本发明属于减肥保健品领域，尤其涉及一种松花活性肽、包含其的组合物、木耳片及其制备工艺。
背景技术：
：随着社会的发展，人民生活水平的提高，肥胖，已经成为普遍现象。肥胖是指一定程度的明显超重与脂肪层过厚，是体内脂肪，尤其是甘油三酯积聚过多而导致的一种状态。由于食物摄入过多或机体代谢的改变而导致体内脂肪积聚过多造成体重过度增长并引起人体病理、生理改变或潜伏。肥胖有以下危害：1、增加心血管疾病的危险；2、影响消化系统的功能；3、影响内分泌系统的功能；4、增加癌症发生的危险性；5、此外还有关节软组织损伤、生殖能力下降以及心理障碍等。当前，世界卫生组织己确认肥胖将成为全球首位的健康问题,其成因除与遗传有关外,更与后天代谢异常、饮食因素相关。目前，肥胖已经成为影响人们健康的杀手，减肥成为主流，特别是正处于青春期的女性，减肥，不仅使得身体健康，而且还能够使自己变得漂亮，苗条，有魅力。目前，常用的减肥方法有：灌肠减肥法、渗透压减肥法、桑拿减肥法、奶粉减肥法、跳绳减肥法、普洱茶减肥法、手术减肥、药物减肥等。但是，对于大多数青春年少的女性来说，运动减肥太累，一般坚持不下来，而喝茶减肥成本又太高，且大多数人没有喝茶的习惯。节食减肥很痛苦，且不科学，对身体非常不利。而药物减肥因为方便、省事备受人们青睐，但是目前市售的减肥产品主要分为两类，1)作用于中枢的减肥产品，2)作用于外周的减肥产品，主要是脂肪酶抑制剂；作用于中枢的减肥产品主要是通过抑制大脑进食中枢达到控制食欲的目的，使食物摄取减少，同时通过增加中枢交感传出神经的兴奋性，来兴奋棕色脂肪β3肾上腺素受体来增加产热，从而达到脂肪的消耗增加的目的；其不良反应较多，容易引发肠功能紊乱，贫血，糖尿病，肾功能损害，或者效果不明显，或者容易反弹，且存在有增加抑郁及焦虑的风险；而作用于外周的脂肪酶抑制剂，代表药物为奥利司他和新利司他，由于其不进入人体血管和神经系统，对人体矿物质平衡以及骨质循环无影响，备受人们喜爱，但是，由于其为化学合成药物，存在潜在的毒副作用，而动物源或植物源活性成分作为脂肪酶抑制剂具有天然、安全、结构多样等特点成为近年来研究的热点。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种松花活性肽、包含其的组合物、木耳片及其制备工艺。为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：技术方案一：一种松花活性肽，由松花分离蛋白依次经胃蛋白酶和碱性蛋白酶水解所得，具体步骤如下：步骤一：酶解：首先，向松花分离蛋白中加入水，配制成质量浓度为2g/100ml的松花蛋白溶液作为底物；采用盐酸调整底物溶液的ph为4.2，并加热至37摄氏度后，以底物计向底物溶液中加入1100u/g的胃蛋白酶，于37摄氏度ph4.2的条件下酶解30～60min，然后采用氢氧化钠调整底物溶液的ph为8.0，并升温至54摄氏度后，以底物计向其中加入2606u/g的碱性蛋白酶，于54摄氏度、ph8.0的条件下酶解60～90min，然后沸水浴中灭酶15min；得酶解液；步骤二：固液分离：将步骤一所得的酶解液于10000r/min的转速下离心，收集沉淀，冷冻干燥，即得。进一步的，步骤二中，在离心前还包括采用分子量为5kda和3kda的超滤膜盒依次对酶解液进行分离，收集分子量在3～5kda范围内的组分。技术方案二：一种权利要求1～2任一项所述松花活性肽作为减肥活性成分在制备减肥药物中的应用。技术方案三：一种包含权利要求1～2任一项所述松花活性肽的组合物，包括以下重量份的各原料：木香4份；香附4份；干姜4份；决明子4份；黄芪4份；权利要求1～2任一项所述松花活性肽2～9份。