构建一株表达副猪嗜血杆菌Omp26基因的猪霍乱减毒沙门菌重组菌株的制作方法

本发明涉及动物细菌性疾病基因工程疫苗技术领域，具体涉及构建一株表达副猪嗜血杆菌omp26基因的猪霍乱减毒沙门菌重组菌株。

背景技术：

沙门氏菌为胞内寄生菌，疫苗株能有效呈递抗原，在激发抗沙门氏菌免疫反应的同时诱导产生针对外源抗原的特异性体液和细胞免疫反应，沙门氏菌载体本身具有免疫佐剂作用，其脂多糖(lps)作为一种内在佐剂可以刺激宿主细胞释放各种细胞因子。鉴于此，以营养缺陷型(asd基因)减毒沙门氏菌作为粘膜免疫用基因工程活疫苗表达载体具有无可比拟的优越性。基于减毒胞内菌在运送疫苗的过程中能将其直接运送至专业抗原提呈细胞(apc)内，大大提高了疫苗的摄入效率，并能刺激机体产生体液免疫、细胞免疫以及黏膜免疫应答。此外减毒胞内菌的宿主载体平衡致死系统解决了外源基因在动物体内无抗性稳定表达的难题。

猪霍乱沙门菌c500株是将抗原性良好的猪霍乱沙门菌强毒株通过醋酸陀体外传代培养的方式筛选出来的1株其毒力弱、遗传稳定、免疫原性好、用于预防仔猪副伤寒的弱毒疫苗株。

c500δasd以c500为亲本株，在基因组上缺失asd基因，构建了平衡致死系统，用于高效表达外源基因；pya3493(即外源基因表达质粒，质粒图谱如图1所示)，含有来源于鼠伤寒沙门菌的asd基因，与c500的asd基因100％同源。asd+平衡表达系统由沙门氏菌的asd基因缺失株c500δasd与含有asd基因的pya3493质粒构成。只有含asd+质粒的沙门氏菌asd缺失株才能在无dap存在的条件下存活，并在体内或体外高效稳定表达外源基因。图2是c500在普通麦康凯平板上的生长效果图，其显示为可生长；图3为c500δasd在普通麦康凯平板上的生长效果图，其显示为不能生长；图4为c500δasd在添加了dap的麦康凯平板上的生长效果图，其显示为长出细小无色透明、光滑、圆整的菌落；图5为asd+平衡表达系统在无dap的麦康凯平板上的生长效果图，其显示为可生长。

asd+平衡表达系统质粒中含有asd基因，可与asd基因缺失的猪霍乱减毒沙门菌c500株载体形成互补，由于asd基因是dap(是所有革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分)生物合成途径中必需的酶，该基因的缺失可导致该突变株在无外源dap存在的条件下溶菌死亡。只有含有asd+质粒的细菌才能在无外源dap的宿主内存活，因此，其稳定性大大提高，在含有asd基因的pya3493质粒上插入副猪嗜血杆菌外膜蛋白omp26外源基因，将此种质粒转化至asd基因缺失的猪霍乱减毒沙门菌c500株，免疫动物后，能产生特异性的免疫保护应答，从而达到了无需抗性标记高效稳定运送副猪嗜血杆菌外膜蛋白omp26外源基因的目的。

副猪嗜血杆菌(haemophilusparasuis，hps)是猪的条件性致病菌，常引起以多发性浆膜炎、关节炎、脑膜炎等为特征的格拉瑟氏病，危害养殖业的发展，并已证实在我国绝大多数猪场存在和流行，在全球范围内影响养猪业典型的细菌性疾病，危害日渐严重。虽然抗生素治疗具有一定效果，但长期使用可导致细菌产生耐药性并存在药物在动物食品中的残留问题。因此，研制安全、高效、制备方便和廉价的新型基因工程疫苗成为越来越多研究者关注的焦点。

