利用结合HTRF技术的甲基转移酶通用酶活分析法筛选抑制剂/激动剂的方法与流程

本发明属于抑制剂/激动剂的筛选领域，具体涉及一种利用结合htrf技术的甲基转移酶通用酶活分析法筛选抑制剂/激动剂的方法。

背景技术：

基因的表达和转录对于各种各样的细胞进程都密切相关，其调控机制包括受dna序列和转录因子影响的转录及转录前调控，以及转录后水平的表观遗传的调控。表观遗传的调控有多种途径，包括dna甲基化、核小体重塑组蛋白变体和组蛋白的翻译后修饰。直接参与组蛋白翻译后修饰的蛋白可分为三类：产生这些修饰的酶、识别修饰的蛋白以及去除修饰的酶。组蛋白的翻译后修饰包括甲基化、乙酰化、磷酸化、类泛素化、泛素化和糖基化等。由于表观遗传调控在细胞分化、增殖、发展和维持细胞形态等重要细胞进程中都能发挥十分关键的作用，因此已成为目前非常热门的研究领域。甲基化修饰作为表观遗传调控重要的组成部分之一，已成为科研人员和新药研发领域关注和研究的重点。由蛋白甲基转移酶(proteinmethyltransferases，pmts)和去甲基化酶(demethylases，kdms)引起的组蛋白转录后修饰，在调节基因表达和转录发挥重要作用，并且它与癌症和其他多种疾病密切相关。此外，这类酶中很大一部分还会靶向组蛋白以外的其他蛋白，从而参与并影响多种重要生理途径。上述特性使它们在人类疾病中发挥关键的生物学功能和影响。除了组蛋白能被甲基化之外，dna、rna、糖类和小分子代谢物都能在甲基转移酶和去甲基化酶的作用下进行甲基化修饰，从而对生物进程发挥一系列影响。因此，甲基转移酶和去甲基化酶已经成为目前药物研发领域十分热门的潜在治疗靶点之一。

s-腺苷甲硫氨酸(s-adenosyl-methionine,sam)是甲硫氨酸的活性形式，在生物体内各种代谢过程中起重要作用，参与人体内100多种不同甲基转移酶的催化作用，并且与多种酶的活性密切相关。在甲基转移酶催化作用中，sam可作为甲基供体，在酶催化下将甲基转移到相应底物(组蛋白、多肽、核小体、dna、ran等)上，随后生成副产物s-腺苷高半胱氨酸(s-adenosyl-l-homocysteine，sah)。甲基转移酶通用酶活评价分析方法就是利用这一特性，通过检测sah的含量变化，从而评估催发反应中酶的活力和反应效率等，进而筛选有效抑制剂。因此，凡是在催化反应中生成sah的甲基转移酶均可使用此方法进行检测并筛选抑制剂或激动剂。

目前，常用的筛选甲基转移酶抑制剂的方法是elisa。

elisa，即酶联免疫吸附实验，将抗sah的抗体包被在高吸附的96孔检测板中，孵育过夜后洗掉多余抗体，加入待测样品(甲基转移酶反应后)，孵育后再次洗掉多余未结合样品，然后加入标记有hrp(辣根过氧化物酶)的抗sah的抗体，第三次孵育并洗涤，最后加入hrp的显色试剂，反应一定时间后在酶标仪下读数。根据信号判断样品中sah的相对含量，从而评估抑制剂对甲基转移酶反应的抑制效果。

elisa作为传统的方法，存在一些难以克服的缺点，如：1)实验步骤多，耗时长,需要经过多次洗板、加样、显色等，至少需要一天的时间；2)无法达到高通量，难以解决药物选样品多的难题；3)因操作步骤繁多易产生实验误差，以致结果重复性差、不稳定。

技术实现要素：

为克服现有技术的不足，本发明提供了结合htrf技术的甲基转移酶通用分析方法，用于筛选其抑制剂。通过本发明，可实现简单快速筛选酶的抑制剂，且能检测所有产物为sah的酶，对于反应底物也不受限制，为快速高效的筛选甲基转移酶抑制剂提供了一种通用便捷的方法。

