专利名称：鉴定或辅助鉴定鸭组织和/或器官的pcr引物对及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及鉴定或辅助鉴定鸭组织和/或器官的PCR引物对及其应用。
背景技术：
目前在国内生肉和肉制品的生产和销售领域，一些不法商贩为了牟取暴利，利用掺杂掺假等手段欺骗消费者的事件时有发生。比如用售价低廉的鸭肉冒充售价比较贵的牛肉和羊肉等。因此一套快速、准确鉴别肉种类，并且能够适应混合肉制品鉴定的方法，无疑会为执法人员提供了强大的技术支撑。传统的肉制品鉴定的方法主要是基于蛋白质水平的分析，包括电泳法、免疫法、 ELISA等技术。操作过程中首先需制备相应物种的抗体，然后抗原和抗体间进行免疫反应， 最后通过电泳或者显色等方法进行鉴别。这类鉴别技术受蛋白质(主要起作用的部分为抗原决定簇)结构的影响很大，实际应用中经常出现的问题包括1.热加工过程会改变蛋白质(抗原决定簇)的结构，因而无法检测热加工的肉类；2.对混合肉类的检测可能出现交叉反应，因为不同物种蛋白质的结构可能具有某种程度的相似性，检验的灵敏程度取决于制备的抗体的特异性强弱。基于以上原因，以核酸为基础的检测方法成为近几年食品检测领域的发展方向， 包括DNA分子杂交法和PCR方法等。DNA分子杂交法操作复杂，且成本较高，目前以逐渐被 PCR方法所取代。PCR方法灵敏度高、特异性强，可对混合肉类进行鉴别和区分，即使掺杂少量异种肉，也能用PCR方法加以鉴别；PCR方法可用于热加工的肉制品鉴别当中，高温过程仅仅打断了核酸的片断，并不会完全降解核酸，因而热加工的肉制品当中仍然存在可扩增的模板，这在饲料工业肉骨粉来源的鉴别过程中得到了很好的证实；PCR反应的迅速，结果易于观测，使得这种检测方法目前广泛应用在饲料、保健品的动物源性成分的鉴别当中。目前，也有PCR-RFLP方法鉴定鸭肉的报道，其通过脊椎动物的通用引物扩增并通过限制性片段长度多态分析鉴别，但技术相对复杂，且在判断时，观测直观性较差。PCR技术中，引物设计是PCR成功的关键因素，好的引物将使检测实验更加快捷， 结果更加清晰。
发明内容
本发明的目的是提供鉴定或辅助鉴定鸭组织和/或器官的PCR引物对，以及利用该引物对鉴定待测动物组织和/或器官中是否掺杂鸭组织和/或器官的方法。本发明所提供的鉴定或辅助鉴定鸭组织和/或器官的PCR引物对，它由两条单链 DNA组成，为如下1)或2)1)所述两条单链DNA是序列表中序列1所示的单链DNA，和序列表中序列2所示的单链DNA ；2)所述两条单链DNA是序列表中序列1的反向互补序列所示的单链DNA，和序列表中序列2的反向互补序列所示的单链DNA。
含有上述引物对的PCR试剂和试剂盒均属于本发明的保护范围。为了提高鉴定或辅助鉴定鸭组织和/或器官的试剂盒的准确性，所述试剂盒还含有限制性内切酶Hind III。上述PCR引物对的制备方法也属于本发明的保护范围。该制备方法具体可包括将所述PCR引物对中所述两条单链DNA分别单独包装的步骤。上述鉴定或辅助鉴定鸭组织和/或器官的试剂盒的制备方法也属于本发明的保护范围。该制备方法具体可包括如下步骤上述PCR引物对中所述两条单链DNA分别单独包装后，与下述物质中的至少一种物质包装在同一试剂盒内PCR反应缓冲液、DNA聚合酶和 4 种 dNTP(dATP, dTTP, dCTP 和 dGTP)和限制性内切酶 Hind III。本发明所提供的鉴定或辅助鉴定离体的待测动物组织和/或器官中是否掺杂鸭组织和/或器官的方法，包括如下步骤用上述PCR引物对PCR扩增线粒体基因组上的细胞色素氧化酶亚基III基因片段，检测所得到的PCR产物的大小，如果PCR产物的大小是 300-400bp，所述待测动物组织和/或器官中掺杂有鸭组织和/或器官，或所述待测动物组织和/或器官中候选掺杂有鸭组织和/或器官。所述PCR扩增中的模板具体可为待检测的动物组织和/或器官的基因组DNA。