目前预防hps病的疫苗为灭活疫苗，但是副猪嗜血杆菌的血清型多样，且很大比例不能分型，菌株间的毒力差异较大，至今还没有一种灭活疫苗诱导的免疫

反应能同时对副猪嗜血杆菌致病菌产生交叉保护。副猪嗜血杆菌的主要毒力因子包括外膜蛋白、荚膜多糖、脂多糖、转铁结合蛋白、神经氨酸酶等。其中外膜蛋白(outermembraneprotein，omp)是革兰阴性菌外膜的主要结构，具有良好的免疫原性，可同时激发机体的体液免疫和细胞免疫，具有异种血清型的免疫交叉保护作用，是一种潜在的共同保护性抗原。hps病原菌的15个血清型均与一个主要的外膜蛋白反应，这个蛋白属于革兰阴性菌的omp家族，表明这个蛋白也许会成为一个很好的诊断标记的候选蛋白。

外膜蛋白是副猪嗜血杆菌的主要毒力因子之一，副猪嗜血杆菌(hps)外膜蛋白是一种混合型结构蛋白，α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲共同组成了复杂的β-桶状结构来维持其结构的稳定性，同时观察到抗原表位的形成是在β-转角和无规则卷曲区域内，在其n末端含有1个信号肽分子的15个抗原决定簇，能引发体液免疫和细胞免疫。

外膜蛋白与功能相关的基因有编码结构蛋白和参与渗透作用的ompa、ompb、ompc、opmf、envz基因和lpp脂蛋白结构基因，参与核苷酸转运的tsx基因以及铁转运蛋白基因tona、fepa、cir、fec等。副猪嗜血杆菌的外膜蛋白共8中，大小分别约为92kda、88kda、53kda、60kda、46kda、37kda、31kda及15kda。通过血清型5型的外膜蛋白研究中发现，副猪嗜血杆菌第一次被鉴别出共有15种蛋白有高效免疫性，通过运用sds-page蛋白电泳将副猪嗜血杆菌菌株分为两个不同的omp表型，生物i型和生物ii型。生物i型为从健康猪鼻腔黏膜分离菌株，包含分子质量为约68kda和23-40kda大小蛋白。从发病猪群中分离的副猪嗜血杆菌通常归属为生物ii型，其特征为包含一个分子为37kda大小的主要蛋白。

omp26是hps的一种特异性外膜蛋白，在所用菌株中高度保守，分子量37kda(图6为omp26的凝胶电泳图)大小，不但具有免疫刺激分子的作用，而且具有候选也疫苗的特征；omp26还具有特殊的功能结构，不仅可作为检测hps的一种标志性抗原，而且具有免疫原性。

技术实现要素：

针对现有技术中的缺陷，本发明目的在于构建一株无抗性标记表达副猪嗜血杆菌外膜蛋白omp26基因的猪霍乱减毒沙门氏菌重组株c501δasdpya3493-omp26，该重组菌缺失了猪霍乱沙门氏菌基因组上的asd基因，含能在该菌株中表达asd基因和副猪嗜血杆菌外膜蛋白omp26基因的重组质粒pya-omp26。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案为：

本发明提供了一种扩增omp26基因的引物对，包括引物1和引物2；

引物1的核苷酸序列如序列表中序列1所示，即上游引物：5’-gcgtcgacaaaaatttatttaaacttgc-3’；

引物2的核苷酸序列如序列表中序列2所示，即下游引物：5’-ccaagcttttttttcacttcttctgg-3’。

本发明还保护上述引物对在扩增omp26基因中的应用。

本发明还提供了一种重组载体，其是将omp26基因插入无抗性质粒载体pya3493的ecori和hindiii酶切位点间构建得到。

本发明还提供了上述重组载体的构建方法，包括步骤：提取副猪嗜血杆菌5型sh0165菌株的dna，然后采用上述的引物对扩增omp26基因，将扩增得到的pcr产物进行胶回收和纯化，之后与pmd18-t载体连接，得到连接产物；将连接产物转入感受态细胞dh-5α中，经酶切鉴定，筛选阳性克隆并进行序列测定，得到pmd18-t-omp26；用ecori和hindiii同时酶切无抗性质粒载体pya3493和pmd18-t-omp26，将酶切产物连接构建得到pya3493(+)-omp26表达载体，即重组载体。

