一种球孢白僵菌及其应用以及包含该球孢白僵菌的杀虫剂的制作方法

本发明属于生物防治技术领域，具体涉及一种球孢白僵菌及其应用以及包含该球孢白僵菌的杀虫剂。

背景技术：

大豆高隆象(erganiadoriaeyunnanusheller)属鞘翅目象甲科害虫，成虫蛀食大豆茎秆和豆荚，造成大豆不正常结实，而幼虫直接取食大豆豆粒，直到成熟出荚。在国内，大豆高隆象主要分布在广西、陕西、四川、云南等地区。近年来，随着玉米-大豆复合种植技术的大面积推广，四川地区的大豆种植面积逐年上升。种植面积的增加加重病虫害发生，据调查，在复合种植模式下大豆高隆象造成的危害远高于其他害虫，危害一般的田块损失10％～20％，危害严重的田块损失高达60％～70％。目前，对大豆高隆象主要以化学防治为主，防治药剂主要有：甲维盐、氯虫苯甲酰胺、溴氰菊脂等。尽管化学防治农业害虫快速有效，但长期使用化学农药会造成严重的“3r”问题。之前的研究发现，喷施三唑磷和氯虫苯甲酰胺进行大豆高隆象的防治，均造成不同程度的大豆氧化胁迫损伤。因此，探究更加合理的防治手段来控制大豆高隆象的发生十分有必要。

球孢白僵菌(beauveriabassiana)可寄生包括15个目700多种昆虫，容易大规模生产，是目前研究和应用最多的昆虫病原菌之一。目前广泛用于防治松毛虫、玉米螟等害虫。运用白僵菌防治的象甲科害虫，主要有稻水象甲、茶丽纹象甲、柑橘灰象甲等，还未见有利用白僵菌对大豆高隆象进行防治的报道。

技术实现要素：

针对上述现有技术，本发明提供一种分离自大豆高隆象的球孢白僵菌以及球孢白僵菌菌剂在防治大豆高隆象中的应用，以解决化学防治高隆象会造成大豆氧化胁迫损伤的问题。

为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：提供一种分离自大豆高隆象的球孢白僵菌，该球孢白僵菌命名为bedy1，于2018年12月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为cctccm2018869，其ncbi登录号为mk345993。

本发明的另一个目的是将从大豆高隆象僵虫上分离出的球孢白僵菌应用于大豆高隆象的防治中，在防治过程中所用的球孢白僵菌的孢悬液浓度为1×10⁷～5×10⁷个/ml。

另外，本发明还提供一种杀虫剂，该杀虫剂以从大豆高隆象上分离出球孢白僵菌为活性成分，并且球孢白僵菌以分生孢子的形式存在。

本发明中的球孢白僵菌beauveriabassianabedy1对大豆高隆象具有高致病力，可以有效杀死大豆高隆象。

本发明从大豆高隆象上分离出的球孢白僵菌的保存信息如下：

菌种名称：球孢白僵菌，拉丁文为beauveriabassiana

命名：bedy1

保藏机构：中国典型培养物保藏中心

保藏机构简称：cctcc

保藏机构地址：湖北省武汉市武昌区武汉大学中国典型培养物保藏中心

保藏编号：cctccm2018869

保藏日期：2018年12月7日

本发明的有益效果是：本发明所用到的球孢白僵菌分离自大豆高隆象僵虫，原料易得，分离简单，而且对大豆高隆象具有特异性致病作用，能高效杀死大豆高隆象，可有效解决长期使用化学农药所带来的“3r”问题，对环境友好。

附图说明

图1为基于rdna-its序列构建的菌株bedy1和其他白僵菌类群的系统发育树；

图2为不同孢子浓度的球孢白僵菌bedy1致大豆高隆象成虫发病症状图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

实施例一、大豆高隆象的采集与饲养

于高隆象成虫发生高发期，从大豆田中采集大量成虫带回实验室，采集地点为四川省作物带状复合种植工程技术研究中心仁寿科研基地。在人工光照培养箱中饲养，温度控制为25±1℃，光周期为14l:10d。用采摘的新鲜豆荚进行饲养，每2天更换一次食物。

