粘附细胞，并用新培养基洗涤细胞。基于优先附着于聚苯乙烯表面，使msc与造血细胞分离。msc的多谱系潜能通过具有特定培养条件和染色的体外脂肪形成和成骨/软骨形成分化测定来确认。免疫表型分型是通过多参数流式细胞术(
细胞活力方案(冷冻/解冻循环)
将msc重悬于10％血清培养基(αmem1x、10％fbs、1％p-s)中，并使用多通道移液管在96孔板中以每孔4000个细胞的密度接种，并在37℃孵育。每个实验和对照条件一式三份铺板。第二天，轻轻吸出培养基并用含有雷公藤红素(10e-6m)或媒剂(dmso)的低血清培养基(αmem1x、1％fbs、1％p-s)替代一小时。然后吸出培养基，用3种不同培养基(αmem1x、1％fbs、1％p-s)洗涤细胞。将细胞用胰蛋白酶消化并使用countessiifl自动细胞计数器(赛默飞世尔科技公司)计数。
冷冻细胞：在如上所述的胰蛋白酶消化和计数步骤之后，将细胞以所需密度等分，向细胞浓缩物中添加dmso(1:10最终稀释液)并转移至预先标记的冷冻小瓶。将冷冻小瓶置于冷冻容器中并转移至-80℃过夜，并且然后转移至-150℃。
解冻细胞：通过将预温热的培养基倒在冷冻的等分试样上来使冷冻的细胞再温热。将小瓶离心(200×g；3分钟)，吸出上清液并将细胞重新悬浮在预温热的10％血清培养基(αmem1x、10％fbs、1％p-s)中。将台盼蓝稀释液添加至细胞等分试样中，并使用countessiifl自动细胞计数器(赛默飞世尔科技公司)测量活力。
实例6：雷公藤红素增加体内对氧化应激诱导的死亡的抵抗力
图27b中给出的结果显示，通过一次或两次腹膜内注射雷公藤红素(1mg/kg；间隔12小时)体内调节斯普拉格-杜勒大鼠剂量依赖性地调节骨髓细胞以抵抗氧化应激诱导的死亡(详情如下)。
如实例5中所述分离间充质干细胞(msc)。
体内调节
斯普拉格-杜勒大鼠(cdcrl；查尔斯河实验室)以12小时间隔接受1或2次雷公藤红素(1mg/kg)或媒剂腹膜内注射。然后处死大鼠并如上所述分离msc。通过重悬于10％血清培养基(αmem1x、10％fbs、1％p-s)中将msc置于培养物中，并使用多通道移液管在96孔板中以每孔4000个细胞的密度接种，并在37℃孵育。每个实验和对照条件一式三份铺板。
然后通过与含有0mm、0.5mm、0.75mm或1mm过氧化氢(acpchemicals公司，h7000)的1％血清培养基一起孵育60分钟来激发细胞。然后根据制造商的方案用使用live/dead试剂盒(赛默飞世尔科技公司)染色的温热αmem1x培养基轻轻洗涤细胞两次。使用高内涵筛选(hcs)系统operetta捕获和分析图像，运行harmony高内涵成像和分析软件版本4.1(铂金埃尔默公司(perkinelmer)，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)。本文给出的结果显示，通过一次或两次注射雷公藤红素体内处理斯普拉格-杜勒大鼠剂量依赖性地调节骨髓细胞以抵抗氧化应激诱导的死亡。
实例7：雷公藤红素保留内皮细胞层活力
收获猪颈动脉，切成闭合环和半圆形开环结构，并在汉克氏平衡盐溶液(hank’sbalancedsaltsolution，hbss)或含有雷公藤红素的hbss中以10e-6m终浓度放置过夜。根据制造商的方案，用live/dead试剂盒(赛默飞世尔科技公司)对颈动脉环进行染色。通过共聚焦显微镜(olympus，fv1000mpe/bk61wf)用20x浸渍物镜对组织成像。还获得了颈动脉内皮细胞表面的z-堆叠。图28显示与没有雷公藤红素的阴性对照(其中箭头指向死细胞和内皮层完整性丧失)相比，具有雷公藤红素的组中保留了内皮细胞层活力和完整性(图28)。
实例8：雷公藤红素诱导细胞保护性介导物
