髓鞘再生疗法的制作方法

本申请要求2016年8月12日提交的标题为“remyelinationtherapy(髓鞘再生疗法)”的美国临时申请序列号62/374,270和2016年12月6日提交的标题为“remyelinationtherapy(髓鞘再生疗法)”的美国临时申请序列号62/430,357的优先权，所述临时申请各自的内容以引用方式并入。

发明背景

在各种脱髓鞘疾病诸如多发性硬化(ms)中，包围神经纤维的髓鞘包被层被免疫系统或其他因素攻击和伤害。髓鞘修复或髓鞘再生是由产生髓鞘的少突胶质细胞进行的。在健康动物中，发生脱髓鞘过程之后，少突胶质细胞祖细胞(opc)被活化并成熟为产生髓鞘的少突胶质细胞，这些产生髓鞘的少突胶质细胞包裹轴突并将髓鞘重新施加于受伤害区域。

然而，在各种脱髓鞘疾病诸如ms中，髓鞘再生过程不足并且髓鞘伤害随时间推移而累积，导致严重的变性。普遍认为髓鞘再生失败不是opc募集和/或向脱髓鞘组织迁移受损所造成的。相反，据信opc分化和膜包裹失败是阻碍脱髓鞘疾患中髓鞘修复的关键障碍。

当前的ms治疗解决了疾病的潜在炎性组分，但迄今为止，对于轴突修复或髓鞘再生还没有获得批准的疗法。因此，本领域一直以来迫切需要有效的髓鞘再生疗法。

技术实现要素：

本公开的发明人有利地开发了促进髓鞘再生的新疗法。在第一方面，本公开的发明人已经鉴定出某些促进髓鞘再生的选择性雌激素受体调节剂(serm)。在另一方面，本公开的发明人已经确定gpr56(一种在某些细胞中有活性的g偶联蛋白受体)是髓鞘再生过程的介体，并且该受体的激动剂可以促进脱髓鞘组织中的髓鞘再生和相关过程。

另外，本公开的发明人已经确定，将髓鞘再生serm或gpr56激动剂与雌激素物质组合施用可进一步促进髓鞘再生。

在一方面，本发明的范围涵盖包含髓鞘再生serm的新治疗组合物。在一方面，本发明的范围涵盖包含gpr56激动剂的新治疗组合物。在一方面，本发明的范围涵盖新治疗组合物，所述新治疗组合物包含髓鞘再生serm，还充当gpr56激动剂

在另一方面，本发明的范围涵盖使用髓鞘再生serm和/或gpr56激动剂来治疗脱髓鞘疾患、促进髓鞘再生以及促进少突胶质细胞前体分化的新方法。

附图说明

图1.bima微柱测定结果示出响应于各种剂处理对pdgfrα(指示opc)或髓鞘碱性蛋白(mbp)(指示髓鞘形成少突胶质细胞)染色呈阳性的环的百分比。

图2.bima微柱测定结果示出在有无雌二醇的情况下，以不同剂量的bza处理的细胞中对mbp染色呈阳性的环的百分比。

图3.在溶血卵磷脂诱导脱髓鞘且随后用bza处理之后，在大鼠胼胝体中的腺瘤性结肠息肉(apc-成熟少突胶质细胞的制造者)阳性细胞密度和olig2(少突神经胶质细胞谱系的标记物)细胞密度。

图4a、图4b、图4c和图4d.图4a、图4b、图4c和图4d示出了在用bza处理培养物中生长的分离的opc后mbp阳性细胞的百分比。图4a示出了野生型细胞中的bza响应，图4b示出了erα敲除细胞中的bza响应，图4c示出了erβ敲除细胞中的bza响应，且图4d示出了erα/erβ双敲除细胞中的bza响应。

具体实施方式

脱髓鞘疾病.在一方面，本发明的各种实施方案涉及脱髓鞘疾患的治疗。如本文所用，脱髓鞘疾患是指其中发生脱髓鞘，即发生对包围神经纤维的保护性髓鞘的伤害的任何疾病状态、自身免疫病症或过程。通常，这种伤害是由未知来源的自身免疫过程引起的。

