一株原油降解菌株及其应用的制作方法

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株原油降解菌株及其应用。

背景技术：

石油又称为地球的“黑色血液”，在国家和地区经济发展中具有举足轻重的作用。随着石油资源的不断开发和利用，并行产生的污染问题也越发严重。在石油勘探开发过程中，钻井、采油、运输、贮存、利用等环节中，往往会产生含油污水、油泥、油污土壤等环境问题。伴随着原油条件、地质条件或采油条件的不同，往往会有高盐、高ph、高温等极端条件出现，如果不能在这些极端环境中良好地处理石油烃类物质，往往会造成严重的环境问题，甚至会威胁到人类的生命安全。

在高盐油污废水处理过程中，物理法和化学方法普遍会出现处理不彻底、经济效益不理想、二次污染等问题，而难以实现推广。随着极端环境的生物资源的开发和生物技术的发展，通过生物途径解决此类问题成为了可能。嗜盐菌是一类适合在高盐环境下生长的微生物，其特殊的功能酶和细胞结构具有很好的环境耐受性，是一类较为理想的原油降解菌株。可以应用于处理海上原油泄漏、货轮油舱清洗及盐碱土壤修复等问题。

中国专利cn108300674a公布了一种石油降解菌及其应用，利用分支杆菌（mycobacteriumsp.）csc-6菌株对150-1500mg/l原油1-3d降解率达到63.70-78.45%，对10-100g/l原油0-7d降解率达到18.25-50.10%。中国专利cn104017747b公布了一种石油降解菌及其应用，利用谷氨酸棒杆菌（corynebacteriumglutamicum）降解含油污泥，在37℃培养30天后石油烃降解率达39.69%。中国专利cn10276424a公布了一种原油降解嗜盐菌--芽孢杆菌（bacillussubtilissp.）y-b，并提供了其在不同类型的高盐含油废液处理中的应用。该菌从油田钻井废弃泥浆中分离得到，加入体积比达2~10%时，在25~30℃培养7d能够使得190~2200mg/l的石油总烃降解率达到70%以上。

以上专利中提供的菌株，短期内对含油量较少的环境下都有较为高效的降解效率。但对于高含盐环境下，具有良好经济效益的原油降解菌株考察并未有显著成果。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一株嗜盐菌及其应用，所述嗜盐菌可在高盐环境下良好地处理石油烃类物质降解，为含盐油污废水处理提供了一种高效、廉价、环境友好的方法。

为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：

一株原油降解菌株，其分类命名为中度嗜盐菌（salinicolasp.）x4，保藏编号为cctccno：m2018773。

所述嗜盐菌在透射电镜下观察细胞形态为短杆状，有鞭毛；固体培养基培养菌落为淡黄色、表面光滑、湿润、易挑取、边缘整齐。

所述嗜盐菌的筛选方法为：将被原油污染的土样作为菌株来源，在温度30-40℃条件下，在原油为唯一碳源的高盐无机盐培养基中培养3-5d，待培养基浑浊后，吸取培养上液转入新鲜的灭菌高盐无机盐培养基中，连续传代培养3-5次。

将多次传代培养的培养基加入无菌水，梯度稀释涂布到lb平板上，在30-40℃恒温培养箱中培养2-3d，分别挑选培养获得的不同菌落形态的菌落转接到lb培养基中富集培养，获得多株单菌。

将获得的菌株分别接入含原油2-3g/l高盐无机盐培养基中，30-40℃，200rpm培养3-5d，分析菌株的生长状况和原油的降解效率，最终得到一株对原油有高效降解作用的菌株。

所述的高盐无机盐培养基的成分模拟高盐含油废水成分，各组分质量百分比为：nacl5%，nh4cl0.4%，kh2po40.05%，k2hpo40.05%，mgso4·6h2o0.033%，酵母膏0.05%，金属离子母液0.1%，其余为蒸馏水，并调节ph到6.5±0.1。

金属离子母液各组分质量百分比为：feso4·7h2o1%，cacl20.1%，znso40.2%，mnso4·7h2o0.05%，cuso4·5h2o0.01%，na2moo40.01%，h3bo30.002%。