雷公藤红素在各种细胞类型中类似地诱导细胞保护性介导物(存活激酶：pakt/akt，perk/erk；抗氧化剂ho1；热休克反应蛋白：hsf1、hsp70)和蛋白表达动力学(对于10-6m剂量的测试时间为5至120分钟处理，并且在用10-6m雷公藤红素处理1小时后恢复0至24小时)。图29a和29b表示在各种大鼠和人细胞系(h9c2大鼠心肌成肌细胞；人和大鼠msc；大鼠新生心肌成肌细胞；产生ins-1胰岛素的大鼠β细胞系)中进行的蛋白质印迹和活力测定。
更具体地，将ins-1细胞在含有10％fbs的完全培养基(补充有如下过滤溶液的rpmi：1mm丙酮酸钠+50μmb巯基乙醇，10mmhepesultra纯，2mml-谷氨酰胺)中培养。将细胞用胰蛋白酶消化(0.25％胰蛋白酶-edta)，以1500rpm离心5分钟，并重悬于补充有1％fbs的完全ins培养基中。使用血细胞计数器计数细胞，并将1-2百万个细胞重悬于含有9ml的1％fbs完全ins培养基的sarstedt管中，并将2.5ul或5.0ul的1mmhsp90抑制剂(雷公藤红素：开曼化学品公司(caymanchemical)70950，格尔德霉素：开曼化学品公司13355，或根赤壳菌素：开曼化学品公司13089)重悬于dmso中。类似地制备对照样品，但是用2.5ul或5.0ul的dmso媒剂替代hsp90抑制剂。用1％fbs完全ins培养基填充细胞悬浮液的体积至终体积10ml。通过几次倒置轻轻混合悬浮液，并将管置于37℃持续30分钟。15分钟后重复倒置。然后将管以1500rpm离心5分钟，轻轻吸出培养基，然后用12ml温热的rpmi溶液洗涤细胞。将旋转和洗涤循环再重复两次，然后用2.5ml或5.0ml的含有1％fbs的完全ins培养基重悬细胞，分别获得含有1或2百万个细胞的沉淀。接下来，使用多通道移液管，将100ul的细胞悬浮液等分式样(含有40,000个细胞/份)铺板在96孔板中。将每个实验和对照条件一式四次铺板并在常氧或缺氧条件下孵育6小时。通过将培养板置于气密缺氧室(billups-rothenberg)中来实现缺氧(<1％氧气)并用经95％n2平衡的5％co2气体混合物以15-20升/分钟的流速冲洗10分钟。孵育6小时后，将来自缺氧激发和常氧对照培养物的培养基用90ul的10％fbs完全ins培养基替代，并向每个孔中添加10ul的prestoblue试剂。孵育60分钟后，使用酶标仪通过荧光采集定量活力。
这些数据表明，当用致死的缺氧应激激发时，用雷公藤红素对ins-1细胞进行短暂预调节可保护细胞活力(图29c)。
实例9：雷公藤红素拯救大鼠免于lps诱导的致死性血压下降
除了雷公藤红素在减少大鼠梗塞面积和保持心脏功能方面的作用外，申请人还观察了经处理大鼠的血压调节。考虑到本文所述的化合物和组合在保存器官和组织对损害(即缺血性、氧化性、炎性、坏死性损害)和保存全身性压力/灌注的潜力，鉴于与这些病症相关的高水平的器官衰竭和死亡率，它们在休克模型(即化脓性、心源性模型)中的应用将是所期望的。实际上，在美国，每年诊断出超过750,000例严重败血症，死亡率为25％-30％(critcaremed[危重病监护医学]29(7):1303y1310,2001)，这由作为关键表现的多器官衰竭(包括心功能不全)引起(circulation[循环]116(7):793y802,2007)。我们建议在大鼠中添加败血症休克模型(由细菌脂多糖(lps)诱导的内毒素模型)(lifesci.[生命科学],1997；60(15):1223-30)。
