专利名称：一种实时荧光rt-pcr检测脊髓灰质炎病毒的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及脊髓灰质炎病毒检测技术，具体地说，涉及一种实时荧光RT-PCR检测脊髓灰质炎病毒的试剂盒。
背景技术：
脊髓灰质炎(poliomyelitis)是一种古老的疾病，是由脊髓灰质炎病毒引起的一种急性传染性疾病，其临床表现多种多样，主要有发热、咽痛和肢体疼痛等，部分病人可发生弛缓性麻痹。脊髓灰质炎病人，由于脊髓前角运动神经元受损，与之有关的肌肉失去了神经的调节作用而发生萎缩，同时皮下脂肪，肌腱及骨骼也萎缩，使整个机体变细。流行时以隐匿感染和无瘫痪病例为多。由于儿童发病比例较成人为高，在普种疫苗前以婴幼儿患病为主，故又称小儿麻痹症(Infantile paralysis)。人是脊髓灰质炎病毒唯一的自然宿主，本病通过直接接触传染，是一种传染性很强的接触性传染病，隐形感染者以及轻症瘫痪型病人是本病的主要传染源，在大规模流行时，隐性感染与临床病例的比例超过100:1。脊髓灰质炎病毒以粪-口感染为主要传播方式，发病前3飞天至发病后1周患者鼻咽部分泌物及粪便均可排出病毒，少数病倒粪便带毒时间可长达3、月；密切生活接触，不良卫生习惯都可导致病毒的大面积扩散。脊髓灰质炎的感染以隐性感染(占99%以上)为主，以发热，咽痛，肢体疼痛等非特异性症状为主要临床表现，严重可以出现瘫痪以及机体萎缩等前角神经元受损的症状。瘫痪病例中，90%以上发生于5岁以前。经济发达的国家和地区环境卫生和个人卫生习惯的进步导致感染的年龄往往推迟，年长儿和青年人仍然是易感者，目前夏季流行在年长小儿中呈现一定的上升趋势。本病广泛分布于全世界，温带地区流行高峰在5 10月，热带地区终年可见。1988 年世界卫生组织提出2000年全球消灭脊髓炎，1989年又提出消灭本病的行动计划，由于减毒活疫苗的应用，发病率已明显下降。虽然我国已经响应世界卫生站组织号召进行了强制接种免疫，但是我国仍为流行地区。且近些年来，脊髓灰质炎减毒疫苗突变导致的脊髓灰质炎感染事件时见报道，而水产食品以及蔬菜引发的脊髓灰质炎病毒感染已经引起食品安全部门的关注。脊髓灰质炎病毒的核酸为单股正链RNA，已知基因组的长度约为7. 5kD。按其抗原性不同，将脊髓灰质炎病毒分为1、2、3等3个血清型。它们的理化性质基本相同，RNA的碱基组成也很相似。以上3个血清型的病毒RNA之间在核苷酸水平上有36% 52%的同源性。三种血清型的病毒都可以致病，其中导致瘫痪病例的主要是1型。脊髓灰质炎初起时与伤风感冒相类似，与其他病毒(柯萨奇病毒、埃可病毒、EB病毒、流行性腮腺炎病毒、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒、流行性乙型脑炎病毒)感染所致的脑膜炎、化脓性脑膜炎、结核性脑膜炎、真菌性脑膜炎以及脑膜炎型钩端螺旋体病等相鉴别。以及感染性多发性神经根炎或称格林-贝尔综合征(Guillain-Barre ‘ s syndrome)临床不易鉴别。目前对于脊髓灰质炎的临床实验室检测主要分为三种，包括病毒分离培养，血清学检测以及核酸检测，其中以血清学和核酸检测为主要手段，血清学检测的诊断指标为发病后1个月内从患者脑脊液或血中查到抗脊髓灰质炎病毒IgM抗体者；或恢复期患者血清中特异性IgG抗体滴度比急性期有4倍升高者；或脑脊液中特异性IgG抗体明显升高，血液与脑脊液IgG抗体滴度比例失常或倒置(在血脑屏障无损伤时，血脑脊液为200—400 1)者均有诊断价值。相对来说抗体的产生虽然具有诊断价值，但是对感染的早期判断一般采取更敏感快速的PCR方法进行诊断。近几年国内外相继报道了检测PVs的巢式rt-PCR、常规RT-PCR等快速检测方法，随着分子生物学技术的发展，实时荧光PCR技术已广泛应用于病毒特征性核酸的检测。 实时荧光PCR技术是近年来发展迅速的一种核酸检测技术，使用一种带有核电偶联装置 (CCD)的PCR扩增仪，通过检测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平。CCD能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号，并通过软件分析汇总到工作站得到扩增曲线。