固体lb培养基各组分质量百分比为：蛋白胨1%，酵母粉0.5%，氯化钠5%，琼脂粉2%，其余为蒸馏水。

本发明的另一个目的是提供上述原油降解菌株在降解原油烃类中的应用。

本发明提供的一种应用方法为，利用嗜盐菌对废液中的石油进行降解处理，培养一定时间后能够良好地将石油烃乳化，将其降解为二氧化碳和水等代谢产物。通过种子培养基培养1-2天将菌株活化，以1%接种量转接到含油的高盐无机盐培养基中，30~40℃，震荡培养3-5天，过程中不添加其他培养物或补料。培养完成后用石油醚萃取剩余原油，在60℃烘箱中将石油醚充分烘干后称取残余的石油烃重量，计算石油降解率。

所述种子培养基为高含盐lb培养基，其各组分质量百分比为：蛋白胨1%，酵母粉0.5%，氯化钠5%，其余为蒸馏水。

所述高盐无机盐培养基各组分质量百分比为：原油0.2-0.3%，nacl，nh4cl0.4%，kh2po40.05%，k2hpo40.05%，mgso4·6h2o0.033%，酵母膏0.05%，金属离子母液0.1%，其余为蒸馏水；

所述金属离子母液各组分质量百分比为：feso4·7h2o1%，cacl20.1%，znso40.2%，mnso4·7h2o0.05%，cuso4·5h2o0.01%，na2moo40.01%，h3bo30.002%。

优选的，高盐无机盐培养基中含盐量为2.5~10%。

进一步的，高盐无机盐培养基中还可加入鼠李糖脂，与嗜盐菌x4菌株进行复配，联用驱油。

本发明的嗜盐菌（salinicolasp.）x4，降解效率高，培养简单，适于高盐环境，在石油行业高盐含油废水及海上原油泄漏事故处理中有良好的应用潜力，为丰富高盐环境原油降解菌库和高盐环境下的解烃技术提供参考。

附图说明

图1是salinicolasp.x4菌落图；

图2是salinicolasp.x4透射电镜图；

图3是salinicolasp.x4菌株发育树；

图4是salinicolasp.x4原油降解率与盐度关系图；

图5是salinicolasp.x4不同盐度下生长情况图；

图6是salinicolasp.x4不同温度下生长情况图；

图7是salinicolasp.x4不同ph下生长情况图；

图8是salinicolasp.x4与不同烃类物质的乳化特性；

图9是salinicolasp.x4对不同盐度下柴油降解性能；

图10是salinicolasp.x4对不同浓度的柴油降解性能；

图11是gc-ms内标品萘的出峰；

图12是gc-ms检测降解前柴油；

图13是gc-ms检测降解后柴油；

图14是不同类表面活性剂对菌体生长的影响；

图15是不同类表面活性剂对菌体柴油各链长降解作用的影响；

图16是不同类表面活性剂对菌体柴油降解作用的影响；

本发明所述的生物材料，其分类命名为中度嗜盐菌（salinicolasp.）x4，已于2018年11月12日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称cctcc，地址：中国.武汉.武汉大学），保藏编号为cctccno：m2018773。

具体实施方式

实施例1：嗜盐菌salinicolasp.x4的分离纯化、筛选、鉴定

菌株的分离纯化：

（1）称取1-2g青海油田附近的被原油污染的土壤土样，加入原油高盐无机盐培养基（培养基各组分质量百分比为：原油0.2-0.3%，nacl5%，nh4cl0.4%，kh2po40.05%，k2hpo40.05%，mgso4·6h2o0.033%，酵母膏0.05%，金属离子母液0.1%，其余为蒸馏水，并调节ph到6.5±0.1），30-40℃，200rpm培养3d。

（2）待培养基浑浊后，吸取5ml培养上液转入新鲜的灭菌高盐无机盐培养基中，连续传代培养3-5次。吸取5ml多次培养后的培养液加入无菌水中，梯度稀释10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8，取100μl稀释液分别涂布到高盐lb固体培养基平板上（lb固体培养基各组分质量百分比为：蛋白胨1%，酵母粉0.5%，氯化钠5%，琼脂粉2%，其余为蒸馏水），在30-40℃恒温培养箱中培养2d以上形成单菌落。

（3）分别挑选培养获得的不同菌落形态的菌落转接到高盐lb培养基（lb固体培养基各组分质量百分比为：蛋白胨1%，酵母粉0.5%，氯化钠5%，其余为蒸馏水）中富集培养，获得多株单菌待进一步筛选，编号并用甘油冻存管冻存（甘油冻存液各组分百分比为：甘油18%，氯化钠3-5%，其余为蒸馏水）。

菌株的筛选：

将获得的多株菌株分别接入含原油2-3g/l高盐无机盐培养基中，30-40℃，200rpm培养3-5d，分析菌株的生长状况和原油的降解效率，最终得到一株对原油有高效降解作用的菌株x4。

