一种生防DSE菌株LS1及其在香蕉枯萎病上的应用的制作方法

本发明涉及一种微生物领域，尤其涉及一种dse菌株cladosporiumchlorocephalumls1对香蕉枯萎病的生防作用。

背景技术：

香蕉是我国南方亚热带地区重要的经济作物。2013年广西香蕉种植面积约9万公顷，产量275.2万吨，相比2005年产量翻了一倍。但是由于香蕉的规模化连作种植，导致了土传病害香蕉枯萎病（fusariumoxysporumf.sp.cubense）的多发危害。该病可引起病株凋萎、维管束坏死，病重田块发病率高达90%，严重制约广西香蕉产业的发展^[1-2]。受抗病品种产量不佳，化学药剂防治不理想等防治手段的制约，经济又环保的生物防治技术逐渐成为防治该病的研究热点。

目前来说，深色有隔内生真菌（darkseptateendophyte,dse）是一类菌丝深色有分隔，可形成“微菌核”的土壤子囊菌或半知菌，其定殖在植物根组织细胞内或细胞间隙，对宿主无致病性。许多研究表明dse能与宿主互惠共生，在抗逆、促生、防病等方面都发挥着积极的生态功能，且其定殖广泛，宿主非专一性，使得植物-dse共生体作为继豆科植物-根瘤共生体、菌根共生体后的又一种植物与微生物共生关系的表现形式，在菌根研究领域逐渐受到重视。2017年，张晓蓉等通过接种dse真菌甘瓶霉phialophoramusteak36与z48显著缓解番茄受尖孢镰刀菌抑制生长的症状；农倩等筛选获得一株对香蕉枯萎病有较强生防能力的dse菌株l-14（裂壳菌schizotheciumsp.）。2018年，surono等发现在芦笋上接种dse真菌phialocepahalafortiniickg.i.11能促进芦笋的生长并对枯萎病有抑制作用。

技术实现要素：

之前的研究中，申请人已发现对香蕉枯萎病具优良生防作用的dse菌株，但数量仍非常有限，为了今后复合菌剂的研发仍需加大优良菌株的筛选力度。为此，本发明的目的是对本实验室保存的其他dse菌株进行生防效果的测定，并进行分类鉴定。本发明旨在筛选获得高效、稳定的香蕉枯萎病生防菌株，为香蕉枯萎病生防菌剂的开发提供更为丰富的菌种资源。

一种防治香蕉枯萎病的内生真菌ls1，保藏号为cgmccno.16498，保藏时间为2018年11月8日。保藏单位：cgmcc-中国普通微生物菌种保藏管理中心、分类命名：cladosporiumchlorocephalum；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明提供一种生防dse菌株ls1及其在香蕉枯萎病上的应用，其应用方法包括如下几个步骤：

步骤a:菌株接种及其对香蕉生长的影响:将供试dse菌株活化后接种于燕麦培养基上，选取长势一致的香蕉组培苗移栽至菌落上，根系平铺于菌落表面，每个菌落移栽一株，培养皿放至组培瓶，放入培养箱中培养；测定香蕉的株高、茎宽、鲜重和干重；各处理的部分新鲜香蕉根样用于dse的定殖观察及再分离，记录预留部分的样品质量，其余部分称量鲜重后烘箱干燥至恒重，测量干重，计算平均含水量，并将之前预留的新鲜根样经换算后一起计算入干重;

步骤b:菌株的再分离与定殖检测:取适量新鲜根样，切小段放置试管中，加入koh溶液完全浸没根段，于恒温水浴锅中解离，使根段软化透明，用墨水醋进行染色后清水漂洗并浸泡脱色，观察dse在香蕉根部的定殖情况，并计算定殖率（定殖率%=（定殖根段数/被镜检根段总数）×100%）;

步骤c:菌株对香蕉枯萎病的防治效果测定:将dse-香蕉共生体（连同燕麦培养基）移至长有镰刀菌的水琼脂培养基上，未接菌的对照香蕉组培苗直接接入带有镰刀菌的水琼脂平板上;观察记录病级、计算病情指数和防治效果;

步骤d:生防菌株的分类鉴定:观察菌株在pda培养基上的菌落特征，并通过盖玻片斜插法，使菌丝着生在盖玻片上，光学显微镜下观察盖玻片上的菌丝形态。

优选的，所述步骤a中，所述燕麦培养基采用：燕麦粉10g·l^-1，琼脂18g·l^-1，mgso4·7h2o1g·l^-1，kh2po41.5g·l^-1，nano31g·l^-1，每皿3个菌块，28℃培养10d。

