诊断或治疗胶质瘤的分子标记物及其应用的制作方法

本发明属于生物医药和分子生物学技术领域，具体涉及诊断或治疗胶质瘤的分子标记物及其应用。

背景技术：

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤，发病率为3-8/10万，占颅内肿瘤的40-50％。胶质瘤的生物学特点主要包括高死亡率和高复发率，强侵袭能力，很强的血管生成能力和广泛的低氧状态。

实性肿瘤如乳腺癌、肝癌、胶质瘤等生长迅速及相对应的血供不足，低氧微环境在这些肿瘤中普遍存在。肿瘤的低氧与低生存期直接相关。目前有很多研究证实低氧与肿瘤的增殖、侵袭迁移、血管生成等进展相关。此外，胶质瘤血供丰富，抗血管生成药物治疗胶质瘤的应用前景备受瞩目。然而，发明人发现，抗血管疗法临床应用后普遍存在疗效短暂和疗效欠佳的问题。1999年血管拟态(vasculogenicmimicryvm)概念的提出，使人们意识到在肿瘤组织中除了由内皮细胞构成的血管外，还有其他的血液供应形式。血管拟态是由肿瘤细胞在特定情况下模拟血管内皮细胞形成的一种功能上类似于正常血管的管道，与肿瘤微循环相通连，构成网状的血液输送循环，为肿瘤提供营养支持。目前已经证实，包括胶质瘤在内的多种恶性肿瘤中均存在血管拟态，并且其阳性率与肿瘤级别及患者的不良预后密切相关，低氧微环境与血管拟态形成息息相关。

尽管目前已经有数个机制阐述低氧诱导的肿瘤细胞的侵袭迁移，仍有很多研究者在探讨mir(microrna)在肿瘤低氧效应中的作用。microrna是一系列内源性的20-22个核苷酸序列的单股非编码rna，在转录后水平负相调节基因表达。在之前，有研究证实在肺癌、胃癌、乳腺癌等疾病中mir-588起抑癌作用，在前列腺癌中mir-588被发现具有促进肿瘤细胞增殖作用而表现为促癌基因。

技术实现要素：

针对上述现有技术的不足，本发明提供诊断或治疗治胶质瘤的分子标记物及其应用。经试验研究证明，胶质瘤中microrna-588的表达在低氧状态下较常氧明显上调，体外实验结果显示mir-588能抑制胶质瘤细胞的侵袭迁移和vm形成能力，为明确其中的分子机制，进一步实验发现robo1是胶质瘤中mir-588的直接和功能相关靶点。敲除robo1能抑制基质金属蛋白酶2(mmp2)及基质金属蛋白酶9(mmp9)表达，进而抑制胶质瘤的侵袭迁移及vm形成能力。因此，mir-588和robo1可以作为诊治胶质瘤的分子标记物。

本发明是通过如下技术方案实现的：

本发明的第一个方面，提供如下任意一种或多种物质在制备胶质瘤分子标记物中的应用，所述物质包括mir-588、robo1基因及其表达产物、基质金属蛋白酶2(mmp2)基因及其表达产物和基质金属蛋白酶9(mmp9)基因及其表达产物。

进一步的，所述应用中，所述标记物用于诊断、检测、监测或预测胶质瘤的进展。

所述胶质瘤的进展包括胶质瘤细胞的迁移、侵袭和/或血管拟态(vasculogenicmimicry,vm)形成；

其中，所述mir-588、robo1基因及其表达产物、mmp2基因及其表达产物、mmp9基因及其表达产物均可为人源。

本发明的第二个方面，提供一种用于诊断、检测、监测或预测胶质瘤的进展的组合物，其包含基于高通量测序方法和/或基于定量pcr方法和/或基于探针杂交方法检测胶质瘤样品中mir-588、robo1基因及其表达产物、mmp2基因及其表达产物和/或mmp9基因及其表达产物；或者基于免疫检测方法检测胶质瘤样品中mir-588调控的靶基因的表达情况、robo1表达产物情况、mmp2蛋白表达情况和/或mmp9表达产物情况的物质。

其中，所述mir-588调控的靶基因包括robo1基因；

优选采用northern杂交方法、mirna表达谱芯片、核酶保护分析技术、rake法、原位杂交检测胶质瘤样品中mir-588、robo1、mmp2和/或mmp9的转录；采用elisa、胶体金检测、蛋白芯片检测胶质瘤样品中mir-588调控的靶基因的表达情况、robo1表达产物情况、mmp2蛋白表达情况和/或mmp9表达产物情况；

进一步的，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包括用于诊断、检测、监测或预测胶质瘤的进展的组合物；

所述胶质瘤的进展包括胶质瘤细胞的迁移、侵袭和/或血管拟态(vasculogenicmimicry,vm)形成。

本发明的第三个方面，提供能够促进mir-588表达和/或活性提高的物质、抑制robo1基因及其表达产物和/或活性降低的物质、抑制mmp2基因及其表达产物和/或活性降低的物质、和/或抑制mmp9基因及其表达产物和/或活性降低的物质在如下(i)-(iii)至少一种中的应用：

(i)抑制胶质瘤细胞的迁移，或制备用于抑制胶质瘤细胞迁移的产品；

(ii)抑制胶质瘤细胞的侵袭，或者制备用于抑制胶质瘤细胞侵袭的产品；

(iii)抑制胶质瘤细胞的血管拟态，或者制备用于抑制胶质瘤细胞生长的产品。

本发明的第四个方面，提供一种用于治疗或预防胶质瘤的药物组合物，其包含促进mir-588表达和/或活性提高的物质、抑制robo1基因及其表达产物和/或活性降低的物质、抑制mmp2基因及其表达产物和/或活性降低的物质、和/或抑制mmp9基因及其表达产物和/或活性降低的物质；