本发明还保护上述重组载体在制备omp26蛋白中的应用；本发明还保护上述重组载体在动物细菌性疾病基因工程疫苗技术领域中的应用。

本发明还提供了一种副猪嗜血杆菌外膜蛋白基因omp26重组猪霍乱减毒沙门氏菌株，其是将上述重组载体pya3493(+)-omp26转入猪霍乱沙门氏菌asd基因缺失株c500δasd中构建得到。

本发明还提供了上述副猪嗜血杆菌外膜蛋白基因omp26重组猪霍乱减毒沙门氏菌株的构建方法，包括步骤：构建猪霍乱沙门氏菌asd基因缺失株c500δasd；然后将上述重组载体pya3493(+)-omp26电转入猪霍乱沙门氏菌asd基因缺失株c500δasd中，之后培养，待平皿表面有菌落长出后进行双酶切、pcr鉴定及测序，结果均证明所得为阳性pya3493(+)-omp26质粒，得到副猪嗜血杆菌外膜蛋白基因omp26重组猪霍乱减毒沙门氏菌株c501δasdpya3493-omp26，又名hps-sal菌株。

本发明还保护上述副猪嗜血杆菌外膜蛋白基因omp26重组猪霍乱减毒沙门氏菌株在制备omp26蛋白中的应用；本发明还保护上述副猪嗜血杆菌外膜蛋白基因omp26重组猪霍乱减毒沙门氏菌株在动物细菌性疾病基因工程疫苗技术领域中的应用。

本发明根据genbank中副猪嗜血杆菌(hps)的外膜蛋白omp26基因序列，设计合成了1对特异性引物，通过pcr方法从hps标准5型基因组中克隆出798bp的omp26基因。将克隆扩增hps的omp26基因与无抗性表达载体pya3493连接，通过pcr、酶切及测序鉴定后，将阳性重组质粒电转入猪霍乱减毒沙门氏菌c500asd基因缺失株中，构成asd+平衡表达系统，进一步通过westernblot鉴定表达产物，对其进行免疫原性研究。本发明选择猪霍乱减毒沙门菌c500株作为猪霍乱和副猪嗜血杆菌二联疫苗活载体，结合外源基因表达质粒pya3493，构建asd+平衡表达系统，该系统在无外源选择压力的条件下能够稳定遗传asd基因，能够克服以往外源基因不稳定遗传的问题，同时，该系统没有任何抗生素基因的标记，不会产生生物安全的问题，这为将猪霍乱减毒沙门氏菌c500asd基因缺失株开发成安全高效的疫苗活载体奠定了基础。同时又能良好表达副猪嗜血杆菌(hps)外膜蛋白omp26，并可作为之后研究副猪嗜血杆菌临床检测、流行病学调查和免疫检测的一个特殊蛋白，并为后续猪霍乱-副猪嗜血杆菌二联疫苗研究提供基础设想。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明背景技术中pya3493的质粒图谱；

图2为本发明背景技术中c500在普通麦康凯平板上的生长效果图；

图3为本发明背景技术中c500δasd在普通麦康凯平板上的生长效果图；

图4为本发明背景技术中c500δasd在添加了dap的麦康凯平板上的生长效果图；

图5为本发明背景技术中asd+平衡表达系统在无dap的麦康凯平板上的生长效果图；

图6为本发明背景技术中omp26的凝胶电泳图；

图7为本发明实施例2中pya3493酶切位点图；

图8为本发明实施例2中pya3493双酶切后的线性化质粒凝胶电泳图；

图9为本发明实施例2中扩增得到的pcr产物的凝胶电泳图；

图10为本发明实施例4中重组菌株猪霍乱沙门氏菌c501δasdpya3493-omp26的分析结果图；

图11为本发明实施例4中重组菌株猪霍乱沙门氏菌c501δasdpya3493-omp26的生长曲线图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。