优选的，所述步骤a中，组培瓶，于28℃，光强180μmol·m^-2·s^-2、光周期16h:8h的培养箱中培养40d。

优选的，所述步骤b中，加入质量浓度为10%koh溶液完全浸没根段，于90℃恒温水浴锅中解离15-20min，使根段软化透明，用墨水醋（体积比：墨水5：米醋95）进行染色后清水漂洗3次，并浸泡12h脱色。

优选的，所述步骤c中，病情分级标准：0级-外观无可见症状；1级-植株长势无明显受阻，全株黄萎面积≤35%；2级-植株弱小，35%＜全株黄萎面积≤80%；3级-全株黄萎面积＞80%。

优选的，所述步骤c中，盆栽生防试验取4叶期大小的香蕉幼苗进行；制备5×10⁵cfuml^-1的dse菌液进行灌根处理。每株香蕉苗灌根50ml菌液，每隔15d灌一次，共灌三次。于最后一次灌根结束10-15d后，对香蕉苗进行伤根并接种镰刀菌孢子液（1×10⁶cfuml^-1）。

优选的，以清水灌根并接种病原菌的处理为对照（ck）。于接种病原菌后25d解剖香蕉球茎，观察记录发病情况并计算防效。每处理3个重复，每重复8株苗。病情分级标准：0级-球茎健康无变色；1级：球茎变色面积占球茎面积＜20%；2级：20%≤球茎变色面积占球茎面积＜40%；3级：40%≤球茎变色面积占球茎面积的＜60%；4级：60%≤球茎变色面积占球茎面积＜80%；5级：球茎变色面积占球茎面积≥80%。

计算公式：病情指数=∑（病株级数×代表数值)/（株数总和×最高病级代表值）；防治效果（%）=[（对照病情指数－处理病情指数）×100]/对照病情指数

优选的，所述步骤d中，诱导产孢时，放置4℃培养2-4周。

优选的，所述步骤d中，菌丝体总dna采用omega真菌dna提取试剂盒提取，扩增引物为its1：5’-tccgtaggtgaacctgcgg-3’和its4：5’-tcctccgcttattgatatgc-3’。扩增体系50μl，其中含：mastermix（tiangel）25μl，20μmoll-1正反引物各1μl，dna1μl，ddh2o定容。扩增程序：98℃预变性2min；94℃变性40s，50℃退火1min，68℃延伸4min，30个循环；最后72℃延伸10min。

长期以来，室内抑菌试验与田间防治试验的防治效果差异大是生物防治技术有效应用的一大问题。鉴于“dse-植物”共生体中dse定殖在植物的根内部而非表面的特点，我们将dse应用在土传病害香蕉枯萎病的防治上，以期能减少其他土壤微生物对生防菌株的影响，从而降低防效的不稳定性。

本发明通过室内平皿和盆栽实验筛选到了一株生防dse菌株ls1，其平皿防治效果高达86.19%，盆栽防治效果为63.19%。该菌株在平皿和盆栽试验中的防效表现还算比较稳定，田间施用防效如何还需要进一步的实验证实。实验中的另外4株dse菌株对香蕉也能表现一定的生防作用，但盆栽实验防效不理想。。

附图说明

图1是本发明菌株ls1形态鉴定图。其中a为在pda培养基上的菌落形态；b为产孢梗和分生孢子；c为分生孢子。

图2是本发明中的dse在香蕉根中的菌丝和微菌核结构，其中，箭头所示为微菌核。

图3是本发明不同dse定殖率比较图。

图4不同dse菌株对香蕉枯萎病的生防效果。

图5是本发明菌株ls1与相关菌株基于its片段的系统发育树。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明：

实施例1

菌株ls1的分离所需材料与方法如下：

1.材料

采集南宁市郊区蔗地根围土样，4℃保存待用。

选用茄子种子，种子表面消毒方法：体积浓度75%酒精20秒→质量浓度1%次氯酸钠振荡消毒40s→无菌水振荡漂洗三次→无菌滤纸吸干水分→置于纯琼脂平板上培养2-3天，出芽长成无菌苗。2.菌株ls1的分离将上述获得的无菌茄子苗移栽至混合培养基质中（土样与灭菌育苗土重量比2:1），种植50至60天，用自来水冲洗干净茄子根附着的土壤基质，采用质量浓度0.5%吐温-20震荡消毒3次，每次1分钟，灭菌水震荡冲洗3次后，吸干水分后置于重量浓度为1/2玉米粉培养基上，于28℃培养箱中培养并逐日观察，待菌丝从根段部位长出后及时转接到马铃薯葡萄糖培养基（pda）上，获得纯培养菌株。

