一种海洋低温葡萄糖氧化酶及其应用的制作方法

本发明涉及一种海洋低温葡萄糖酶及其在鸡饲养中作为饲料添加剂的应用。
背景技术：
：葡萄糖氧化酶的应用领域大多在中低温环境，如饲料添加、食品保鲜、低温漂白等。低温葡萄糖氧化酶具有更广阔的的应用范围、高酶活力及高催化效率，可降低生产成本，提高生产效率，改善并提高产品质量，具有更广阔的工业开发价值与市场优势。海洋环境是具有高盐、高压、低温、低光照、寡营养等特点的极端环境，且其微生物资源丰富。复杂多变的生态环境和遗传机制赋予海洋微生物酶独特的作用机制，因此海洋微生物逐渐成为新型酶制剂的重要来源。国内外对海洋微生物来源的低温酶、耐盐酶等结构和功能新颖的极端酶研究逐渐增多，为海洋低温酶研究领域的发展奠定了良好的基础。1999年农业部将god定为12种允许使用的饲料酶制剂添加剂之一。god具有破坏饲料中霉菌毒素、延长饲料保质期、改善饲料品质、提高饲料养分消化率、减少或替代氧化锌、益生菌和替代抗生素等作用，可调节畜禽肠道ph、抑制畜禽肠道内有害菌生长、维持肠道菌群平衡、改善胃肠道环境、减少腹泻发生、保护肠道上皮细胞完整、清除畜禽体内多余的自由基，减少应激损伤、减少畜禽肝脏损伤、促进生长、降低死亡率等性能，已成为研究学者和养殖企业关注的焦点。技术实现要素：为解决上述问题，本发明提供了一种海洋低温葡萄糖氧化酶，本发明还提供了该酶的制备方法及其在鸡饲养中作为饲料添加剂的应用。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种海洋低温葡萄糖氧化酶，所述海洋低温葡萄糖氧化酶产自海洋basidioascussp.wyq23，保藏号为cgmccno.17180。编码上述海洋低温葡萄糖氧化酶的基因具有如seqid：1所示的核苷酸序列，genbank号为bankit2156862bseq#1mk061427，该基因通过转录组测序获得。上述一种海洋低温葡萄糖氧化酶的制备方法，所述方法具体如下：将basidioascussp.wyq23接种于发酵培养基，发酵培养获得发酵液，4000r/min离心10min后于4℃硫酸铵盐析沉淀过夜，12000r/min离心30min，沉淀使用缓冲液复溶后超滤，过葡聚糖层析柱，获得纯酶液。上述一种海洋低温葡萄糖氧化酶的制备方法，所述发酵液培养基为葡萄糖40-60g，蛋白胨3-4g，caco36-10g，mgso40.6-0.7g，kcl0.3-0.4g，kh2po43-4g，nano33-4g，加400ml海水溶解定容至1000ml，ph自然，121℃灭菌20min；所述发酵培养的温度为15-25℃，转速160r/min-180r/min，培养时间36h-48h；所述硫酸铵浓度为65％；所述离心条件为12000r/min；所述超滤条件为截留量为100kda的超滤管，5000r/min超滤10min，所述缓冲液为1mol/l的ph5.6的pbs，所述葡聚糖柱层析填料为sephadexg-200。上述海洋低温葡萄糖氧化酶在鸡饲养中作为饲料添加剂应用的方法为，将玉米、粗蛋白、麸皮、豆粕、鱼粉、骨粉、预混料、食盐混合后形成基料，每100kg基料加入纯化后的200ml-400ml海洋低温葡萄糖氧化酶，其中各原料的重量份数为：玉米55-60份、粗蛋白16-19、麸皮3-4、豆粕16-21、鱼粉1-3、预混料1、食盐0.3。与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明的海洋低温葡萄糖氧化酶为首次于basidioascussp.wyq23中制备，具有较低的最适温度及较广的温度耐受范围，最适温度20℃，酶活为0.660u/ml，在0℃测得酶活为0.495u/ml，为最适温度下酶活的88.4％；在60℃测得酶活为0.402u/ml，为最适温度下酶活的71.2％。本发明的海洋低温葡萄糖氧化酶应用于鸡饲料添加剂中，可有效提高鸡的日增重及抗病能力，并降低死亡率，可代替抗生素，提高其营养价值，是一种无毒副作用的绿色添加剂。附图说明图1本发明海洋低温葡萄糖氧化酶最适反应温度的测定；图2本发明海洋低温葡萄糖氧化酶在不同温度下酶稳定性的测定；图3本发明海洋低温葡萄糖氧化酶最适反应ph的测定；图4本发明海洋低温葡萄糖氧化酶在不同ph下酶稳定性的测定；图5金属离子对本发明海洋低温葡萄糖氧化酶的影响。具体实施方式下面通过附图和具体实施例详述本发明，但不限制本发明的保护范围。如无特殊说明，本发明所采用的实验方法均为常规方法，所用实验器材、材料、试剂等均可从商业途径获得。实施例1本发明的酶来源于basidioascussp.wyq23，具体制备过程如下：步骤1：将basidioascussp.wyq23接种于发酵培养基(葡萄糖40g、蛋白胨4g、caco36g、mgso40.7g、kcl0.3g、kh2po43g、nano33g加400ml海水溶解定容至1000ml，ph自然)，培养温度25℃，转速160r/min，接种量10ml，培养时间38h，得到发酵液；步骤2：将发酵液在4℃，4000r/min的条件离心10min，弃去沉淀，上清液即为海洋低温葡萄糖氧化酶粗酶液；步骤3：将步骤2得到的粗酶液加入65％的硫酸铵于4℃盐析沉淀过夜；步骤4：将步骤3得到的盐析沉淀用ph5.6的pbs缓冲液复溶；步骤5：将步骤4得到的溶液使用截留量为100kda的超滤管中超滤，5000r/min超滤10min，留取上层管中蛋白液；步骤6：将步骤5得到的蛋白液于4℃过sephadexg-200层析柱，检测酶活，收集纯度高的酶溶液，即为本发明海洋低温葡萄糖氧化酶。