检测所得到的PCR产物的大小的方法具体可为将所得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，如果所述PCR产物在琼脂糖凝胶电泳上显示为300-400bp之间的一条带，所述待测动物组织和/或器官中掺杂有鸭组织和/或器官，或所述待测动物组织和/或器官中候选掺杂有鸭组织和/或器官。为了进一步提高上述方法的准确性，所述方法在所述检测所得到的PCR产物的大小之后，还可包括将大小为300-400bp的所述PCR产物用Hind III进行酶切鉴定的步骤， 如果所述PCR扩增产物可被Hind III酶切为两段，所述待测动物组织和/或器官中掺杂有鸭组织和/或器官，或所述待测动物组织和/或器官中候选掺杂有鸭组织和/或器官。所述待测动物组织和/或器官具体可来源于下述至少一种动物牛、羊、猪和鸡。所述待测动物组织和/或器官具体可为结缔组织(如血液)、肌肉组织、毛发。所述鸭组织和/或器官具体可为结缔组织(如血液)、肌肉组织、鸭绒、鸭毛。本发明的检测方法特异性强，能鉴别牛、羊、猪和鸡中掺杂的鸭组织和/或器官。 整个结果清晰、可信度高。本发明的方法检测过程耗时短，从提取基因组到酶切结束，仅仅需要一天的时间(样品数量多时酌情延长)。
图1为牛、羊、猪、鸡、鸭5种肉类基因组的提取结果。从左至右的六条泳道分别为DNA分子量标准DL15000，牛(黄牛，Bos taurus)、羊 (绵羊，Ovis aries)、猪(家猪，Sus scrofa)、鸡(原鸡，Gallus gallus)、鸭(北京鸭，Anas platyrhynchos)的基因组电泳图。图2为鸭特异引物PCR检测牛、羊、猪、鸡、鸭肌肉样品结果。从左至右的六条泳道分别为DNA分子量标准50bp Ladder,牛(黄牛，Bos taurus)、羊(绵羊，Ovis aries)、猪(家猪，Sus scrofa)、鸡(原鸡，Gallus gallus)、鸭 (北京鸭，Anas platyrhynchos)的 PCR 结果。
图3为鸭特异引物PCR扩增特异性片段的酶切结果。从左至右的三条泳道分别为DNA分子量标准50bp Ladder，鸭(北京鸭，Anas platyrhynchos)肌肉的PCR产物，该PCR产物的酶切结果。图4为鸭特异引物PCR检测掺杂0. 鸭肉的牛肉和纯牛肉。从左至右的三条泳道分别为DNA分子量标准50bp Ladder,纯牛肉，掺杂0. 1 %鸭肉的牛肉作为添加组。图5为鸭特异引物PCR检测掺杂0. 鸭肉的羊肉和纯羊肉。 从左至右的三条泳道分别为DNA分子量标准50bp Ladder,纯羊肉，掺杂0. 1 %鸭肉的羊肉作为添加组。图6为鸭特异引物PCR检测掺杂0. 鸭肉的猪肉和纯猪肉。从左至右的三条泳道分别为DNA分子量标准50bp Ladder,纯猪肉，掺杂0. 1 %鸭肉的猪肉作为添加组。图7为鸭特异引物PCR检测掺杂0. 1 %鸭肉的鸡肉和纯鸡肉。从左至右的三条泳道分别为DNA分子量标准50bp Ladder,纯鸡肉，掺杂0. 1 %鸭肉的鸡肉作为添加组。图8为鸭特异引物PCR检测鸭绒毛。从左到右的两条泳道分别为DNA分子量标准50bp Ladder,鸭绒毛的PCR结果。图9为鸭特异引物PCR检测绍兴鸭、绿头鸭和建昌鸭肌肉。从左到右的四条泳道分别为DNA分子量标准50bp Ladder,绍兴鸭、绿头鸭、建昌鸭肌肉的PCR结果。图10为鸭特异引物PCR扩增绍兴鸭、绿头鸭、建昌鸭特异性片段的酶切结果。从左到右的四条泳道分别为DNA分子量标准50bp Ladder,绍兴鸭、绿头鸭、建昌鸭肌肉PCR结果产物的酶切结果。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、利用鉴定或辅助鉴定鸭组织和/或器官的PCR引物对检测动物肌肉样品一、制备鉴定或辅助鉴定鸭组织和/或器官的PCR引物对以鸭肉线粒体DNA细胞色素氧化酶亚基III基因为靶基因，设计特异扩增该基因的弓I物对。上游弓I物的序列为5 ‘ -ATGTGATTCCACTACAACTCATCTAT-3 ‘(序列表中的序列 1)，下游引物的序列为5 ‘ -TGGTGGGCTCATGTGACAGTT-3 ‘(序列表中的序列2)。该引物对即为鉴定或辅助鉴定鸭组织和/或器官的PCR引物对。