香矛醇假单胞菌WXP-4及其在脱氮中的应用的制作方法

本发明涉及一株具有反硝化性能的兼性厌氧香矛醇假单胞菌wxp-4，及其在脱氮中的应用。

(二)

背景技术：

硝酸盐由于其高的水溶性特征，可能是水中主要的氮污染物。高浓度的硝酸盐会引起环境问题，如河流的富营养化和水源的恶化，以及危害人类健康。世界卫生组织(who)建议饮用水中的硝酸盐浓度应低于10mg/l，但我国地下水中硝酸盐浓度普遍高于10mg/l，甚至超过30mg/l。因此，硝酸盐的修复是近年来受到广泛关注的重大课题。

目前废水中硝酸盐的去除方法主要包括微生物反硝化法、离子交换、电渗析、反渗透、零价铁和零价镁物理化学还原法等，其中细菌脱氮是减少氮污染的最有效途径。许多报道表明，生物修复法与物理化学法相比具有更高的效率，更低的成本，并且更容易实施。传统的生物脱氮方法是以好氧自养硝化和厌氧异养反硝化工艺为基础的。然而，由于硝化速率低以及分离好氧和缺氧区的复杂性，这往往耗时且成本密集。另外，自养生物生长缓慢，对溶解氧(do)含量、盐度、光照、底物浓度等环境因素较敏感，限制了其在含氮废水处理中的应用。与传统反硝化工艺相比，好氧反硝化装置不仅操作简单，而且直接利用no3^--n/no2^--n作为反硝化剂，可以加速硝化反硝化。

(三)

技术实现要素：

本发明目的是提供一株高效、具有反硝化性能的兼性厌氧香矛醇假单胞菌—香矛醇假单胞菌wxp-4，及其在脱氮中的应用。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一株新菌株—香矛醇假单胞菌(pseudomonascitronellolis)wxp-4，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：cctccno：m2018526，保藏日期2018年08月03日，地址：中国湖北省武汉市武昌区珞珈山街16号武汉大学，邮政编码：430072。

本发明所述香矛醇假单胞菌wxp-4为兼性厌氧反硝化细菌，菌落颜色为白色，菌落呈小型单个菌落，无芽孢，不透明，表面光滑，边缘整齐。透射电镜下观察该菌体的形态为杆菌，具有单极鞭毛，革兰氏染色阴性。它生长最适ph值为6.0～7.0，最适温度为40℃，45℃有活菌且硝态氮的去除率没有明显下降。此外该菌株的生长量对溶解氧浓度敏感，溶解氧含量越低菌的od600越小，但其对硝态氮的去除率没有明显下降；并且c/n比高并不是提高细胞密度和硝酸盐反硝化性能的限制因素。因此，菌株wxp-4可以用于处理高c/n比(c/n>7)的废水，并在一定溶解氧浓度(好氧：40～200rpm、缺氧：0rpm、厌氧)内具有对中高温废水的脱氮能力。

本发明提供一种所述香矛醇假单胞菌wxp-4在脱氮(即降解硝态氮或亚硝态氮)中的应用，所述应用方法为：将香矛醇假单胞菌wxp-4接种至以硝态氮(no3^--n)或亚硝态氮(no2^--n)为氮源的dm液体选择培养基中，在25-50℃、0-200rpm下反应，实现对no3^--n或no2^--n的降解，将no3^--n/no2^--n还原为n2；所述dm液体选择培养基的终浓度组成为：氮源610-6100mg·l^-1，碳源670-23600mg·l^-1，kh2po41500mg·l^-1，mgso4·7h2o100mg·l^-1，na2hpo4·12h2o7715mg·l^-1，微量元素2ml·l^-1，琼脂20g·l^-1，溶剂为去离子水，ph＝4.0-10.0；微量元素的终浓度组成为：edta5000mg·l^-1，cacl25500mg·l^-1，cuso4·5h2o250mg·l^-1，feso4·7h2o500mg·l^-1，znso4430mg·l^-1，cocl2·6h2o240mg·l^-1，mncl2·4h2o990mg·l^-1，h3bo414mg·l^-1，溶剂为去离子水。