在一个实施方案中，脱髓鞘疾患是中枢神经系统的疾患。在一个实施方案中，脱髓鞘疾病是髓鞘破坏性病症。在一个实施方案中，脱髓鞘疾患是ms。在其他实施方案中，脱髓鞘疾病可以是德维克病(devic'sdisease)、炎性脱髓鞘疾病或急性播散性脑脊髓炎。脱髓鞘疾患可包括脑白质营养不良病症。脱髓鞘疾患可包括中枢神经系统神经病变、脑桥中央髓鞘溶解或进行性多灶性脑白质病。本发明的组合物和方法还可用于促进周围神经系统脱髓鞘疾患中的髓鞘再生。

髓鞘再生组合物.本公开的发明人已经鉴定出某些可以充当髓鞘再生剂的物质组合物。本发明的范围涵盖在本文中称为“髓鞘再生组合物”的物质的施用。髓鞘再生组合物包含一种或多种髓鞘再生剂。

在第一方面，髓鞘再生组合物包含具有髓鞘再生活性的serm。此类组合物在本文中将称为“髓鞘再生serm”。serm是已知作用于雌激素受体的组合物，它们具有组织特异性作用，例如，在一些组织中充当雌激素剂，在其他组织中起抗雌激素作用。

在第二方面，髓鞘再生组合物包含gpr56激动剂。如本领域已知的，gpr56是在各种组织中有活性的g偶联蛋白受体。gpr56蛋白质序列的登录号为q9y653，genecardid为gc16p057610，ncbi参考序列为ng_011643.1。gpr56还被称为粘附g蛋白偶联受体g1和tm7xn1。

gpr56先前已显示与发育期间的脑皮层图案化、卵巢发育、细胞粘附、细胞-细胞相互作用以及骨髓微环境中的造血干细胞和/或白血病干细胞的维持有关。先前未曾报道过gpr56在髓鞘形成中的作用。

本公开的发明人有利地确定了gpr56与髓鞘再生有关。具体地，已经鉴定了某些髓鞘再生组合物，所述髓鞘再生组合物包含serm并且还充当gpr56激动剂。此发现为本领域提供了各种治疗方法、已知化合物的二次使用以及可用于促进髓鞘再生的其他有价值的发明。

本发明的各种实施方案涉及gpr56激动剂对gpr56的活化。如本文所用，激动剂是指结合gpr56并在少突神经胶质细胞或其他细胞中诱导一种或多种gpr56相关髓鞘形成过程的任何物质组合物。gpr56激动剂可以是小分子、生长因子、多肽、核酸或任何其他化学或生物物质组合物。

如本文所用，gpr56激动剂还将指代gpr56下游效应子的激动剂、活化剂和增强剂，即受gpr56活化调节并且有助于gpr56活化所诱导的髓鞘再生反应的物质的活化剂。

本公开的发明人有利地鉴定了几种髓鞘再生组合物。髓鞘再生组合物包含髓鞘再生serm，并且还包含推定的gpr56激动剂。

第一种髓鞘再生组合物是巴多昔芬(bazedoxifene)。巴多昔芬(bza)是一种选择性雌激素受体调节剂(serm)，其与结合雌激素的组合已被批准用于治疗绝经后骨质疏松症和绝经期潮热。bza与结合雌激素组合具有良好的耐受性，例如，副作用小于他莫昔芬(tamoxifen)。