简言之，将sd大鼠用异氟烷2.5％-3.0％(雅培实验室，雅培科技园，伊利诺州)，1l/min氧气麻醉，并置于加热毯上以防止体温过低。将左外颈动脉用gelco#20插管并转接到压力传感器。可替代地，根据大小，将左股动脉插管。将大鼠保持在2％异氟烷、1l/min氧气中，并收集基础压力测量值。测定响应通过lps的颈静脉静脉内注射(20至50mg/kg)和腹膜内注射雷公藤红素(1mg/kg)的压力动力学。值得注意的是，动物中lps的剂量可以变化，并且还取决于动物的年龄(infectionandimmunity[感染和免疫],1996年3月,第64卷,第3期,第769页)。在我们的实验中，两只大鼠均以10mg/kg第一次接受lps大剂量推注剂。在两只大鼠的血压(bp)短暂下降后，bp稳定并恢复基线值。然后向不同的大鼠腹膜内注射300ul雷公藤红素(1mg/kg)或媒剂(10％dmso，70％氢化蓖麻油el/乙醇(3:1)，20％pbs)大剂量推注剂(参见箭头；图30在两只大鼠中重新注射10mg/kglps大剂量推注剂之前导致经媒剂处理的大鼠中致命性血压下降，而在接受单次雷公藤红素注射的大鼠中血压得以维持(图30)。
实例10：雷公藤红素诱导大鼠肾脏中hsp32(ho-1)的表达
申请人先前表明，雷公藤红素促进心肌细胞存活、减少损伤和不良重塑，同时保存大鼠缺血心肌中的心脏功能。申请人测试了在其他类型的缺血性疾病中是否可以观察到这种保护作用。
将大鼠在1l/min氧气中用2.0％-3.0％异氟烷麻醉(雅培实验室)，并在加热垫上仰卧位放置。大鼠通过颈外静脉以1mg/kg的剂量接受媒剂溶液或雷公藤红素((开曼化学品公司70950)50mm储备溶液重悬于0,2um过滤器灭菌媒剂：dmso(西格玛公司(sigma)154938)(4％总体积)，pbs1x(96％总体积))的单次大剂量注射。将大鼠剃毛，将眼用软膏施用于角膜，并且在开始于胸骨基部至脐点的3-4cm切口部位注射布比卡因(2mg/kgs.c.)。用牵开器保持切口张开，并用无菌盐水阻尼纱布包裹肠。分离左肾(kl)并用血管夹封闭肾动脉。在腹腔中替换肠，并用临时3-0缝合线(ethicon)缝合皮肤。大鼠接受盐酸丁丙诺非(0.05mg/kgsc)并用1.0％-2.0％异氟烷(雅培实验室)在1l/min的氧气中维持30分钟的缺血，并在取出夹子后再灌注另外45分钟。通过用40mmkcl补充的盐水灌注来给大鼠抽血并收集器官，在冷的磷酸盐缓冲盐水(pbs1x)中冲洗，保存在用pbs缓冲的10％福尔马林中过夜，用于石蜡包埋用于组织学/免疫组织切片或在液氮中快速冷冻用于蛋白质印迹表达分析。
本文提供的蛋白质印迹分析的结果证明单次注射雷公藤红素(1mg/kg)在60分钟内诱导大鼠肾脏中hsp32(ho-1)的表达(图31)。此外，雷公藤红素增加了经历肾缺血的大鼠的非结扎对照肾(kr)中hsp70的表达，表明敏感性和细胞保护性反应增加。这种现象特别令人感兴趣，因为它表明在临床干预期间赋予全身性细胞保护的可能性类似于远程调节，可能产生全身性神经-体液保护介导物，从而减少潜在的相关并发症(例如由外科手术引起的中风发生)。
实例11：雷公藤红素和雷公藤红素类似物对细胞活力及针对应激和损害的保护作用的影响
申请人测试了雷公藤红素或雷公藤红素类似物对h9c2大鼠心肌成肌细胞的和心肌梗塞大鼠模型中的缺氧培养物的影响。雷公藤红素或雷公藤红素类似物与助剂的组合可以以类似的方式测试。
体外研究
细胞培养和刺激：
对于针对缺氧激发和氧化激发的存活，使h9c2心肌成肌细胞经受缺氧/血清饥饿(在低血清培养基中在缺氧室<1％o2中持续48小时)或氧化应激(在掺入0-1mmh2o2的培养基中孵育1小时)。使用live/dead测定评估h9c2细胞的存活状态。