实施例1(设计引物对)

本实施例提供一种扩增hps标准5型sh0165菌株的omp26基因的引物对，其是根据ncbi数据库已公布序列geneid：219691637设计得到的引物，包括引物1和引物2；

引物1的核苷酸序列如序列表中序列1所示，即上游引物(omp26-up)：5’-gcgtcgacaaaaatttatttaaacttgc-3’；

引物2的核苷酸序列如序列表中序列2所示，即下游引物(omp26-down)：5’-ccaagcttttttttcacttcttctgg-3’。

实施例2(构建重组载体)

本实施例构建一种重组载体，步骤包括：提取副猪嗜血杆菌5型sh0165菌株的dna，然后采用实施例1的引物对扩增omp26基因，其中，pcr的扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸1min，共32个循环；最后72℃延伸10min；将扩增得到的pcr产物进行胶回收(凝胶电泳图如图7所示)和纯化，之后与pmd18-t载体连接，得到连接产物；将连接产物转入感受态细胞dh-5α中，经酶切鉴定，筛选阳性克隆并进行序列测定，得到pmd18-t-omp26；用ecori和hindiii同时酶切无抗性质粒载体pya3493(pya3493酶切位点如图8所示，pya3493双酶切后的线性化质粒凝胶电泳图如图9所示)和pmd18-t-omp26，将酶切产物连接构建得到pya3493(+)-omp26表达载体，即重组载体。

实施例3(构建一株副猪嗜血杆菌外膜蛋白基因omp26重组猪霍乱减毒沙门氏菌株)

本实施例构建一株副猪嗜血杆菌外膜蛋白基因omp26重组猪霍乱减毒沙门氏菌株，步骤包括：构建猪霍乱沙门氏菌asd基因缺失株c500δasd；然后将实施例2的重组载体pya3493(+)-omp26电转入猪霍乱沙门氏菌asd基因缺失株c500δasd中，具体为取10μl已除盐重组质粒pya3493(+)-omp26加入到100μl感受态细胞c500δasd中，轻轻混匀并立即转移到预冷的0.2cm电转杯中，吸干电转杯外面水迹，然后放入电转仪样品槽中按照以下条件进行电转化电压2.0kv电容5μf；脉冲电阻200ω；时间4ms；电击后，马上取出电转杯，迅速加入至1.5mllb培养基中，37℃、200r/h震荡培养1h，取出菌液涂布于固体培养基表面，将平板正放于37℃培养箱中，待培养液完全被吸收后，倒置培养16-18h，待平皿表面有菌落长出后进行双酶切、pcr鉴定及测序，结果均证明所得为阳性pya3493(+)-omp26质粒，得到副猪嗜血杆菌外膜蛋白基因omp26重组猪霍乱减毒沙门氏菌株c501δasdpya3493-omp26，又名hps-sal菌株。

实施例4(omp26蛋白免疫原性研究)

将实施例3中阳性克隆的培养液用iptg诱导表达omp26重组蛋白；将经诱导表达的菌体离心，将沉淀以倍浓缩比例重悬于中，超声破碎裂解菌体，离心取上清结合一柱，用咪哩洗脱法纯化重组蛋白，取样经四亚群大肠埃希氏菌免疫血清和对照菌免疫血清鉴定及免疫原性、普遍性和特异性验证。并确定蛋白浓度。

将实施例3得到的重组菌c501δasdpya3493-omp26接种于无抗性液体lb培养基中，37℃振摇培养16-18h后，离心收集菌体。加入适量pbs重悬菌体沉淀，洗涤1次后加入等体积2×sds上样buffer，煮沸10min后冰浴裂解菌体，以备进行sds-page。同时处理c501δasdpya3493菌体作为阴性对照。

