基于芒草转录组序列开发的内参基因及其应用的制作方法

本发明属于内参基因领域，具体涉及一种基于芒草转录组序列开发的内参基因及其应用。

背景技术：

芒草(miscanthussinensis)是禾本科多年生根茎型c4植物，被广泛用做优质饲草、景观植物观赏草、水土保持及重金属污染修复植物。由于芒属植物普遍生物质产量高、燃烧品质好，加之其分布广泛、抗逆性强、适宜在广袤的边际土地上种植，也被认为是一种极有潜力的可持续生物能源作物之一。目前，在世界范围内应用最为广泛的芒属植物是三倍体奇岗(miscanthus×giganteus)，是由二倍体的芒和四倍体的荻杂交而成，虽然其具有较高的生物质产量，但由于其遗传基础狭窄及三倍体不育特性，被认为可能具有较高的风险通过育种来提高其品质及抗逆性。作为亲本物种之一，芒草广泛分布于亚洲东部，在我国遍布于海拔1800m以下的山地、丘陵和荒坡原野，且具有与奇岗可比的生物质产量和更好的抗逆性。

随着全球气候变化，极端气温频发，加之雨量分布不均，干旱已经成为严重影响植物生长、发育甚至生存的非生物逆境因子。植物耐旱性是一个复杂的数量性状，由多基因联合调控，包括多个代谢途径、调控网络及细胞组成。目前，在模式植物中已报到许多抗旱相关基因，如在拟南芥中已确定299个干旱引起的基因，主要作用于功能蛋白和调节蛋白。在水稻中，73个基因被确定由干旱、高盐及冷胁迫引起。在芒干旱研究中，虽然前人已对不同芒材料从生长、生理等方面做了较多的研究，但芒对干旱胁迫响应的分子机制还处于起步阶段。nie等虽然利用转录组测序技术检测到5324个上调差异表达基因与芒干旱胁迫响应相关，找到对应调控通路，但论文后续还需要大量的基因筛选与验证工作。

实时荧光定量pcr(qrt-pcr)是一种基于普通pcr定性技术发展而来的核酸定量技术，具有识别特异性强、反应灵敏度高、重复性好等优点，已成为分子生物学中研究基因表达、筛选与验证最常用技术之一。在内参基因表达分析中，为获得精确度高的数据，需要筛选表达稳定的内参基因作为标准。常见内参基因在不同的物种、植物组织和生长环境等条件下表达不同，没有一个内参基因能在所有条件下都稳定表达，测定不同条件下内参基因的表达情况尤为重要。目前，仍未见在芒草上研究相关内参基因的开发、验证，严重制约其后续基因筛选、验证研究的进程。因此，作为工具基因，对芒草内参基因的开发、筛选、验证具有重要的理论与实际价值。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种基于芒草转录组序列开发的内参基因，该内参基因为芒草基因表达分析、筛选、验证工作提供了有效的内参基因校正工具。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案为：该基于芒草转录组序列开发的内参基因，所述内参基因包括以下三种：unigene33312、unigene33024和unigene26576，所述unigene33312内参基因的cdna序列如序列表sequenceidno.1所示，所述unigene33024内参基因的cdna序列如序列表sequenceidno.2所示，所述unigene26576内参基因的cdna序列如序列表sequenceidno.3所示。

本发明还发现了基于芒草转录组序列开发的内参基因在芒草干旱胁迫后基因分析中的应用。

本发明还提供了利用所述基于芒草转录组序列开发的内参基因在芒草干旱胁迫后基因分析方法，包括如下步骤：

1)、材料选择：选取芒草种子，将选取的种子经75％酒精和1％次氯酸钠消毒，将种子在培养皿中发芽后移栽于培养箱中，并在培养箱中浇注1倍的霍格兰营养液进行砂培，砂培处理的昼夜温度分别为28℃和25℃，昼夜各12h依次循环，相对湿度75％，光照强度250umol·m-2·s-1，培养三个月；选取长势相近且健康的植株进行干旱处理，干旱处理的方式为采用20％的peg6000模拟干旱处理6天，分别在处理后的0、1、3、6天对叶片进行取样，样品取样后经液氮速冻，放-80℃冰箱用于rna的提取；