接下来，进行缺氧/再氧化激发。简言之，如先前报道的，在大鼠h9c2心肌成肌细胞中进行活力分析。对于缺氧/再氧化应激，将细胞在无葡萄糖dmem(生命技术公司(lifetechnologies))中培养，血清饥饿并置于缺氧条件(<1％o2)18小时。在再氧化(常氧条件)下，将细胞用雷公藤红素(10-10至10-6mol/l，开曼化学品公司，安阿伯，密歇根州)，雷公藤红素类似物或媒剂(二甲基亚砜(dmso)，加拿大西格玛奥德里奇公司(sigma-aldrich)，奥克维尔，安大略省；终浓度<1％v/v)在dmem高葡萄糖1％fbs中处理1小时，然后在dmem高葡萄糖中再继续再氧化5小时。
图32中给出的结果显示雷公藤红素(1um)(雷公藤红素1c：从商业来源购买；雷公藤红素2和3用于产生合成类似物)和雷公藤红素类似物3(1um)、类似物1(1um)、类似物2(1um)和类似物4(1um)有效保护h9c2心肌成肌细胞免受缺氧和缺氧/再氧化应激。
实例12：雷公藤红素和雷公藤红素类似物用于治疗缺血性疾病
将路易斯(lewis)大鼠(250-300g，查尔斯河实验室(charlesriver)，圣斯坦市，魁北克省(stconstant，qc))用于所有离体和体内实验。根据实验动物护理和使用指南处理所有动物。
离体研究
分离的灌注心脏制备：
将大鼠随机分配到以下组：媒剂(n＝6)，雷公藤红素或雷公藤红素类似物10-8、10-7或10-6mol/l(n＝5每组)。在异氟烷麻醉下，给大鼠注射肝素(i.p，1000i.u，诺华公司(novartis)，多瓦尔市，魁北克省(dorval，qc))并收获心脏并立即浸没在冰冷的krebs缓冲液中(以mmol/l计：nacl113，kcl4.5，nah2po41.6，cacl21.25，mgcl2+6h2o1，d-葡萄糖5.5，nahco325)。使用langendorff系统(radnoti公司，蒙罗维亚，加利福尼亚州(monrovia，ca))逆行灌注心脏，恒定主动脉压为60-70mmhg，使用krebs缓冲液(37℃)，用5％co2平衡的o2鼓泡。将连接到压力传感器的乳胶球囊插入左心室(lv)并调节至15mmhg(lv预负荷)。使心脏以300bpm的速度跳动并允许稳定化20分钟。
使用powerlab8/30多种波动描记器(adinstruments公司，科罗拉多泉，科罗拉多州)连续测量室内压，使用labchartprov.7.3.7(ad仪器)记录和分析。
为了确保雷公藤红素、雷公藤红素类似物或媒剂(dmso)在再灌注开始时与心脏接触，在诱导暖性全身缺血时启动系统，通过停止心脏起搏和灌注30分钟实现。使用krebs缓冲液和雷公藤红素(10-8、10-7或10-6mol/l)或媒剂开始再灌注10分钟，然后继续再灌注(krebs缓冲液)，持续总时间为120分钟。
在稳定化结束时，在再灌注5分钟时收集心脏流出物5分钟，并且然后每15分钟收集一次，持续总共60分钟。测量体积并将样品保持在-80℃直至分析。
在再灌注结束时，将心脏横向切片(1-2mm)，并在37℃用ph7.4的磷酸盐缓冲盐水(ttc，加拿大西格玛-奥德里奇公司(sigma-aldrich))中的5％2,3,5-三苯基-四唑氯化物染色20分钟15。称重切片，然后使用耦合到axiocamerc5s相机的stemi508立体显微镜拍摄图像，并用zen2.3成像软件(加拿大卡尔蔡司公司(carlzeiss)，多伦多市，安大略省)处理。使用imagej1.51h免费软件(nih，贝塞斯达，马里兰州)进行分析。将梗塞面积归一化至心脏组织切片的重量。将一个切片/心脏快速冷冻用于基因和蛋白质表达。
图33a至33h中所示结果指示，与暖性全身心肌缺血再灌注后的媒剂(dmso)处理相比较，雷公藤红素(10-7mol/l，最佳剂量)和类似物1(10-8mol/l剂量)保护心脏免于i/r诱导的收缩功能障碍，如通过a,b)+/-dp/dt、c)产生的压力(最大-最小压力)、d)舒张末期压力(edp)、和e)收缩指数变化所示。f)冠状动脉储备血流(crf)随着处理保留，g)高敏感性肌钙蛋白t(tnt-hs)释放和h)与i/r损伤后媒剂(dmso)处理的心脏相比，雷公藤红素和类似物治疗组中通过ttc染色测量的梗塞面积显著减小。
