薄壳山核桃品种Osage的特征序列、标记引物及鉴定方法与流程

本发明涉及薄壳山核桃品种osage的特征序列、分子特异性标记引物组合以及利用该分子特异性标记引物组合对薄壳山核桃品种osage进行特异性鉴定的方法。

背景技术：

薄壳山核桃（caryaillinoënsis(wangenh.)k.koch）是胡桃科山核桃属中最有经济价值的树种；薄壳山核桃是典型的异交植物，现有生产实践发现，薄壳山核桃的品种配置是影响其产量的主要因素之一；美国是薄壳山核桃的原产地之一，也是中心产区，多年来，美国已选育命名的栽培品种约1000个；我国引种薄壳山核桃已有100多年历史，目前生产上常用的品种有几十个，多年的生产实践证明我国广大亚热带地区是薄壳山核桃的适生区；

但是，我国现有薄壳山核桃产区面临的主要问题是产量低下和不稳定，造成这一现象的原因有多个方面，其中之一就是现有引进的品种尚缺乏明确的亲缘关系分析，再加上一些杂交后代定名的混乱，导致难以进行有效的亲本选择和合理配置，不便于品种鉴定、推广、交流及新品种的培育，因此着力从分子水平上开发出一些稳定、特异的dna品种指纹标记是实现薄壳山核桃品种准确快速鉴定的科学途径；

国内外已报导一些用于薄壳山核桃品种鉴定和亲缘关系分析的分子标记方法，比较好的有ssr分子标记法，但这些旧有的检测方法较为繁琐，且结果不稳定。

技术实现要素：

本发明的目的是提供薄壳山核桃品种osage的特征序列、分子特异性标记引物组合以及利用该分子特异性标记引物组合对薄壳山核桃品种osage进行特异性鉴定的方法；

本发明采用的技术方案是：

薄壳山核桃品种osage的特征序列组，其序列组如下：

1)5′-aattcttccgctacgatttactacatattgatagaatataggtgcattgcatcttaaatgtcatgtatgaggggtatgtaacctagtgttgcatgtcctgacgctctaggctccttggggagcttcgtctccacttcaggatccaccaccctcacatcgaagaaccccgcaggcttcaatgcaacacatctatggccatttctccctactgctagagggactggaggaactcttcgggccacgagctgatgaggagtcaaacaagaagtcctaattgaccatgcacaaacggtcgggcgttgtcaagtagctcccaattagagaggactagctcaatccccgagttgagagggttcgctgacacccaagatagctttgacgctaacttggccttggagaggaggacgaatgcccaagttgggtattc-3′

2)5′-aggcaaggataatcgtggcagatattcgtaacatccttaatgatgttttcgacagctatgcagcagaacctggtgtgcaggtgcaggaattatcctcttccttttccacaagtcatatgataaatcagtggcaccagtctaaacgttatcagtctgctgcctcaccaagggcagaactcaatcgatatttacaagaggatgtcattaataatgcagaagaggatttcgacatcttgggttggtgg-3′

3)5′-aattcgaacaagagattctttcaaaactactgtgaatagcgaatgaaaatatagaaatagatataagctaagtatcgcagcaacaaacaacattcaaaacgagtgaagaaaaccttgttccctgcatccctagttgtagaaattagccttgaatcatcctgtaaaagatgattccaagaccctatcaaaaccctatagaacaatgtttttggaaaaaacaaaaacaaatgaaaaaccctaaaactgatgcaaaaatgatgcccttcacccctatgcctcggctctttttatttcctcctcccttcatctctttttctctctctactacaagttgcctttccctatcatgattctaccccttggaagaatgtccctc-3′

本发明还涉及薄壳山核桃品种osage的分子特异性标记引物组，所述引物序列为：

1)上游引物：5′-gcaggcttcaatgcaacaca-3′

下游引物：5′-tgtcagcgaaccctctcaac-3′

2)上游引物：5′-aggcaaggataatcgtggca-3′

下游引物：5′-ccaccaacccaagatgtcga-3′

3)上游引物：5′-tcgcagcaacaaacaacattca-3′

下游引物：5′-gggacattcttccaaggggt-3′

上述3对引物组合的来源：首先，从常见的24个品种中筛选出性状差异较大的5个品种进行简化基因的测序和比较分析；接着，根据分析结果设计1000多对引物，在24个样品中进行筛选和验证，获得薄壳山核桃品种osage的特异性dna片段；然后，将该片段克隆测序，再经过三次以上重复性取样的复筛，最终获得的分子特异性标记引物组合；以上述特异性引物组合对薄壳山核桃品种进行pcr扩增，仅osage可获得分别为195bp、245bp、300bp大小的3条特异性片段，其他薄壳山核桃品种均不能获得选出引物组合的特异性片段；需要说明的是，本发明的分子特异性标记引物组合仅限于薄壳山核桃品种的鉴定，即待测样品仅限于薄壳山核桃；