2)、芒草总rna的提取：采用direct-zol^tmrnaminiprep试剂盒提取总rna，1％琼脂糖凝胶电泳检测rna的完整性，并使用nanodrop2000对提取的rna进行纯度检测以及浓度的定量；

3)、cdna的合成；合格的样品采用iscriptcdnasynthesiskit试剂盒(bio-radlaboratoriesinc.)合成cdna，放在-20℃储存备用；cdna的合成的具体步骤如下：

首先，在微型管中配制反转录反应液总量为20μl，反应过程如下：先在25℃下反应5min后，再46℃反应20min，之后95℃反应1min，之后保持在4℃。所述反转录反应液体系如表1所示：

表1反转录反应液表

4)、目标基因和内参基因的qrt-pcr反应：

使用ssoadvancedtmuniversalgreensupermix(bio-radlaboratoriesinc.,hercules,ca,usa)进行qrt-pcr，将内参基因和目标基因点在同一块pcr板上，反应在cfx96tmrealtimesystem(bio-rad)荧光定量仪上进行，所述pcr反应体系如表2所示：

表2qrt-pcr反应体系表

扩增程序为：95℃预变性30s；95℃变性10s、60℃退火30s，35个循环，然后进行65～95℃溶解曲线分析，每个循环增加0.5℃，持续2-5s获得解链温度，采集溶解曲线荧光信号，ct值数据由实时荧光定量pcr仪(bio-rad,usa)自动读取；

5)、将获得的ct值用2^-△△ct法计算相对表达量，具体步骤如下：

△ct＝ct(目标基因)-ct(内参基因)

△△ct＝△ct(处理)-△ct(对照)

2^-△△ct＝相对表达量。

本发明的有益效果在于：本发明所述的3个内参基因序列均来自芒草转录组序列，比以往的其他物种上的通用内参基因具有特异性好，稳定性高等优点，同时通过对sod、cat基因在芒草干旱胁迫下的表达分析研究中，较好的验证了本发明所述的三个内参基因比其他通用内参基因具有更好的校正能力，为今后芒草基因表达分析、筛选、验证工作提供了有效的内参基因校正工具，此外本发明所述的三个的内参基因属于新开发的基因，丰富了植物内参基因的可用数量，以及运用在其它蜀黍族、芒属植物上的相关研究。

附图说明

图1为实施例1中12个内参基因扩增电泳图；

图2为实施例1中所有样品12个内参基因的ct值；

图3为实施例1中12个内参基因的溶解曲线；

图4为实施例1中利用genorm软件计算得到的12个内参基因的配对变异系数(a)和表达稳定性值m(b)；

图5为实施2中在芒干旱处理下sod、cat基因表达分析用不同内参基因校正结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

该基于芒草转录组序列开发的内参基因因包括以下三种：unigene33312、unigene33024和unigene26576；

所述unigene33312内参基因的cdna序列如下所示：

taagccattcaagggaattcatttcttaaatatcagcgagtcatgctaaacttggttcaactttgttcaacaaggatttgatatgaaccttgctttctgcaatcaagagaagcagagaaatgaggggagttccgtggagtcatcacaatggagaaacatcaagcagcatgtgctaccttatggttcttcgaggccactcacacgaaagctttcatttgatgcctcctcaagtgaatcaagaggcacagaagcctcaacaagtatgtcaacagagaacacctctgtgtccatcaatgtcccaaagttggcagagggcattgaatttgggaggcaaccaatggtcacatcctccactttggtagaactaacaactagactagatttcttcaaggagcgaaggtcgcaactgatggaacaacttcatagtcttgatttaggacgtggatctgctcctcagggttttccatacaagccaccatctccttggaaccacccaaggtaggatgaccattcaatttcatgattgtaaattcttcagtagggttcttttctccccgcctggcaattgtagaaaactgcgtatgcgagtgtaaatgtattttgttttttttttcaatatggtttagctttcatgttgcgcgagaatagctcctcaagtgggatgtgatcaagtcttctgtatgtaatgttgtcatggtggtgccctttagacaagttttccagtgttgtggcggtgtatatgtattttgtgcgttttctcatagaaattggataggttgactacttgtatggccgtttattcatacctagcgcaaaggatgaggaaaacagggatcaaatgagaacccagcatgagtttataaataattcgaggtaggcttgaggctgtgttttatccttgcaaattagtg