所述促进mir-588表达和/或活性提高的物质，包括采用基于rna的microrna功能性获得技术和/或基因特异性mirmimics技术上调mir-let-7i-5p表达和/或促进其活性；进一步优选为人工合成的mir-588短发夹rna(shorthairpinrna，shrna)或上调mir-588表达的启动子。

所述抑制robo1基因及其表达产物和/或活性降低的物质，包括robo1蛋白特异的抗体、针对robo1mrna的rna干扰分子或反义寡核苷酸、小分子抑制剂、sirna；进一步的，所述抗体为人抗体。

所述抑制mmp2基因及其表达产物和/或活性降低的物质，包括mmp2蛋白特异的抗体、针对mmp2mrna的rna干扰分子或反义寡核苷酸、小分子抑制剂、sirna；进一步的，所述抗体为人抗体。

所述抑制mmp9基因及其表达产物和/或活性降低的物质，包括mmp9蛋白特异的抗体、针对mmp9mrna的rna干扰分子或反义寡核苷酸、小分子抑制剂、sirna；进一步的，所述抗体为人抗体。

在本发明中，“治疗或预防”指的是能够抑制胶质瘤细胞的迁移、侵袭和/或血管拟态。

进一步的，所述药物组合物还可以包含通常使用的适量载体、赋形剂及稀释剂。而且，根据通常的方法，可以制作成粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、喷雾剂等的口服剂、外用剂、栓剂及无菌注射溶液形式的剂型使用。可以包含的载体、赋形剂及稀释剂有乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油等。

本发明有益效果：本发明首次证明胶质瘤中microrna-588的表达在低氧状态下较常氧明显上调，而且体外实验结果显示mir-588能抑制胶质瘤细胞的侵袭迁移和vm形成能力，同时进一步发现robo1是胶质瘤中mir-588的直接和功能相关靶点。敲除robo1能抑制基质金属蛋白酶2(mmp2)及基质金属蛋白酶9(mmp9)表达，进而抑制胶质瘤的侵袭迁移及vm形成能力。因此，mir-588和robo1可以作为诊治胶质瘤的分子标记物，具有良好的实际应用之价值。

附图说明

图1为低氧胶质瘤细胞芯片结果及mir-588的表达水平系列图，其中，图1a为通过火山图法分析，全基因组表达谱芯片筛选出显著性差异表达的micrornas有84个，其中上调67个，下调17个；其中mir-588在低氧下显著上调；图1b为显著上调的micrornas，mir-588低氧下上调倍数位于前10位；图1c为rt-qpcr结果显示mir-588在低氧下显著上调，且与低氧培养时间相关；图1d为cck8结果显示敲除和过表达mir-588对细胞活性无影响。

图2为mir-588敲除和过表达对胶质瘤细胞侵袭迁移及vm形成能力的影响系列图；其中，图2a为常氧和低氧条件下36小时划痕实验结果显示低氧下u251细胞的迁移能力明显增强，敲除mir-588增强胶质瘤细胞的迁移能力，过表达mir-588则抑制胶质瘤细胞的迁移能力；图2i为统计图，结果有显著性差异；图2b为a172胶质瘤细胞重复常氧及低氧下划痕实验，结果与u251细胞实验一致；图2j为统计图；图2c和图2d分别为常氧和低氧条件下的u87和a172细胞的transwell迁移实验，结果显示敲除mir-588显著增强胶质瘤细胞的迁移能力，过表达mir-588则抑制胶质瘤细胞的迁移能力；图2k和图2l分别为统计图，结果有显著性差异；图2e和图2f分别为常氧和低氧条件下的u87和a172细胞的matrigel基质胶侵袭实验，结果显示敲除mir-588显著增强胶质瘤细胞的侵袭能力，过表达mir-588则抑制胶质瘤细胞的侵袭能力，低氧能增强这种侵袭能力；图2m和图2n分别为统计图，结果有显著性差异；图2g和图2h分别为常氧和低氧条件下的u87和a172细胞在matrigel基质胶中的vm形成实验，结果显示敲除mir-588显著增强胶质瘤细胞的vm形成能力，过表达mir-588则抑制胶质瘤细胞的vm形成能力，低氧能显著增强这种vm形成能力；图2o和

图2p分别为统计图，结果有显著性差异。

图3为mir-588调控低氧胶质瘤细胞侵袭迁移及vm形成能力的直接靶点验证系列图；图3a为预测结果显示robo1的3’utr区域存在mir-588的直接结合靶点，并构建了该结合位点突变的荧光素酶报告基因质粒；图3b为荧光素酶报告基因实验结果显示该结合位点的突变能够消除mir-588对robo1的抑制作用；

图3c表明胶质瘤患者中高表达robo1者生存期更短；图3d为胶质瘤中robo1的表达量明显高于正常脑组织；图3e为cck8结果显示应用sirna敲除robo1后胶质瘤细胞的活性无显著变化；图3f和图3g为westernblot结果显示u87和a172细胞过表达mir-588后，robo1的表达明显受抑制，敲除mir-588则增加robo1的表达，mmp2和mmp9的表达与robo1的表达趋势一致；图3h为westernblot实验结果显示robo1sirna的敲除效率满意，敲除robo1后mmp2和mmp9的表达也随之下降。