进一步，优选所述碳源为草酸钠、丁二酸钠、乙醇、葡萄糖或乙酸钠中一种或两种及以上以任意比例的混合，更优选丁二酸钠。所述氮源为nano3。

进一步，所述碳源与氮源中碳氮质量比为2～15:1，更优选所述碳氮元素质量比为7:1，即碳源浓度为2360mg·l^-1。

进一步，优选dm液体选择培养基ph为7.0。

进一步，优选反应条件为40℃、160rmp。

本发明所述香矛醇假单胞菌wxp-4以od600值为1.4～1.6的菌悬液形式接种，体积接种量为1％，所述菌悬液按如下步骤制备：

(1)斜面培养：将香矛醇假单胞菌wxp-4接种至btb培养基，30℃培养1天，获得斜面菌体；所述btb培养基终浓度组成为：丁二酸钠8.5g·l^-1、l-天冬酰胺酸1g·l^-1、kh2po41g·l^-1、fecl2·6h2o0.05g·l^-1、nano20.7g·l^-1、cacl2·2h2o0.2g·l^-1、mgso4·7h2o1g·l^-1、质量浓度1％btb(溴麝香草酚蓝)乙醇溶液1ml/l，琼脂20g·l^-1，溶剂为去离子水，ph值7.0。

(2)种子培养：从斜面菌体挑取菌落接种至lb培养基，30℃培养12h，获得菌悬液；所述lb培养基终浓度组成为：nacl10g/l，蛋白胨5g/l，牛肉膏10g/l，溶剂为去离子水，ph值7.0。与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：

1.香矛醇假单胞菌wxp-4是兼性厌氧反硝化菌株，它具有高效的好氧反硝化能力，其最大的硝酸根去除速率是32.05mgl^-1h^-1和平均去除速率是12.5mgl^-1h^-1(初始浓度100mg/l)。

2.它耐受广泛的硝酸根浓度，其具有应用氮污染废水的潜能。

(四)附图说明

图1为菌株wxp-4的透射电镜照片。

图2为菌株wxp-4的系统发育树图。

图3不同碳源下菌株wxp-4的no3^--n还原性能比较。

图4不同c/n下菌株wxp-4的no3^--n还原性能比较。

图5不同ph下菌株wxp-4的no3^--n还原性能比较。

图6不同温度下菌株wxp-4的no3^--n还原性能比较。

图7不同溶解氧下菌株wxp-4的no3^--n还原性能比较。

图8不同初始硝酸根浓度下菌株wxp-4的no3^--n还原性能比较。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：pseudomonascitronelloliswxp-4的分离、纯化及其鉴定

1.pseudomonascitronelloliswxp-4的分离及纯化

pseudomonascitronelloliswxp-4是从七格污水处理厂好氧污泥池中筛得，具体步骤如下：

富集培养液配制方法如下：丁二酸钠2840mg·l^-1，nano2345mg·l^-1，(nh4)2so4270mg·l^-1，kh2po41360mg·l^-1，mgso4·7h2o190mg·l^-1，酵母膏1000mg·l^-1，微量元素1ml·l^-1，ph＝7.0，琼脂20g·l^-1，溶剂为去离子水，ph＝7.0。

dm液体选择培养基：nano3610mg·l^-1，丁二酸钠2360mg·l^-1，kh2po41500mg·l^-1，mgso4·7h2o100mg·l^-1，na2hpo4·12h2o7715mg·l^-1，微量元素2ml·l^-1，琼脂20g·l^-1，溶剂为去离子水，ph＝7.0。