所述unigene33024内参基因的cdna序列如下所示：

tgcacacaaccatgtcgatcattcatcacacatagagtagccgaagtcacatctcaacttggtctctcaataggcatctgtatacatttctatttatatatacactgggcacagtacaacatttattaattcaattatctttgtcagtttaaggatgaccacctaatttatgctgacaacattcagagcactgcggtacaccagacccaacacccgtttggttccacatcaaaacagggagtcaagatacgagtagttgcacaggcggtcgaactgaagcaggctgccatacatcctatcccacacaccaacgaaaagtgtgtcagtgtctgggctgaacgacgtgccggatatctcgccaaagaagtccagctcctgccttttgttgtagtcactcttcacatcgtagatgtgcacaaagtcagcaggttcggccatggacatgaactggccatccgaggtgaagcggatcgacctgatggctccaaggttacccctcaacacatggacggattttgagagattcctcacgtcccagattcggcatgtcttgtcttggttgccagtagcaaatgttcgcccgtcagggctccaagccgatgcaaatgaataatcccgatgtccttttatggaatgaagcgtctttccagagttggcatcaataagtagaccatcaggatcatcccccacaataacaactacctttctgtcaggactcaacgaagtatgctgcatcaacaaactacaagtaaacacagatacagcaacaaaaataatgaagaattgcactaaacttgacctactcccttcattccaaattatagctcactttatctttgttctaagccaggcttctttaacttttgaccaagttttctagaaaaaatgcaccaacatttacaacatcaaatcagtctcattaaattttcatgaaatatgtcttgatggtgcatttatttgaactttactttggagaaaaaagaacttatttgtgaaattcatacagatgttggacccatttatcctctacattatgttagaaaaggtgacaaggaagagggaagctaaggatgccatgtccagaatgaccaggtatattgaagggtgccagcagtgcatgtcacttttcttttattattaatactgtatccagaagatgggagcctactatgtcatcaactgcggcaatagaaatgtaaaggcattttggatttgttccacaaaccaagtataggtttatgtatcggtattgctagattcaccaacagctataaccaataggtcaaaaacatgcccaagaaagtagaacaagctaataatacaagcacaactatggggcatatgaaatagcaatgaagtctgtattctgtaaattttatttgctgacagcatgtgtagaaagatgtaccttgtaatgatagcaccaacaagaagatccaaatatagaacataaaggtaatagaaatagctaagaaaccaaaggaacctacattcactggccattcaaactgaaa

所述unigene26576内参基因的cdna序列如下所示：

cccacgtttgctcaggtccactcggaacagataccagcaaacgacatctctccccgacgtccccgtccctttcacccctcgccgccgtcgtcgccgccgcgctcgtatctgcggctccccgcgccgtatcctgcggaagaagtgtttaacgggctacatcccaccactgcacgatgtcggcagcggcgcgggtgctgccgaaggcggtgaccttcgtgacgggcaacgccaagaagctggaggaggtccgcgccatcctcggctcttccatccccttccagtcgctgaagctcgacctgccagaactgcaaggggagccagaggacatatccaaagagaaagcacgaatggctgcatctcaggtgaatgggcctgtactggtggaggacacctgcctatgttttaatgcactcaaaggcctaccaggaccctacataaagtggtttcttgagaagattgggcatgaaggtctgaacaatctgttaaaagcttacgaagataaatcagcgtttgcaatgtgcatcttttctcttgctcttggacctggagaggaaccaatcacatttgttggaaaaactgcgggaaagattgtacctgctagaggtcctaatgattttggatgggatcctgtattccagccagttggttttgaacaaacatatgctgagatgcccaagtcagtgaagaatgaaatatctcagagggaaagctcttgctctggtgaaagaacactttgcatctgctagctatacagttcagagcgatgactcagcttaagtttgactttggttcccagacgaatgaacgtcacattctggaatgtaaactgaactagttttagtggatactgtggtctactgttaagtttattcatagctgtactatagtttgtttgattgtaatatacttggtgcctattatcaacttacgatatttcttcactggatcaatgacacct