针对上述特征序列，设计的3对特异性引物，所扩增的3个产物分别为：

1)195bp:5’-gcaggcttcaatgcaacacatctatggccatttctccctactgctagagggactggaggaactcttcgggccacgagctgatgaggagtcaaacaagaagtcctaattgaccatgcacaaacggtcgggcgttgtcaagtagctcccaattagagaggactagctcaatccccgagttgagagggttcgctgaca-3′

2)245bp:5’-aggcaaggataatcgtggcagatattcgtaacatccttaatgatgttttcgacagctatgcagcagaacctggtgtgcaggtgcaggaattatcctcttccttttccacaagtcatatgataaatcagtggcaccagtctaaacgttatcagtctgctgcctcaccaagggcagaactcaatcgatatttacaagaggatgtcattaataatgcagaagaggatttcgacatcttgggttggtgg-3′

3)300bp:5’-tcgcagcaacaaacaacattcaaaacgagtgaagaaaaccttgttccctgcatccctagttgtagaaattagccttgaatcatcctgtaaaagatgattccaagaccctatcaaaaccctatagaacaatgtttttggaaaaaacaaaaacaaatgaaaaaccctaaaactgatgcaaaaatgatgcccttcacccctatgcctcggctctttttatttcctcctcccttcatctctttttctctctctactacaagttgcctttccctatcatgattctaccccttggaagaatgtccc-3′

osage是美国早期从实生树中发现的品种，树体生长势旺，喜光，在高郁闭度时将自然整枝，花期早，雄花成熟比雌花稍早，几乎同期，雌花柱头较大，先为绿色后转为淡红色；属中果型，成熟早，坚果外壳有黑色块纹，平均单果重8.5g左右；

本发明还涉及一种利用所述的分子特异性标记引物组合对薄壳山核桃品种osage进行快速鉴定的方法，所述方法为：提取待测薄壳山核桃品种叶片的基因组dna作为模板，以所述分子特异性标记引物组作为扩增引物，进行pcr扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果同时出现分别为195bp、245bp、300bp大小的3条dna条带，则待测薄壳山核桃品种为薄壳山核桃品种osage，反之则否；所述分子特异性标记引物序列为：

1)上游引物：5′-gcaggcttcaatgcaacaca-3′

下游引物：5′-tgtcagcgaaccctctcaac-3′

2)上游引物：5′-aggcaaggataatcgtggca-3′

下游引物：5′-ccaccaacccaagatgtcga-3′

3)上游引物：5′-tcgcagcaacaaacaacattca-3′

下游引物：5′-gggacattcttccaaggggt-3′

本发明方法关键在于扩增引物组合的选择，dna提取，pcr反应体系及反应条件确定，以及电泳检测，均可按照本领域常规方法进行；

本发明方法与现有薄壳山核桃品种的分子标记方法相比，如ssr等标记方法，有以下优点：（1）因为所用引物经测序和反复验证，故可靠性提高了很多；（2）检测方便、直观，直接通过普通电泳观察条带的有无组合即可判断，而应用ssr标记法的话扩增后还需要利用高分辨率电泳进一步分析或者测序；（3）对样品的要求较低，叶片等组织的dna样品均可以满足品种鉴定的需要；

优选的，本发明所述pcr扩增体系组成如下：

pcrbuffer终浓度为1×

dntps1mmol/l

mgcl22.5mmol/l

taq酶1.0u/反应

上、下游引物各0.2μm

模板dna60ng/反应

余量为ddh2o；

所述pcr扩增条件如下：94℃预变性300s后，95℃变性10s，56℃退火时间50s，72℃延伸40s，共循环30次，最后在72℃补平300s；终止温度为4℃；

pcrbuffer终浓度为1×，是指pcrbuffer中各组分在反应体系中的浓度与1×pcrbuffer相同，通常选用体积为反应体系体积1/10的10×pcrbuffer；10×pcrbuffer成分为：100mmtris-hcl（ph8.5）、500mmkcl、25mmmgcl2和1.0%triton-x-100，溶剂为ddh2o；