实施例二、菌株的分离纯化

用消毒接种针从饲养的大豆高隆象成虫的僵虫虫体上挑取霉层，接种于含医用链霉素(100μg/μl)的马铃薯葡萄糖琼脂(potatodextroseagar，pda)培养基上，置于27℃恒温培养箱中暗培养，pda培养基包括：马铃薯200g(去皮)，琼脂粉12g，无水葡萄糖10g，蒸馏水定容至1l。待菌落长出后，挑取单孢进行分离纯化，得到纯化菌株，编号为bedy1；将分离得到的纯化菌株接种于试管斜面，保存备用。

实施例三、菌种的分子生物学鉴定

利用真菌dna快速提取试剂盒(dn41)对纯化后的菌株bedy1进行dna提取，并使用引物its1和its4进行pcr扩增，扩增总体系为25μl：2×taqmastermix12.5μl、dna模板1μl、上下游引物各1μl，ddh2o9.5μl，反应程序为：94℃，3min；94℃，30s，54℃，30s，72℃，1min，35个循环；72℃，10min。pcr产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测后，送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，获得长度为544bp的基因片段。在ncbi数据库对测序获得的序列进行blast比对，发现bedy1与多个已经公布的球孢白僵菌(beauveriabassiana)的rdna-its存在很高的序列相似性，其中与菌株jef006(登录号：kt280276)的rdna-its相似性达99％。为了进一步明确菌株bedy1的分类学地位，从genbank数据库下载了与球孢白僵菌相近的其他种白僵菌rdna-its序列，在mega7软件中实施musle比对，并基于邻接法构建系统发育树，所构建的系统发育树如图1所示。结果显示，菌株bedy1与另外三个球孢白僵菌聚集在一个独立的进化枝，且与其他种白僵菌独立分支。以上结果表明，致使大豆高隆象于田间发生死亡的病原菌bedy1为球孢白僵菌(ncbi登录号：mk345993)。

实施例四、菌株对大豆高隆象成虫的致病性测定

取纯化后的菌株bedy1，于pda平板上培养15d，收集分生孢子，加入0.2％的吐温-80溶液搅拌均匀，配制浓度分别为5.0×10⁷、1.0×10⁷、1.0×10⁶孢子/ml的孢悬液。采用浸虫处理法进行接种，具体操作为：将大豆高隆象成虫浸入孢悬液3～5s，迅速取出，在无菌滤纸上吸掉多余菌液，放入白瓷盘，白瓷盘底部垫有无菌水湿润的滤纸，以保持湿度，顶部覆盖通有小孔的保鲜膜，维持气体出入。用新鲜豆荚喂食，每两天更换一次食物和干净的湿润滤纸，在人工光照培养箱中饲养。每个浓度为一个处理，每个处理50头高隆象成虫，设置三个重复，0.2％的吐温-80溶液作为对照(ck)。10d后计算死亡率(死亡虫数/处理总虫数×100％)和僵虫率(虫尸上长出肉眼可见的菌丝，僵虫数/处理总虫数×100％)，结果列于表1。

表1不同孢子浓度的球孢白僵菌bedy1对大豆高隆象成虫的致病性

从表中可以看出孢子浓度为5.0×10⁷个/ml的孢悬液处理大豆高隆象成虫，第10天的累计死亡率为100％，僵虫率达93.3％。孢子浓度为1.0×10⁷个/ml的孢悬液处理大豆高隆象成虫，第10天累计死亡率为93.3％，僵虫率为66.6％。而孢悬液浓度为1.0×10⁶个/ml时，第10天累计死亡率为66.6％，僵虫率仅有13.3％。这些结果表明孢悬液浓度为1.0×10⁷个/ml以上时，对大豆高隆象成虫有高的致死率，其中把孢子浓度达5.0×10⁷个/ml时，全部死亡。不同孢子浓度的球孢白僵菌bedy1致使大豆高隆象成虫发病的严重程度见图2，其中，a为孢子浓度为5.0×10⁷个/ml时大豆高隆象的发病情况，b为孢子浓度为1.0×10⁷个/ml时大豆高隆象的发病情况，c为孢子浓度为1.0×10⁶个/ml时大豆高隆象的发病情况；可以看出，随着孢子浓度的降低，发病严重度降低，孢子浓度为1.0×10⁶个/ml时，发病成虫仅有10头。根据得到的结果，确定浓度为5.0×10⁷个/ml的球孢白僵菌bedy1的孢悬液，可用作大豆高隆象的生物防治指导浓度。

虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可作出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。