实施例2温度对本发明的海洋低温葡萄糖氧化酶的影响：(1)最适反应温度的测定，取本发明实施例1中制得的酶液、底物溶液分别于0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、70℃、80℃温度下水浴10min，将底物溶液加入酶液反应，测定酶活性。底物溶液为5％葡萄糖、0.07g/l邻联茴香胺、0.1g/l辣根过氧化物酶。(2)不同温度下酶稳定性的测定，将酶于20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃温度下分别水浴15min、30min、45min、60min后，将酶液加入底物溶液反应，测定酶活性，以(1)中相应温度酶活为100％，计算各温度下的相对酶活。本发明海洋低温葡萄糖氧化酶催化反应的最适温度为20℃，高于60℃时酶活迅速降低(见附图1)。在不同温度下，该酶的稳定性显示，在50℃处理60min时仍有42.4％的酶活，在80℃处理60min时仍有4％的酶活(见附图2)，总体可见其稳定性较高。实施例3ph对本发明的海洋低温葡萄糖氧化酶的影响：(1)最适反应ph的测定，取本发明实施例1中制得的酶液、底物溶液分别与ph分别为3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、9的pbs缓冲液混合，在20℃下水浴10min后将酶液加入底物溶液进行反应，测定酶活性。底物溶液为5％葡萄糖、0.07g/l邻联茴香胺、0.1g/l辣根过氧化物酶。(2)不同ph下酶稳定性的测定，将酶与所述ph分别为3、4、5、6、7、8、9的pbs缓冲液混合后分别在20℃保温15min、30min、45min、60min，将酶液加入底物溶液反应，测定酶活性，以实施例2(1)中相应ph酶活为100％，计算各温度下的相对酶活。本发明海洋低温葡萄糖氧化酶催化反应的最适ph为5.6，高于4.5或6.5时酶活迅速降低(见附图3)。在不同ph缓冲液条件下，经ph9的缓冲液处理60min后时保留76.3％的酶活(见附图4)，可见对不同ph缓冲液条件下耐受性较高。实施例4金属离子对本发明的海洋低温葡萄糖氧化酶的影响：不同金属离子对酶活的影响，将酶与不同金属离子混合后于20℃下分别保温15min、30min、45min、60min后，取本发明实施例1中制得的酶液加入底物溶液反应，测定酶活性，以空白对照为100％，计算各金属离子对酶活的影响。对本发明海洋低温葡萄糖氧化酶有增强作用的金属离子是mgcl2、kcl(见附图5)；对本发明海洋低温葡萄糖氧化酶有较强抑制作用的金属离子是agno3、zncl2、feso4。实施例5含有本发明海洋低温葡萄糖氧化酶的鸡饲料：按质量分数将57份玉米、17.5份粗蛋白、3.5份麸皮、17份豆粕、2份鱼粉、2份骨粉、1份预混料、0.3份食盐混合后形成基料，每100kg基料加入纯化后的300ml海洋低温葡萄糖氧化酶即得。选择100只1日龄肉鸡，其健康体重、产蛋率差异均不显著(p>0.05)，将其随机分为2组，每组50只。其中第1组采用上述含本发明海洋低温葡萄糖氧化酶的鸡饲料进行喂养，为样品例，第2组采用普通饲料(天大天成全价饲料)进行喂养，为对照例；养40天，各组饲养条件相同，自由采食与饮用自来水。观察记录每组的体重及状态，食欲减退、生长停滞认定为得病，实验结果见表1：表1体重净增/g发病率/％存活率/％样品例2765298对照例2183892由表1结果可以看出，添加了本发明海洋低温葡萄糖氧化酶的鸡饲料，可以提高鸡的日增重及抗病能力，并且降低死亡率。以上所述，仅为本发明专利优选的实施例，但本发明专利的保护范围并不限于此。任何熟悉本
技术领域：
的技术人员在本发明专利所公开的范围内，根据本发明专利的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都属于本发明专利的保护范围。