进一步的，如果采用权利要求1中方法制备的松花活性肽，则松花活性肽为3～9份；如果采用权利要求2中方法制备的松花活性肽，则松花活性肽为2～6份；进一步的，所述组合物还包括药学上可接受的载体。例如：填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、基质等。填充剂包括：淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等；崩解剂包括：淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素钠等；润滑剂包括：硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等；助悬剂包括：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素等；粘合剂包括，淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等；甜味剂包括：糖精钠、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等；矫味剂包括：甜味剂及各种香精；防腐剂包括：尼泊金类、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸及其盐类、苯扎溴铵、醋酸氯乙定、桉叶油等；基质包括：peg6000，peg4000，虫蜡等。为使上述剂型能够实现中药药剂学，需在制备这些剂型时加入药学可接受的其它辅料。技术方案四：一种包含上述组合物的临床制剂，所述制剂为口服剂型，选自汤剂、散剂、胶囊剂、片剂、合剂、糖浆剂、内服膏剂、丸剂或口服液。技术方案五：一种包含上述组合物的木耳片，按重量份计，还包括黑木耳80份。技术方案六：一种木耳片的制备工艺，具体包括以下步骤：步骤1、将黑木耳去除杂质后，按重量份称取各原料，然后将木香、香附、干姜、决明子、黄芪混合均匀后，按料液体积比1:8～10，向其中加入水，煎煮提取30min，提取2次，合并2次的提取液后，减压浓缩得中药浸膏；步骤2、将黑木耳用水浸泡4～5h、洗净后用沸水煮熟，捞出，控去多余水分后，打磨成浆，过200目筛后，得木耳浆；步骤3、向步骤2所制得的木耳浆中加入步骤1制得的中药浸膏以及松花活性肽，搅拌均匀后，加入粘合剂，继续搅拌至混合均匀，制成软材，然后经湿法制粒、干燥、整粒、压片，即得木耳片。与现有技术相比，本发明的优点为：本发明胃蛋白酶采用的ph为4.2，碱性蛋白酶采用的ph为8.0，均非其最适ph，是为了降低酶解的速率，延长酶解时间，从而容易操作，否则酶解速度太快来不及终止反应，使得酶解程度过高，导致得到的3～5kda的松花活性肽含量减少。本发明以黑木耳和松花活性肽为减肥主要成分，以木香、香附、干姜、决明子和黄芪为辅，共同起到减肥瘦身的目的；其中，松花活性肽能够通过抑制胰脂肪酶的活性降低脂肪的吸收以达到减肥的目的，木耳片一方面经过胃时吸水膨胀，体积扩大，增加胃的饱腹感，从根本上解决了饥饿想吃东西的情况，另一方面，木耳中的纤维素能够吸收油脂，促进肠胃蠕动，从而达到清理肠壁垃圾，通便减肥的作用；而木香、香附理气健胃，干姜温热健胃，决明子降脂、黄芪补气避免因体重减轻过快带来的元气损伤。本发明配伍科学，天然安全，无副作用，各组分之间协同作用，功效相辅相成，共同起到减肥瘦身的目的。