一种荧光SSR引物组合及其在构建白蜡新品种分子指纹图谱中的应用的制作方法

本发明涉及dna指纹图谱技术领域，具体而言，涉及一种荧光ssr引物组合及其在构建20个白蜡新品种分子指纹图谱中的应用。

背景技术：

白蜡属(fraxinus)隶属木犀科(oleceae)，木樨亚科。白蜡属植物全世界约70余种，我国有30多种，种质资源非常丰富，无论实生苗还是栽培种，均具有丰富的遗传多样性，这可能与其异化授粉的生物学特性有关，对其种质资源进行鉴别评价是育种研究工作的重要环节之一，但其种或品种的植物学分类存在争议。传统的白蜡分类鉴别主要依靠翅果、花、芽、叶及花粉粒等形态学标记，以翅果和花性状的差异最为明显，其次是芽、叶缘锯齿和果实缺刻被作为分类的依据。虽然形态标记研究简单直观且较经济，但有些不同种或品种间的形态特征极为相似，在种间交互难以区分，造成了白蜡属植物分类混淆问题，常出现同种多名称以及同名多品种的现象，导致白蜡命名上存在一些争议。在种质资源的鉴别中，仅依靠其形态性状，通常不能准确的反映不同品种的差别，因为形态性状极易受到环境的影响而发生变化，这给种或品种鉴别带来困难。

近年来，随着育种方法的不断进步，新的白蜡品种也不断涌现，这些白蜡种质资源有许多优异品种未能被合理利用，如何鉴别白蜡种的真伪、品种成为一个函待解决的问题。因此，将这些白蜡种质资源进行有效分类和鉴定，对白蜡种质资源的研究，品种创新尤为重要。

dna指纹图谱技术对白蜡品种精准鉴定提供了一种有效的技术手段。简单重复序列(simplesequencerepeat，ssr)分子标记具有分析方法简便、快速、共显性遗传、信息含量高、重复性好等优点，使其成为构建白蜡品种分子身份证的较理想的分子标记技术，并且已成功应用于玉米、水稻、小麦、番茄、柑橘、马铃薯等主要农作物中。以此方法构建品种的分子指纹图谱、鉴别品种的真伪和纯度，对种子产业化和品种的知识产权保护有重大意义。但这种方法存在成本高、耗时、且通过好多对引物结合检测位点才能鉴别。基于此，开发一种ssr引物组合并将其在构建20个白蜡新品种分子指纹图谱中的应用，为dna指纹图谱在白蜡上的进一步应用，快速实现对白蜡新品种的区别与鉴定，克服以往形态、生理鉴定的技术缺陷，具有重要意义。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是供用一种荧光ssr引物组合及其在构建20个白蜡新品种分子指纹图谱中的应用。

本发明所述的荧光ssr引物组合，其特征在于：该荧光ssr引物组合由命名为f202和r202的ssr引物对和命名为f208和r208的ssr引物对组成，其中在每对引物的上游引物的5′端加有fam(6-carboxy-fluorescein)荧光标记，正向引物为与携带荧光标记的tp-m13引物组成；所述f202和r202引物对中f202的核苷酸序列是如seqidno.1所示的正向引物序列，r202的核苷酸序列是如seqidno.2所示的正向引物序列，所述f208和r208引物对中f208的核苷酸序列是如seqidno.3所示的正向引物序列，r208的核苷酸序列是如seqidno.4所示的正向引物序列。其详细信息见表1。

表1：荧光ssr引物组合及其扩增信息

本发明所述荧光ssr引物组合在构建20个白蜡新品种分子指纹图谱中的应用，其中，所述20个白蜡新品种分别是：鲁蜡6号、金箭、鲁蜡1号、冬红白蜡、鲁蜡2号、红叶白蜡、鲁蜡5号、金叶白蜡、贾斯白蜡、秋紫白蜡、地图白蜡、秋欢白蜡、垂枝白蜡、柱形白蜡、秋火白蜡、青碧、华雄、鲁蜡3号、鲁蜡4号、金枝白蜡。