序列表<110>大连大学<120>一种海洋低温葡萄糖氧化酶及其应用<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>2133<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1atggttcttcgatcgtctcttgttgcggccagcgtggcgcttgggctcgcggttctgcct60gcgcacgcgcagtacaaccgtgacaatggctacaagcatcagctcatcaggcgccaagcc120gtcacgaatgatacgagtcaagtcgccggcaagacgttcgactttgtcgtcgtgggcggc180ggagtcggcggtctcgcaattgcggcgcggctatccgaaaactcaaatttcactgtcgct240gttattgaagccggtggagacggttcggatgtgcacgaccagatttacattcccggttac300tcgtacttgaacggtttgactgtgtctagctacgactggaactatgagacagtgcagcag360caagagatcgactcgacctccaagatctttactaaccgatggccgcgcggcaaaggactt420ggcggctctggcgcgattaacggactcttctggtgccgggcgagtcaggccgaatacaac480tcgtgggacacgctcaatccgggctcgtcgatccactggggatgggatgaaatgcagaag540tacatgaagcggagtgaaacgctcaccccgccgccgcagaatgactcggattacttccac600atctcttacgacattaatgaccacggtacggatggtcctattcaggcgggctggccttgg660tacttctatgacgctgtcaaggactggattcccgcttgggaagagcttggtctgccgatt720ccgactgatggcgcatccggcaacaatcgcggtgcggtgatcaccccttctacactcaac780acggtcaacatgtctcgctccgaccccaaggccggatacattgacccgatgccgccgcgc840gacaatctcgttgtactcacgaaccatcaagtcacgaagatcctgtggaagaccgaccgg900gacggcaacaacgttgttgccgatggtgtcgagttcggtcctgacaacgagaacctgtct960caggtcaaggtcaacaaggaggtcattctatctggcggcaccgtcaatactccgcagaca1020ctccaactgtcgggcataggaccgcaggcactgcttgaaggcctcggcatccaggtccaa1080gtcgcgcttccaggagttgggcataatctgcaggaccacgcagcgaccgctgtatacctg1140acgacgaacgaccagcacacttgggcggagctccaagacaagactctcgccgcagcggag1200ctccagaagtggaagaccgagatgggccgctccaaatggtctttcattaatcaggcgatc1260ggttaccctgcgcttgaggacatcatgaccgatacggcgacgcggacgagctggatcaac1320ggtgtccagagtagcttcgacaagtacgcttcgactgtcaagaacatgtacaatgaggac1380gatacggtcatcaccggaatgcaggcgcaatggaacgagacaatgaattacctgaatggc1440gaggttggccagctcgagatcctcttcaccatgtatggtggcggtgtcggtcagatcggt1500attcaagtcgcgctgcaacaccccttctcgcgcggcacgattctgattaactccacgaac1560cccttcgacccgcctcagattgaccccgggtaccttacccactcagctgacatggacatt1620ctccgcgccggtgtgaggttcgctatcgcgctttccaagactaagtcgctcggctcgtac1680atcagcggtcagacatccttcaccgaagatacggatgacgctatcaacacaggcatccgt1740caggatgcgcacacggagtaccaccctatgggtaccgccgccatgttgccgctcgaaaat1800ggcggtgtcgtcaatacgtcacttattgtttacggtacttcgaacgtccgcgtcgttgat1860gcttcggtcatgcctctcgaaatctccgcgcacttgatggcgtcgacttacggaatcgct1920gagaaggctgccgacattatcaagacgcactacgcacaggtcgcctctggccagaccccc1980accgttggtgatcccgacagcggcgcagcggcgtcgacgtcggcatctgccggcgcaagc2040caagactcgggcgccatgtcgtctacgacgcgttcgatcatcattggatgtgtcgttggc2100gctgccgggcttgccgtcatcgcggtaagctga2133当前第1页12