一步法实时荧光RT-PCR技术是实时荧光PCR的一种 (Martel 1, M. , J. Gomez, J. Esteban, S. Sauleda, J. Quer, B. Cabot, R. Esteban, and J. Guardia. 1999. High-throughput real-time reverse transcription—PCR quantitation of hepatitis C virus RNA. J. Clin. Microbiol. 37:327 - 332；Lee Cff, Suarez DL. 2004. Application of real-time RT-PCR for the quantitation and competitive replication study of H5 and H7 subtype avian influenza virus. J Virol Methods. 119 O) : 151-8。)，它是一种直接快速检测RNA的方法，与检测DNA的实时荧光PCR相比，不同之处在于前者在反应体系中增加了逆转录酶，同时多了一个逆转录反应步骤；相同之处在于两者在反应体系中均有一条两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团的探针，探针结构完整时，荧光报告基团发出荧光的能量转移给淬灭基团，呈现淬灭效应。 如果扩增过程中有靶序列的存在，扩增的过程中探针分子逐渐被水解切断，荧光报告基团与淬灭基团相互解离，阻断了二者间荧光共振能量转移效应，荧光报告基团发出荧光信号。 随着扩增的进行，荧光信号随着目的片段的扩增而呈现线性增强。传统的RT-PCR由两个单独的反应程序或步骤完成，第一步是通过逆转录酶作用， 将RNA逆转录成cDNA ；第二步是在Taq酶作用下，以第一步中形成的cDNA为模板进行PCR 扩增。与传统的RT-PCR相比较，一步法实时荧光RT-PCR技术具有如下优点1、将逆转录和 PCR扩增两个在不同反应管中分开进行的二个反应程序合并成一个反应程序，在一个PCR 反应管中完全闭管完成检测过程，大大节省了反应时间；2、通过对扩增曲线以及对数增长期的循环阈值(Ct)的分析，摒弃普通PCR方法受多种因素干扰的终点分析方法，能够对检测样品进行准确定量分析，从而有效监测药物治疗的效果；3、将RNA逆转录、DNA扩增与检测三过程融合为一体，可以实时、动态监测RNA扩增的全过程，省掉了 PCR产物后处理过程， 大大缩短了结果分析时间，使得该方法更加快捷、方便；4、由于采取一种封闭的检测模式， 从而减少了气溶胶污染和由此造成的假阳性；5、由于在普通RT-PCR基础上增加了一条可与模板互补配对的荧光探针，进一步提高了检测靶多核苷酸的特异性。因此，该技术在RNA 样品的检测和分析中，已逐渐取代传统的RT-PCR方法，得到十分广泛的应用。我国食品与药品管理局(SFDA)已经批准了诸如Hiv-l、HCV等病原体的一步法实时荧光RT-PCR检测试剂盒的生产与临床应用。因此，通过一步法实时荧光RT-PCR方法开发一种检测脊髓灰质炎病毒的试剂盒在技术上是可行的，它的应用将极大满足脊髓灰质炎病毒快速检测与监测工作的需要。众所周知，在使用已知的一步法实时荧光RT-PCR技术检测和定量分析样品中某特定靶核酸的实践中，为了减少和避免检测结果的假阴性或假阳性，提高定量分析的准确性，一个关键性的基本技术环节是如何基于已知的靶多核苷酸序列设计、筛选及制备适当的引物和寡核苷酸探针。本发明人在此基础上利用一步法实时荧光RT-PCR技术发明了一种检测脊髓灰质炎病毒的试剂盒，应用于脊髓灰质炎病毒的检测和分析。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种能提高定量分析的准确性的实时荧光RT-PCR检测脊髓灰质炎病毒的试剂盒。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案