第二种髓鞘再生组合物是雷洛昔芬(raloxifene)。雷洛昔芬是fda批准的用于预防骨质疏松症及用作绝经后女性的乳腺癌预防物的药物。

第三种髓鞘再生组合物是克罗米芬(clomifene)。克罗米芬是fda批准的用于女性生育治疗的药物。

第四种髓鞘再生组合物是托瑞米芬(toremifene)。托瑞米芬是fda批准的用于治疗乳腺癌的药物。

第五种髓鞘再生组合物是拉索昔芬(lasofoxifene)。拉索昔芬是eu批准的药物，已在治疗骨质疏松症、预防乳腺癌和阴道萎缩方面显示出功效。

第六种髓鞘再生组合物是欧司哌米芬(ospemifene)。欧司哌米芬已获fda批准用于治疗性交困难。

第七种髓鞘再生组合物是二芳基丙腈。二芳基丙腈是雌激素受体激动剂，并且是内源性催产素系统的活化剂。

第八种髓鞘再生组合物激动剂是他莫昔芬。他莫昔芬广泛用于治疗某些乳腺癌。

有趣的是，前面列出的每种化合物都是serm。然而，本公开的发明人已经确定这些serm的髓鞘再生作用的介导与α或β雌激素受体无关。如下文实施例中所述，即使在已经敲除了两种形式的er的细胞中，这些化合物也在少突胶质细胞中诱导髓鞘再生。因此，由这些化合物诱导的髓鞘再生作用在很大程度上与er活性无关，并且据信主要或完全借助gpr56活化的作用。

本发明的范围涵盖各种髓鞘再生组合物组合物。在一个实施方案中，本发明的范围涵盖一种药物组合物，所述药物组合物包含用于治疗脱髓鞘疾患的髓鞘再生组合物。在一个实施方案中，髓鞘再生组合物是髓鞘再生serm。在一个实施方案中，髓鞘再生组合物是gpr56激动剂。在一个实施方案中，髓鞘再生组合物是选自由以下组成的组：巴多昔芬、雷洛昔芬、克罗米芬、欧司哌米芬、拉索昔芬、二芳基丙腈、托瑞米芬和他莫昔芬，它们是髓鞘再生serm并且充当gpr56激动剂。

与雌激素共同施用.本公开的发明人已经确定当与雌激素物质共同施用时，髓鞘再生组合物的髓鞘再生作用得到增强。本领域已知ms具有雌激素组分，这是基于各种关联，诸如女性与男性的ms发病率增加，而绝经后女性的ms发病率降低。然而，雌性激素在ms中的作用尚不清楚，且仅施用雌性激素尚未显示能有效治疗脱髓鞘疾患。因此，雌性激素与髓鞘再生组合物组合所带来的惊人的髓鞘再生增强为本领域提供了效力增加的髓鞘再生疗法。

共同施用的雌激素剂可包含任何雌性激素或雌激素物质，例如像雌激素、雌二醇、结合雌激素、雌三醇、雌激素模拟物、雌酮、乙炔雌激素和雌激素激动剂。

本发明的方法.本发明的范围涵盖利用髓鞘再生组合物来促进髓鞘再生过程的各种方法。本文公开的方法涵盖向受试者施用髓鞘再生组合物。

这种施用可涵盖施用药学有效量的髓鞘再生组合物，即施用足以对一种或多种髓鞘再生过程产生可测量作用的量。例如，可以使用产生1nm至1mm(例如在5nm至500nm范围内)的生理浓度的髓鞘再生组合物剂量。对于与髓鞘再生组合物组合的雌激素剂，示例性剂量包括产生1至100微摩尔的生理浓度的剂量。

施用的受试者可以是任何动物，例如人、兽医受试者或试验动物。在一个实施方案中，受试者是患有脱髓鞘疾患或有患脱髓鞘疾患风险并且需要治疗的人。本发明的范围还扩展到向细胞、细胞培养物和外植组织施用髓鞘再生组合物。在一个实施方案中，本发明的范围涵盖如本领域已知的在微柱测定中向少突胶质细胞施用髓鞘再生组合物。

在一些实施方案中，髓鞘再生组合物的施用将被称为增加、增强或以其他方式改变髓鞘形成相关过程的量级。这种变化可以相对于在未治疗的对照中或在治疗前的受试者中观察到的髓鞘形成相关过程的量级来定义。

