miRNA-6761-5p及其新用途的制作方法

本发明涉及分子生物学领域，更具体的涉及mir-6761-5p及其在制备区别左半结肠癌和右半结肠癌诊断制剂中的应用。
背景技术：
：结肠分为右半结肠和左半结肠，二者以脾曲为界，前者包括回盲部、升结肠、结肠肝曲、横结肠；后者由结肠脾曲、降结肠、乙状结肠组成。nccn指南2017版明确医学界对左右半结肠癌的主流观点，即左、右半结肠胚胎起源不同，两者在生理功能、形态及代谢等方面存在差异，导致肿瘤在发病机制、病理特点、临床特征、转移规律、对治疗的反应以预后等方面不同。因此，针对左、右半结肠癌的临床及病理特征等方面的比较分析是很有必要的，尤其是能够区分二者的分子标志物，对指导临床不同发病部位的结肠癌的防治将起到重要作用。micrornas(mirna)是一类短小(长度约为22个核苷酸)的非编码rna分子，通过破坏mrna的稳定结构或通过抑制翻译调节基因的表达而发挥作用。已有研究表明mirna在结肠癌的发生发展中起到非常重要的作用：血清中mir-720、mir-484可用于结肠癌分期及早期诊断；mir-93可能通过pi3k/akt信号通路参与结肠癌发生发展的过程；专利zl2014101918129、cn2016106181508、cn201610620059x均揭示mirna和结肠癌的相关性，但是，目前少有研究聚焦在mirna和左右半结肠癌的相关性。本研究中，申请人通过整合tcga数据库中高通量测序数据，并运用生物信息学方法进行分析，发现能够区别左半结肠癌和右半结肠癌潜在靶点mir-6761-5p，现有研究报道过mir-6761-5p与黑色素瘤相关，但是没有研究表明其与消化道肿瘤的关系。申请人通过荧光定量pcr实验结果进行了验证，表明mir-6761-5p在左半结肠癌中表达显著。本发明为临床发现潜在的区别左右半结肠癌分子标志物奠定基础。技术实现要素：本发明的目的在于提供mir-6761-5p和/或其前体在制备结肠癌诊断试剂中的应用。所述mir-6761-5p序列见序列表seqidno1，其前体mir-6761序列见序列表seqidno2。进一步，结肠癌为左半结肠癌或右半结肠癌。mir-6761-5p和/或其前体在左半结肠癌中高表达。优选的，结肠癌为左半结肠腺癌或右半结肠腺癌。右半结肠癌包括发生在回盲部、升结肠、结肠肝曲、横结肠的癌变；左半结肠癌包括发展在结肠脾曲、降结肠、乙状结肠的癌变。进一步，结肠癌诊断试剂采用高通量测序方法和/或定量pcr方法和/或基于探针杂交方法检测样本中mirna和/或其前体的转录。优选采用northern杂交方法、mirna表达谱芯片、核酶保护分析技术、rake法、原位杂交、基于微球的流式细胞术检测样本中mirna和/或其前体的转录。优选的，所述的用于定量pcr方法包括特异性扩增mirna和/或其前体的引物；所述的基于探针杂交方法包括与mirna和/或其前体的核酸序列杂交的探针。进一步，扩增mir-6761-5p的引物为序列seqidno3。本发明的目的在于提供一种结肠癌诊断试剂，所述结肠癌诊断试剂检测样本中mir-6761-5p和/或其前体的转录情况。所述的样本为癌组织或外周血。优选的，结肠癌为左半结肠癌或右半结肠癌。mir-6761-5p和/或其前体高表达的样本为左半结肠癌。更优选的，结肠癌为左半结肠腺癌或右半结肠腺癌。定义：现阶段检测mirna的表达水平的方法主要包括基于高通量测序技术、基于核苷酸杂交和基于pcr的mirna检测方法。基于探针杂交技术的mirna检测方法是一种直接检测法，不需要对样本rna进行预扩增，包括northern杂交方法、mirna表达谱芯片、核酶保护分析技术、rake法、原位杂交、基于微球的流式细胞术等技术。(1)northern杂交又称rna印迹技术为最经典的检测真核生物rna大小，估计其丰度的实验方法。基本原理如下：首先在载体(如硅片、微球或膜等)上固定mirna样本，再与经过标记的探针杂交，洗涤多余的杂交探针后进行信号检测；也可以在载体上先固定与靶mirna序列互补的dna探针，然后与经过标记的样本mirna杂交，再进行信号检测。信号标记的方法包括同位素标记、荧光标记和纳米金标记等。(2)mirna表达谱芯片原理同样是使用标记探针检测固相支持物上的目标分子。通过设计芯片上mirna基因及内参序列，可精确分析出样品中相应mirna的表达水平。基因芯片具有高通量的优点，可以一次在同一样本中检测出几百个基因的全部表达。luminex公司研制的液相芯片(liquidchip)又称多功能悬浮点阵(multianalytesuspensionarray，masa)，是出的新一代生物芯片技术。液相芯片体系由许多小球体为主要基质构成，每种小球体上固定有不同的探针分子，为了区分不同的探针，每一种用于标记探针的球形基质都带有一个独特的色彩编号，将这些小球体悬浮于一个液相体系中，就构成了液相芯片系统。该系统可以对同一个微量样本中的多个不同分子同时进行快速的定性、定量分析，这种检测技术被称为fmap(flexiblemultianalyteprofiling)技术。分子杂交在悬浮溶液中进行，检测速度极快。