图4为robo1特异性小干扰rna可以阻断mir-588对胶质瘤细胞侵袭迁移及vm形成能力的调控作用系列图；图4a为划痕实验结果显示转染robo1小干扰rna能显著抑制胶质瘤细胞的迁移能力，并能阻断mir-588inhibitor促进胶质瘤细胞迁移的作用，同时增强mir-588mimics对细胞迁移的抑制作用；图4e为统计图，结果有显著性差异；图4b和图4c为transwell迁移及侵袭实验，结果显示robo1sirna能显著阻断mir-588敲除后的胶质瘤细胞侵袭迁移能力上调，并能增强mir-588过表达对胶质瘤细胞的侵袭迁移抑制作用；图4f和图4g分别为统计图，结果有显著性差异；图4d为u87胶质瘤细胞在matrigel基质胶中的vm形成实验，结果显示robo1sirna能显著抑制胶质瘤细胞的vm形成能力，并能阻断mir-588敲除后的胶质瘤细胞侵袭迁移能力上调，可以增强mir-588过表达对胶质瘤细胞的侵袭迁移抑制作用；图4h为统计图，结果有显著性差异。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

本发明中术语解释和说明：

液相杂交(solutionhbridization)：使变性的待测核酸单链与放射笥核素标记的已知的酸单链(探针)在溶液中保温，使之形成杂交复合物。反应结束后，用羟磷灰石法或酶解法将未被杂交的单链和杂交双链分开，然后结膈后在杂妆分子中的探针量，就可推算出被测的核酸量。

mirna表达谱芯片：原理是使用标记探针检测固相支持物上的目标分子。通过设计芯片上mirna基因及内参序列，可精确分析出样品中相应mirna的表达水平。基因芯片具有高通量的优点，可以一次在同一样本中检测出几百个基因的全部表达。luminex公司研制的液相芯片(liquidchip)又称多功能悬浮点阵(multianalytesuspensionarray，masa)，是出的新一代生物芯片技术。液相芯片体系由许多小球体为主要基质构成，每种小球体上固定有不同的探针分子，为了区分不同的探针，每一种用于标记探针的球形基质都带有一个独特的色彩编号，将这些小球体悬浮于一个液相体系中，就构成了液相芯片系统。该系统可以对同一个微量样本中的多个不同分子同时进行快速的定性、定量分析，这种检测技术被称为fmap(flexiblemultianalyteprofiling)技术。分子杂交在悬浮溶液中进行，检测速度极快。

核酶保护分析技术(rpa)：mirna的检测还可以采用核酶保护分析技术，将标记好的探针和待测rna样本混合，热变性后杂交，未杂交的rna和多余的探针用单链核酸酶消化，热失活核酸酶后纯化受保护的rna分子，最后通过变性page电泳分离探针，显色。这种基于液相杂交的新方法简单快速，灵敏度高。

rake法(rnaprimedarraybasedklenowemzyme)：是在mirnamicroarray的基础上利用dna聚合酶i的klenow片段，使mirna与固定的dna探针杂交的方法。rake可以敏感特异地检测mirna，适用于大量快速的筛选所有己知的mirna。能够在特定的细胞和肿瘤中检测mirna表达谱情况。不仅如此，rake法还可以从由福尔马林固定了的石蜡包埋的组织中分离出mirna并对其进行分析。

原位杂交(insituhybridization)：原位杂交技术可直观了解mirna表达方式，是观测mirna时空表达的一种较简便的方法，常标记方式包括地高辛、生物素、荧光标记等。锁定核酸基础上的原位杂交(lockednucleicacid(lna)basedinsituhybridization(lna-ish))是当前应用较多的探针方式。

高通量测序(high-throughputsequencing)：又称下一代测序技术(nextgenerationsequencing)是对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万到几百万条dna分子进行序列测定，极大提高了测序效率。这类大规模测序技术极大的提高了多个物种遗传信息的解读速度，为获取所有mirna的序列信息，解密mirna图谱提供了保证。同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序(deepsequencing)。高通量测序平台的代表是罗氏公司(roche)的454测序仪(rochgsflxsequencer)，illumina公司的solexa基因组分析仪(illuminagenomeanalyzer)和abi的solid测序仪(abisolidsequencer)。

免疫检测方法：是以一种抗体或多种抗体作为分析试剂，对待测物进行定量或定性分析的检测方法。其基本原理是抗体和抗原之间的相互作用。为提高抗原和抗体检测的敏感性，将已知抗体或抗原标记上易显示的物质，通过检测标记物，反映有无抗原抗体反应，从而间接测出微量的抗原或抗体。常用的标记物有酶、荧光素、放射性同位素、胶体金及电子致密物质等。这种抗原或抗体标记上显示物所进行的特异性反应称为免疫标记技术(immunolabellingtechnique)。目前应用最广的免疫检测技术主要有：酶联免疫吸附试验(enzyme-linkedimmunosorbentassay,elisa)，胶体金免疫层析法等。

酶联免疫吸附试验原理是将抗原或抗体与底物(酶)结合，使其保持免疫反应和酶的活性。把标记的抗原或抗体与包被于固相载体上的配体结合，再使之与相应的无色底物作用而显示颜色，根据显色深浅程度目测或用酶标仪测定od值判定结果。