生防菌株的分类鉴定：

1.菌株ls1的形态学观察

将菌株活化至马铃薯葡萄糖培养基（pda）上，培养14天后观察菌落形态特征。用插片法将纯化的菌株接于燕麦培养基，28℃培养2周，待明显看到菌丝着生在盖玻片上时，至于4℃冰箱中4周-6周，诱导其产生分生孢子，将玻片取出，于光学显微镜下进行观察。

2.菌株ls1的分子鉴定

将内生真菌菌株ls1培养于马铃薯葡萄糖液体培养基（pdb），在28℃转速120r/min摇床中震荡培养10-14d后，过滤收集菌丝。菌丝体总dna采用omega真菌dna提取试剂盒提取，扩增引物为its1：5’-tccgtaggtgaacctgcgg-3’和its4：5’-tcctccgcttattgatatgc-3’。扩增体系50μl，其中含：mastermix（tiangel）25μl，20μmoll-1正反引物各1μl，dna1μl，ddh2o定容。扩增程序：98℃预变性2min；94℃变性40s，50℃退火1min，68℃延伸4min，30个循环；最后72℃延伸10min。产物测序由上海生工生物工程技术有限公司完成。

序列使用clustalx1.81和bioeditv7.0软件进行分析，实验获得的its1/its4序列及其在genbank中下载的最相似序列，使用mega6.06软件基于kimura双参数模型构建neighbor-joining系统发育树，经bootstrap1000次循环检验系统树的可靠性。

3.菌株ls1的形态学鉴定

形态学鉴定：菌株ls1在pda培养基上生长速度适中，28℃培养2周后，菌落直径约70mm，菌落圆形，褐色至褐绿色，绒毡状，边缘平整，有浅放射状沟纹，背面深褐色（图1a）。显微镜下观察可见ls1菌丝分支有隔，黄褐色至褐色，光滑，厚壁，直径1.4-4.7μm。分生孢子梗在菌丝的顶端或侧枝上直立产生，不分枝，褐色，光滑，有隔，大小为22.4-386.7×2.7-5.2μm（图1b）。分生孢子梗顶端及中部膨大形成产孢细胞，膨大部位3.7-6.3μm。分枝分生孢子多为柱形，部分椭圆形，大部分中部稍有收缩，有0-2个分隔，其上分生孢子链生，链生孢子上或再产生枝孢，再链生孢子，枝孢大小为6.4-28.5×2.0-5.6μm。分生孢子近圆形、椭圆形、柠檬形或纺锤形，黄褐色，无分隔，部分孢子两端或一端有孢脐，3.4-8.4×2.2-4.7μm；近圆形孢子直径为2.4-7.6μm。（图1c）。上述特征与现有技术中对绿头枝孢cladosporiumchlorocephalum的形态特征描述基本相符。

4.序列分析及系统发育分析

对ls1菌株的its片段扩增、纯化、测序后获得一条约550bp的目的片段，提交genbank获得登入号mh376857，序列在ncbi中进行blastn分析，发现ls1与枝霉属cladosporium各分离物的序列相似性均在99%以上；采用benschk（studiesinmycology,2015,82(82):23-74）文中序列及genbank中下载的相关序列，构建了基于its序列的系统发育树（图5），发现ls1与c.chlorocephalum、c.tenuissimum聚为一支，支持率为89%，且菌株ls1与c.chlorocephalum的its序列相似性为100%。综合分析结果，将菌株ls1鉴定为绿头枝孢菌cladosporiumchlorocephalum。