具体步骤如下：

（1）将冻存菌株接入高盐lb培养基中培养1-2天，转接2-3次使菌株活化。

（2）将活化后菌株培养液以1%接种量分别转接至原油高盐无机盐培养基中（培养基各组分质量百分比为：原油0.2-0.3%，nacl5%，nh4cl0.4%，kh2po40.05%，k2hpo40.05%，mgso4·6h2o0.033%，酵母膏0.05%，金属离子母液0.1%，其余为蒸馏水，并调节ph到6.5±0.1），30-40℃，200rpm培养3-5d，检测菌体生物量及菌株对原油的乳化效果。

（3）挑选出菌体生物量和乳化效果都较好的菌株，划线到高盐lb培养基中，放入37℃恒温培养箱中培养，获得单菌落，即为筛选后菌株。

本发明提供菌株的鉴定：

（1）菌株的菌落形态特征：筛选后菌株命名为x4，在37℃培养箱中，lb固体培养基培养24h，如图1所示，形成了米黄色不透明单菌落，菌落边缘饱满、圆润、光滑，直径0.5-1.2mm，革兰氏染色法鉴定为革兰氏阴性菌。

（2）菌体的细胞形态特征：将冻存菌株在高盐lb培养基中活化，清洗细胞后，进行透射电镜实验，如图2所示，观察到菌体细胞为短杆状，细胞大小为1.5-2.0μm×0.7-1.0μm，有荚膜，有单鞭毛，会分泌胞外产物。

（3）16srdna鉴定及菌株发育树：利用dna快速提取试剂盒提取菌株的dna，采用细菌16srdna序列的通用引物27f：5'-agagtttgatcctggctcag-3'和1492r：5'-cggttaccttgttacgactt-3'对菌株的16srdna序列进行pcr扩增，将纯化后的dna片段送金唯智生物公司测序，得到的16srdna基因全长为1415bp，如seqidno.1所示，与salinicolazeshuniistraing7同源性高达99%，为一株典型的嗜盐菌。并将菌株建立系统发育树，如图3。本发明菌株已于2018年11月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：cctccno：m2018773。

实施例2：嗜盐菌salinicolasp.x4能够在高盐环境下降解烃类物质。

本实施以高盐含油无机盐培养基模拟高盐废水环境，探究本发明中菌株对原油为唯一碳源的生长利用和对原油的降解作用。

具体步骤如下：

（1）将本发明提供的嗜盐菌salinicolasp.x4在高盐lb培养基中活化（lb培养基各组分质量百分比为：蛋白胨1%，酵母粉0.5%，氯化钠5%，其余为蒸馏水），30-40℃，200rpm培养24h后，以1%接种量转接到梯度高盐无机盐培养基中（培养基各组分质量百分比为：原油0.2-0.3%，nh4cl0.4%，kh2po40.05%，k2hpo40.05%，mgso4·6h2o0.033%，酵母膏0.05%，金属离子母液0.1%，其余为蒸馏水，并调节ph到6.5±0.1，nacl添加量分别为25、50、75、100、125、150g/l)，设置多组对照组，30-40℃，200rpm培养3-5d。

（2）每24h取3组摇瓶，取2倍体积石油醚充分萃取摇瓶中剩余原油，充分震荡萃取，复萃2次。萃取完成后取上层有机相放入60℃烘箱中，蒸发石油醚，时间必须充分确保石油醚完全蒸干，称取残留原油质量。

（3）计算原油降解率=（初始原油加入质量-残留原油质量）/初始原油加入质量×100%；

嗜盐菌salinicolasp.x4在含盐环境下的原油降解效率如图4所示，菌株salinicolasp.x4在2.5%-10%高盐环境下培养5d，原油去除率达到了38.0~44.2%，证明该菌株在此盐度下具有较高的原油降解效率。

实施例3：嗜盐菌salinicolasp.x4的最适生长环境

本案例中探究了菌株的最适生长条件，具体步骤如下：

（1）最适生长盐度：

本发明提供的嗜盐菌x4在高盐lb培养基（lb培养基各组分质量百分比为：蛋白胨1%，酵母粉0.5%，氯化钠5%，其余为蒸馏水）中活化，取活化后培养液以1%接种量转接到盐浓度分别为10-250g/l的lb培养基中，37℃、200rpm条件下培养24h，培养完成后取培养液1ml于离心机中12000rpm离心5min后，去除上清液后用无菌水重悬菌体，震荡混匀，用紫外分光光度计测菌体量的od600。