1)使用适当的核酸分析软件分别对已知的脊髓灰质炎病毒POl基因的核苷酸序列进行同源性比较，通过严格的比对分析，在找出同源区段的基础上，进一步使用适当的引物设计软件(例如Primer Express 3)选择并设计寡核苷酸引物和探针。由于所设计的引物和探针均具有互补于脊髓灰质炎病毒的序列，而且与其他病原体的核苷酸序列没有同源性， 也不包括任何常见的核酸内切酶的酶切位点，所以避免了脊髓灰质炎病毒检测的假阴性和假阳性，提高了检测的可靠性和准确度。初步选择引物探针之后我们将引物探针分别进行进一步的序列比对，通过比对工具(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/blast/) 的blastnr中进行同源性检索,弃掉与基因组其它部分同源性比较高的引物，也就是有可能形成错配的引物。尤其选取跟脊髓灰质炎病毒同源性较高的肠道病毒序列进行进一步比较，完全排除3 ‘端的同源性，确保引物探针的特异性。2)使用DNA合成装置合成所需的寡核苷酸引物，用分子筛和快速蛋白质液相层析法(FPLC)纯化后进行氨解处理。同样合成所需的探针序列，氨解处理后分别在其5’端标记作为荧光发生基团(报告基团)的6-FAM amidite,并在其3’端标记借助活性连接臂偶联上作为荧光淬灭或抑制基团的BHQ。以FPLC层析法纯化荧光标记的探针。然后，使用变性条件下的聚丙烯酰胺凝胶(20%)电泳法和分光光度法物理鉴定所合成的引物和探针。3)适宜于一步法实时荧光RT-PCR扩增的反应体系。反应体系包括逆转录酶、热启动Taq酶、2’ -脱氧核苷三磷酸、能够与双链靶多聚核苷酸的第一条链结合的正向引物、能够与双链靶多聚核苷酸的第二条链结合的反向引物、能够与靶多聚核苷酸结合并且两末端分别结合有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针、含有镁离子的缓冲液。4)从待测样本中提取RNA，分别加入前述的反应体系中，直接经一步法RT-PCR扩增，从荧光扩增曲线判断是否存在脊髓灰质炎病毒。本发明所得实时荧光RT-PCR检测脊髓灰质炎病毒的试剂盒，包括RNA提取试剂、 脊髓灰质炎RT-PCR反应体系、阴性质控品和阳性质控品；所述脊髓灰质炎RT-PCR反应体系包括脊髓灰质炎引物探针混合液、RT-PCR反应液和RT-PCR酶系；所述脊髓灰质炎引物探针混合液中脊髓灰质炎正向引物的序列为5’-GATGATTGCCTATGGTGATGATG-3' (SEQ NO. 1)，脊髓灰质炎反向引物的序列为5’_ TCCTGATTGGGCTAGGAGACT -3，(SEQ NO. 2);所述脊髓灰质炎引物探针混合液中正、反向引物向5’和3’端方向各延伸10个碱基。所述脊髓灰质炎引物探针混合液中脊髓灰质炎寡核苷酸探针的序列为
5’- AATTGCATCCTACCCCCATGAGGTTGAC -3’ (SEQ NO. 3)；
在上述试剂盒中，所述脊髓灰质炎正、反向引物的浓度均为5 15 pmol/反应，探针的浓度为5 15 pmol/反应。在上述试剂盒中，所述RT-PCR酶系由逆转录酶、热启动Taq酶、RNasin, dNTPs和酶系稀释液组成。所述逆转录酶用量为1. 5 3. 5U/反应、热启动Taq酶用量为3 7U/ 反应、RNasin用量为15 25U/反应、dNTPs浓度为0. 20mmol/L。在上述试剂盒中，酶系稀释液为一般市售的酶系稀释液；阴性质控品为生理盐水； 脊髓灰质炎阳性质控品为含有脊髓灰质炎基因序列的重组假病毒，假病毒通过市售的逆转录病毒包装系统构建而成。相对于利用质粒DNA作为阳性模版的标准品来说，由逆转录病毒构建的阳性指控品完全模拟了实际情况，为衣壳和包膜包裹的RNA片段，可以为实验的全过程，包括病毒核酸的提取，RNA至DNA的逆转录，以及最后的核酸扩增进行阳性参照。阳性质控品浓度均为IX IO6拷贝/ml。在上述试剂盒中，所述RT-PCR反应液包括一步法RT-PCR反应缓冲液和DEPC水， 其中一步法 RT-PCR 反应缓冲液包含 10 mmol/L Tris-HCl (pH8.0)、150 mmol/L KCl, 2. Ommo 1/L MgCl20在上述试剂盒中，其中用于PCR扩增的最佳反应温度和时间为50°C逆转录 15min，1个循环；94°C lOmin，1个循环；最后95°C 15s，55 60°C 45s，45个循环(收集荧