胶体金试纸条一般由样品垫、金标垫、层析膜、吸水垫四部分组成。层析材料有硝化纤维膜、聚酯膜、尼龙膜和pvdf膜等，根据试验需要可选择不同要求的膜，其中硝化纤维膜最为常用，使用前可根据试验具体情况确定是否需要活化或处理，多数情况下无需处理，即可直接使用。将金标蛋白溶液均匀喷涂在金标垫上，于室温下晾干备用。硝化纤维膜可捕获一定量的包被(抗体)和二抗作为检测线和质控线。最后将样品垫、金标垫、硝化纤维膜和吸水纸依次固定于pvc板，即成试纸条。

基于rna的microrna功能获得性技术：即通过外源性补充mirnas合成的前体物质来升高mirnas的水平。例如，可以人工合成与内源性mirna序列一致的短发夹样rna(shorthairpinrna，shrna)，由聚合酶ii或iii做启动子，以病毒为载体转染细胞，被dicer酶修饰后载入risc发挥作用，相当于升高pre-mirna的水平，作用效果稳定而持久。

基因特异性mirmimics技术：该技术避免了mirna与基因的非特异性作用。这种人工合成的与靶基因3’utr互补结合的特异性寡核苷酸链，能够起到与mirna相同的转录后调节作用。

胶质瘤在低氧条件下培养，会发生特殊的生物学反应，包括调控增殖、血管生成、转移和凋亡的信号通路的激活。肿瘤低氧环境与预后较差、放疗抵抗、化疗抵抗等有关。在手术切除的胶质瘤组织中，可见细胞围绕着中心的坏死组织，并向外迁移，这可能意味着低氧在该过程中起调控作用。这已经被体内外实验所证实，肿瘤低氧导致胶质瘤细胞的侵袭迁移能力增强，但具体的机制仍不清楚，近期的研究显示不同的mir参与这一过程。然而，针对mir-588与胶质瘤进展的关系尚不清楚；因此有必要对mir-588在胶质瘤中的具体分子机制进行研究分析。

胶质瘤是一种高度血管化的脑肿瘤，但目前抗血管疗法在临床应用后却出现了疗效短暂和疗效欠佳的问题。随着1999年血管拟态概念的提出，人们意识到在肿瘤组织中除了由内皮细胞构成的血管外，还有其他的血液供应形式。血管拟态是由肿瘤细胞在特定情况下模拟血管内皮细胞形成的一种功能上类似于正常血管的管道，与肿瘤微循环相通连，构成网状的血液输送循环，为肿瘤提供营养支持。其具有以下特点：(1)管道由肿瘤细胞而不是内皮细胞排列构成，与肿瘤微循环系统相通；(2)decm重塑；(3)pas染色阳性和cd31染色阴性。目前已经证实，包括胶质瘤在内的多种恶性肿瘤中存在血管拟态，其阳性率与肿瘤级别及患者的不良预后密切相关，血管拟态高水平的患者更倾向出现肿瘤转移并具有较低的存活率。因而，靶向血管拟态的治疗策略很可能是一种非常有前景的抗肿瘤血管治疗手段。vm形成主要是通过胶质瘤干细胞、tgfβ、vegfr-2/flk-1、ve-cadherin、rtk/pi3k/akt/mtor、mmp-laminin5γ2chainpathway等通路进行，上皮间质转化及低氧微环境都在其中起重要作用。研究发现，mir-588在低氧下明显上调，而且过表达mir-588抑制胶质瘤细胞的侵袭迁移，这些都提示mir-588可能与胶质瘤的vm形成有关。通过进行胶质瘤细胞的vm形成实验，结果证实mir-588抑制胶质瘤细胞的vm形成。这些发现说明mir-588起抑癌作用，可以作为潜在的恶性胶质瘤的生物标记物。

参与mir-588抑癌机制的通路报道很少，本发明证明mir-588与低氧之间的关系。基于前期的实验和研究结果表明，mir-588能拮抗低氧诱导的胶质瘤的恶性进展，能起到抑制肿瘤侵袭迁移及vm形成的能力。前期实验结果显示mir-588mimics转染的细胞的运动性及vm形成能力显著下降，敲除mir-588则得到相反结果，而且mir-588的这些作用在低氧状态下得到放大。mir-588对低氧的反应是上调，且起到抑癌作用。由此，mir-588可能参与了保护性代偿机制，在抑制低氧诱导的胶质瘤细胞的侵袭迁移及vm形成能力方面起重要作用。通过预测网站寻找了mir-588下游运动相关基因robo1作为潜在促癌基因靶点，并通过实验验证。robo1是一种保守跨膜受体蛋白，主要表达于神经系统，参与传导生物学信息。robo1在肿瘤发生发展中的作用仍没有明确，癌基因或抑癌基因的作用都有表现。

分析tcga数据库的结果显示，在胶质瘤中robo1的表达与正常脑组织相比明显升高，而且在胶质瘤患者中robo1表达量高者生存期明显缩短。荧光素酶报告基因实验确认mir-588与robo1的直接靶点关系。westernblot实验证实mir-588能抑制robo1的表达，同时也抑制了侵袭迁移及vm标记物mmp2和mmp9的表达。进一步的细胞实验确认敲除robo1后胶质瘤细胞的侵袭迁移及vm形成能力下降，同时mir-588inhibitor的促侵袭迁移能力也被抑制。因此考虑mir-588的作用机制为在低氧环境下，mir-588直接结合3’-utr区下调robo1表达，降低mmp2和mmp9的表达，从而抑制了细胞的侵袭迁移及vm形成能力，mir-588是一种低氧诱导的肿瘤抑制因子，可以拮抗低氧条件下产生的促侵袭作用。