(1)sds-page凝胶的配制、电泳、染色以及脱色

sds-page的配制及电泳：按照表1准备好分离胶所需相关试剂，将各成分依次加入20ml烧杯中，迅速混匀，然后立刻添加到制胶板中，胶液上层缓慢铺上少量ddh2o。约30min后，待下层分离胶完全凝好后彻底弃掉上层水，同时准备5％浓缩胶的配制，具体胶液组成见表1，添加各成分后迅速混合，加入制胶板的分离胶上面，灌满后插入加样梳。待浓缩胶完全凝固后取下子，将凝胶板固定于电泳装置上，并向胶槽中加入足量tris-甘氨酸电泳缓冲液。向加样孔中分别加入各样品电泳时先设置电压为80v，电流保持在20ma-40ma范围内，电泳约30min后，至所有样品进入分离胶层后调整电压至120v，直至嗅酚蓝泳出胶底面时终止电泳。

表1sds-page胶配置

待电泳完成以后卸下凝胶，用0.25％的考马斯亮蓝r250染色液(含50％甲醇，45％纯化水，5％冰乙酸)染色过夜，然后再用脱色液(含50％甲醇，45％纯化水，5％冰乙酸)进行脱色，观察结果。重组菌株猪霍乱沙门氏菌c501δasdpya3493-omp26的分析结果见图10所示。

(2)westernblot分析：

重组猪霍乱沙门氏菌c500δasdpya3493-omp26的westernblot分析首先是按照上述方法进行sds-page凝胶电泳，其后操作步骤如下：

1)转膜：裁取6张whatman3m滤纸和1张nc膜，滤纸和nc膜的尺寸大小要完全等于或略小于凝胶；将nc膜在ddh2o中浸泡5min，滤纸浸泡于转移缓冲液中。然后按如下步骤操作：平放石墨电极的阳极底座，依次放3层滤纸、nc膜、sds-page凝胶和3层滤纸，彻底排除各层间气泡。将转移电泳槽的上盖扣到石墨电极-转移膜胶复合体上；连接电源，根据凝胶板面积按照0.65ma/cm²-1.0ma/cm²厅的参数设置电流，电泳转移1h。

2)封闭：转膜完全后取出nc膜，置于含2％bsa的封闭液中，室温封闭2h；

3)洗涤：弃封闭液，用tbst(ph7.5，含1mtris-hcl10ml，nacl8.8g，0.05％吐温-20)洗nc膜3遍，每次5min。

4)一抗孵育：将nc膜放入1：100倍稀释的小鼠抗感染血清hpssh0165(该血清来源于感染了致死剂量的副猪嗜血杆菌hpssh0165菌株后存活的小鼠)中，37℃孵育2h。

5)洗涤：取出nc膜，用tbst洗膜3-5次，每次5min。

6)二抗孵育：将nc膜转入用封闭液1：5000倍稀释的羊抗兔iga抗体(hpr标记)中，37℃孵育2h。

7)洗涤：取出nc膜，用tbst洗膜3-5次，每次5min。

8)显色：将膜置于新配置的dab显色液中，避光显色，待目的带颜色深度达到要求后，迅速用洗涤液冲洗以终止反应。观察结果。

(3)重组菌株c500δasdpya3493-omp26生长特性

将重组猪霍乱沙门菌株c500δasdpya3493-omp26与对照组重组猪霍乱沙门菌株c500δasdpya3493划线接种于无抗性lb平板上，挑取单克隆分别接种于lb液体培养基中，37℃振荡培养10h后，调整菌液od562值，取50ul接种于5mllb液体培养基中，37℃振荡培养，每隔1h测定菌液od562值。结果见图11所示，其中1为c501(pya-g)，2为c501(pya-o)，pya-o代表重组菌株c500δasdpya3493-omp26，3为c501(pya-pya3493)，结果表明重组菌株c500δasdpya3493-omp26与对照菌株c500δasdpya3493生长趋势比较接近。

需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对步骤、数字表达式和数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个以上，除非另有明确具体的限定。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的保护范围当中。

sequencelisting

<110>华南农业大学

<120>构建一株表达副猪嗜血杆菌omp26基因的猪霍乱减毒沙门菌重组菌株

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