具体实施方式以下结合实施例对本发明进行进一步详细的叙述。碱性蛋白酶采用alcalase2.4l碱性蛋白酶；胃蛋白酶：上海歆睿生物科技有限公司；松花分离蛋白：取松花粉按料液质量体积比1g:15～18ml向松花粉中加入去离子水，超声于500～1000w的功率下超声20min，然后用氢氧化钠溶液调ph至10.0，45摄氏度水浴提取50min，3500r/min离心10min，取上清，用盐酸调ph至4.17，静置3h，3500r/min离心15min，取沉淀，冷冻干燥，得松花分离蛋白。实施例1～6一种松花活性肽，由松花分离蛋白依次经胃蛋白酶和碱性蛋白酶水解所得，具体步骤如下：步骤一：酶解：步骤a：首先，向松花分离蛋白中加入水，配制成质量浓度为2g/100ml的松花蛋白溶液作为底物；采用盐酸调整底物溶液的ph为4.2，并加热至37摄氏度后，以底物计向底物溶液中加入1100u/g的胃蛋白酶，于37摄氏度ph4.2的条件下酶解15min，然后采用氢氧化钠调整底物溶液的ph为8.0，并升温至54摄氏度后，以底物计向其中加入2606u/g的碱性蛋白酶，于54摄氏度、ph8.0的条件下酶解30min，然后沸水浴中灭酶15min；得酶解液a；步骤b：胃蛋白酶的酶解时间为45min，碱性蛋白酶的酶解时间为75min，其余与步骤a相同，得酶解液b；步骤c：胃蛋白酶的酶解时间为75min，碱性蛋白酶的酶解时间为120min，其余与步骤a相同，得酶解液c；步骤d：将酶解液a、酶解液b、酶解液c混合，得酶解液；步骤二：超滤分离：将步骤一制得的酶解液采用分子量为9kda、7kda、5kda、3kda、1kda的超滤膜盒依次对酶解液进行分离，分别收集分子量小于1kda、1～3kda、3～5kda、5～7kda、7～9大于9kda范围内的各组分溶液；步骤三：固液分离：分别将步骤二所收集的各组分溶液于10000r/min的转速下离心，收集沉淀，冷冻干燥，即得。实施例1～6仅收集的松花活性肽分子片段不同，其余均相同；其中，实施例1为：收集小于1kda的松花活性肽；实施例2为：收集1～3kda的松花活性肽；实施例3为：收集3～5kda的松花活性肽；实施例4为：收集5～7kda的松花活性肽；实施例5为：收集7～9kda的松花活性肽；实施例6为：收集大于9kda的松花活性肽。实施例7一种松花活性肽，由松花分离蛋白经胃蛋白酶水解所得，具体步骤如下：步骤一：酶解：首先，向松花分离蛋白中加入水，配制成质量浓度为2g/100ml的松花蛋白溶液作为底物；采用盐酸调整底物溶液的ph为4.2，并加热至37摄氏度后，以底物计向底物溶液中加入1100u/g的胃蛋白酶，于37摄氏度ph4.2的条件下酶解120min；得酶解液；步骤二：超滤分离：将步骤一制得的酶解液采用分子量为5kda、3kda的超滤膜盒依次对酶解液进行分离，收集分子量在3～5kda范围内的组分溶液；步骤三：固液分离：将步骤二所收集的分子量在3～5kda范围内的组分溶液于10000r/min的转速下离心，收集沉淀，冷冻干燥，即得。实施例8一种松花活性肽，由松花分离蛋白经碱性蛋白酶水解所得，具体步骤如下：步骤一：酶解：首先，向松花分离蛋白中加入水，配制成质量浓度为2g/100ml的松花蛋白溶液作为底物；采用氢氧化钠调整底物溶液的ph为8.0，并升温至54摄氏度后，以底物计向其中加入2606u/g的碱性蛋白酶，于54摄氏度、ph8.0的条件下酶解120min，然后沸水浴中灭酶15min；得酶解液；步骤二：超滤分离：将步骤一制得的酶解液采用分子量为5kda、3kda的超滤膜盒依次对酶解液进行分离，收集分子量在3～5kda范围内的组分溶液；步骤三：固液分离：将步骤二所收集的分子量在3～5kda范围内的组分溶液于10000r/min的转速下离心，收集沉淀，冷冻干燥，即得。