光信号)。在上述试剂盒中，试剂盒的待检样品优选是粪便、脑脊液及血清等样品。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果本发明提供了使用一步法实时荧光 RT-PCR技术检测样品中脊髓灰质炎病毒的试剂盒，其基本原理是利用一对寡核苷酸的特异性引物和一条寡聚核苷酸的特异性探针，在逆转录酶(RT酶)、热启动Taq酶、RNA酶抑制剂 (RNasin)、高质量的脱氧核糖核苷三磷酸(dNIPs)以及Mg2+等RT-PCR反应缓冲液中，通过 DA7600、ABI7500等市售的荧光PCR扩增仪实现靶多核苷酸的循环扩增，从而达到快速、实时、定量检测靶多核苷酸的目的。本发明分别针对脊髓灰质炎病毒Pol基因设计特异性引物和探针，可检测出脊髓灰质炎病毒，包括I、II、III型，但不能检测出肠道病毒EV71，科萨奇病毒Α16，乙型脑炎病毒，流感病毒A型，流感病毒B型，埃可病毒样本或其他呼吸道病原体样本，说明本试剂盒具有很好的特异性。本发明提供的一步法实时荧光RT-PCR检测试剂盒可以检测粪便、脑脊液及血清等样品中的脊髓灰质炎病毒；可为灵敏、快速早期诊断脊髓灰质炎病毒感染提供可靠的实验证据。本试剂盒具有很高的灵敏度和特异性，通过本发明的试剂盒实现对咽拭子、鼻咽分泌物等呼吸道样本以及血清等样品中的脊髓灰质炎病毒进行早期快速诊断。本试剂盒可以检测出脊髓灰质炎病毒的最低浓度为1.0Χ102 copies /ml，说明本试剂盒具有非常好的灵敏度。
图1显示脊髓灰质炎阳性质控品和阴性质控品的检测结果。从左到右曲线分别代表，脊髓灰质炎病毒II型，I型，III型，以及阳性质控品，阴性质控品未见曲线。阳性质控品扩增曲线有明显指数增长期，成S型，可明确判定为阳性。阴性质控品扩增曲线平直或斜向下且与基线无交叉，没有Ct值，可明确判定为阴性。图2显示特异性参考品的检测结果。以肠道病毒EV71，科萨奇病毒A16，乙型脑炎病毒，流感病毒A型，流感病毒B型、埃可病毒感作为特异性参考品；以去离子水及健康人血清作为阴性质控品，结果显示均为阴性结果；6份特异性参考品的扩增曲线平直或斜向下且与基线无交叉，没有Ct值，可明确判定为阴性。图3显示灵敏度参考品的检测结果。从左到右曲线分别为1. OXlO5 copies /ml、1. OXlO4 copies /mlU. OXlO3 copies/mlU. OXlO2 copies /mlU. OXlO1 copies /ml 的含有脊髓灰质炎病毒假病毒组成灵敏度参考品，生理盐水作为阴性对照未见曲线。5份灵敏度参考品中除了浓度为 1.0X101 copies /ml的脊髓灰质炎假病毒样品外扩增曲线平直或斜向下且与基线无交叉， 没有Ct值，可明确判定为阴性。其余样本均可明确判定为阳性。
具体实施例方式下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。实施例1 脊髓灰质炎病毒检测试剂的研制
1、引物和探针的设计通过对已报导脊髓灰质炎病毒的核酸序列进行序列比对分析， 以脊髓灰质炎病毒Pol基因为扩增靶位点，选择无二级结构且高度保守的区段，根据引物探针设计的基本原则，利用软件和人工设计多对引物和探针。2、临床样本的选择根据国内外相关文献报道表明，可以粪便、脑脊液及血清等样
P
ΡΠ
3、反应体系的建立与优化
样品的准备以构建的含有目的扩增区域的假病毒作为脊髓灰质炎病毒检测的阳性质控品；以肠道病毒EV71，科萨奇病毒A16，乙型脑炎病毒，流感病毒A型，流感病毒B型、埃可病毒感作为特异性参考品；以去离子水及健康人血清作为阴性质控品，分别提取上述阳性质控品与特异性参考品的RNA，阴性质控品待用。引物探针的筛选以上述1中设计的多组引物探针分别检测上述的阳性质控品与阴性参考品的RNA，经反复试验，筛选出特异性、灵敏度和重复性好的最佳引物探针组合。 (如序列表中 SEQ ID NO 1 SEQ ID NO :3)。引物探针浓度的优化在反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从2pmol/ 反应至15pmol/反应梯度的引物和从2pmol/反应至15pmol/反应浓度梯度的探针进行PCR 反应，经多次重复试验发现引物和探针浓度在5 15 pmol/反应之间均可，其中最佳的引物浓度为5pmol/反应、探针浓度为5pmol/反应。镁离子浓度的优化在反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从lmmol/L 至2. 5mmol/L浓度梯度的镁离子进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的镁离子浓度为 2. Ommol/Lο