微量元素的终浓度组成为：edta5000mg·l^-1，cacl25500mg·l^-1，cuso4·5h2o250mg·l^-1，feso4·7h2o500mg·l^-1，znso4430mg·l^-1，cocl2·6h2o240mg·l^-1，mncl2·4h2o990mg·l^-1，h3bo414mg·l^-1，溶剂为去离子水。

btb培养基终浓度组成为：丁二酸钠8.5g·l^-1、l-天冬酰胺酸1g·l^-1、kh2po41g·l^-1、fecl2·6h2o0.05g·l^-1、nano20.7g·l^-1、cacl2·2h2o0.2g·l^-1、mgso4·7h2o1g·l^-1、质量浓度1％btb(溴麝香草酚蓝)乙醇溶液1ml/l，琼脂20g·l^-1，溶剂为去离子水，ph值7.0。

取好氧池中污泥，静置2h后，取上清液10ml接种于含100ml富集培养液250ml培养瓶中，30℃，160rpm振荡培养24h，重复3次。用无菌水将菌液稀释成10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7。将所得到的菌液用btb培养基经多次平板划线分离纯化，得到单菌落即还原菌种，记为菌株wxp-4。

2.菌株wxp-4的鉴定

a、菌株wxp-4的生理生化特征

菌株wxp-4接种至btb培养基，30℃培养1天，菌落颜色为白色，菌落呈小型单个菌落，无芽孢，不透明，表面光滑，边缘整齐。透射电镜下观察该菌体的形态为杆菌(图1所示)，具有鞭毛，革兰氏染色阴性。它生长最适ph值为7.0，最适温度为40℃。

b、菌株wxp-4的16srrna序列分析

通过16srrna序列分析和生理生化实验鉴定，确定菌株wxp-4为pseudomonascitronellolis。测序结果见序列seqidno：1所示。

将wxp-4的16srdna序列上传到genbank，获得genbank的登录号mk102980，与genbank中的基因序列进行同源性比较，图2为该菌株的系统发育树图。为了进一步确定鉴定结果的可靠性，经过生理生化实验，最终确定菌株wxp-4属于pseudomonascitronellolis，因此，将该菌株命名为香矛醇假单胞菌(pseudomonascitronellolis)wxp-4，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：cctccno：m2018526，保藏日期2018年08月03日，地址：中国，武汉，武汉大学，邮政编码：430072。

实施例2香矛醇假单胞菌wxp-4种子培养液

(1)斜面培养：将香矛醇假单胞菌wxp-4接种至btb培养基(组成同实施例1)，30℃培养1天，获得斜面菌体；

(2)种子培养：从斜面菌体挑取菌落接种至lb培养基，30℃培养12h，获得od600为1.5种子液，即为菌悬液；所述lb培养基终浓度组成为：nacl10g/l，蛋白胨5g/l，牛肉膏10g/l，溶剂为去离子水，ph值7.0。

实施例3：香矛醇假单胞菌wxp-4反硝化性能检测

1.考察不同碳源下香矛醇假单胞菌wxp-4还原no3^--n的性能

在不同碳源下实施香矛醇假单胞菌wxp-4还原no3^--n的实验，结果表明其最佳碳源为丁二酸钠，具体实施方案如下：

将实施例2方法制备的od600为1.5的菌悬液按体积浓度1％接种量接种至5种不同碳源的dm液体选择培养基(均以no3^--n为唯一氮源)中，30℃，160rpm振荡培养10h，分别取1ml各个培养液在10000rpm离心5min去除微生物获得上清液，然后用紫外分光光度计分别测出其在220nm、275nm波长下的吸光度值,a＝a220-2×a275。

dm液体选择培养基：nano3610mg·l^-1(氮元素质量浓度100mg·l^-1)，碳源2360mg·l^-1(碳元素的质量浓度700mg·l^-1)，kh2po41500mg·l^-1，mgso4·7h2o100mg·l^-1，na2hpo4·12h2o7715mg·l^-1，微量元素2ml·l^-1，琼脂20g·l^-1，溶剂为去离子水，ph＝7.0。微量元素的终浓度组成为：edta5000mg·l^-1，cacl25500mg·l^-1，cuso4·5h2o250mg·l^-1，feso4·7h2o500mg·l^-1，znso4430mg·l^-1，cocl2·6h2o240mg·l^-1，mncl2·4h2o990mg·l^-1，h3bo414mg·l^-1，溶剂为去离子水。