有鉴于此，本发明一个具体实施方式中，提供如下任意一种或多种物质在制备胶质瘤分子标记物中的应用，所述物质包括mir-588、robo1基因及其表达产物、mmp2基因及其表达产物和mmp9基因及其表达产物。

进一步的，所述应用中，所述标记物用于诊断、检测、监测或预测胶质瘤的进展。

所述胶质瘤的进展包括胶质瘤细胞的迁移、侵袭和/或血管拟态形成；

其中，所述mir-588、robo1基因及其表达产物、mmp2基因及其表达产物、mmp9基因及其表达产物均可为人源。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种用于诊断、检测、监测或预测胶质瘤的进展的组合物，其包含基于高通量测序方法和/或基于定量pcr方法和/或基于探针杂交方法检测胶质瘤样品中mir-588、robo1基因及其表达产物、mmp2基因及其表达产物和/或mmp9基因及其表达产物；或者基于免疫检测方法检测胶质瘤样品中mir-588调控的靶基因的表达情况、robo1表达产物情况、mmp2蛋白表达情况和/或mmp9表达产物情况的物质。

其中，所述mir-588调控的靶基因包括robo1基因；

本发明的又一具体实施方式中，采用液相杂交、northern杂交方法、mirna表达谱芯片、核酶保护分析技术、rake法、原位杂交检测胶质瘤样品中mir-588、robo1、mmp2和/或mmp9的转录；采用elisa、胶体金检测、蛋白芯片检测胶质瘤样品中mir-588调控的靶基因的表达情况、robo1表达产物情况、mmp2蛋白表达情况和/或mmp9表达产物情况；

本发明的又一具体实施方式中，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包括用于诊断、检测、监测或预测胶质瘤的进展的组合物；

所述胶质瘤的进展包括胶质瘤细胞的迁移、侵袭和/或血管拟态(vasculogenicmimicry,vm)形成。

本发明的又一具体实施方式中，提供能够促进mir-588表达和/或活性提高的物质、抑制robo1基因及其表达产物和/或活性降低的物质、抑制mmp2基因及其表达产物和/或活性降低的物质、和/或抑制mmp9基因及其表达产物和/或活性降低的物质在如下(i)-(iii)至少一种中的应用：

(i)抑制胶质瘤细胞的迁移，或制备用于抑制胶质瘤细胞迁移的产品；

(ii)抑制胶质瘤细胞的侵袭，或者制备用于抑制胶质瘤细胞侵袭的产品；

(iii)抑制胶质瘤细胞的血管拟态，或者制备用于抑制胶质瘤细胞生长的产品。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种用于治疗或预防胶质瘤的药物组合物，其包含促进mir-588表达和/或活性提高的物质、抑制robo1基因及其表达产物和/或活性降低的物质、抑制mmp2基因及其表达产物和/或活性降低的物质、和/或抑制mmp9基因及其表达产物和/或活性降低的物质；

所述促进mir-588表达和/或活性提高的物质，包括采用基于rna的microrna功能性获得技术和/或基因特异性mirmimics技术上调mir-let-7i-5p表达和/或促进其活性；进一步优选为人工合成的mir-588短发夹rna(shorthairpinrna，shrna)或上调mir-588表达的启动子。

所述抑制robo1基因及其表达产物和/或活性降低的物质，包括robo1蛋白特异的抗体、针对robo1mrna的rna干扰分子或反义寡核苷酸、小分子抑制剂、sirna；进一步的，所述抗体为人抗体。

所述抑制mmp2基因及其表达产物和/或活性降低的物质，包括mmp2蛋白特异的抗体、针对mmp2mrna的rna干扰分子或反义寡核苷酸、小分子抑制剂、sirna；进一步的，所述抗体为人抗体。

所述抑制mmp9基因及其表达产物和/或活性降低的物质，包括mmp9蛋白特异的抗体、针对mmp9mrna的rna干扰分子或反义寡核苷酸、小分子抑制剂、sirna；进一步的，所述抗体为人抗体。

在本发明中，“治疗或预防”指的是能够抑制胶质瘤细胞的迁移、侵袭和/或血管拟态。

本发明的又一具体实施方式中，所述药物组合物还可以包含通常使用的适量载体、赋形剂及稀释剂。而且，根据通常的方法，可以制作成粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、喷雾剂等的口服剂、外用剂、栓剂及无菌注射溶液形式的剂型使用。

本发明的又一具体实施方式中，可以包含的载体、赋形剂及稀释剂有乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油等。将所述组合物制剂化时，使用常用的填料、增量剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、表面活性剂等的稀释剂或赋形剂而制造。口服固体制剂包含片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂等，这种固体制剂是在所述组合物中混合至少一种以上的赋形剂，例如淀粉、碳酸钙(calciumcarbonate)、蔗糖、乳糖、明胶等而制造。而且，除了简单的赋形剂以外，也使用如硬脂酸镁、滑石粉等润滑剂。口服液相制剂有混悬剂、液剂、乳剂、糖浆剂等，除了常用的简单稀释剂，例如水、液状石蜡以外，可以包含多种赋形剂，例如湿润剂、甜味剂、芳香剂、保存剂等。非口服制剂包含无菌水溶液、非水溶剂、悬浮剂、乳剂、冻干制剂、栓剂。非水溶剂、悬浮剂可以使用丙二醇(propyleneglycol)，聚乙二醇，像橄榄油的植物油，像醋酸乙酯的可注射酯等。栓剂基质可以使用witepsol、聚乙二醇、吐温(tween)61、可可脂、月桂精脂、甘油明胶等。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。另外，实施例中未详细说明的分子生物学方法均为本领域常规的方法，具体操作可参看分子生物指南或产品说明书。

