一种检测橄榄组织中胶孢炭疽菌的LAMP检测引物的制作方法

本发明属于植物病理学领域，具体涉及一种快速检测橄榄组织中胶孢炭疽菌的方法。

背景技术：

胶孢炭疽菌(c.gloeosporioides)寄主繁多，有2200多种植物，引起炭疽病，给农业生产造成严重的经济损失。传统病原菌的分类、鉴定主要基于形态学特性、致病性测定等，但炭疽菌种间甚至种内菌株间形态变异大，近似种之间的分类特征差异微小，造成该属的分类较难操作。胶孢炭疽菌作为该属内一个主要种和重要种，从形态特征来看，具有集合种群和复合种的特征，种内菌株间变异大，有多个专化型或生理小种。由于种内菌株从形态至生理特性存在较大的变异性，使该种在鉴定上常与一些近似种混淆，为此类病害的有效防治带来很多困难和问题。同时传统分类鉴定方法耗时长、灵敏度低、易受人为及环境等诸多因素的干扰，不能在病害潜伏期和初发期做出诊断，很难对病害发生进行及时的监测和有效控制。

目前传统的病原菌形态学鉴定：费时费力，而且要求操作者需具备扎实的真菌分类学知识。由于橄榄炭疽病具有潜伏性，当橄榄果实表现症状采集样本进行分离时，已错过了最佳防治时期。以its为靶标的普通pcr分子检测、rapd-pcr方法、巢式pcr技术等：这些检测方法需要的检测时间比较长，准确性、灵敏度偏低，或需要昂贵的仪器。这些缺陷使其在基层农业部门和资源不足的发展中国家的使用受到了一定的限制。根据its设计引物的lamp技术：由于its2区域存在非同源拷贝，致使其不能真实准确地用于病原菌分类。

在lamp检测技术研发中靶标基因的选取和引物的设计与筛选是重要环节。前人的研究认为its2区域存在非同源拷贝，致使其不能真实准确地用于病原菌分类，而翻译延长因子可以。翻译延长因子是在种的水平上信息量很高的单拷贝基因，利用翻译延长因子基因序列设计得到的引物非常适用于病原菌种间的鉴定。本研究利用翻译延长因子序列设计的特异性引物，可为胶孢炭疽菌的准确鉴定和快速检测提供技术和方法。对病害进行快速检测可及时防治病害，对于橄榄生产具有重要意义。

本发明在lamp技术的基础上，选取新的靶标基因设计与筛选引物，使这个技术更准确地用于检测胶孢炭疽菌，为橄榄炭疽病的及时防治提供技术支持。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种快速检测橄榄组织中胶孢炭疽菌的lamp检测引物。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种快速检测橄榄组织中胶孢炭疽菌的lamp检测引物，所述引物包含外引物f3/b3和内引物fip/bip，序列为：

f3：ggctccttcaagtacgcc；

b3：tcggacagccaattttcagc；

fip：gctcggccttgagcttgtcaag-gccgtttcttcgcgatcc；

bip：tcaccatcgacattgccctctg-tgaggaagccagacttacca。

所述的引物在检测橄榄组织中胶孢炭疽菌中的应用。

本发明的优点在于：

本发明方法适用于橄榄组织中胶孢炭疽菌的快速可靠的检测和鉴定，对于农业生产中胶孢炭疽菌引起的病害防治具有重要的实用价值。本发明与现有技术相比，具有以下的技术优势和积极效果：

1、结果可靠：本发明所设计出的lamp检测引物，已经对不同地区的胶孢炭疽菌和带胶孢炭疽菌的植物组织进行了测试验证，因此结果可靠性具有充分的保证；

3、灵敏度高：lamp对胶孢炭疽菌的检测灵敏度在dna水平上可达到10fg·25μl^-1。

4、实用性好：本发明所设计出的lamp引物，可用于带胶孢炭疽菌的组织中高灵敏度快速检测，因此本方法的实用性强，可满足对带菌组织中存在的胶孢炭疽菌进行快速可靠的检测和鉴定的需要；