本发明所述的3个内参基因序列均来自芒草转录组序列，比以往的其他物种上的通用内参基因具有特异性好，稳定性高等优点，同时通过对sod、cat基因在芒草干旱胁迫下的表达分析研究中，较好的验证了本发明所述的三个内参基因比其他通用内参基因具有更好的校正能力，为今后芒草基因表达分析、筛选、验证工作提供了有效的内参基因校正工具，此外本发明所述的三个的内参基因属于新开发的基因，丰富了植物内参基因的可用数量，以及运用在其它蜀黍族、芒属植物上的相关研究。

本发明还发现了基于芒草转录组序列开发的内参基因在芒草干旱胁迫后基因分析中的应用。

本发明还提供了利用所述基于芒草转录组序列开发的内参基因在芒草干旱胁迫后基因分析方法，包括如下步骤：

1)、材料选择：选取芒草种子，将选取的种子经75％酒精和1％次氯酸钠消毒，将种子在培养皿中发芽后移栽于培养箱中，并在培养箱中浇注1倍的霍格兰营养液进行砂培，砂培处理的昼夜温度分别为28℃和25℃，昼夜各12h依次循环，相对湿度75％，光照强度250umol·m-2·s-1，培养三个月；选取长势相近且健康的植株进行干旱处理，干旱处理的方式为采用20％的peg6000模拟干旱处理6天，分别在处理后的0、1、3、6天对叶片进行取样，样品取样后经液氮速冻，放-80℃冰箱用于rna的提取；

2)、芒草总rna的提取：采用direct-zol^tmrnaminiprep试剂盒提取总rna，1％琼脂糖凝胶电泳检测rna的完整性，并使用nanodrop2000对提取的rna进行纯度检测以及浓度的定量；

3)、cdna的合成；合格的样品采用iscriptcdnasynthesiskit试剂盒(bio-radlaboratoriesinc.)合成cdna，放在-20℃储存备用；cdna的合成的具体步骤如下：

首先，在微型管中配制反转录反应液总量为20μl，反应过程如下：先在25℃下反应5min后，再46℃20min，之后95℃反应1min，之后保持在4℃。所述反转录反应液体系如表1所示：

表1反转录反应液表

4)、目标基因和内参基因的qrt-pcr反应：

使用ssoadvancedtmuniversalgreensupermix(bio-radlaboratoriesinc.,hercules,ca,usa)进行qrt-pcr，将内参基因和目标基因点在同一块pcr板上，反应在cfx96tmrealtimesystem(bio-rad)荧光定量仪上进行，所述pcr反应体系如表2所示：

表2qrt-pcr反应体系表

扩增程序为：95℃预变性30s；95℃变性10s、60℃退火30s，35个循环，然后进行65～95℃溶解曲线分析，每个循环增加0.5℃，持续2-5s获得解链温度，采集溶解曲线荧光信号，ct值数据由实时荧光定量pcr仪(bio-rad,usa)自动读取；

5)、将获得的ct值用2^-△△ct法计算相对表达量，具体步骤如下：

△ct＝ct(目标基因)-ct(内参基因)

△△ct＝△ct(处理)-△ct(对照)

2^-△△ct＝相对表达量。

实施例1

本实施例为本发明所述的基于芒草转录组序列开发的三个内参基因在芒草干旱胁迫后基因分析中与九个传统内参基因的比较应用，为对比开发新内参基因的效果，选择以下七个常用的传统内参基因gapdh、18srrna、actin、pp2a、eif4a、sams、samdc和两个近缘物种高粱上内参基因sb09g019750、sb02g041180为对照。常见内参基因的序列信息来自ncbi数据库，通过同源基因序列比对后使用primer3.0在线设计引物，引物相关信息见表4。