该引物对扩增北京鸭的靶序列如序列表中序列3所示。序列表中的序列3的第173-178位是Hind III的识别序列，PCR产物经酶切后将成为两条片段，长度相差小于S3P，在2%琼脂糖凝胶电泳中不能明显区分，电泳结果应显示为一条带。二、检测动物肌肉样品1、检测样品的制备该实验中的样品均是肌肉，包括纯肌肉和掺杂肌肉。纯肌肉分别是未掺杂的牛肉、羊肉、猪肉、鸡肉和北京鸭鸭肉。掺杂肌肉是掺杂北京鸭鸭肉的牛肉、掺杂北京鸭鸭肉的羊肉、掺杂北京鸭鸭肉的猪肉和掺杂北京鸭鸭肉的鸡肉。1)牛肉和掺杂鸭肉的牛肉在IOOg牛肉中掺杂0. Ig北京鸭鸭肉，制成0. 的掺杂鸭肉的牛肉，同时以未掺杂的纯牛肉为对照。2)掺杂鸭肉的羊肉在IOOg羊肉中掺杂0. Ig北京鸭鸭肉，制成0. 的掺杂鸭肉的羊肉，同时以未掺杂的纯羊肉为对照。3)掺杂鸭肉的猪肉在IOOg猪肉中掺杂0. Ig北京鸭鸭肉，制成0. 的掺杂鸭肉的猪肉，同时以未掺杂的纯猪肉为对照。4)掺杂鸭肉的鸡肉在IOOg鸡肉中掺杂0. Ig北京鸭鸭肉，制成0. 的掺杂鸭肉的鸡肉，同时以未掺杂的纯鸡肉为对照。2、利用步骤一的引物对PCR扩增线粒体基因组上的细胞色素氧化酶亚基III基因片段1)样品基因组的提取使用北京全式金生物技术有限公司Easy Pure Genomic DNA Extraction Kit (货号EE101-01)提取步骤1中样品的基因组DNA。结果表明，步骤1中的所有样品使用该试剂盒均能有效提取到基因组，提取的数量在电泳检测时可见(如图1)，足够用作PCR反应的模板。 2) PCR反应及电泳检测分别以上述步骤1中各个样品的基因组DNA为模板，以序列表中序列1所示的上游引物和序列表中序列2所示的下游引物，进行PCR扩增反应。其中，PCR体系10XBuffer 2. 0 μ L(购自宝生物工程(大连)有限公司，货号 DR001A)，dATP, dTTP, dCTP和dGTP各2. 5mM的4种dNTP混合物(购自宝生物工程(大连) 有限公司，货号D4030) 2. OyL,浓度为20 μ M的上游引物1. 0 μ L，浓度为20 μ M的下游引物 1. 0 μ L，模板(总DNA) 2. OyL, 5U/ μ L的Taq DNA聚合酶(购自宝生物工程(大连)有限公司，货号DR001A) 0. 5 μ L，加双蒸水至20 μ L。PCR 程序:95°C, IOmin 预变性；95°C, 30s, 62 "C，30s, 72 "C，45s,扩增反应进行 30 个循环；72°C，延伸5min ；4°C，保温结束。将PCR反应获得的产物分别进行琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶电泳浓度为2%。3、纯肌肉样品的PCR结果电泳检测结果表明鸭肉中得到一条大小300_400bp的条带，其它牛、羊、猪、鸡肌肉样品中没有该条带(图幻。说明鸭特异引物专一性非常好，与其他动物没有交叉反应； 没有非特异的杂带产生。4、掺杂鸭肉的肌肉样品检测结果电泳检测结果表明，掺杂0. 鸭肉的牛肉中得到一条大小300_400bp的条带，纯牛肉中没有该条带(图4)；掺杂0. 鸭肉的羊肉中得到一条大小300-400bp的条带，纯羊肉中没有该条带(图5)；掺杂0. 鸭肉的猪肉中得到一条大小300-400bp的条带，纯猪肉中没有该条带(图6)；掺杂0. 鸭肉的鸡肉中得到一条大小300-400bp的条带，纯鸡肉中没有该条带(图7)。5、酶切鉴定将PCR扩增获得的所有鸭的条带使用Hind III进行酶切反应。酶切体系10XBuffer 1. 0 μ L(购自宝生物工程(大连)有限公司，货号 D1060A)，Hind III 0. 5 μ L (购自宝生物工程(大连)有限公司，货号D1060A)，步骤二 2中获得的PCR产物8.5 μ L。酶切反应获得的产物进行凝胶电泳，琼脂糖凝胶电泳浓度为2%，结果表明，PCR 扩增获得的所有北京鸭肌肉的条带均被酶切为150-200bp之间的条带(图3)。说明PCR产物符合最初的设计，不是非特异性扩增的结果，说明PCR反应结果真实有效。