实施例9一种松花活性肽，由松花分离蛋白经中性蛋白酶水解所得，具体步骤如下：步骤一：酶解：首先，向松花分离蛋白中加入水，配制成质量浓度为2g/100ml的松花蛋白溶液作为底物；采用氢氧化钠调整底物溶液的ph为7.0，并升温至37摄氏度后，以底物计向其中加入1800u/g的中性蛋白酶，于37摄氏度、ph7.0的条件下酶解70min，然后沸水浴中灭酶15min；得酶解液；步骤二：超滤分离：将步骤一制得的酶解液采用分子量为5kda、3kda的超滤膜盒依次对酶解液进行分离，收集分子量在3～5kda范围内的组分溶液；步骤三：固液分离：将步骤二所收集的分子量在3～5kda范围内的组分溶液于10000r/min的转速下离心，收集沉淀，冷冻干燥，即得。实施例10～14一种松花活性肽，由松花分离蛋白依次经胃蛋白酶和碱性蛋白酶水解所得，具体步骤如下：步骤一：酶解：首先，向松花分离蛋白中加入水，配制成质量浓度为2g/100ml的松花蛋白溶液作为底物；采用盐酸调整底物溶液的ph为4.2，并加热至37摄氏度后，以底物计向底物溶液中加入1100u/g的胃蛋白酶，于37摄氏度ph4.2的条件下酶解30～60min，然后采用氢氧化钠调整底物溶液的ph为8.0，并升温至54摄氏度后，以底物计向其中加入2606u/g的碱性蛋白酶，于54摄氏度、ph8.0的条件下酶解60～90min，然后沸水浴中灭酶15min；得酶解液；步骤二：固液分离将步骤一所得的酶解液于10000r/min的转速下离心，收集沉淀，冷冻干燥，即得。实施例10～14中仅胃蛋白酶和碱性蛋白酶的酶解时间不同，其余均相同；实施例10～14中仅胃蛋白酶和碱性蛋白酶的酶解时间，见下表1；表1实施例15一种松花活性肽，由松花分离蛋白依次经胃蛋白酶和碱性蛋白酶水解所得，具体步骤如下：步骤一：酶解：首先，向松花分离蛋白中加入水，配制成质量浓度为2g/100ml的松花蛋白溶液作为底物；采用盐酸调整底物溶液的ph为4.2，并加热至37摄氏度后，以底物计向底物溶液中加入1100u/g的胃蛋白酶，于37摄氏度ph4.2的条件下酶解45min，然后采用氢氧化钠调整底物溶液的ph为8.0，并升温至54摄氏度后，以底物计向其中加入2606u/g的碱性蛋白酶，于54摄氏度、ph8.0的条件下酶解75min，然后沸水浴中灭酶15min；得酶解液；步骤二：超滤分离将步骤一制得的酶解液采用分子量为5kda、3kda的超滤膜盒依次对酶解液进行分离，收集分子量在3～5kda范围内的组分溶液；步骤三：固液分离将步骤二所收集分子量在3～5kda范围内的组分溶液于10000r/min的转速下离心，收集沉淀，冷冻干燥，即得。实施例16一种木耳片，包括以下重量份的各原料：黑木耳80份；木香4份；香附4份；干姜4份；决明子4份；黄芪4份；实施例12制得的松花活性肽6份；其制备方法为：步骤1、将黑木耳去除杂质后，按重量份称取各原料，然后将木香、香附、干姜、决明子、黄芪混合均匀后，按料液体积比1:8～10，向其中加入水，煎煮提取30min，提取2次，合并2次的提取液后，减压浓缩得中药浸膏；步骤2、将黑木耳用水浸泡4～5h、洗净后用沸水煮熟，捞出，控去多余水分后，打磨成浆，过200目筛后，得木耳浆；步骤3、向步骤2所制得的木耳浆中加入步骤1制得的中药浸膏以及松花活性肽，搅拌均匀后，加入粘合剂，混合均匀，制成软材，然后经湿法制粒、干燥、整粒后，压片，即得木耳片。