将dm液体选择培养基的氮源为nano3，对碳源进行选择，分别得到：dm液体选择培养基a(碳源为乙酸钠)、dm液体选择培养基b(碳源为葡萄糖)、dm液体选择培养基c(碳源为丁二酸钠)、dm液体选择培养基d(碳源为草酸钠)、dm液体选择培养基e(碳源为乙醇)。

碳源为微生物的生长提供重要的能源，并构成微生物的细胞物质。不同的碳源因其结构和分子量不同，对微生物还原的影响程度也不尽相同，结果如图3所示。香矛醇假单胞菌wxp-4在丁二酸钠为碳源时no3^--n的降解率相对高一些，草酸钠为碳源时降解率最低。研究得出的结论，所用碳源的化学结构和分子量对还原效率的影响是很大的。通常结构越简单，分子量越小的碳源越有利于微生物还原的进行。

2.考察不同c/n质量比下pseudomonascitronelloliswxp-4还原no3^--n的性能

在不同c/n质量比下实施pseudomonascitronelloliswxp-4的反硝化实验，结果表明其最佳c/n质量比为7:1，具体实施方案如下：

将实施例2方法制备的od600为1.5的菌悬液按体积浓度1％接种量接种至5种不同c/n质量比的dm液体选择培养基(均以nano3为氮源，以丁二酸钠为碳源)中，30℃，160rpm振荡培养10h，分别取1ml各个培养液在10000rpm离心5min去除微生物获得上清液，然后用紫外分光光度计分别测出其在220nm、275nm波长下的吸光度值，a＝a220-2×a275。

将dm液体选择培养基的氮源为nano3，碳源为丁二酸钠，对碳氮质量比进行选择，分别得到：dm液体选择培养基a1(c/n质量比为2:1，nano3610mg·l^-1，丁二酸钠670mg·l^-1)、dm液体选择培养基b1(c/n质量比为4:1，nano3610mg·l^-1，丁二酸钠1350mg·l^-1)、dm液体选择培养基c1(c/n质量比为7:1，nano3610mg·l^-1，丁二酸钠2360mg·l^-1)、dm液体选择培养基d1(c/n质量比为10:1，nano3610mg·l^-1，丁二酸钠3380mg·l^-1)、dm液体选择培养基e1(c/n质量比为15:1，nano3610mg·l^-1，丁二酸钠5060mg·l^-1)5种培养基中。

结果如图4所示：当丁二酸钠小于2360mg·l^-1时，由于碳源对菌体的生长和还原效率起着重要的作用，碳源不足，就没有足够的电子流来提供足够的能源以供菌体生长，当c/n>7时，还原效率达到最大且稳定。

3.考察不同初始ph条件下pseudomonascitronelloliswxp-4还原no3^--n的性能

在不同初始ph下实施pseudomonascitronelloliswxp-4还原no3^--n的实验，发现ph在7.0时具有较高的反硝化能力，从实际应用角度看，ph＝7.0为最佳ph，此时降解率最高，具体实施步骤如下：

将实施例2方法制备的od600为1.5的菌悬液按体积浓度1％接种量接种至5种不同ph值(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)的dm液体选择培养基(nano3610mg·l^-1，丁二酸钠2360mg·l^-1)中，30℃，160rpm振荡培养10h，分别取1ml各个培养液在10000rpm离心5min去除微生物获得上清液，然后用紫外分光光度计分别测出其在220nm、275nm波长下的吸光度值，a＝a220-2×a275。