6、测序验证将北京鸭肌肉的PCR产物进行测序，结果表明该PCR产物的序列与NCBI数据库中北京鸭(EU755252)细胞色素氧化酶亚基III基因片段的序列一致，大小为350bp。上述实验表明，本发明的检测方法特异性强，能鉴别肉中掺杂的鸭肉的组分，引物之间没有交叉反应。扩增产物符合预计的大小，且都能被设计好的限制性内切酶切割，说明扩增产物不是非特异性扩增的结果。整个结果清晰、可信度高。本发明的方法检测过程耗时短，从提取基因组到酶切结束，仅仅需要8小时的时间(样品数量多时酌情延长)。实施例2、利用鉴定或辅助鉴定鸭组织和/或器官的PCR引物对检测鸭绒毛样品—、制备鉴定或辅助鉴定鸭组织和/或器官的PCR引物对设计和制备方法同实施例1 一。二、检测鸭绒毛样品1、检测样品检测样品为北京鸭绒毛。2、利用步骤一的引物对PCR扩增线粒体基因组上的细胞色素氧化酶亚基III基因片段1)样品基因组的提取使用毛发DNA提取试剂盒-柱式(AndyBio公司，货号M090050)进行鸭绒毛中总 DNA的提取。2) PCR 反应以上述步骤1中DNA为模板，以序列表中序列1所示的上游引物和序列表中序列 2所示的下游引物，进行PCR扩增反应。其中，PCR体系10XBuffer 2. 0 μ L(宝生物工程(大连)有限公司，货号 DR001A)，dATP，dTTP，dCTP和dGTP (各2. 5mM)的4种dNTP混合物(宝生物工程(大连)有限公司，货号D4030) 2 μ L，20 μ M上游引物IyL, 20 μ M下游引物1 μ L，模板(DNA) 10 μ L (步骤二 1)中提取的总DNA，琼脂糖凝胶电泳检测可见，足够进行PCR反应)，Taq DNA聚合酶 (宝生物工程(大连)有限公司，货号DROO1Α) 0. 5 μ L (5U/ μ L)，加双蒸水至20 μ L0PCR 程序:95°C, IOmin 预变性；95 °C, 30s, 62 V，30s, 72 V，45s,扩增反应进行 25个循环；72°C，延伸5min ；4°C，保温结束。将PCR反应获得的产物分别进行琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶电泳浓度为2%。电泳检测结果表明北京鸭绒毛的DNA扩增产物中可得到一条大小300-400bp的条带(图8)。3、酶切鉴定将PCR扩增获得的鸭绒毛的条带使用Hind III进行酶切反应。具体酶切反应条件同实施例1。酶切反应获得的产物进行凝胶电泳，琼脂糖凝胶电泳浓度为2%，结果表明，PCR 扩增获得的所有北京鸭绒毛的条带均被酶切为150-200bp之间的条带。说明PCR产物符合最初的设计，不是非特异性扩增的结果，说明PCR反应结果真实有效。4、测序验证将北京鸭绒毛的PCR产物进行测序，结果表明该PCR产物的序列与NCBI数据库中北京鸭(EU755252)细胞色素氧化酶亚基III基因片段的序列一致，大小为350bp。实施例3、利用鉴定或辅助鉴定鸭组织和/或器官的PCR引物对检测不同鸭肉样品一、制备鉴定或辅助鉴定鸭组织和/或器官的PCR引物对设计和制备方法同实施例1步骤一。二、检测各种鸭肉样品1、检测样品检测样品为绍兴鸭、绿头鸭和建昌鸭肌肉。2、利用步骤一的引物对PCR扩增线粒体基因组上的细胞色素氧化酶亚基III基因片段1)样品基因组的提取同实施例1。2) PCR 反应同实施例1。将PCR反应获得的产物分别进行琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶电泳浓度为2%。电泳检测结果表明绍兴鸭、绿头鸭和建昌鸭肌肉中均得到一条大小300-400bp的条带(图9)。3、酶切鉴定同实施例1。酶切反应获得的产物进行凝胶电泳，琼脂糖凝胶电泳浓度为2%，结果表明，PCR 扩增获得的绍兴鸭、绿头鸭和建昌鸭肌肉的条带均被酶切为150-200bp之间的条带(图 10)，说明通过所设计的引物可以用于绍兴鸭、绿头鸭和建昌鸭鸭成分的鉴别中。4、测序验证将所有的绍兴鸭、绿头鸭和建昌鸭肌肉的PCR产物进行测序，结果表明绍兴鸭(序列表中的序列4)、绿头鸭(序列表中的序列5)和建昌鸭(序列表中的序列6)肌肉的PCR 产物的大小为350bp，均在第173-178位有Hind III的识别序列。其中，绍兴鸭、绿头鸭和建昌鸭的扩增序列完全一致，与北京鸭扩增序列只有1个位点的差异。