上述的应用中，构建20个白蜡新品种分子指纹图谱的方法及步骤是：

(1)由白蜡幼嫩叶片提取白蜡基因组dna；

(2)ssr引物的初步筛选；

(3)全自动毛细管电泳系统复筛，根据电泳结果选出核心引物；

(4)根据电泳结果中每对ssr引物的峰值，组合形成20个白蜡新品种的ssr指纹图谱，并且验证选出的核心ssr引物组合的正确性；

其特征是：

步骤(1)中dna的提取采用ctab法，提取缓冲液中加入2％β-巯基乙醇和2％pvp；紫外分光光度法测定dna的浓度和纯度，稀释至30ng·μl^-1，-20℃保存，备用；

步骤(2)所述初步筛选ssr引物的方法是：选取表型性状差异较大的4个白蜡品种华雄、鲁蜡5号、金叶白蜡和金枝白蜡提取dna进行ssr引物筛选；其中，pcr反应体系：10μmol·l^-1的引物正反向引物各0.3μl、dna模板0.2μl、pcr-mix5.5μl、ddh2o3.7μl共计10μl；pcr反应条件：94℃预变性3min，94℃变性1min，54℃–58℃退火1min，72℃延伸lmin，共35个循环；最后72℃延伸10min，4℃10min终止反应。ssr扩增产物在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳检测，扩增产物点样3.5μl，分子量标准为50bpdnaladder，在200v电压下预电泳30min，再继续电泳2h，用0.1％的agno3溶液银染，漂洗，naoh溶液显色，凝胶扫描保存，统计数据后进行分析初步筛选出扩增带型清晰、主带明显、稳定、多态性、重复性好的ssr引物；

步骤(3)所述全自动毛细管电泳系统复筛，根据电泳结果选出核心引物的方法是：从初步筛选出引物中再选出多态性好的引物对，在每对引物的上游引物的5′端添加荧光标记fam，正向引物为与携带荧光标记的tp-m13引物组成；其中，荧光标记毛细管电泳的pcr扩增采用10μl的反应体系：dna模板1μl、2xtaqpluspcrmastermix5μl、10μmol·l^-1的正反向引物各0.1μl以及ddh2o共10μl；pcr扩增程序采用touchdown模式：95℃预变性5min；95℃变性30s，52℃退火30s，每个循环降低0.5℃；72℃延伸30s，15个循环；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，20个循环；72℃延伸10min，4℃保存；取pcr产物0.3μl、gs-500liz分子量内标0.5μl和去离子甲酰胺9.5μl混合加入pcr板，95℃变性5min，4℃冷却后离心，1×buffer缓冲液上机检测；采用3730xldna测序仪进行毛细管电泳：预电泳15kv下3min；1.6kv下进样15s；电泳15kv下20min；将上机结果原始文件导入genemarker2.2.0软件，进行数据收集和图像分析最终确定核心引物是命名为f202和r202的ssr引物对和命名为f208和r208的ssr引物对相结合组成的荧光ssr引物组合；

步骤(4)所述形成的20个白蜡新品种的ssr指纹图谱中2对f202和r202的ssr引物对和f208和r208的ssr引物对相结合完全能区分20个白蜡新品种，验证了该核心ssr引物组合的正确性；其中，所述20个白蜡新品种分别是：鲁蜡6号、金箭、鲁蜡1号、冬红白蜡、鲁蜡2号、红叶白蜡、鲁蜡5号、金叶白蜡、贾斯白蜡、秋紫白蜡、地图白蜡、秋欢白蜡、垂枝白蜡、柱形白蜡、秋火白蜡、青碧、华雄、鲁蜡3号、鲁蜡4号、金枝白蜡。两对荧光ssr引物对20个国审白蜡新品种鉴定结果汇总见表2。

本发明根据转录组测序获得的序列数据设计并通过大量的筛选，选出特异性稳定、多态性好的2对荧光ssr特异引物，利用构建的20个白蜡新品种分子指纹图谱实现了对20个白蜡新品种的简便、快速、准确的全部区分，克服了以往形态、生理鉴定的技术缺陷。