利用htrf技术同时检测多个细胞因子的方法，该方法包括如下步骤：

步骤一，配制待检测的酶、反应底物、sam、htrfdonor的anti-sahantibody和偶联htrfacceptor的sah；

步骤二，对待测样品进行系列浓度梯度稀释或固定浓度稀释；

步骤三，在微型板中依次加入酶、待测样品、底物和sam，反应一段时间；

步骤四，加入检测缓冲液，室温孵育10分钟；

步骤五，加入htrfdonor的anti-sahantibody和偶联htrfacceptor的sah，室温孵育1小时；

步骤六，进行htrf读值与数据处理分析，计算样品ic50或抑制率。

进一步，所述酶为甲基转移酶，不同的甲基转移酶，对应不同的反应体系。

进一步，所述微型板包括96孔版和384孔板。

进一步，在步骤一中，所述待检测的酶包括甲基转移酶或其他产物为sah的酶。

进一步，在步骤一中，所述反应底物与待检测酶相对应。

结合htrf技术的甲基转移酶通用分析法的特点如下：

1)通量高，易小型化：384孔板操作；

2)信号稳定，可连续多次检测，重复性好；

3)均相的、非放射性的检测形式；

4)可检测所有产物为sah的酶；

5)反应底物包括组蛋白、多肽、核小体、dna、rna、小分子等；

6)既可以筛选甲基转移酶抑制剂也可筛选激动剂、反向激动剂。

本发明的优点在于：与传统方法elisa相比，结合htrf技术的甲基转移酶通用分析法的优势如下：

1)在一块微型板中同时完成了酶反应和检测，无需转板操作，简单方便；

2)适用于所有抑制剂、激动剂或反向激动剂的筛选，无论是抗体、蛋白、多肽、小分子化合物或复合分子均可检测；

3)减小了背景信号的影响，误差更小，信号稳定可靠，可重复性高；

4)大大节省了实验工作量和实验时间：实验操作从原来的包被、封闭、多次洗板，到现在的只需加入样品和检测试剂，实验时间由原来的1天时间缩短到1-2个小时；

5)极大提高了实验的通量：由原来elisa的96孔，提高到384孔甚至1536孔，从而实现在短时间内进行大批量样品筛选。

附图说明

图1为本发明提供的甲基转移酶活分析方法原理示意图。

图2为本发明提供的甲基转移酶通用分析法筛选抑制剂/激动剂的主要步骤和反应体系示意图。

图3为本发明提供的酶浓度优化结果示意图。

图4为本发明提供的底物和sam浓度优化结果示意图。

图5为本发明提供的待测样品检测浓度优化(以抑制剂为例)结果示意图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

在本实施例中，htrf是均相时间分辨荧光技术的简称，是对tr-fret技术的进一步改良。htrf基于时间分辨荧光(trf)其和荧光共振能量转移(fret)两大技术。trf利用稀土元素半衰期长的特性(毫秒级，较普通荧光纳秒级，有6个数量级差异)。所以可以通过延迟50-100微秒排除背景。fret利用两种荧光基团的能量转移，这两种荧光基团分别称为能量供体(donor)和能量受体(acceptor)。donor被外来光源激发，如果它与acceptor接近，可将能量共振转移到acceptor上，使其受到激发，发射出特定波长665nm的发射光。较传统tr-fret的能量供体包裹在螯合物中，htrf的荧光能量的两种donor——铕(eu3+cryptate)和铽(lumi4^tmtb)，它们被永久地嵌合在穴状化合物中，更加灵敏和稳定。铕和铽受激光激发后，其发射波谱在620nm处有一波峰。acceptor也有两种，一种是apc铰链复合体，商业名称为xl665，另一种是d2，为小分子化合物，分子量约1kd。xl665和d2的激发光与donor的发射光有一定重叠，其受激后会在665nm处形成一特异波峰。因此信噪比高，均一性好。通过计算665nm/620nm比值的方式，排除了系统背景的影响，使结果更准确。