实施例

一、实验材料

人胶质瘤细胞株u251、u87、a172购自中国科学院细胞库，分级标准为iv级，贴壁生长。dmem完全培养基购于gibco公司，细胞培养瓶及培养板购于corning公司，胰蛋白酶购于invitrogen公司，胎牛血清购于hyclone公司，双抗购于sigma公司，pbs干粉购于上海歌凡生物，trizol购于takara公司，全基因表达谱芯片及全microrna表达芯片由上海康成生物有限公司代购并委托检测，rt-qpcr试剂盒购于takara公司，ripa裂解液、5×sds-page上样缓冲液、tris-hcl配胶套装及一抗稀释液购于碧云天公司，蛋白酶抑制剂、tris、sds、甘氨酸、tween20、lipofectamine2000购于sigma公司，0.45μmpvdf膜及western发光试剂盒购于millipore公司，micrornamimics及inhibitor购于上海博尚生物，mir-588稳转慢病毒及荧光素酶报告基因质粒由上海博尚生物合成。

二、实验方法

1、细胞常氧与低氧培养

胶质瘤细胞株u251、u87、a172常规培养于5％co2、37℃细胞培养箱中，并选取状态良好的细胞，在低氧培养箱(5％co2、1％o2、37℃)中培养。

2、mrna提取与rt-qpcr

培养的胶质瘤细胞制备悬液，离心后留取沉淀，加入1mltrizol，室温裂解5min。加入200μl氯仿，室温静置2min，离心15min，去上层水相400μl至新ep管中。加入400μl异丙醇，静置20min。离心15min，弃上清留底部mrna的白色沉淀，并用乙醇洗涤沉淀后，离心5min。弃去上清，倒扣ep管，干燥沉淀后depc水溶解mrna，nanodrop测浓度。将样品使用takara的rt-pcr试剂盒进行cdna逆转录。反应条件为30℃10min，42℃30min，99℃5min，5℃5min。micrornas的rt-pcr体系中还需加入特异性的mir-rt引物0.5μl，代替0.5μl的双蒸水。然后使用sybrgreenpcrmastermix试剂盒进行实时定量荧光pcr体系配制，反应条件为95℃激活5min，95℃变性10s，60℃退火20s，72℃延伸20s，循环30-35次，溶解曲线为95℃5s，65℃1min，97℃-40℃冷却10s。反应结束后，罗氏实时荧光定量pcr仪自动生成报告，并将结果导出，计算结果。

3、mir-588mimics和inhibitor瞬时转染

将状态良好的胶质瘤细胞均匀接种于6孔板中，培养12h。首先配制lipo混合液，然后配microrna转染剂混合液，每孔2ml无血清培养基加4μg的micrornainhibitor或mimics，均匀混合后加入lipo3000混合液中，静置15min。吸除原培养基，pbs冲洗，加入配置好的转染混合液2ml/孔。37℃培养箱中孵育6小时，更换新鲜含血清的完全dmem培养基，继续培养24小时后进行后续实验。

4、蛋白提取与westernblot

细胞蛋白提取

将培养至1×10⁷/孔细胞的六孔板，pbs洗3遍，细胞刮子刮下细胞，离心收集细胞。使用专用western细胞裂解液500μl冰上裂解15～30min。离心10min。吸取400μl上清液。加入5×上样缓冲液适量，于沸水中变性10分钟，冷却后检测。

sds-page凝胶电泳

配胶架上配制凝胶，凝固后，微量加样器上样，80v恒压电泳1.5小时左右，待目的蛋白条带分离明显时停止。取下凝胶，置于转膜液中，依次放置海绵、滤纸、凝胶条、pvdf膜、滤纸、海绵固定。200ma恒流进行转膜。摇床上tbst溶液洗膜，封闭液中封闭1小时。tbst洗涤，将pvdf膜在一抗工作液中4℃孵育过夜。tbst溶液洗膜后孵育二抗工作液，室温摇床30min。tbst溶液洗膜。hrp发光法显色，bio-rad红外线成像系统扫描pvdf膜，保存并导出图像。

5、划痕实验

收集生长状态良好的胶质瘤细胞接种于六孔板中，培养至细胞融合度70％左右，更换无血清培养基进行12h饥饿预处理。使用无菌10μl枪头每孔划痕3条。加入无血清培养基在倒置显微镜下拍照(记为0h)。然后12h、24h、36h等时间点进行拍照，观察细胞迁移融合度。imageg软件计算融合度。

6、transwell实验

收集生长状态良好的胶质瘤细胞接种于六孔板中，培养并处理后消化重悬细胞并计数，调整至相同细胞浓度。将每组细胞悬液200μl加入transwell小室上室中，下室使用600μl含20％胎牛血清的完全培养基进行趋化。培养12h后取上室膜，4％甲醇固定10min，伊红染色15min，棉签拭去顶面细胞后，置于载玻片上观察拍照。

matrigel基质胶侵袭实验则是在上述transwell实验基础上将小室预先用matrigel基质胶包被。稀释好的matrigel基质胶100μl，均匀铺于小室底部，37℃培养箱内凝固30min后，用于实验。