权利要求
1.鉴定或辅助鉴定鸭组织和/或器官的PCR引物对，它由两条单链DNA组成，其特征在于所述引物对为如下1)或2)1)所述两条单链DNA是序列表中序列1所示的单链DNA，和序列表中序列2所示的单链 DNA ；2)所述两条单链DNA是序列表中序列1的反向互补序列所示的单链DNA，和序列表中序列2的反向互补序列所示的单链DNA。
2.鉴定或辅助鉴定鸭组织和/或器官的PCR试剂，其特征在于所述PCR试剂含有权利要求1所述的引物对。
3.鉴定或辅助鉴定鸭组织和/或器官的试剂盒，其特征在于所述试剂盒含有权利要求2所述的PCR试剂。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒含有限制性内切酶HindIII。
5.权利要求1所述的PCR引物对的制备方法，其特征在于所述制备方法包括将权利要求1所述的PCR引物对中所述两条单链DNA分别单独包装的步骤。
6.权利要求3或4所述的PCR试剂盒的制备方法，包括如下步骤将权利要求1所述的 PCR引物对中所述两条单链DNA分别单独包装后，与下述物质中的至少一种物质包装在同一试剂盒内PCR反应缓冲液、DNA聚合酶、限制性内切酶Hind III和下述4种dNTP :dATP， dTTP, dCTP 和 dGTPo
7.一种鉴定或辅助鉴定待测动物组织和/或器官中是否掺杂鸭组织和/或器官的方法，包括如下步骤用权利要求1所述的PCR引物对PCR扩增线粒体基因组上的细胞色素氧化酶亚基III基因片段，检测所得到的PCR产物的大小，如果PCR产物的大小是300-400bp， 所述待测动物组织和/或器官中掺杂有鸭组织和/或器官，或所述待测动物组织和/或器官中候选掺杂有鸭组织和/或器官。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于检测所得到的PCR产物的大小的方法是将所得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，如果所述PCR产物在琼脂糖凝胶电泳上显示为 300-400bp之间的一条带，所述待测动物组织和/或器官中掺杂有鸭组织和/或器官，或所述待测动物组织和/或器官中候选掺杂有鸭组织和/或器官。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于所述方法在所述检测所得到的PCR产物的大小之后，还包括将大小为300-400bp的所述PCR产物用Hind III进行酶切鉴定的步骤，如果所述PCR扩增产物可被Hind III酶切为150_200bp之间的片段，所述待测动物组织和/或器官中掺杂有鸭组织和/或器官，或所述待测动物组织和/或器官中候选掺杂有鸭组织和/或器官。
10.根据权利要求7-9中任一所述的方法，其特征在于所述待测动物组织和/或器官来源于下述至少一种动物牛、羊、猪和鸡。
全文摘要
本发明公开了鉴定或辅助鉴定鸭组织和/或器官的PCR引物对及其应用。该鉴定或辅助鉴定鸭组织和/或器官的PCR引物对，它由两条单链DNA组成，为如下1)或2)1)所述两条单链DNA是序列表中序列1所示的单链DNA，和序列表中序列2所示的单链DNA；2)所述两条单链DNA是序列表中序列1的反向互补序列所示的单链DNA，和序列表中序列2的反向互补序列所示的单链DNA。本发明的检测方法特异性强，能鉴别牛、羊、猪和鸡中掺杂的鸭组织和/或器官。整个结果清晰、可信度高。本发明的方法检测过程耗时短，从提取基因组到酶切结束，仅仅需要8小时的时间。
文档编号C12N15/11GK102242220SQ20111020104
公开日2011年11月16日 申请日期2011年7月18日 优先权日2011年7月18日
发明者于雷, 侯东军, 姜艳彬, 李颖, 杨红菊, 王海 申请人:于雷