具体包括如下步骤：

1)、材料选择：选取芒草种子，将选取的种子经75％酒精和1％次氯酸钠消毒。实验种子在培养皿中发芽后移栽于塑料盆(直径9cm)中进行沙培，浇1倍的霍格兰营养液在培养箱中进行培养，昼夜温度为28℃/25℃，各12h依次循环，相对湿度75％，光照强度250umol·m-2·s-1，培养三个月；选取长势相近且健康的植株进行干旱处理，用20％的peg6000模拟干旱处理6天，分别在处理后的0、1、3、6天对叶片进行取样，0天的样品作为对照，样品取样后经液氮速冻，放-80℃冰箱用于rna的提取；

2)、芒草总rna的提取：采用direct-zol^tmrnaminiprep试剂盒提取总rna,1％琼脂糖凝胶电泳检测rna的完整性,并使用nanodrop2000对提取的rna进行纯度检测以及浓度的定量；

3)、cdna的合成；合格的样品采用iscriptcdnasynthesiskit试剂盒(bio-radlaboratoriesinc.)合成cdna，放在-20℃储存备用。具体步骤如下：

首先，在微型管中配制反转录反应液总量为20μl，反应过程如下：先在25℃下反应5min后，再46℃20min，之后95℃反应1min，之后保持在4℃。所述反转录反应液体系如表1所示：

表1反转录反应液表

4)、目标基因和内参基因的qrt-pcr反应：

使用ssoadvancedtmuniversalgreensupermix(bio-radlaboratoriesinc.,hercules,ca,usa)进行qrt-pcr，将内参基因和目标基因点在同一块pcr板上，反应在cfx96tmrealtimesystem(bio-rad)荧光定量仪上进行，所述pcr反应体系如表2所示：

表2qrt-pcr反应体系表

反应所用内参基因引物见表4：

表3qrt-pcr内参基因引物序列

扩增程序为：95℃预变性30s；95℃变性10s、60℃退火30s，35个循环。然后进行65～95℃溶解曲线分析，每个循环增加0.5℃，持续2-5s获得解链温度，采集溶解曲线荧光信号，内参基因ct值数据由实时荧光定量pcr仪(bio-rad,usa)自动读取，利用标准曲线计算引物的扩增效率；

在microsoftofficeexcel2010中将不同样本中某一内参基因ct值最小者对应样品的表达量定义为1，其他样品此内参基因的相对表达量则为2^-△ct(△ct＝各样本ct值-最小ct值)，根据12个内参基因数据，利用genorm(ver.3.5)、bestkeeper(ver.1.0)和normfinder(ver.0.953)3种软件程序对候选内参基因的表达量稳定性进行分析，最后利用reffinder对内参基因进行综合排序，如表4所示：

表4内参基因综合分析后排序情况

图1为12个内参基因扩增电泳图，其中m为dl2000dnamarker，1为18srrna，2为eif4a，3为samdc，4为sams，5为pp2a，6为gapdh，7为sb09g019750，8为sb02g041180，9为actin，10为unigene33312，11为unigene33024，12为unigene26576；图2为所有样品12个内参基因的ct值，每个箱的中线表示各个内参的ct中值，箱的两端表示25％-75％的数据所在范围，上下边缘表示最大值和最小值，○表示异常值；图3为12个内参基因的溶解曲线；图4为genorm软件计算得到的12个内参基因的配对变异系数(a)和表达稳定性值m(b)；

由图1、图2、图3、图4、表4可以看出，最后综合排序中，排名前三位的内参基因分别是unigene33024、unigene26576、和unigene33312。结果表明新开发的三个内参基因特异性好、稳定性高，可用于在芒草和其它蜀黍族、芒属植物上的相关研究。

实施例2

本实施例为验证内参基因应用的效果，选用cu/znsod和cat两个基因作为目标基因，sod和cat都是植物体内常见的抗氧化酶，可以帮助植物清除体内的活性氧，保护细胞免受氧化损伤，通常在受到胁迫后其表达量会有所增加。以unigene33312和常见内参基因actin为例对芒sod和cat基因在干旱胁迫后的表达特性进行分析，具体步骤如下：