7、vm形成实验

取预冷的96孔板每孔加入50μlmatrigel基质胶，然后于5％co2，37℃培养箱中放置30分钟，使基质胶再次凝固。消化处理各组试验细胞并重悬制成单细胞混悬液，每孔内接种100μl，置于37℃常氧或低氧培养箱中继续培养。在培养2h、4h、6h、8h、10h、12h时间点观察各试验组细胞的vm形成情况和完整程度。于每孔各区随机选取视野拍照，并计数成管数目，每组实验重复3次。兙

8、荧光素酶报告基因实验

根据选取的靶基因名称和位点，在pubmed数据库中查询其3’-utr区域的基因序列，找到具体的mir互补结合位点，合成带有野生型3’-utr序列的荧光素酶报告基因质粒(wt)，以及将mir互补结合位点进行突变后的突变型3’-utr序列的荧光素酶报告基因质粒(mut)。进行野生型和突变型荧光素酶报告基因质粒和micrornamimics的共转染。使用6孔板共转染48小时后，pbs冲洗，使用1×plb裂解缓冲液进行室温下细胞裂解30分钟，然后加入100μl的stopbuffer终止裂解。加入96孔酶标板中，向各孔中的样品加入100μl的luciferaseassaysreagentii，充分摇匀，同时设置1×plb裂解缓冲液为空白对照孔，使用酶标仪检测。荧光检测参数设为：测定时间10s，测定间隔为2s。激发光波长480nm，检测560nm波长处的荧光强度，进行数据统计和计算。

三、统计学方法

所有实验均重复3次以上，所有数据均采用均数±标准差来表示。数据分析使用spss17.0进行，统计图绘制使用graphpadprism5.0完成。体外实验中两组实验数据用双侧studentt检验，多组数据采用非配对的kruskal-wallis检验。体内实验两组间比较使用mannwhitneyu检验。生存分析使用kaplan-meier函数和log-rank秩和检验。使用one-wayanovas进行多组比较。pearson’s相关分析(数量资料)和spearman’s相关分析(等级资料)用于分析两组间的相关性。所有数据*p<0.05,**p<0.01认为有统计学意义。

四、结果

1、对低氧状态下胶质瘤细胞系中不同表达量的mir及分别在常氧、低氧状态下培养的胶质瘤细胞中mir-588表达的差异的分析

因为低氧是胶质瘤患者低生存期的独立预后因素，利用mir微阵列芯片全通量筛选了低氧和常氧下胶质瘤细胞u251的全基因组mirs，来研究低氧诱导的mir的表，然后确定了一些低氧条件下表达明显上调的mirs。芯片分析结果显示84个mirs表达有显著差异。其中上调最高的mir-210已经被证实为低氧mir标记物，mir-588为前十个上调最高的mir之一。实验验证了mir-1207、mir-597等8个低氧下上调较高的mir，其中mir-588表现出明显抑制胶质瘤侵袭迁移的能力。利用火山图分析芯片实验数据，显示mir-588在低氧状态下显著上调。在实验中应用nc、mir-588mimics和mir-588inhibitor。nc为阴性对照rna，mimics是合成的双链rna分子，可以模拟内源性mir的功能，转染后起到过表达相关rna的作用。mirinhibitor是人工合成的单股rna分子，能通过不可逆的连接起阻断功能而妨碍相关mir的功能，起敲除mir-588的作用。首先应用rt-qpcr技术验证了nc、mir-588mimics、mir-588inhibitor在胶质瘤细胞系中的转染效率，结果显示转染nc后mir-588的表达没有影响，转染mimics可以明显提高mir-588的表达，转染inhibitor明显抑制了mir-588的表达。随后，再次应用rt-qpcr技术检验在常氧及不同时长低氧状态下u251和u87中mir-588的表达水平，发现在低氧状态下mir-588表达较常氧状态下明显上调，且低氧培养约24小时的胶质瘤细胞的mir-588表达为最高峰。

为观察转染对细胞活性的影响，进行了cck8实验验证，实验结果显示转染nc、mir-588mimics、mir-588inhibitor的胶质瘤细胞活性无显著性差异，说明瞬转80nmmimics和inhibitor能显著调控内源性mir-588表达，同时不影响细胞活力。

2、mir-588抑制胶质瘤细胞的侵袭迁移及vm形成能力。mir-588敲除增强胶质瘤细胞的侵袭迁移及vm形成能力，并能增强低氧诱导的侵袭迁移。mir-588过表达抑制胶质瘤细胞的侵袭迁移及vm形成能力。

为研究mir-588的上调和下调是否能够调控低氧诱导的胶质瘤细胞的迁移侵袭及vm形成，在试验中应用了瞬转nc、mir-588mimics、mir-588inhibitor的u87、u251和a172胶质瘤细胞系。为探究mir-588对胶质瘤细胞迁移的影响，进行了a172和u251细胞系的划痕实验。在实验中观察到几个有趣的现象。首先，结果显示低氧培养条件下细胞的迁移能力明显增强，这与预期结果一致。其次，可以观察到mir-588明显抑制胶质瘤细胞的迁移能力，同时也明显拮抗低氧诱导的促迁移效果。敲除mir-588的胶质瘤细胞则表现出迁移能力的明显提升，在低氧状态下培养则更加促进了细胞的迁移。mir-588表达水平及培养箱内氧气水平都能调控胶质瘤细胞迁移能力，并且这种调控效果可以互相影响。