实施例2

1.材料和方法

1.1实验材料

供试菌株：由本实验室2016年从甘蔗根围土壤分离获得，编号分别为ls1、lc8、b2、ms38、td1。

供试香蕉组培苗：桂蕉6号，由广西植物组培苗有限公司提供。

供试病原菌：镰刀菌4号生理小种（foc4）。

1.2实验方法

1.2.1菌株接种及其对香蕉生长的影响

将供试dse菌株活化后接种于燕麦培养基上（燕麦粉10g·l^-1，琼脂18g·l^-1，mgso4·7h2o1g·l^-1，kh2po41.5g·l^-1，nano31g·l^-1），每皿3个菌块，28℃培养10-14d。选取长势一致的香蕉组培苗移栽至菌落上，根系平铺于菌落表面，每个菌落移栽一株，培养皿放至组培瓶，于28-30℃，光强160-180μmol·m^-2·s^-2、光周期16h:8h的培养箱中培养40d左右，以不接种dse菌株处理为对照，每个处理3个重复，每重复10皿。测定香蕉的株高、茎宽、鲜重和干重。各处理的部分新鲜香蕉根样用于dse的定殖观察及再分离，记录预留部分的样品质量，其余部分称量鲜重后置于70℃烘箱干燥70-75h至恒重，测量干重，计算平均含水量，并将之前预留的新鲜根样经换算后一起计算入干重。

1.2.2菌株的再分离与定殖检测

取适量新鲜根样，自来水冲洗干净后剪成约1cm的小段放置干净50ml试管中，加入10%koh溶液完全浸没根段，于90℃恒温水浴锅中解离15-20min，使根段软化透明，用墨水醋（体积比墨水5：米醋95）进行染色后清水漂洗3次，并浸泡10-14h脱色，于光学显微镜下观察dse在香蕉根部的定殖情况，并计算定殖率（定殖率%=（定殖根段数/被镜检根段总数）×100%）。dse的再分离。

1.2.3菌株对香蕉枯萎病的防治效果测定

平皿和盆栽生防实验：将dse-香蕉共生体（连同燕麦培养基）移至长有镰刀菌的水琼脂培养基上，未接菌的对照香蕉组培苗直接接入带有镰刀菌的水琼脂平板上。每个处理重复10皿。观察记录病级、计算病情指数和防治效果。病情分级标准：0级-外观无可见症状；1级-植株长势无明显受阻，全株黄萎面积≤35%；2级-植株弱小，35%＜全株黄萎面积≤80%；3级-全株黄萎面积＞80%。

盆栽生防试验取4叶期大小的香蕉幼苗进行。制备5×10⁵cfuml^-1的dse菌液进行灌根处理。每株香蕉苗灌根50ml菌液，每隔15d灌一次，共灌三次。于最后一次灌根结束15d后，对香蕉苗进行伤根并接种镰刀菌孢子液（1×10⁶cfuml^-1）。以清水灌根并接种病原菌的处理为对照（ck）。于接种病原菌后25d解剖香蕉球茎，观察记录发病情况并计算防效。每处理3个重复，每重复8株苗。病情分级标准：0级-球茎健康无变色；1级：球茎变色面积占球茎面积＜20%；2级：20%≤球茎变色面积占球茎面积＜40%；3级：40%≤球茎变色面积占球茎面积的＜60%；4级：60%≤球茎变色面积占球茎面积＜80%；5级：球茎变色面积占球茎面积≥80%。

计算公式：病情指数=∑（病株级数×代表数值)/（株数总和×最高病级代表值）；防治效果（%）=[（对照病情指数－处理病情指数）×100]/对照病情指数。

1.2.4生防菌株的分类鉴定

dse的形态学观察参照蓝桃菊等的方法进行，观察菌株在pda培养基上的菌落特征，并通过盖玻片斜插法，使菌丝着生在盖玻片上，光学显微镜下观察盖玻片上的菌丝形态。诱导产孢时，放置4℃培养2-4周。

菌丝体总dna采用omega真菌dna提取试剂盒提取，扩增引物为its1：5’-tccgtaggtgaacctgcgg-3’和its4：5’-tcctccgcttattgatatgc-3’。扩增体系50μl，其中含：mastermix（tiangel）25μl，20μmoll-1正反引物各1μl，dna1μl，ddh2o定容。扩增程序：98℃预变性2min；94℃变性40s，50℃退火1min，68℃延伸4min，30个循环；最后72℃延伸10min。产物测序由上海生工生物工程技术有限公司完成。通过ncbiblastn对获得序列进行比对分析，使用mega6.0程序进行系统进化树构建。

2.结果与分析

2.1接种菌株对香蕉生长的影响

接种dse菌株40d后观察发现，各接种dse处理的香蕉植株均比未接种dse的处理长势要好。由表1可见，接种dse可以有效提高香蕉植株的株高、茎宽、鲜重和干重，增长率分别为4.49%～21.91%、3.66%～30.37%、18.42%～47.36%、35.9%～42.40%，其中接种菌株ls1后的香蕉植株株高、茎宽、鲜重和干重与对照相比均达到差异显著水平，鲜重与干重分别较对照增长47.36%与42.40%。