（2）最适生长温度：

本发明提供的嗜盐菌x4在lb培养基中活化，以1%接种量转接到含盐lb培养基中，培养温度分别为10-50℃，200rpm条件下培养24h，培养完成后取培养液1ml于离心机中12000rpm离心5min后，去除上清液后用无菌水重悬菌体，震荡混匀，用紫外分光光度计测菌体量的od600。

（3）最适生长ph

本发明提供的嗜盐菌x4在高盐lb培养基中活化，以1%接种量转接到ph为3-11的含盐lb培养基中，37℃、200rpm条件下培养24h，培养完成后取培养液1ml于离心机中12000rpm离心5min后，去除上清液后用无菌水重悬菌体，震荡混匀，用紫外分光光度计测菌体量的od600。

如图5所示：本发明提供菌株的生长盐度范围为10-200g/l，最适生长盐度为50-100g/l。

如图6所示：本发明提供菌株的生长温度范围为10-45℃，最适生长温度为25-40℃。

如图7所示：本发明提供菌株的生长ph范围为4.5-9，最适生长ph为6-7.5。

实施例4：嗜盐菌salinicolasp.x4的乳化功能及对柴油各组分降解效果的探究

本案例中对菌株的乳化功能和以柴油为例的进行了烃降解组分分析，具体步骤如下：

（1）菌株的乳化特性分析：

将本发明提供的嗜盐菌x4在高含盐lb培养基中（高含盐lb培养基各组分质量百分比为：蛋白胨1%，酵母粉0.5%，氯化钠5%，其余为蒸馏水）活化后分别收集等量的发酵液、上清、等体积菌体重悬液和不同类烷烃物质按照4：6加入10ml磨口试管中，漩涡震荡2min，室温静置24h后测定乳化层高度，以乳化指数ei24判断乳化活性。ei24=乳化层高度/有机相总高度×100%。

结果如图8，菌体对各类烷烃都有一定的乳化特性，发酵液和上清对正辛烷和十二烷的乳化特性高达70%以上。

（2）菌株对柴油的降解效率探究：

将嗜盐菌salinicolasp.x4在高盐lb培养基中活化（lb培养基各组分质量百分比为：蛋白胨1%，酵母粉0.5%，氯化钠5%，其余为蒸馏水），30-40℃，200rpm培养24h后，以1%接种量转接到不同盐度梯度和不同柴油浓度的无机盐培养基中（培养基各组分质量百分比为：nh4cl0.4%，kh2po40.05%，k2hpo40.05%，mgso4·6h2o0.033%，酵母膏0.05%，金属离子母液0.1%，其余为蒸馏水，并调节ph到6.5±0.1）；

柴油梯度实验组：在氯化钠浓度为30g/l条件下分别添加浓度为1、3、5、8、10g/l的柴油；设置多组对照组，30-40℃，200rpm培养1-5d。

盐度梯度实验组：在柴油添加量为3g/l条件下分别添加浓度为10、30、50、80、100、150g/l的氯化钠；设置多组对照组，30-40℃，200rpm培养1-5d。

培养1d，3d，5d取3组摇瓶，取2倍体积石油醚充分萃取摇瓶中剩余原油，充分震荡萃取，复萃2次。萃取完成后取上层有机相在常温鼓风蒸发石油醚，时间必须充分确保石油醚完全蒸干，称取残留柴油质量。

计算柴油降解率=（初始柴油加入质量-残留柴油质量）/初始柴油加入质量×100%；

结果如图9，10所示，本发明提供菌株在高盐环境下培养1-5d，在盐浓度为30-80g/l情况下5d对于3g/l柴油降解率均能达到50%，具有较高的原油降解效率。而在30g/l盐浓度下进行的梯度柴油降解实验显示其在添加量达到5g/l以内的降解率能达到50%以上，10g/l以内的降解率能达到30%以上，证明其具有良好的降解效率。