(3)核酶保护分析技术(rpa)mirna的检测还可以采用核酶保护分析技术，将标记好的探针和待测rna样本混合，热变性后杂交，未杂交的rna和多余的探针用单链核酸酶消化，热失活核酸酶后纯化受保护的rna分子，最后通过变性page电泳分离探针，显色。这种基于液相杂交的新方法简单快速，灵敏度高，但也只能用于分析已知mirna。(4)rake法rake法(rnaprimedarraybasedklenowemzyme)是在mirnamicroarray的基础上利用dna聚合酶i的klenow片段，使mirna与固定的dna探针杂交的方法。rake可以敏感特异地检测mirna，适用于大量快速的筛选所有己知的mirna。能够在特定的细胞中检测mirna表达谱情况。不仅如此，rake法还可以从由福尔马林固定了的石蜡包埋的组织中分离出mirna并对其进行分析，为从存档标本中分析mirna开启了希望之门。(5)原位杂交(insituhybridization)原位杂交技术可直观了解mirna表达方式，是观测mirna时空表达的一种较简便的方法，常标记方式包括地高辛、生物素、荧光标记等。锁定核酸基础上的原位杂交(lockednucleicacid(lna)basedinsituhybridization(lna-ish))是当前应用较多的探针方式。(6)基于微球的流式细胞术(bead-basedflowcytometry)是一种液相芯片技术，该方法将流式细胞检测与芯片技术有机地结合起来，兼有通量大、检测速度快、灵敏度高和特异性好等特点。(7)实时荧光定量pcr技术(real-timepcr，rt-pcr)荧光检测pcr仪可对整个pcr过程中扩增序列的累积速率绘制动态变化曲线。在反应混合体系中靶序列的起始浓度越大，要求获得扩增产物某特定产量的pcr循环数(一般用特定阈值循环数ct来表达)越少。由于mirna长度仅为22nt，传统的qrt-pcr不适合扩增如此短的片段。现今有几种用于mirna的实时定量pcr方法，如加尾法、颈环法等。颈环法是一种理想的mirna检测qrt-pcr方法：首先设计特殊的茎环结构引物，以待测mirna为模板逆转录合成cdna第一链，该cdna一端为茎环状引物，茎环状结构被打开便增加了cdna的长度，随后以合成的cdna为模板设计引物进行实时定量pcr扩增。qrt-pcr具有特异性高、灵敏度好、快速简单等多种优点。(8)测序法大部分已知的mirna都是通过cdna克隆测序发现和鉴定的。该法需要先构建mirna的cdna文库，再进行pcr扩增，扩增产物随后克隆到表达载体上测序。takada开发了一种改进的扩增克隆法(mirnaamplificationprofiling，mrap)，mrap法先在mirna的3’端连上接头，然后用与接头互补的反转录引物反转录。因为特定的反转录酶具有末端脱氧核苷酸酶活性，一些核苷酸(主要是脱氧胞苷酸)会连接到反转录出的cdna链的3’末端。当5’端接头与cdna链的poly(c)粘性末端退火后，加入一对共用引物即可实现对cdna的pcr扩增。由于mrap高度灵敏，可以直接用克隆和测序技术检测少量组织中mirna的表达量。标签序列克隆法是一种在在基因表达系列分析(sage)技术的基础上发展了检测效率更高的mirage(mirnasage)克隆法，该法通过生成大的串联子，通过单个测序反应可检测多个mirna，明显提高了检测效率。高通量测序(high-throughputsequencing)又称下一代测序技术(nextgenerationsequencing)是对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万到几百万条dna分子进行序列测定，极大提高了测序效率。这类大规模测序技术极大的提高了多个物种遗传信息的解读速度，为获取所有mirna的序列信息，解密mirna图谱提供了保证。同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序(deepsequencing)。高通量测序平台的代表是罗氏公司(roche)的454测序仪(rochgsflxsequencer)，illumina公司的solexa基因组分析仪(illuminagenomeanalyzer)和abi的solid测序仪(abisolidsequencer)。说明书附图图1是差异表达mirna的热图图2是mir-6761-5p差异表达图具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。实施例1区别左右半结肠腺癌相关的mirna的筛选1、数据收集检索时tcga数据库收录结肠腺癌患者460例，包含459例患者临床资料、456例患者的mrna数据，444例患者的mirna数据。根据临床资料记载，筛选纳入研究的患者。要求：(1)histological_type为colonadenocarcinoma；(2)anatomic_neoplasm_subdivision为ascendingcolon，sigmoidcolon，cecum，descendingcolon。