表1不同dse菌株对香蕉组培苗生长的影响

2.2dse在香蕉根系中的定殖

以无菌条件下接种dse菌株40d后的香蕉组培苗根样为材料，从根系中分离到与接种dse培养性状、形态结构一致的内生真菌，表明接种40d后“dse-香蕉”共生体系已经建立。对香蕉根样解离染色后，进行显微镜观察，均发现了深色、有横隔的菌丝，部分样品能观察到“微菌核”等dse典型结构（图2）。5株dse菌株的定殖率在30%-45%之间，菌株ls1、td1、b2的定殖率较高，且差异不显著，菌株lc8的定殖率最低（图3）。

2.3dse对香蕉枯萎病的生防效果

如图4所示，接种5株dse菌株后，各处理的香蕉植株对香蕉枯萎病产生了强弱不一的抗病性，平皿防效在57.76%-86.19%之间，盆栽防效在12.69%-63.19%之间。其中菌株ls1处理的香蕉植株表现的防治效果最佳，并与其它菌株处理达到差异显著水平。可见菌株ls1是一株具生防潜力的内生真菌，对其进行进一步的分类鉴定。

2.4生防菌株ls1的分类鉴定

形态学鉴定：菌株ls1在pda培养基上生长速度适中，28℃培养2周后，菌落直径约70mm，菌落圆形，褐色至褐绿色，绒毡状，边缘平整，有浅放射状沟纹，背面深褐色（图1a）。显微镜下观察可见ls1菌丝分支有隔，黄褐色至褐色，光滑，厚壁，直径1.4-4.7μm。分生孢子梗在菌丝的顶端或侧枝上直立产生，不分枝，褐色，光滑，有隔，大小为22.4-386.7×2.7-5.2μm（图1b）。分生孢子梗顶端及中部膨大形成产孢细胞，膨大部位3.7-6.3μm。分枝分生孢子多为柱形，部分椭圆形，大部分中部稍有收缩，有0-2个分隔，其上分生孢子链生，链生孢子上或再产生枝孢，再链生孢子，枝孢大小为6.4-28.5×2.0-5.6μm。分生孢子近圆形、椭圆形、柠檬形或纺锤形，黄褐色，无分隔，部分孢子两端或一端有孢脐，3.4-8.4×2.2-4.7μm；近圆形孢子直径为2.4-7.6μm。（图1c）。上述特征与文献中所纪录的对绿头枝孢cladosporiumchlorocephalum的形态特征描述基本相符。

分子鉴定：利用its引物对ls1菌株总dna进行its扩增后得到一条约550bp的目的pcr产物条带，将pcr产物经纯化后进行测序，提交genbank获得登入号mh376857，序列在ncbi中进行blastn分析，发现ls1与枝霉属cladosporium各分离物的序列相似性均在99%以上；采用benschk（studiesinmycology,2015,82(82):23-74）文中序列及genbank中下载的相关序列，构建了基于its序列的系统发育树（图5），发现ls1与c.chlorocephalum、c.tenuissimum聚为一支，支持率为89%，且菌株ls1与c.chlorocephalum的its序列相似性为100%。

综合分析结果，将菌株ls1鉴定为绿头枝孢菌cladosporiumchlorocephalum。

有关dse的分类地位是目前dse研究中亟待解决的问题之一。由于多数dse在可培养条件下均已无性态存在，有性态很少出现，给形态学分类带来了困难。目前借助分子鉴定技术，已被鉴定出来的dse包括10多个属，约30个种的真菌，呈现多源性。本发明通过形态学和分子鉴定相结合的手段，将菌株ls1鉴定为绿头枝孢菌cladosporiumchlorocephalum。

通过在香蕉上接种从甘蔗根围土壤分离获得的绿头枝孢菌cladosporiumchlorocephalumls1，有效提高了香蕉的株高、茎宽、鲜重和干重。且接种完成后，ls1-香蕉共生体对香蕉枯萎病的平皿防效达86.19%，盆栽防效达63.19%。由此可见，该菌是一株极具研究利用价值的有益生防菌。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

序列表

<110>广西壮族自治区农业科学院

<120>一种生防dse菌株ls1及其在香蕉枯萎病上的应用

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>19

<212>dna

<213>its1

<400>1

tccgtaggtgaacctgcgg19

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>its4

<400>2

tcctccgcttattgatatgc20