本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：

1)本发明提供的荧光ssr引物组合及其应用方法是一种从分子水平上快速、高效鉴定白蜡新品种方法，具有快速、准确、操作方便等优势，并且鉴定结果不易受环境影响。

2)本发明利用毛细管电泳荧光标记电泳技术，克服了聚丙烯酞胺凝胶电泳的不足，能准确读出产物片段的大小，精确度达到lbp之内，能对品种进行精确鉴定，而且成本较低，应用价值大。

3)本发明通过2对荧光ssr引物组合，能够快速的将20个白蜡新品种鉴定，克服了以往形态、生理鉴定的技术缺陷。同时也为dna指纹图谱在白蜡上的进一步应用研究以及评价白蜡种质资源和解决其品种产权纠纷提供科学、有效的参考依据。

附图说明

图1：为本发明示例的荧光ssr引物对f202和r202的部分白蜡树种pcr扩增产物毛细管电泳图。

图2：为本发明示例的荧光ssr引物对f208和r208的部分白蜡树种pcr扩增产物毛细管电泳图。

具体实施方式

实施例1

1.鉴定材料

选用不同品种(种)白蜡树幼嫩叶片提取基因组dna。本发明选用已通过国外和国外审(认)定的白蜡优良品种：鲁蜡6号、金箭、鲁蜡1号、冬红白蜡、鲁蜡2号、红叶白蜡、鲁蜡5号、金叶白蜡、贾斯白蜡、秋紫白蜡、地图白蜡、秋欢白蜡、垂枝白蜡、柱形白蜡、秋火白蜡、青碧、华雄、鲁蜡3号、鲁蜡4号、金枝白蜡。见表2。

2.dna的提取

2.1将配制好的ctab提取缓冲液置于65℃的水浴锅中预热30min，氯仿一异戊醇(24:1)、无水乙醇、70％乙醇置于-20℃冰箱预冷备用，研钵需提前预冷，使用前再用少量液氮预冷；

2.2取0.4-0.5g白蜡幼叶，加充足液氮研磨至粉末状，迅速转入2ml离心管中，加入600μl2％的ctab提取液(含2％β-巯基乙醇)，充分混匀。在65℃的水浴锅中水浴30min，其间轻轻颠倒3-4次；

2.3冷至室温后加入600μl的氯仿：异戊醇(24：1)抽提10min，其间不停地轻轻地摇动，冷却至室温，在12000r/min离心10min；

2.4将上清液(约500μl)转入另一离心管中，加等体积氯仿：异戊醇(24：l)重复步骤2.3；

2.5取出上清液并移到另一个干净的1.5ml的离心管中，再加1ml的预冷无水乙醇沉淀dna(-20℃放置30min)，轻轻旋转离心管，出现絮状dna，-20℃放置1h，观察沉淀生成；

2.68000rmp室温离心5min，倒掉上清液，沉淀用1ml75％的酒精洗涤两次，超净工作台静置乙醇挥发干净。

2.7待dna风干后(dna不宜过分干燥，否则极难溶解)，用适量的te(ph8.0、50μl)或超纯水溶解，4℃放置6-12h使其充分溶解；

2.8加入2μlrna酶10mg/ml，37℃水浴1h，-80℃保存备用；

3.dna定量和质量检测

3.1取2μldna用微量核酸蛋白检测仪检测，可以直接读出dna浓度和a260/a280的比值，比值在1.8～2.0之间符合要求。

3.2另取3μldna加1μl的溴酚蓝，在0.8％琼脂糖凝胶上电泳15min～20min，稳压100v，电泳缓冲液为1×tbe，325nm紫外灯下观察，照相，通过与标准溶液的荧光进行比较估测未知dna的浓度。

3.3植物总dna样品呈现一条相对分子量较大而迁移速率很小的清晰条带。

3.4将样品稀释成浓度为20ng/μl，在-80℃保存备用。

4.ssr引物的初步筛选

4.1选取表型性状差异较大的4个白蜡品种华雄、鲁蜡5号、金叶白蜡和金枝白蜡提取dna进行ssr引物筛选，所用引物通过转录组测序开发获得，初步筛选500对ssr引物作为本研究的候选引物，由山东华博基因工程有限公司合成。