共筛选出患者314例，其中右半结肠腺癌包括：升结肠(ascendingcolon)，盲肠(cecum)；左半结肠腺癌包括：降结肠(descendingcolon)，乙状结肠(sigmoidcolon)。采用tcga数据库产生的结肠腺癌转录组mrna、mirna数据。按照上述标准筛选完后，删去没有临床信息的样本，mirna与mrna数据样本取交集，得到结肠腺癌患者转录组mrna、mirna数据详见表1。以下数据可用于整合分析。表1是结肠腺癌患者转录组数据2、差异表达mrna和mirna参考基因组hg38。本研究删除了不易检测到的mirna或mrna(即该mirna或mrna的readcount值在rscoad中为0的样本数大于总的rscoad样本量的20％或该mirna的readcount值在lscoad中为0的样本数大于总的lscoad样本量的20％)后，将483个mirna、15751个差异表达mrna用于差异表达分析。差异表达mirna筛选标准：fdr<0.01；共获得54个差异表达mirna，上调32个，下调22个，制作差异表达热图(见图1)；差异表达mrna筛选标准：fdr<0.01；共获得2534个差异表达mrna，上调1594个，下调940个。经检索，大部分mirna均报道过与结肠癌相关，mir-6761-5p还未曾见于报道，选择mir-6761-5p进行后续验证。实施例2q-pcr验证差异表达的和mir-6761-5p1、42例结肠癌患病血液样本收集于天津市南开医院胃肠外科，其中右半结肠癌样本20例，左半结肠癌样本22。样本均为病理学确诊的。2、rna提取利用qiagen血液rna提取试剂盒提取血清中的rna，具体步骤参考说明书。3、逆转录：1)将10pg-1μg的总rna模板与2μl10×缓冲液、2μldatp(10mm)、0.5μlpolya多聚酶、0.5μl核糖核酸酶(rnase)抑制剂和无核糖核酸酶水(rnasefreewater)混合，体积最后为20μl，37℃孵育1h。2)反应管中加入1μl0.5μg/μloligo(dt)特异性rt引物，70℃孵育5min。3)立即冰上孵育至少2min，打断rna和引物的二级结构。4)将上述20μl反应混合物与4μl5×缓冲液、1μldntp(10mm)，0.5μlm-mlv逆转录酶，0.5μl核糖核酸酶(rnase)抑制剂，10μlpolya反应混合液和4μl无核糖核酸酶水(rnasefreewater)混合，42℃孵育1h。4、q-pcr反应：1)引物设计扩增mir-6761-5p的引物引物：tctgagagagctcgatggcag(seqidno.3)2)按照表1配制pcr反应体系：其中，sybrgreen聚合酶链式反应体系购自invitrogen公司。表1pcr反应体系体积sybrgreen聚合酶链式反应体系12.5μl正向引物1μl反向引物1μlcdna模板2μlddh2o8.5μl总体积25μl3)pcr反应条件：95℃10min，(95℃15s，60℃60s)×35个循环。以sybrgreen作为荧光标记物，在lightcycler荧光定量pcr仪上进行pcr反应，以u6snrna作为参照基因，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，δδct法进行相对定量。5、结果与右半结肠癌相比，左半结肠癌患者外周血中mir-6761-5p表达量显著升高，约为右半结肠癌组的2.86倍，见图2，22例左半结肠癌患者组中，16例有显著的高表达，2例差异表达无显著性差异，4例低表达，20例右半结肠癌患者组中，14例有显著的低表达，3例差异表达无显著性差异，3例高表达，提示mir-6761-5p可能作为检测靶标应用于区别左右半结肠癌的诊断。虽然已参考各种优选实施方案描述了本发明，但本领域技术人员理解，可进行各种变化，并且可用等同物替代其组件而不背离本发明的基本范围。此外，可进行许多改动来使特定情况或材料适合于本发明的教导而不背离其基本范围。因此，本发明无意限定于本文中公开的用于进行本发明的特定实施方案；相反地，本发明意欲包括落在权利要求书范围内的所有实施方案。序列表<110>天津市中西医结合医院（天津市南开医院）<120>mirna-6761-5p及其新用途<160>3<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>21<212>rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1ucugagagagcucgauggcag21<210>2<211>72<212>rna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2ucugcucugagagagcucgauggcaggugccuccguguugccgaacccuccuacgcugcu60cucucacuccag72<210>3<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3tctgagagagctcgatggcag21当前第1页12