5、操作简便快速：应用本发明方法，对带胶孢炭疽菌的组织进行检测可在数小时内完成，且lamp核酸扩增是在等温条件下进行，只需一个水浴锅即可，不需要复杂的仪器设备和昂贵的分子试剂，结果肉眼直接可见。

附图说明

图1为温度对lamp反应的影响图，其中1-4的反应温度分别61℃、62℃、63℃和64℃，5为阴性对照，2-4呈绿色荧光。

图2为lamp体系的特异性验证图，其中1-3colletotrichumgloeosporioides;4,c.truncatum;5,c.orbiculare;6，阴性对照，1-3呈绿色荧光。

图3为lamp方法检测橄榄炭疽病灵敏度图，其中1-7,dna的浓度分别为10pg·25μl^-1,1pg·25μl^-1,100fg·25μl^-1,10fg·25μl^-1,1fg·25μl^-1,100ag·25μl^-1and10ag·25μl^-1,8为阴性对照，，1-4呈绿色荧光。

具体实施方式

实施例1

1菌丝体基因组dna的提取：

按照高效植物基因组dna提取试剂盒操作说明提取基因组dna。使用分光光度计检测dna纯度。

2lamp特异性引物的设计

选择在不同的物种中基因及表达调控有高度保守性的翻译延长因子（translationelongationfactoralpha1gene,tef1）基因为靶标基因。从ncbi网站中查找并下载胶孢炭疽菌及其相近种的tef1基因序列，使用bioedit软件进行序列比对，分析并查找胶孢炭疽菌特异性保守位点，然后使用primerexplorerv5（http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html）在线软件设计引物（表1）。

表1lamp引物及序列

3lamp扩增检测体系的建立

以上述（1）提取的dna为模板，利用外引物f3/b3和内引物fip/bip进行lamp扩增。

其中，lamp检测反应体系（混合液）为25μl，包括5μm外引物f3和b3各1.0μl，40μm内引物fip和bip各1.0μl，lamp反应缓冲液【40mmtris-hcl，20mm(nh4)2so4，20mmkcl，16mmmgso4，1.6mol/l甜菜碱(betaine)，2.0mmdntps，0.2%trionx-100】12.5μl，8ubst聚合酶1.0μl，dna模板1.0μl，用灭菌超纯水补足至25μl。

lamp反应温度优化：将配制好的lamp反应混合液分别置于61、62、63和64℃水浴锅中温育60min，然后80℃，5min终止反应，以筛选出最佳反应温度；反应结束后，采用荧光染料目测观察法和琼脂糖凝胶电泳法对反应结果进行测定。在lamp反应的扩增产物中加入显色剂sybrgreenⅰ1.0µl，常光显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，绿色判断为阴性，采用琼脂糖凝胶电泳法，取2.0µllamp扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，如出现梯形条形判断为阳性，没有出现梯形条形判断为阴性。

4lamp特异性检测

为验证3所建胶孢炭疽菌lamp检测体系的特异性，利用所建的lamp检测体系对不同地区、不同寄主来源的胶孢炭疽菌以及属内相近种及其他属重要病原菌（见下表2）的基因组dna进行扩增。以灭菌的双蒸水（ddh2o）为阴性对照。反应结速后，采用琼脂糖凝胶电泳法和荧光染料目测观察法对lamp的特异性进行判定。每个供试菌株lamp反应试验至少重复3次。

表2

5lamp灵敏度检测

采用ctab法提取橄榄炭疽病菌基因组dna，利用分光光度计对所提取的dna浓度进行测定，并将dna浓度进行10倍梯度稀释，配置为10pg·μl^-1、1pg·μl^-1、100fg·μl^-1、10fg·μl^-1、1fg·μl^-1、100ag·μl^-1和10ag·μl^-1等7个质量浓度梯度，各取1μl作为模板，进行lamp扩增。反应体系参照上述优化的反应体系。采用琼脂糖凝胶电泳法和荧光染料目测观察法对反应结果进行测定，以明确lamp检测体系的灵敏度。每个试验至少重复3次。