在一方面，本发明的范围涵盖一种通过施用髓鞘再生组合物来治疗受试者的脱髓鞘疾患的方法，其中所述髓鞘再生组合物是髓鞘再生serm、gpr56激动剂，或者是髓鞘再生serm和gpr56激动剂两者。另选地，本发明的范围可涵盖髓鞘再生组合物用于治疗受试者的脱髓鞘疾患的用途，其中所述髓鞘再生组合物是髓鞘再生serm、gpr56激动剂，或者是髓鞘再生serm和gpr56激动剂两者。如本文所用，治疗可包括例如：治愈脱髓鞘疾患；改善与脱髓鞘相关的症状(例如神经信号破坏、轴突伤害和神经变性)；减缓脱髓鞘疾患的进展；预防或延迟有风险受试者的脱髓鞘疾患的发作；预防髓鞘进一步丧失；或者在治疗前恢复髓鞘丧失。这种治疗或使用可以与施用一种或多种雌激素剂组合。

在一方面，本发明的范围涵盖一种通过向患有脱髓鞘疾患的受试者施用髓鞘再生组合物来增强所述受试者的轴突髓鞘再生的方法。如本文所用，增强是指增加髓鞘再生的程度，例如增加轴突上髓鞘的厚度；增加轴突包裹的速率或分布；增加髓鞘再生的速率；或增加治疗区域中髓鞘再生轴突的数量。这种施用可以与一种或多种雌激素剂组合。

在一方面，本发明的范围涵盖一种通过向受试者施用髓鞘再生组合物来增强所述受试者中opc向髓鞘形成少突胶质细胞的分化的方法。如本文所用，增强的分化可以指opc向产生髓鞘的少突胶质细胞的分化的任何量度的增加，包括例如分化的少突胶质细胞与opc的比例增加，例如mbp表达细胞的增加或pdgfrα表达细胞的比例的降低。这种施用可以与一种或多种雌激素剂组合。

在另一方面，本发明的范围涵盖一种使用髓鞘再生组合物来制造用于治疗脱髓鞘疾患的药剂的方法。例如，用于治疗脱髓鞘疾患的药物组合物可包含一种或多种髓鞘再生组合物，所述一种或多种髓鞘再生组合物与一种或多种另外的药学上可接受的元素组合配制或混合。例如，髓鞘再生组合物可与诸如载体、赋形剂、稀释剂、缓冲剂、盐或释放调节剂的组合物以及雌激素组合物组合。

实施例.

实施例1.髓鞘再生serm的鉴定。使用bima(使用微柱阵列的二元髓鞘形成指示剂(binaryindicantformyelinationusingmicropillararrays))测定测试各种serm和其他化合物的髓鞘再生作用，该测定是一种利用独立式压缩二氧化硅微柱阵列的功能性高通量筛选，在微柱阵列的周围由少突胶质细胞产生的膜包裹的髓鞘“环”可在横截面中可视化。bima允许忽略掉神经元和其他因素的间接作用测试化合物对少突胶质细胞的直接作用。

用opc培养微柱，并测定100个微柱的每个场中mbp阳性环或pdgfrα阳性环的数量。结果在图1中示出。误差线表示均值±s.e.m.*p<0.05，显著性基于利用相应对照的学生t检验。以500nm-1μm之间的浓度筛选另外七种serm或雌激素衍生物，对少突胶质细胞分化或膜包裹没有任何显著作用。

实施例2.bza促进少突胶质细胞分化将纯化的opc培养并用不同浓度的bza(单独的或连同雌二醇)处理48小时，并针对mbp、pdgfrα和dapi进行免疫染色。处理后mbp阳性细胞百分比的定量在图2中示出。误差线表示均值±s.e.m.，*p<0.05，**p<0.01，显著性基于利用相应对照的学生t检验。

实施例3.opc分化。为了评定所选择的serm对髓鞘形成的作用，使用先前验证的方法从wtp7大鼠幼仔中获得opc，分离培养，并用选择的一组serm以500nm的初步浓度处理48小时。然后将细胞透化并针对mbp(少突胶质细胞)、pdgfrα(opc)和dapi(细胞体)进行免疫染色。测试的每种serm((2,3-双(4-羟基苯基)-丙腈、bza和他莫昔芬)在该浓度下显著增强opc分化(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)。另外，将opc与背根神经节神经元(drg)共培养，随后每3天用500nmbza进行处理。将共培养物固定、透化并染色。bza显著(p<0.001)增强共培养系统中的opc分化和后续髓鞘形成，显示出对opc分化和髓鞘形成的强烈作用。