热启动Taq酶用量的优化在25 μ L反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从IU (酶单位)至8U浓度梯度的酶用量/反应进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的热启动Taq酶用量为3 7U/反应。RT酶用量的优化在25 μ L反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从IU(酶单位)至8U浓度梯度的酶用量/反应进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的RT 酶用量为1. 5 3. 5U/反应。RNasin用量的优化在25 μ L反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从5U (酶单位)至40U浓度梯度的酶用量/反应进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的 RNasin用量为15 25U/反应。dNTPs浓度的优化在反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从0. lmmol/L 至0. 25mmol/L浓度梯度的dNIPs进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的dNIPs 浓度为 0. 20mmol/Lo反应温度的优化根据酶的活性和靶多核苷酸的长度，主要对退火温度和延伸时间进行了优化，经多次重复试验，最终确定最佳的反应温度和时间为50°C逆转录15min，l 个循环；94°C 10min，l个循环；最后95°C 15s，55 60°C 45s，45个循环(收集荧光信号)。实施例2 脊髓灰质炎病毒检测试剂盒及其使用
1、制备包括下列组成成分的试剂盒RNA提取液(50ml /管)1管、脊髓灰质炎引物探针混合液(50 μ 1/管)1管、RT-PCR反应液(720 μ 1/管)1管、RT-PCR酶系(150 μ 1/管)1 管，阴性质控品(200 μ 1/管)1管，脊髓灰质炎阳性质控品1管。2、标本采集、运送和保存
由临床医师根据实际情况进行标本采集，可检测的标本包括，咽拭子、鼻咽分泌物、血清。采集方法如下①粪便样品取适量标本按比例制备样品悬液，离心取上清，密封保存， 低温送检；②脑脊液采集时间为出现神经系统症状后3d内，采集量为1. 0 2. Oml0采集后立即装入无菌带垫圈的冻存管中，4°C下送达实验室，-20°C以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于_70°C以下冰箱。；③血清无菌采集静脉血约1ml，分别于室温和4°C静置2 小时和1小时后，离心(8，000 rpm，5分钟)分离并收集血清标本。标本可立即用于测试，也可以保存于-70°C待测，保存期为6个月。标本运送采用 0°C冰壶。3、检测步骤
(I)RNA提取
取上述类型的样本各100 μ (样品不足ΙΟΟμΙ时请补加适量生理盐水重悬)，放置于 1.5ml灭菌离心管，加入200μ1 Trizol试剂及ΙΟΟμΙ氯仿，用振荡器强力振荡20秒后静置 3分钟；
2 8°C下12，OOOrpm离心lOmin，吸取上清至另一干净的1. 5ml离心管；
加入0. 2ml氯仿，盖紧盖子，手动用力颠倒摇动15s (不可用振荡器)，室温孵育2 3
min ；
2 8°C下12000rpm离心15 min后，取最上层的上清液至另一干净的1. 5ml离心管； 加入0. 5ml预冷的异丙醇，缓慢颠倒充分混勻后，一 20°C静置15min，2 8 °C， 12000rpm离心10 min，小心弃尽上清液；加入Iml预冷的70 %的冰冷乙醇，手动颠倒数次洗涤沉淀，2 8°C，8000rpm离心 5min，小心弃尽上清液；
空气或真空干燥5 10 min，加入50μ1 DEPC H2O, 55 60° C下孵育lOmin，手指轻轻弹打管底，使其充分溶解，直接用于实验或-70°C保存备用。(2) PCR反应与结果分析