实施例17采用实施例15制得的松花活性肽4份；其余均同实施例16。实施例18一种木耳片，包括以下重量份的各原料：黑木耳80份；木香4份；香附4份；干姜4份；决明子4份；黄芪4份；其制备方法为：步骤1、将黑木耳去除杂质后，按重量份称取各原料，然后将木香、香附、干姜、决明子、黄芪混合均匀后，按料液体积比1:8～10，向其中加入水，煎煮提取30min，提取2次，合并2次的提取液后，减压浓缩得中药浸膏；步骤2、将黑木耳用水浸泡4～5h、洗净后用沸水煮熟，捞出，控去多余水分后，打磨成浆，过200目筛后，得木耳浆；步骤3、向步骤2所制得的木耳浆中加入步骤1制得的中药浸膏，搅拌均匀后，加入粘合剂，继续搅拌至混合均匀，制成软材，然后经湿法制粒、干燥、整粒、压片，即得木耳片。效果例1：松花活性肽对脂肪酶的抑制作用一、试验方法1、药品：实施例1～15制得的松花活性肽；奥利司他2、分组情况：试验一组：采用实施例1制得的松花活性肽；试验二组：采用实施例2制得的松花活性肽；试验三组：采用实施例3制得的松花活性肽；试验四组：采用实施例4制得的松花活性肽；试验五组：采用实施例5制得的松花活性肽；试验六组：采用实施例6制得的松花活性肽；试验七组：采用实施例7制得的松花活性肽；试验八组：采用实施例8制得的松花活性肽；试验九组：采用实施例9制得的松花活性肽；试验十组：采用实施例10制得的松花活性肽；试验十一组：采用实施例11制得的松花活性肽；试验十二组：采用实施例12制得的松花活性肽；试验十三组：采用实施例13制得的松花活性肽；试验十四组：采用实施例14制得的松花活性肽；试验十五组：采用实施例15制得的松花活性肽；药物对照组：奥利司他；空白对照组：不采用任何药物。3、试验方法(1)试剂配制奥利司他母液配置：取奥利司他溶于二甲基亚砜中，配置成15mg/ml的奥利司他母液；临用前用去离子水稀释3倍使用；待测样品溶液的配制：按照体积比为1:2配置二甲亚砜和去离子水，形成二甲亚砜水溶液，然后向二甲亚砜水溶液加入待测样品，配制成浓度均为5mg/ml的待测样品溶液，临用前配制；缓冲液配制：50mmtris-hcl溶液，ph值为8.8。酶溶液配制：用缓冲液配制1.2mg/ml酶，混匀，5000rpm离心5分钟，取上清，分装，-70℃保存，临用前采用缓冲液将其稀释120倍使用。底物溶液配制：称取0.302gpnpp，加入32ml异丙醇，超生乳化，即为25mmpnpp，分装，4℃保存，临用前采用缓冲液稀释50倍使用；(2)脂肪酶抑制剂活性测定取96孔细胞培养板，按照表2中不同的分组分别加入缓冲液、抑制剂和脂肪酶，37℃孵育10分钟。脂肪酶和抑制剂预孵育10分钟后，每孔加入100μl底物，37℃反应60分钟。在酶标仪od405nm处测量各孔的吸光值；表2为脂肪酶抑制剂筛选反应体系(200μl)缓冲溶液抑制剂脂肪酶底物/μla50050100a10000100b302050100b80200100a：为未加抑制剂的酶活；a：为未加抑制剂的空白对照(未加酶)；b：为加抑制剂的酶活；b：为加抑制剂的空白对照(未加酶)。2.结果处理及分析脂肪酶抑制率的计算公式：脂肪酶抑制率％＝[1-(b-b)/(a-a)]×100；各试验组和对照组对脂肪酶抑制作用的测试结果，见表3；表3各试验组和对照组对脂肪酶抑制作用的测试结果由表中数据可知：从试验一组至试验六组的对比可知：酶解后的片段大小对制得的松花活性肽的脂肪酶抑制作用影响显著，以3～5kda松花活性肽效果最好，1～3kda松花活性肽效果次之，由试验七组至试验九组与试验十二组的对比可知：酶的种类对制得的松花活性肽的脂肪酶抑制作用影响显著；当采用胃蛋白酶和碱性蛋白酶2种酶依次酶解并收集的3～5kda的活性肽其对脂肪酶抑制作用的抑制作用最佳，随着活性肽分子量的增大或减小效果降低，且采用其他没进行酶解所得活性肽对脂肪酶无抑制作用。