具体的，所述方法如下：

（1）取待测薄壳山核桃叶片，加液氮磨碎，采用bioteke新型快速植物基因组dna提取试剂盒的操作说明提取待测薄壳山核桃叶片的基因组dna；

（2）以步骤（1）提取的基因组dna为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进行pcr扩增：

pcr反应体系每15μl组成如下：

2×tsingkemastermix7.5μl

10μm上、下游引物各0.2μl

20ng/μl模板dna2μl

ddh2o4.3μl；

pcr反应条件如下：

94℃预变性300s后，95℃变性10s，56℃退火时间50s，72℃延伸40s，共循环30次，最后在72℃补平300s；终止温度为4℃；

（3）取步骤（2）扩增产物3μl，与1μl0.25%溴酚兰缓冲液混匀，点样于1.5%的琼脂糖凝胶上，于1×tae缓冲液中、5v/cm电压下电泳，电泳结束后eb染色，于自动凝胶图像分析仪上照相，若电泳结果出现分别为195bp、245bp、300bp大小的3条dna条带，则待测薄壳山核桃品种为osage；反之则否。

附图说明

图1为将24种薄壳山核桃品种进行pcr扩增的结果（编号1-24代表薄壳山核桃品种依次为：1、moore，2、dependable，3、nacono，4、靖州1号，5、vandeman，6、sturat5，7、forkert，8、desirable，9、davis，10、elliott，11、caddo，12、schley，13、choctaw，14、绍兴，15、wichita，16、sumner，17、mahan，18、gloriagrande，19、peruque，20、sioux，21、pyzner，22、pawnee，23、osage，24、oconee）；m为takaradl2000marker；仅编号23为薄壳山核桃品种osage扩增出了分别为195bp、245bp、300bp大小的3条特异dna条带；其余编号为其它的薄壳山核桃品种，未见有特异dna条带产生。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

（1）薄壳山核桃品种基因组dna的提取：

取待测薄壳山核桃品种幼嫩叶片0.05g，加液氮彻底磨碎，基因组dna的提取采用bioteke新型快速植物基因组dna提取试剂盒的操作说明，经多次抽提，来获得薄壳山核桃品种的基因组dna提取物；dna提取物再经过1.5%的琼脂糖凝胶电泳来检测完整性、纯度及浓度；判断条带亮度用于后续pcr扩增；dna提取物于-20℃冰箱贮藏备用；

（2）设计特异pcr扩增引物，引物对的序列为：

1）:上游引物：5′-gcaggcttcaatgcaacaca-3′

下游引物：5′-tgtcagcgaaccctctcaac-3′

2）:上游引物：5′-aggcaaggataatcgtggca-3′

下游引物：5′-ccaccaacccaagatgtcga-3′

3）:上游引物：5′-tcgcagcaacaaacaacattca-3′

下游引物：5′-gggacattcttccaaggggt-3′

由上海生物工程技术有限公司合成；

（3）pcr扩增：

pcr反应液组成（15μl）：

2×tsingkemastermixmastermix（擎科生物，北京）7.5μl

10μm上、下游引物各0.2μl

20ng/μl模板dna2μl

ddh2o4.3μl；

扩增反应在tc-xp型扩增仪上进行；扩增条件：94℃预变性300s后，95℃变性10s，56℃退火时间50s，72℃延伸40s，共循环30次，最后在72℃补平300s；终止温度为4℃；

（4）电泳检测：取步骤（3）pcr扩增产物3μl，与1μl0.25%溴酚兰缓冲液混匀，点样于1.5%的琼脂糖凝胶上，于1×tae缓冲液中，5v/cm电压下电泳，电泳结束后，在含0.5μg/mleb的水溶液中染色30分钟，然后在bio-rad凝胶成像系统geldoc上照相；

按照上述方法分别对24个薄壳山核桃品种（编号1-24代表薄壳山核桃品种依次为：1、moore，2、dependable，3、nacono，4、靖州1号，5、vandeman，6、sturat5，7、forkert，8、desirable，9、davis，10、elliott，11、caddo，12、schley，13、choctaw，14、绍兴，15、wichita，16、sumner，17、mahan，18、gloriagrande，19、peruque，20、sioux，21、pyzner，22、pawnee，23、osage，24、oconee）的pcr扩增图谱进行电泳检测，结果见图1；