1)、材料选择：选取芒草(两个品种：0819和1302)种子，将选取的种子经75％酒精和1％次氯酸钠消毒。实验种子在培养皿中发芽后移栽于塑料盆(直径9cm)中进行沙培，浇1倍的霍格兰营养液在培养箱中进行培养，昼夜温度为28℃/25℃，各12h依次循环，相对湿度75％，光照强度250umol·m-2·s-1，培养三个月；选取长势相近且健康的植株进行干旱处理。用20％的peg6000模拟干旱处理6天，分别在处理后的0、1、3、6天对叶片进行取样，0天的样品作为对照，样品取样后经液氮速冻，放-80℃冰箱用于rna的提取；

2)、芒草总rna的提取：采用direct-zol^tmrnaminiprep试剂盒提取总rna,1％琼脂糖凝胶电泳检测rna的完整性,并使用nanodrop2000对提取的rna进行纯度检测以及浓度的定量。

3)、cdna的合成；合格的样品采用iscriptcdnasynthesiskit试剂盒(bio-radlaboratoriesinc.)合成cdna，放在-20℃储存备用。具体步骤如下：

先，在微型管中配制反转录反应液总量为20μl，反应过程如下：先在25℃下反应5min后，再46℃20min，之后95℃反应1min，之后保持在4℃。所述反转录反应液体系如表1所示：

表1反转录反应液表

4)、目标基因和内参基因的qrt-pcr反应：

使用ssoadvancedtmuniversalgreensupermix(bio-radlaboratoriesinc.,hercules,ca,usa)进行qrt-pcr，将内参基因和目标基因点在同一块pcr板上，反应在cfx96tmrealtimesystem(bio-rad)荧光定量仪上进行，所述pcr反应体系如表2所示：

表2qrt-pcr反应体系表

扩增程序为：95℃预变性30s；95℃变性10s、60℃退火30s，35个循环，然后进行65～95℃溶解曲线分析，每个循环增加0.5℃，持续2-5s获得解链温度，采集溶解曲线荧光信号，ct值数据由实时荧光定量pcr仪(bio-rad,usa)自动读取；其中sod和cat定量pcr引物见表5；

表5目标基因引物扩增信息

获得ct值后，在microsoftofficeexcel2010用2^-△△ct法计算相对表达量，具体步骤如下：

△ct＝ct(目标基因)-ct(内参基因)

△△ct＝△ct(处理)-△ct(对照)

2^-△△ct＝相对表达量

图5为芒干旱处理下sod、cat基因表达分析用不同内参基因校正结果，由图5可知，本发明开发的内参基因与常用内参actin相比对目标基因表达分析有较好的效果，清楚表现出目标基因sod和cat在干旱处理1、3、6天后基因的表达变化情况；单独使用时使试验操作简便、减少成本，也可与其他内参基因组合用于校正，由图5可见，unigene33312可以作为芒草及同源物种上最经济、有效的内参基因选择。

综上所述，本发明所述的3个内参基因序列来自芒草转录组序列，比以往的其他物种上的通用内参基因具有特异性好，稳定性高等优点，同时通过对sod、cat基因在芒草干旱胁迫下的表达分析研究中，较好的验证了开发的三个内参基因比其他通用内参基因具有更好的校正能力，为今后芒草基因表达分析、筛选、验证工作提供了有效的内参基因校正工具。此外新开发的内参基因丰富了植物内参基因的可用数量，以及运用在其它蜀黍族、芒属植物上的相关研究。

序列表

<110>四川农业大学

<120>基于芒草转录组序列开发的内参基因及其应用

<130>2019

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>911

<212>dna

<213>人工序列(人工序列（rengongxulie）)

<400>1

taagccattcaagggaattcatttcttaaatatcagcgagtcatgctaaacttggttcaa60

ctttgttcaacaaggatttgatatgaaccttgctttctgcaatcaagagaagcagagaaa120

tgaggggagttccgtggagtcatcacaatggagaaacatcaagcagcatgtgctacctta180

tggttcttcgaggccactcacacgaaagctttcatttgatgcctcctcaagtgaatcaag240

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<210>2

<211>1514

<212>dna

<213>人工序列(人工序列（rengongxulie）)

<400>2

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ggtctctcaataggcatctgtatacatttctatttatatatacactgggcacagtacaac120

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<400>3

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