实施例4.对人esc产生的opc进行bza处理。从人esc产生人opc，并将其在存在或不存在bza(500nm)的情况下培养10天。然后针对o4和mbp对细胞进行染色。用bza处理后mbp阳性少突胶质细胞的数量显著增加。

实施例5.bza对opc分化的作用。将溶血卵磷脂注射到小鼠的胼胝体中并在注射后6天进行分析，显示出脱髓鞘损害区域。注射溶血卵磷脂后，用bza(10mg/kg)或媒介物对照处理小鼠，持续7天。在注射后10天对小鼠实施安乐死，并对脑进行切片且针对髓鞘少突胶质细胞糖蛋白肽(mog)、腺瘤性结肠息肉(apc-成熟少突胶质细胞的制造者)和olig2进行免疫染色。如图3所示，对apc阳性细胞的定量表明用bza处理后胼胝体中的髓鞘再生增加了2倍。

实施例6.bza对髓鞘再生动力学的作用。使用先前描述的方法，在8周龄成年小鼠的胼胝体中诱导毒性、灶性脱髓鞘损伤，评定髓鞘再生的速率和程度。通过注射1μl的1％溶血卵磷脂溶液来诱导脱髓鞘。这种脱髓鞘模型的关键是修复时间表，包括活性脱髓鞘[1-3dpl(损害后天数，dayspostlesion)]、opc募集(3-7dpl，在5dpl时达到峰值)、少突胶质细胞分化(7-10dpl)以及活性髓鞘再生(14-21dpl)。分析10dpl时的少突胶质细胞分化和髓鞘再生，从而评定bza对髓鞘修复动力学的作用。在注射溶血卵磷脂后，将bza通过口服强饲法以10mg/kg/天的浓度施用给成年小鼠，持续7天。在10dpl时将动物处死并进行灌注。mog和cc1/apc免疫染色表明，与媒介物处理的同窝仔畜对照相比，在10dpl时在bza处理的小鼠的损害中分化增强且少突胶质细胞显著更多。这些发现进一步表明在脱髓鞘侵害后bza极大地促进分化并加速髓鞘再生的动力学。

实例7.髓鞘再生作用与雌激素受体活性无关。

从雌激素受体α(erα)或β(erβ)缺陷型p7小鼠以及双敲除动物分离opc。通过基因分型进入esr1或esr2基因(分别编码erα和erβ的基因)的插入盒确认敲除动物。将opc分离培养，并用500nmbza处理48小时。然后将细胞透化并针对mbp(少突胶质细胞)、pgfrα(opc)和dapi(细胞体)进行免疫染色在20x放大率下定量mbp/dapi+细胞/总细胞。使用双尾学生t检验确定显著性(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)。与对照相比，bza显著增强野生型小鼠(图4a)、erα缺陷型小鼠(图4b)、erβ缺陷型小鼠(图4c)和erα/erβ缺陷型小鼠(图4d)中的opc分化。这些结果表明，er并非serm髓鞘再生剂引发髓鞘再生作用所必需的。

实施例8.髓鞘再生serm活化gpr56。由于先前的发现表明serm不通过雌激素受体发挥作用，因此采用整合了化学和分子谱的生物信息学方法执行生物信息学筛选来鉴定促进髓鞘再生的髓鞘再生serm的分子靶标。具体地，该分析旨在鉴定雌激素衍生物(单独的雌激素衍生物对髓鞘形成没有作用)与髓鞘再生serm之间的非重叠靶标。鉴定的最佳候选物是gpr56，这是一种先前被认为在少突胶质细胞发育中起作用的粘附gpcr。初步数据表明，gpr56是髓鞘再生serm促进髓鞘再生作用的分子靶标。

本说明书中引用的所有专利、专利申请和出版物均以引用方式并入本文，其程度如同每个独立专利申请或出版物被具体和单独地指出以引用方式并入。所公开的实施方案是出于说明而非限制的目的而给出的。虽然已经参考所描述的本发明的实施方案描述了本发明，但是本领域技术人员将理解，在不脱离本发明作为整体的精神和范围的情况下，可以对本发明的结构和元素进行修改。