其中仅从编号为23的薄壳山核桃品种osage中扩增出了三条清晰明亮、稳定的分别为195bp、245bp、300bp大小的特异dna条带，而其余编号的薄壳山核桃品种，未见有特殊dna条带产生，也未有其它非目的条带产生，可见本发明开发出的分子特异性标记引物对用于薄壳山核桃品种osage的早期鉴定，其稳定性、特异性非常高。

sequencelisting

<110>浙江省林业科学研究院

<120>薄壳山核桃品种osage的特征序列、标记引物及鉴定方法

<130>

<160>12

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>427

<212>dna

<213>caryaillinoensis

<220>

<221>unsure

<400>1

aattcttccgctacgatttactacatattgatagaatataggtgcattgcatcttaaatg60

tcatgtatgaggggtatgtaacctagtgttgcatgtcctgacgctctaggctccttgggg120

agcttcgtctccacttcaggatccaccaccctcacatcgaagaaccccgcaggcttcaat180

gcaacacatctatggccatttctccctactgctagagggactggaggaactcttcgggcc240

acgagctgatgaggagtcaaacaagaagtcctaattgaccatgcacaaacggtcgggcgt300

tgtcaagtagctcccaattagagaggactagctcaatccccgagttgagagggttcgctg360

acacccaagatagctttgacgctaacttggccttggagaggaggacgaatgcccaagttg420

ggtattc427

<210>2

<211>195

<212>dna

<213>unknown

<220>

<221>unsure

<223>人工序列

<400>2

gcaggcttcaatgcaacacatctatggccatttctccctactgctagagggactggagga60

actcttcgggccacgagctgatgaggagtcaaacaagaagtcctaattgaccatgcacaa120

acggtcgggcgttgtcaagtagctcccaattagagaggactagctcaatccccgagttga180

gagggttcgctgaca195

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>unknown

<220>

<221>unsure

<223>人工序列

<400>3

gcaggcttcaatgcaacaca20

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>unknown

<220>

<221>unsure

<223>人工序列

<400>4

tgtcagcgaaccctctcaac20

<210>5

<211>245

<212>dna

<213>caryaillinoensis

<220>

<221>unsure

<400>5

aggcaaggataatcgtggcagatattcgtaacatccttaatgatgttttcgacagctatg60

cagcagaacctggtgtgcaggtgcaggaattatcctcttccttttccacaagtcatatga120

taaatcagtggcaccagtctaaacgttatcagtctgctgcctcaccaagggcagaactca180

atcgatatttacaagaggatgtcattaataatgcagaagaggatttcgacatcttgggtt240

ggtgg245

<210>6

<211>245

<212>dna

<213>unknown

<220>

<221>unsure

<223>人工序列

<400>6

aggcaaggataatcgtggcagatattcgtaacatccttaatgatgttttcgacagctatg60

cagcagaacctggtgtgcaggtgcaggaattatcctcttccttttccacaagtcatatga120

taaatcagtggcaccagtctaaacgttatcagtctgctgcctcaccaagggcagaactca180

atcgatatttacaagaggatgtcattaataatgcagaagaggatttcgacatcttgggtt240

ggtgg245

<210>7

<211>20

<212>dna

<213>unknown

<220>

<221>unsure

<223>人工序列

<400>7

aggcaaggataatcgtggca20

<210>8

<211>20

<212>dna

<213>unknown

<220>

<221>unsure

<223>人工序列

<400>8

ccaccaacccaagatgtcga20

<210>9

<211>376

<212>dna

<213>caryaillinoensis

<220>

<221>unsure

<400>9

aattcgaacaagagattctttcaaaactactgtgaatagcgaatgaaaatatagaaatag60

atataagctaagtatcgcagcaacaaacaacattcaaaacgagtgaagaaaaccttgttc120

cctgcatccctagttgtagaaattagccttgaatcatcctgtaaaagatgattccaagac180

cctatcaaaaccctatagaacaatgtttttggaaaaaacaaaaacaaatgaaaaacccta240

aaactgatgcaaaaatgatgcccttcacccctatgcctcggctctttttatttcctcctc300

ccttcatctctttttctctctctactacaagttgcctttccctatcatgattctacccct360

tggaagaatgtccctc376

<210>10

<211>300

<212>dna

<213>unknown

<220>

<221>unsure

<223>人工序列

<400>10

tcgcagcaacaaacaacattcaaaacgagtgaagaaaaccttgttccctgcatccctagt60

tgtagaaattagccttgaatcatcctgtaaaagatgattccaagaccctatcaaaaccct120

atagaacaatgtttttggaaaaaacaaaaacaaatgaaaaaccctaaaactgatgcaaaa180

atgatgcccttcacccctatgcctcggctctttttatttcctcctcccttcatctctttt240

tctctctctactacaagttgcctttccctatcatgattctaccccttggaagaatgtccc300

<210>11

<211>22

<212>dna

<213>unknown

<220>

<221>unsure

<223>人工序列

<400>11

tcgcagcaacaaacaacattca22

<210>12

<211>20

<212>dna

<213>unknown

<220>

<221>unsure

<223>人工序列

<400>12

gggacattcttccaaggggt20