结果如图5所示，菌株wxp-4对弱酸弱碱的环境适应性相对较差，但当ph为7.0时，菌株wxp-4的还原率达到100％。

4.考察不同初始温度条件下pseudomonascitronelloliswxp-4还原no3^--n的性能

在不同初始温度下实施pseudomonascitronelloliswxp-4还原no3^--n的实验，发现温度在40℃时具有较高的反硝化能力，此时降解率最高，具体实施步骤如下：

将实施例2方法制备的od600为1.5的菌悬液按体积浓度1％接种量接种至dm液体选择培养基(nano3610mg·l^-1，丁二酸钠2360mg·l^-1)中，分别在不同温度(25℃、30℃、37℃、40℃、45℃、50℃)，160rpm振荡培养10h，分别取1ml各个培养液在10000rpm离心5min去除微生物获得上清液，然后用紫外分光光度计分别测出其在220nm、275nm波长下的吸光度值，a＝a220-2×a275。

结果如图6所示：菌株wxp-4对中温有很好的耐受性，以40℃为最佳，45℃有活菌且硝态氮的去除率没有明显下降。

5.考察不同初始溶解氧条件下pseudomonascitronelloliswxp-4还原no3^--n的性能

在不同浓度溶解氧下实施pseudomonascitronelloliswxp-4还原no3^--n的实验，发现摇床转速在160rpm时具有最高的反硝化能力，此时降解率最高，具体实施步骤如下：

将实施例2方法制备的od600为1.5的菌悬液按体积浓度1％接种量接种至dm液体选择培养基(nano3610mg·l^-1，丁二酸钠2360mg·l^-1)中，在40℃，不同溶解氧值(好氧：40、80、120、160、200rpm；缺氧：0rpm；)振荡培养10h，分别取1ml各个培养液在10000rpm离心5min去除微生物获得上清液，然后用紫外分光光度计分别测出其在220nm、275nm波长下的吸光度值，a＝a220-2×a275。

结果如图7所示：该菌株的生长量对溶解氧浓度敏感，溶解氧含量越低菌的od600越小，但其对硝态氮的去除率没有明显下降。

实施例4：考察不同初始硝酸根浓度下香矛醇假单胞菌wxp-4反硝化性能

在不同初始硝酸根浓度下实施pseudomonascitronelloliswxp-4的反硝化实验，具体实施方案如下：

将实施例2方法制备的od600为1.5的菌悬液按体积浓度1％接种量接种至不同硝酸根浓度的dm液体选择培养基(氮源nano3，碳源丁二酸钠)中，在40℃，160rpm振荡培养10h，分别取1ml各个培养液在10000rpm离心5min去除微生物获得上清液，然后用紫外分光光度计分别测出其在220nm、275nm波长下的吸光度值，a＝a220-2×a275。

结果如图8所示：总体上，no3^--n去除效率随着no3^--n初始浓度的增加而降低。

将dm液体选择培养基的氮源no3^--n，碳源丁二酸钠进行浓度选择，分别得到：dm液体选择培养基a1(nano3610mg·l^-1，丁二酸钠2360mg·l^-1)b1(nano31220mg·l^-1，丁二酸钠4720mg·l^-1)、dm液体选择培养基c1(nano32440mg·l^-1，丁二酸钠9440mg·l^-1)、dm液体选择培养基d1(nano33660mg·l^-1，丁二酸钠14160mg·l^-1)、dm液体选择培养基e1(nano34880mg·l^-1，丁二酸钠18880mg·l^-1)、dm液体选择培养基f1(nano36100mg·l^-1，丁二酸钠23600mg·l^-1)。

序列表

<110>浙江工业大学

<120>香矛醇假单胞菌wxp-4及其在脱氮中的应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1362

<212>dna

<213>香矛醇假单胞菌(pseudomonascitronellolis)

<400>1

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