为进一步研究mir-588对胶质瘤细胞迁移和侵袭能力的影响，应用u87和a172细胞系进行transwell实验。u87细胞穿过聚碳酸酯膜的能力明显较a172细胞强，多次重复试验发现，u87细胞在transwell小室中培养6小时进行固定染色，a172细胞则在20小时进行固定染色。这两种细胞系的实验结果是一致的。与对照组相比，mir-588显著抑制胶质瘤细胞的穿膜迁移能力，mir-588inhibitor则显著增强了细胞的迁移能力。同时，低氧促进胶质瘤细胞的穿膜迁移活动。随后，应用matrigel胶铺在小室中进行胶质瘤细胞侵袭能力的观察，结果与迁移实验的结果相似。这说明mir-588能显著抑制胶质瘤细胞的侵袭迁移能力，并能同时拮抗低氧诱导的促侵袭迁移能力，而敲除了mir-588之后，胶质瘤细胞的侵袭迁移能力得到明显的增强。

应用u87和a172细胞系在matrigel胶中培养进行vm形成实验观察。实验中，胶质瘤细胞首先聚集并伸出突起连接，随后形成管状结构即vm，一段时间后管状结构崩解。实验结果显示低氧状态下vm形成速度更快，形成的管状结构更多。与对照组相比，过表达mir-588明显抑制了vm形成的速度和管状结构数量，对低氧导致的促vm形成有拮抗作用。敲除mir-588细胞的vm形成能力明显提高。这些结果显示，vm形成与细胞的侵袭迁移能力具有一致性，mir-588能明显抑制胶质瘤细胞的vm形成能力。

3、robo1是mir-588抑制胶质瘤细胞侵袭迁移及vm形成能力方面的下游关键基因。

为探究mir-588调控胶质瘤细胞的侵袭迁移及vm形成能力的机制，寻找其下游关键靶点基因。筛选出robo1，相关的预测结果显示robo1的3’-utr区存在mir-588的直接结合靶点。robo1是一种保守跨膜受体蛋白，主要在神经系统表达。分析tcga数据库的结果显示，在胶质瘤中robo1的表达与正常脑组织相比明显升高，而且在胶质瘤患者中robo1表达量高者生存期明显缩短。这些说明在胶质瘤中robo1起促癌作用。rt-qpcr实验显示转染mir-588mimics后，robo1表达明显下调，敲除mir-588可诱导robo1表达。为检验蛋白水平的mir-588的抑制效果，mir-588的mimics和inhibitor转染后48小时提取蛋白进行westernblot实验，实验结果显示过表达mir-588可以减少robo1的表达，反之，敲除mir-588则增加robo1的表达，这说明mir-588可以调控robo1的表达，并与之呈负相关。为明确mir-588与robo1的直接靶点关系，进行荧光素酶报告基因实验，结果显示相比于对照组，细胞转染mir-588后荧光素酶活性降低至约61.3％，说明在胶质瘤细胞中robo1被mir-588直接调控。

在westernblot实验中，还可以观察到在u87和a172细胞系中，过表达mir-588抑制mmp2和mmp9的表达，mmp2与胶质瘤细胞的侵袭迁移能力呈正相关，mmp9与细胞的侵袭迁移和vm形成相关，这部分说明了mir-588抑制胶质瘤细胞侵袭迁移及vm形成能力的机制。为进一步研究敲除robo1后mmp2和mmp9的变化，用慢病毒装载的nc、mir-588mimics、mir-588inhibitor稳定转染u87细胞。robo1的sirna转染稳转后的u87细胞，提取蛋白与对照组相比，robo1的表达明显降低，说明robo1-sirna的敲除效率满意。同时在westernblot实验结果证实敲除robo1后，mmp2和mmp9的表达同时降低，说明robo1表达的下降抑制mmp2和mmp9的表达，从而影响胶质瘤细胞的侵袭迁移和vm形成能力，部分说明了mir-588调控胶质瘤侵袭迁移及vm形成的机制。

为验证robo1在胶质瘤细胞侵袭迁移及vm形成中的作用，用robo1-sirna转染稳定转染nc、mir-588mimics、mir-588inhibitor的u87胶质瘤细胞，并以此进行划痕、transwell及vm形成实验，并以未敲除robo1的细胞作为对照组。划痕实验结果显示与对照组相比，敲除robo1后胶质瘤细胞迁移能力明显下降，稳转mir-588mimics的细胞在敲除robo1后，细胞迁移的能力降至最低。稳转mir-588inhibitor的细胞在敲除robo1后，细胞迁移能力与nc相仿，较未敲除robo1的对照组细胞明显下降。

在随后的transwell实验中，得到同样的结论，敲除robo1明显抑制了胶质瘤细胞的迁移能力。同时进行侵袭实验，实验结果与迁移实验一致，敲除robo1同样也抑制了胶质瘤细胞的侵袭能力。实验结果说明robo1明显促进胶质瘤细胞的侵袭迁移，敲除robo1能够增强mir-588的抑制胶质瘤细胞侵袭迁移的能力。robo1作为mir-588的下游靶点，mir-588通过抑制robo1的表达发挥抑癌作用。

为明确robo1在胶质瘤细胞vm形成中的作用，使用转染robo1sirna的胶质瘤细胞进行vm形成实验。实验结果显示敲除robo1细胞的vm形成的管状结构较对照组明显减少，形成时间延迟，说明vm形成能力显著下降，这说明robo1在胶质瘤细胞的vm形成中也起到重要作用，这与侵袭迁移的结果一致。

综上，本实施例阐述了一种靶向robo1抑制胶质瘤侵袭迁移及vm形成的microrna，mir-588，并表明mir-588可作为一种胶质瘤的生物标记物，同时也是一个恶性胶质瘤潜在的治疗靶点。

应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。