从试验十组到试验十四组的数据对比可知：酶解时间对松花分离蛋白的水解程度影响巨大，当采用胃蛋白酶酶解45min、碱性蛋白酶酶解75min时，由于所得活性肽中的3～5kda的活性肽含量最多，因此其对脂肪酶的抑制作用最佳。实施例三组和试验十五组与药物对照组相比可知：本发明松花活性肽对胰脂肪酶活性的抑制作用与奥利司他对胰脂肪酶活性的抑制作用相当或更优。效果例2实施例10～14中制得的酶解液中的分子量分布情况使用tskgelg3000pwxl色谱柱，通过高效液相色谱测定松花肽的分子量分布。检测条件:以体积比1:1的乙腈与0.2％三氟乙酸(tfa)混合溶液为流动相，按0.5ml/min的流速过柱，紫外检测波长为225nm。取牛血清蛋白、vb12、及胶原蛋白样品各1mg，分别溶于1ml的纯水中，用0.45μm微孔滤膜过滤后进样。hplc结果通过gpc软件进行分子量分布分析，结果见表4。表4酶解液中的分子量分布情况由表中数据可知，实施例12中的酶解液中3～5kda以及1～5kda的松花活性肽均为最多。效果例4木耳片的减肥临床应用效果1、实验对象与方法1.1实验对象本实验全部受试者在实验前分别进行体质指数评估均为肥胖人群，150例受试者中男75例，女75例；年龄在18-45岁之间，平均年龄(30.2±10.7)岁。1.2实验方法分组：180名受试者随机分为6组，实验一组(n＝30)、实验二组(n＝30)、实验三组(n＝30)、实验四组(n＝30)、药物对照组(n＝30)、阴性对照组(n＝30)；分组情况：实验一组：服用本发明实施例16中制备的木耳片，10片/天,每片重0.7g,餐中服用；实验二组：服用本发明实施例17中制备的木耳片，10片/天；每片重0.7g，餐中服用；实验三组：服用本发明实施例18中制备的木耳片，10片/天；每片重0.7g，餐中服用；实验四组：服用本发明实施例12中制备的松花活性肽，0.46g/天；分三次餐中服用；药物对照组：服用奥利司他，0.36g/天；餐中服用；阴性对照组：服用安慰剂，10片/天；每片重0.7g，餐中服用；每组按照上述方法连续服用8周。整个实验期间，不控制饮食，不刻意增加运动，并禁服其他减肥食品和药品。1.3测试指标1.3.1人体成分测试：实验前和实验后每周采用dx200超强型体成分测试仪测试受试者的体重，体脂百分比。1.3.2记录各组中不良反应发生的人数；不良反应包括：大便次数增多(每天大于等于3次)、稀便、腹痛、恶心、呕吐及油性呃逆、上呼吸道和下呼吸道感染、头痛、疲劳、焦虑、泌尿系感染、月经失调等反应。1.4数据统计所得数据用excel处理，采用单盲法和t检验对测试数据进行统计学分析，用mean±sd表示。2、实验结果与分析2.1人体成分分析结果2.1.1实验前、服药8周后受试者体重及体脂检测结果，见表5；表5服药8周后受试者体重及体脂检测结果由表中数据可知：含有松花活性肽的试验一组、试验二组以及试验四组效果显著，而缺少松花活性肽的试验三组效果较差，但仍旧优于阴性对照组试验三组与药物对照组效果差异不显著，但不良反应显著优于药物对照组。以上所述实施方式仅为本发明的优选实施例，而并非本发明可行实施的穷举。对于本领域一般技术人员而言，在不背离本发明原理和精神的前提下对其所作出的任何显而易见的改动，都应当被认为包含在本发明的权利要求保护范围之内。当前第1页12