6样品检测

为验证所建立lamp检测体系的应用性，从福清和莆田等地采集橄榄炭疽病典型症状和健康的橄榄果实样本，使用植物基因组dna提取试剂盒提取样本基因组dna，以所提dna为模板进行lamp扩增，并以胶孢炭疽菌基因组dna作为阳性对照，ddh2o作为阴性对照。采用琼脂糖凝胶电泳法和荧光染料目测观察法对反应结果进行测定。每个试验重复3次。为进一步验证果实中胶孢炭疽菌的存在情况，采用传统植物组织分离法对是果实中炭疽菌进行分离、培养和鉴定，并比较传统分离方法和lamp方法的阳性检出率。

7结果

7.1lamp反应温度的优化

如图1所示，经所设置的4个温度反应60min后，62-64℃反应条件下肉眼均可观察到反应液显现绿色荧光信号，扩增产物电泳检测后出现了梯度型电泳条带，表明在62℃、63℃和64℃下均能进行lamp反应。但反应温度63℃时，电泳条带最清晰，表明lmap扩增效率最高故确定63℃为该反应体系的最佳反应温度。

7.2lamp特异性检测

利用设计的特异性引物建立的lamp检测体系对不同地区、不同寄主来源的胶孢炭疽菌以及属内相近种及其他属重要病原菌基因组dna进行lamp反应，以验证lamp体系的检测特异性。结果如图2表明，在显色剂sybrgreenⅰ的作用下，只有橄榄炭疽病菌株lamp检测均显示绿色荧光信号，扩增产物出现特有的梯形条带，而阴性对照和其他病原菌中均没有观察到这些现象。结果表明所建立的lamp体系对橄榄炭疽病菌具有特异性，可将橄榄炭疽病菌和其它病原菌区分开。

7.3lamp灵敏度检测

对胶孢炭疽菌基因组dna不同浓度的检测结果显示（图3），dna浓度高于10fg·25μl^-1时，lamp反应均为阳性，dna浓度低于10fg·25μl^-1时，lamp反应表现为阴性，表明所建立的lamp检测体系对橄榄炭疽病菌基因组dna的检测灵敏度为10fg·25μl^-1。

7.4橄榄果实中胶孢炭疽菌的检测

利用lamp方法对从福清和莆田采集的28份橄榄炭疽病典型症状以及6份健康的橄榄果实进行检测，并对供试的橄榄样品采用传统的分离方法进行验证。结果显示，在福清采集的19份样品中，lamp技术的阳性检出率为100%，传统分离方法的阳性检出率为87.5%；在莆田采集的15份样品中，lamp技术的阳性检出率为100%，传统分离方法的阳性检出率为91.7%。lamp技术检测检出率高于传统分离方法。6份健康橄榄叶片或果实2种检测方法检测均为阴性。3次重复取得一致的结果，可见lamp检测技术明显提高了检测效率。

田间样品lamp及传统分离方法检测

7.5总结

建立的橄榄炭疽病菌lamp检测体系的最佳反应条件为63℃、60min，该体系对胶孢炭疽病菌具有很强的特异性，供试菌株中，除了胶孢炭疽病菌有扩增反应，其他菌株均表现为阴性，对橄榄炭疽病菌基因组dna的检测灵敏度为10fg·25μl^-1，该体系可从田间发病或潜伏侵染的橄榄果实中检测出胶孢炭疽菌。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

sequencelisting

<110>福建省农业科学院果树研究所

<120>一种检测橄榄组织中胶孢炭疽菌的lamp检测引物

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<170>patentinversion3.3

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