（3）对柴油各组分降解效果探究：

将本发明提供的嗜盐菌在高含盐lb培养基中（高含盐lb培养基各组分质量百分比为：蛋白胨1%，酵母粉0.5%，氯化钠5%，其余为蒸馏水）活化后，以1%接种量转接到以柴油为唯一碳源的高盐无机盐培养基中（培养基各组分质量百分比为：柴油0.3%，nacl5%，nh4cl0.4%，kh2po40.05%，k2hpo40.05%，mgso4·6h2o0.033%，酵母膏0.05%，金属离子母液0.1%，其余为蒸馏水，并调节ph到6.5±0.1），培养5d后，用等体积正己烷萃取培养基中剩余柴油组分，复萃多次确保充分萃取。萃取完成后加入足量无水硫酸钠除水，定容与容量瓶中，加入终浓度为20mg/l萘作为内标物，取1ml萃取液经过0.22μm滤膜除杂，进行gc-ms测定。

采用安捷伦公司生产（7890b-5977a）gc-ms气相色谱质谱联用仪方法如下：

色谱柱为hp-5ms弹性石英毛细柱（60m×0.25mm×0.25μm），fid检测器，载气为99.999%氦气。色谱条件：50℃保持1min，20℃/min升温至120℃，以4℃/min升至250℃，保持30min；进样口，检测器温度均为250℃，进样量1μl。

实验结果如图11,12,13显示：本发明提供菌株在高盐环境下培养5d对3g/l柴油整体降解率为56.0%，对c7-c13组分降解率约为64.1%，对c14-c20组分降解率为52.3%，对c21以上组分降解率为26.8%。

实施例5：嗜盐菌salinicolasp.x4与各类表面活性剂的复配后的生长和解烃效果

本案例中，将本发明提供菌株与表面活性剂复配，探究各类表面活性剂对菌体生长和烃类降解能力的影响。具体方案如下：

（1）表面活性剂对嗜盐菌salinicolasp.x4菌体生长的影响

将本发明提供的嗜盐菌salinicolasp.x4在高含盐lb培养基（高含盐lb培养基各组分质量百分比为：蛋白胨1%，酵母粉0.5%，氯化钠5%，其余为蒸馏水）中活化，将典型的四类表面活性剂：非离子型--聚山梨酯-80（吐温80）、阴离子型--十二烷基磺酸钠（sds）、阳离子型--十四烷三甲基溴化铵(ttab)、生物表面活性剂--鼠李糖脂（rh）复配添加到以甘油为碳源的高盐无机盐培养基（培养基各组分质量百分比为：甘油2%，nacl5%，nh4cl0.4%，kh2po40.05%，k2hpo40.05%，mgso4·6h2o0.033%，酵母膏0.05%，金属离子母液0.1%，其余为蒸馏水，并调节ph到6.5±0.1），并添加表面活性剂浓度为10-400mg/l，在最适条件下培养24h。培养完成后取培养液1ml于离心机中12000rpm离心5min后，去除上清液后用无菌水重悬菌体，震荡混匀，用紫外分光光度计测菌体量的od600。

结果如图14所示，离子型表面活性剂ttab和sds对x4菌株具有显著的细胞毒性，菌株生长受到强烈抑制，浓度分别为100mg/l和400mg/l时，就可以彻底抑制细胞生长。x4菌株对非离子型表活剂吐温80和生物表活剂鼠李糖脂具有较好的耐受性，浓度达400mg/l时，对细胞生长仍然影响较小。

（2）表面活性剂对嗜盐菌salinicolasp.x4菌体解烃能力的影响

菌株在高含盐培养基中活化后，按1%接种量转接到以3g/l柴油为唯一碳源的高盐无机盐培养基中分别加入40mg/l的吐温80、sds、ttab和鼠李糖脂，30-40℃、200rpm培养5d，采用gc-ms测定柴油降解特性。

以3g/l柴油为唯一碳源的高盐无机盐培养基中，添加40mg/l表活剂后的x4菌株烷烃降解效率如图15和图16所示：添加表活剂并不能提升体系中的烃降解效率。sds对柴油烃的降解效率抑制效果最为显著，总体降解率由56%下降至28.6%。添加化学表活剂后，菌株x4对于不同链长的烷烃降解能力均有所下降，特别是对c21-c31组分的降解几乎被完全抑制。生物表活剂鼠李糖脂对x4菌株的柴油烃降解效率影响相对较弱，总降解率约54%。生物表面活性剂鼠李糖脂已经在许多油田实现复配驱油体系实验，并产生了一定经济效益。本实验的结果表明，嗜盐菌x4菌株与鼠李糖脂有一定复配能力，可在高盐油污环境中实现联用驱油。

序列表

<110>南京工业大学

<120>一株原油降解菌株及其应用

<130>xb19012801

<141>2019-01-28

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1415

<212>dna

<213>中度嗜盐菌x4(salinicolasp.)

<400>1

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