体内研究
将大鼠随机分配到以下组：假手术组(n＝6)，媒剂组(n＝8)，雷公藤红素1mg/kg(n＝6)或雷公藤红素类似物。在2％异氟烷麻醉下，使用具有12mhz换能器的sonos5500成像系统(philips，飞利浦医疗保健公司(philipshealthcare)，安多佛，马萨诸塞州，美国)如所述进行基线超声心动图检查12。所有测量均由同一位经验丰富的观察者获得，对治疗不知情。对于每次测量，分析三至五个心动周期并计算其平均值。
超声心动图后，将动物插管并机械通气，然后注射布比卡因2mg/kg，并进行左胸廓切开术，暴露心脏。使用5-0丝状活结使左前降支冠状动脉闭合。视觉上变白和心电图改变证实了心肌缺血。在假手术动物中，缝合未结扎。30分钟后，松开缝合闭合。将雷公藤红素、雷公藤红素类似物或媒剂心室内注射用于急性全身递送，然后关闭胸腔。在手术结束时注射丁丙诺啡(0.05mg/kgsc)和卡洛芬(5mg/kgsc)。让动物恢复24小时，然后进行第二次超声心动图检查。处死动物，快速冷冻心脏组织，并将血液收集在肝素化管中，然后在4℃离心。收集血浆，快速冷冻并保持在-80℃直至分析。
图34的结果指示，与媒剂(dmso)处理的动物相比，通过保留a)射血分数(ef)、b)心输出量(co)、c)缩短分数(fs)和d)每搏输出量(sv)，雷公藤红素(1mg/kg)和类似物1(1mg/kg)保护i/r损伤后的心脏功能，这些雷公藤红素的体内保护作用与心脏保护性hsp70和ho-1的组织表达显著增加有关。
统计分析
数据表示为平均值±标准误差或中值，置信区间为95％。将anova测试用于非重复测量的组比较。对于重复测量，使用线性混合效应模型来比较各组(sas软件中的mixed程序，版本9.3；sas机构，cary，nc，usa)。评估组间差异。对于非正态分布的测量值，例如指数和比率，使用测量值的对数变换。对于血液动力学测量，在模型中使用多达200次测量/大鼠/时间点，每个单次测量值相应地加权(即1/200)。对于所有分析，p<0.05被认为具有统计学意义。
实例13：雷公藤红素和雷公藤红素类似物在hsr和are元件的控制下调节基因的表达
根据制造商的方案，将h9c2大鼠心肌成肌细胞以每孔5,000个细胞的密度接种在dmem10％fbs完全培养基中的96孔板中并使用脂质体用cignal报告测定热休克反应和抗氧化反应试剂盒(sabiosciences，凯杰公司(qiagen))进行转染。第二天，将雷公藤红素、类似物和各种其他化合物一式三份添加到在dmem1％fbs培养基中的孔中持续4小时，添加剂量范围为10e-5至10e-10m，然后清除完全培养基持续3小时，之后使用双荧光素酶测定法(普洛麦格公司(promega))测量信号传导活性。图35中总结结果显示，雷公藤红素(雷公藤红素1c：从商业来源购买；雷公藤红素2和3用于产生合成类似物)和雷公藤红素类似物1、类似物3和类似物4属于用于刺激报告基因的表达的最强和最有效的测试化合物，所述基因部分受健康休克反应元件(hsr)或抗氧化反应元件(are)的控制。
尽管上文已经通过其特定实施例的方式描述了本发明，但是在不脱离所附权利要求限定的本发明的精神和本质的情况下，可以对其进行修改。在权利要求中，词语“包含”用作开放式术语，基本上等同于短语“包括但不限于”。除非上下文中另外明确指明，否则单数形式“一个/种(a/an)”和“所述(the)”包括相应的复数个指示物。
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