本发明所述甲基转移酶活分析方法，是一种通用的生化分析法，可用于检测所有产物为sah的酶(不仅限于甲基转移酶)，并且反应底物不仅限于蛋白。它是一种通用的检测反应体系中sah相对含量的方法，融合了htrf和传统酶催化反应技术。此分析方法主要包括两个步骤：酶反应和通用检测步骤，原理如图1所示。在酶反应步骤中，酶与待测样品(小分子化合物)共同孵育，随后添加甲基供体sam起始酶催化反应，从而使甲基转移到底物上并生成sah。若待测样品对酶有抑制作用，则产生的sah随之减少。在检测步骤中，应用竞争性免疫分析法和htrf技术，使用带donor的anti-sahantibody检测反应生成的sah和添加的带有acceptor的sah之间的比例，最后所获得的htrf信号值即可反应sah的浓度，从而评估化合物对酶的抑制作用。

如图2所示，利用htrf技术同时检测多个细胞因子的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

配制待检测的酶、反应底物、sam、htrfdonor的anti-sahantibody和偶联htrfacceptor的sah；

对待测样品进行系列浓度梯度稀释或固定浓度稀释；

在微型板中依次加入酶、待测样品、底物和sam，反应一段时间；

加入检测缓冲液，室温孵育10分钟；

加入htrfdonor的anti-sahantibody和偶联htrfacceptor的sah，室温孵育1小时；

进行htrf读值与数据处理分析，计算样品ic50或抑制率。

作为优选而非限定，所述酶为甲基转移酶，不同的甲基转移酶，对应不同的反应体系。

作为优选而非限定，所述微型板包括96孔版和384孔板。

作为优选而非限定，所述待检测的酶包括甲基转移酶或其他产物为sah的酶。

作为优选而非限定，所述反应底物与待检测酶相对应。

在本发明中，常规的甲基转移酶通用分析法反应条件的优化步骤如下(以dot1l为例)：

(一)酶浓度优化

如图3所示，设置反应缓冲液成分、反应时间、反应温度、sam和底物浓度。对dot1l酶进行系列浓度梯度稀释：500nm-0.02nm(1/3连续稀释)，sam浓度为2μm，底物核小体浓度为10ng/μl，酶反应条件为30℃2小时；同时检测sam/sah标准曲线。所得结果如图3所示。

阴性对照：反应体系中只加sam或底物；用于检验信号的下降是由于酶反应产生的。

标准曲线：sam最高浓度与酶反应体系相同，使用相同的酶反应缓冲液；检验试剂和信号线性度。

后续实验酶浓度选择：选择ec80-ec100之间的酶浓度，根据上述结果可选择dot1l浓度4.6nm。综合考虑signal/background、信号线性度、避免酶过饱和等情况进行选择。

(二)底物和sam浓度优化

如图4所示，反应缓冲液成分、反应时间、反应温度与酶浓度优化保持一致，使用根据上述结果选出的酶浓度，即4.6nm。对底物进行系列浓度梯度稀释：设置尽可能大的检测范围，根据底物的不同而有所变化。sam浓度选择km附近的值或酶浓度优化中最佳反应条件决定。具体结果如图4所示。根据上述结果，可选择ec80-ec100之间的底物浓度(77nm)和sam浓度为0.5μm(已报道的km为0.67μm)用于后续实验条件设置。

(三)待测样品检测浓度优化(以抑制剂为例)

根据以上步骤中的结果设置反应缓冲液成分、反应时间、反应温度、酶浓度、sam和底物浓度。对抑制剂进行系列浓度梯度稀释：初步筛选时，设置尽可能大的检测范围。具体结果如图5所示。

阴性对照：反应体系中不加酶；用于检测化合物抑制剂本身对检测体系是否产生干扰。通过结果可以计算出抑制剂对于dot1l的ic50，由此来评估和筛选能特异性抑制dot1l酶的抑制剂。

以上仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。