分别取脊髓灰质炎RT-PCR反应液17 μ 1.RT-PCR酶系3 μ 1配制成脊髓灰质炎反应体系。取阴性质控品、阳性质控品各5 μ 1，加入脊髓灰质炎反应体系使用市售的荧光定量PCR仪(如ΑΒΙ7500)进行PCR扩增。PCR循环条件是50°C逆转录15min，1个循环；94°C 10min，l个循环；最后95°C 15s，55 60°C 45s，45个循环(收集荧光信号)。反应结束后保存检测数据文件。根据PCR扩增结果所得到的曲线，分析实验结果。 如扩增曲线有明显指数增长期，则判定为阳性，否则为阴性。实施例3 应用脊髓灰质炎病毒检测试剂盒检测样品
以实施例1中的阳性质控品、阴性质控品、特异性参考品作为待检样本，按照实施例2 的方法分别检测这些样本，阳性质控品检测结果为阳性，阴性质控品和特异性参考品检测结果均为阴性(参见图1，2)。实施例4 脊髓灰质炎病毒检测试剂盒灵敏度实验
分别由浓度为 1. OXlO5 copies /ml、1. OXlO4 copies /mlU. OXlO3 copies/ml、 1.0X102 copies /ml、l.OXlO1 copies /ml的含有脊髓灰质炎病毒假病毒组成灵敏度参考品，按照实施例2的方法分别检测这5份样本，检测结果表明，本试剂盒的灵敏度为 1. OXlO2 copies /ml (见图 3)。
权利要求
1.一种实时荧光RT-PCR检测脊髓灰质炎病毒的试剂盒，包括RNA提取试剂、脊髓灰质炎RT-PCR反应体系、阴性质控品和阳性质控品，其特征在于，所述脊髓灰质炎RT-PCR反应体系包括脊髓灰质炎引物探针混合液、 RT-PCR反应液和RT-PCR酶系；所述脊髓灰质炎引物探针混合液中脊髓灰质炎正向引物的序列为 5，-GATGATTGCCTATGGTGATGATG-3，，脊髓灰质炎反向引物的序列为5，-TCCTGATTGGGCTAGGAGACT -3’ ；所述脊髓灰质炎引物探针混合液中脊髓灰质炎寡核苷酸探针的序列为5’_ AATTGCATCCTACCCCCATGAGGTTGAC -3’ 。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述脊髓灰质炎引物探针混合液中正、 反向引物向5’和3’端方向各延伸10个碱基。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述脊髓灰质炎正、反向引物的浓度均为5 15 pmol/反应，探针的浓度为5 15 pmol/反应。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述RT-PCR酶系由逆转录酶、热启动 Taq酶、RNasin, dNTPs和酶系稀释液组成。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述逆转录酶用量为1.5 3. 5U/ 反应、热启动Taq酶用量为3 7U/反应、RNasin用量为15 25U/反应、dNTPs浓度为 0. 20mmol/Lo
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性指控品为含有脊髓灰质炎病毒检测靶标的假病毒悬液。
全文摘要
本发明公开了一种实时荧光RT-PCR检测脊髓灰质炎病毒的试剂盒，包括RNA提取试剂、脊髓灰质炎RT-PCR反应体系、阴性质控品和阳性质控品，所述脊髓灰质炎RT-PCR反应体系包括脊髓灰质炎引物探针混合液、RT-PCR反应液和RT-PCR酶系。本试剂盒能快速、实时、定量检测靶多核苷酸，可检测出脊髓灰质炎病毒，包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。可以检测粪便、脑脊液及血清等样品中的脊髓灰质炎病毒；可为灵敏、快速早期诊断脊髓灰质炎病毒感染提供可靠的实验证据。本试剂盒具有很高的灵敏度和特异性，通过本发明的试剂盒实现对咽拭子、鼻咽分泌物等呼吸道样本以及血清等样品中的脊髓灰质炎病毒进行早期快速诊断。
文档编号C12R1/93GK102344971SQ20111020069
公开日2012年2月8日 申请日期2011年7月18日 优先权日2011年7月18日
发明者李明, 杜红延, 陈华云, 陈瑶, 高秀洁 申请人:南方医科大学