4.2pcr反应体系：引物正反向引物各0.3μl(10μmol·l^-1)、dna模板0.2μl、pcr-mix5.5μl、ddh2o3.7μl共计10μl。

4.3pcr反应条件：94℃预变性3min，94℃变性1min，54℃–58℃退火1min，72℃延伸lmin，共35个循环；最后72℃延伸10min，4℃10min终止反应。

4.4ssr扩增产物在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳检测，扩增产物点样3.5μl，分子量标准为50bpdnaladder，在200v电压下预电泳30min，再继续电泳2h，用0.1％的agno3溶液银染，漂洗，naoh溶液显色，凝胶扫描保存，统计数据后进行分析。

4.5最终从500对引物中筛选出扩增带型清晰、主带明显、稳定、多态性、重复性好的42对高效ssr引物标记。

5.全自动毛细管电泳系统复筛，根据电泳结果选出核心引物

5.1从42对引物中筛选出多态性好的17对引物，在每对引物5′端添加荧光标记fam(6-carboxy-fluorescein)。正向引物为与携带荧光标记的tp-m13引物组成，由山东华博基因工程有限公司合成。

5.2荧光标记毛细管电泳的pcr扩增采用10μl的反应体系：dna模板1μl、2xtaqpluspcrmastermix5μl、正反向引物各0.1μl(10μmol·l^-1)以及ddh2o共10μl。

5.3pcr扩增程序采用touchdown模式：95℃预变性5min；95℃变性30s，52℃退火30s(每个循环降低0.5℃)，72℃延伸30s，15个循环；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，20个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

5.4pcr产物变性：pcr产物用双蒸水稀释10-20倍，取pcr产物0.3μl、分子量内标0.5μl和去离子甲酰胺9.5μl混匀加入pcr板；在pcr仪上运行变性程序：95℃变性5min，4℃冷却后离心，1×buffer缓冲液上机检测。

5.5pcr产物扩增检测：pcr产物检测采用美国abi公司生产的3730xldnaanalyzer基因分析仪，采用美国abi公司生产的50cm，96道毛细管电泳，预电泳15kv下3min；1.6kv下进样15s；电泳15kv下20min。将上机结果原始文件导入genemarker2.2.0软件，进行数据收集和图像分析。

6.数据分析

根据筛选引物时确定的分子量大小及引物颜色进行分子量的确定，将收集的原始数据采用datacollection软件导入genemarker2.2.0系统进行分析。根据目标峰值大小系统软件与其泳道中的gs-500liz分子量内标进行比较，准确计算出目标dna片段大小，将电泳结果转化成pdf图片格式导出。各荧光标记毛细管电泳检测3次重复，3次重复的平均值作为实验材料在该座位上的数据。根据数据收集和图像分析最终确定核心引物是命名为f202和r202的ssr引物对和命名为f208和r208的ssr引物对相结合组成的荧光ssr引物组合。

7.结果分析

两对荧光ssr引物(f/r202和f/r208)对20个国审白蜡新品种鉴定结果见表2。其中引物f/r202多态性位点最多，将b10、b29、b32、b43、b57、b79、b107、b181、b182和b199共计9个白蜡新品种区分开，2对引物组合f/r202和f/r208能将20个品种完全区分，说明20个白蜡没有重复品种，引物的区分比较好，将来可用于白蜡品种鉴定和品种指纹图谱的构建。

表2两对ssr引物对20个国审白蜡新品种鉴定

序列表

<110>山东省林业科学研究院山东华博基因工程科技有限公司

<120>一种荧光ssr引物组合及其在构建白蜡新品种分子指纹图谱中的应用

<141>2018-12-24

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<221>引物f202核苷酸序列

<400>1

agttttcaccgctttcagtgtta23

<210>2

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<221>引物r202核苷酸序列

<400>2

gggaatgaacatgagtttcagta23

<210>3

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<221>引物f208核苷酸序列

<400>3

cctcctattgaatcattcgctta23

<210>4

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<221>引物r208核苷酸序列

<400>4

attttgatttccctcctctgaag23